この方法は、タンパク質化学や創薬の質問に答えることができますか?どの突然変異が酵素のサーモスタン性に影響を与えますか?そして、どのリガンドがタンパク質標的に結合しますか?
この技術の主な利点は、高速で、標準のラボで簡単に実行でき、中~高スループットのアプリケーションに完全に適していることです。安定性スクリーンの各条件のタンパク質サンプル転送を10マイクロリットルのマルチチャンネルピペットを用いて96ウェルプレートの対応するウェルに10マイクロリットルの時間を節約する準備を行った。その後、適切な緩衝システムでミリリットルタンパク質溶液あたり約1ミリグラムの1ミリリットルを調製します。
熱シフトアッセイを行う場合は、SYPROオレンジ色の色素をタンパク質サンプルに加え、最終的に20倍の濃度にします。反転または短い渦のいずれかで混合します。今96ウェルプレートの各ウェルにタンパク質溶液の10マイクロリットルを転送します。
96ウェルプレートを600倍Gで2分間シールし遠心分離し、タンパク質サンプルとスクリーン成分が混合されていることを確認した。安定性画面を深く密封し、最大4ヶ月間摂氏4度で画面を保存します。TSA実験を行う場合は、引き出しの右側のインデントをしっかりと押してサンプルドロワーを開きます。
96ウェルトレイをRTPCRシステムに入れ、後ろにA-1を左に置きます。新しい実験ボタンをクリックして、TSA実験の設定を開始します。[実験プロパティ] タブで、どの種類の実験を設定するか確認する質問が表示されたら、[カーブを溶かす] オプションをクリックします。
次に、質問されたときに、ターゲットシーケンスを検出するために使用する試薬を選択し、他のオプションをクリックします。プレート設定の[ターゲットとサンプルを定義]タブで、[ターゲット名]を入力し、レポーターをROXに設定します。そしてクエンチャーはなし。
[プレート設定]の[ターゲットとサンプルを割り当て]タブで、パッシブ参照として使用する色素を[なし]に設定します。同じタブで、前のステップで入力したターゲット名に 96 ウェルプレートのすべてのウェルを割り当てます。[実行方法] タブで、合計 3 つになるまでステップを削除します。
最初のステップを摂氏25度に設定し、ランプレートは100%、時間は5秒です。2 番目のステップを摂氏 95 度に設定し、ランプレートは 1%、時間は 1 分です。最後に、ランプレートが100%、時間が5秒の95°Cに3番目のステップを設定します。
[データの収集] ドロップダウン メニューを使用するか、データ収集アイコンをクリックして、[データの収集] を選択します。ウェルあたりの反応量を20マイクロリットルに設定します。[実行の開始]ボタンをクリックして、TSA実験を開始します。
NanoDSFは、外因性染料を使用せずにタンパク質の熱安定性をプローブするために使用できます。サンプルは、プロトコルで前述したように96ウェルプレートで調製することができますが、任意のSYPROオレンジ色素を追加することなく。[ドロワーを開く] ボタンを押して、サンプル ドロワーを開きます。
装置が清潔であることを確認し、サンプルラックの近くのほこりに特に注意を払ってください。システムが後方散乱ミラーを持っている場合は、エタノールと糸くずのない組織を使用してそれをきれいにします。毛細血管の一端を溶液に触れることで、96ウェルプレートの各ウェルから約10マイクロリットルで毛細血管をロードします。
次に、サンプルラックの対応するキャピラリーホルダーに毛細管を置きます。これは、実験全体を通して蛍光測定値を妨げる可能性がありますので、指紋で毛細血管の真ん中を汚染しないように注意してください。磁気シーリングストリップで毛細血管を固定化します。
[検出スキャン]タブの[検出スキャンの開始]ボタンを押して、各キャピラリーの位置と強度を検出するための予備スキャンを起動します。最初の電力 10% から、各キャピラリースキャンのピークまで、入射励起強度を増加または減少させます。[融解スキャン]タブで、[温度勾配]オプションを毎分7.0度に設定して、メルトスキャンをプログラムします。
摂氏25度まで温度を開始します。そして、摂氏95度に温度を終了します。次に、溶融開始ボタンを押してnanoDSF実験を開始します。
これらの手順を繰り返して、完全な実験のためにサンプルを準備します。完全な実験を設定したら、[溶融スキャン]タブに移動し、[温度勾配]オプションを1分あたり1.0°Cに設定してメルトスキャンをプログラムします。摂氏25度まで温度を開始します。
そして、摂氏95度に温度を終了します。最後に、溶融開始ボタンを押してnanoDSF実験を開始します。Tmは、異なる条件の好感度を比較するベンチマークでタンパク質熱安定性の定量的尺度として使用される。
ここに示されているサンプルは、塩スクリーンからのサンプル結果であり、リソザイムに対する塩化アンモニウムの熱的安定化特性を例示する。リソザイムのTm値とpHスクリーンを比較すると、TSAとnanoDSFとの間の一般的な合意は良好であるが、nanoDSFはTSAよりもわずかに大きいTmシフトでわずかに高いTm値を同定する傾向を示す。pH 値の減少に伴う安定性の向上には、一般的な傾向があります。
同一のpH値を持つ異なるバッファシステムを使用して得られるTm値の範囲は有意である可能性がある。各安定性画面から最高のTSA T m値を生じる条件のリソチームの組み合わせについて、相乗的な組み合わせ効果についてプローブを試験した。バッファシステムのコンポーネントが増えると、T m値が一般的に増加します。
バッファーの個々のコンポーネントが最適化され、安定性画面と組み合わされている場合、顕著な相乗効果が発生する可能性があります。この技術に従って、結晶化などの他の方法を用いて、タンパク質の立体構造を決定し、リガンド結合の分子基盤を解明することができる。Virus-Xプロジェクトの一環としてタンパク質の安定性に関する洞察を提供するだけでなく、この技術は幅広い創薬および開発システムに適用可能です。
