ダウンストリームアプリケーションのための鳥類の排卵前卵胞顆粒膜およびテカ細胞層の分離

私たちは、ラングハンド卵巣の特殊な顆粒膜細胞とテカ細胞を理解しようとしています。私たちは、排卵中の異なる時点での2つの細胞タイプ間の遺伝子発現の違いを研究しています。これにより、生殖効率と生殖能力に関する洞察が得られ、卵子生産を持続的に強化するために使用されます。

家禽生殖生物学は現在、次世代シーケンシング技術と代謝アッセイを使用して研究されています。これは、生殖組織と、性的成熟と排卵に関与するホルモンの相互作用の両方を研究するために行われます。顆粒膜細胞層は、常に無傷のシートとして剥がれるとは限りません。

実際の患者さんは、より高い成功確率を確保する必要があります。顆粒膜層に余分な卵黄が残っていることも懸念事項です。冷たいPBSでのインキュベーション時間が長いと、この問題が軽減される可能性があります。

それ以外の場合は、ダウンストリームのクリーンアップが必要になる場合があります。この技術により、鳥類の生殖生物学者の間での標準化が可能になります。シーケンシング技術が進歩するにつれて、臓器内の特殊な細胞の役割を解明することがますます容易になってきています。

したがって、特殊な細胞タイプを分離する技術の視覚化は、将来の複製にとって重要です。まず、性的に成熟した雌の鳥から分離された卵胞を取り、氷の上に置きます。操作する前に、茎の位置、柱頭、および胚椎間板に注意して、卵胞を研究します。

次に、乾いたペーパータオルの上で卵胞をそっと転がし、必要に応じて卵胞の表面から漿膜を引き抜きます。PBSで満たされたボウルの上で茎で卵胞を保持し、重力を使用して茎が卵胞表面で終わる場所を視覚化します。はさみを使用して、卵胞の表面に穴を開けずに茎だけを切り取り、漿膜が見えなくなるまで漿膜を取り除き続けます。

ライトボックスを照らし、胚椎間板を基準にして、柱頭を反対側に移動します。柱頭側が見えるように卵胞をそっと保持し、卵胞を氷のように冷たいPBSのボウルの真上に配置します。次に、メスを手に取り、柱頭の長さに沿って優しくスライスします。

卵黄が落ち始めたら、すぐに卵胞をPBSに落とします。一対のまっすぐな歯のない組織鉗子を使用して、スライスの片側の卵黄から卵胞壁のピンク色の層をそっと剥がします。小さなつまみと引っ張りの動きを続けて、卵胞壁を卵黄から持ち上げます。

層分離を行うには、卵黄から一度に約5ミリメートルの卵胞壁組織を引っ込めます。5ミリメートルのセクションが引っ込められたら、まっすぐな鉗子と一緒に角度のある鉗子を使用して、卵胞の殻に沿ってプローブします。顆粒膜層が見つかったら、しっかりとテカ層につまみ、前述のように両方の層を卵黄から引き離し続けます。

次に、湾曲した鉗子を使用して、つままれた層から卵黄を軽く払います。顆粒膜層をこすり落とさずにボウルから余分な卵黄を掃き出すか取り除いて、引き裂かれないようにします。卵胞壁の各5〜10ミリメートルのセクションを引っ込めた後、一時停止して鉗子を使用して、テカ層と顆粒膜層を互いに、また卵黄から剥がします。

次に、まっすぐな鉗子を使用して胚椎間板に慎重にアプローチします。顆粒膜層をテカ層にしっかりと保持します。湾曲した鉗子では、軽いブラッシング動作を使用して、胚椎間板を顆粒膜細胞から卵黄表面に押し出します。

胚盤を研究標本として必要な場合は、角度のある鉗子を使用して卵黄を払い落とします。卵胞の球全体に卵黄がなくなるまで、湾曲した鉗子で卵黄を卵胞壁から分離し続けます。卵黄の残りの部分を払い落としたら、顆粒膜層の最後の部分をテカ層から分離します。

完全に分離された顆粒膜層が、ヨーク物質で過度にコーティングされることなく、できるだけきれいであることを確認してください。グラニュローザ層とテカ層を摂氏4度のPBSで別々の容器に入れます。顆粒膜層とテカ層を指定された容器に入れた後、鉗子でPBSのテカ層を穏やかに攪拌し、顆粒膜層の残りの残りを取り除きます。