Cette méthode peut répondre à des questions sur la chimie des protéines et la découverte de médicaments, telles que les conditions qui stabilisent une protéine? Quelles mutations ont un impact sur la thermostabilité d’une enzyme ? Et quels ligands se lient à une cible protéique ?
Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est rapide, facile à effectuer dans un laboratoire standard, et parfaitement adaptée aux applications à débit moyen à élevé. Pour préparer l’échantillon de protéines transférer 10 microlitres de chaque condition d’un écran de stabilité dans le puits correspondant d’une plaque de puits 96 à l’aide d’une pipette multicanal pour gagner du temps. Préparez ensuite une millilitre d’environ un milligramme par solution protéique millilitre dans un système tampon approprié.
Si vous effectuez un test de décalage thermique, ajoutez le colorant orange SYPRO à l’échantillon de protéines à une concentration finale de 20X. Mélanger soit par inversion, soit par un bref tourbillon. Maintenant, transférez 10 microlitres de la solution protéique dans chaque puits de la plaque de puits 96.
Sceller et centrifuger la plaque de puits 96 pendant deux minutes à 600 fois G pour s’assurer que l’échantillon de protéines et le composant de l’écran sont mélangés. Reseal l’écran de stabilité profondément bloc de puits et de stocker l’écran à quatre degrés Celsius pour un jusqu’à quatre mois. Pour effectuer l’expérience TSA, ouvrez le tiroir de l’échantillon en appuyant fermement sur l’indent sur le côté droit du tiroir.
Placez le plateau de puits 96 dans le système RTPCR avec bien A-one à l’arrière gauche. Cliquez sur le nouveau bouton d’expérience pour commencer à mettre en place une expérience TSA. Dans l’onglet Propriétés d’expérience, cliquez sur l’option Courbe de fusion lorsqu’on vous le demande, quel type d’expérience souhaitez-vous configurer ?
Ensuite, cliquez sur l’autre option lorsqu’on vous demande quels reagents voulez-vous utiliser pour détecter la séquence cible? Dans la configuration de la plaque, définissez l’onglet Cibles et Échantillons, entrez un nom cible, puis définissez Reporter comme ROX. Et Quencher comme aucun.
Dans l’onglet Configuration de la plaque, attribuez des cibles et des échantillons, définissez le colorant à utiliser comme référence passive comme Aucun. Dans le même onglet, attribuez chaque puits de la plaque de puits 96 au nom cible entré dans l’étape précédente. Dans l’onglet Méthode d’exécuter, supprimez les étapes jusqu’à ce qu’il y en ait un total de trois.
Réglez la première étape à 25 degrés Celsius, avec un taux de rampe de 100% et le temps de cinq secondes. Réglez la deuxième étape à 95 degrés Celsius, avec un taux de rampe de 1% et le temps d’une minute. Enfin, réglez la troisième étape à la 95 degrés Celsius avec un taux de rampe de 100% et le temps de cinq secondes.
Choisissez de collecter des données à l’aide du menu collecter ou en cliquant sur l’icône de collecte de données. Réglez le volume de réaction par puits à 20 microlitres. Cliquez sur le bouton Démarrer pour commencer l’expérience TSA.
NanoDSF peut être utilisé pour sonder la stabilité thermique des protéines sans l’utilisation de dyes extrinsèques. Les échantillons peuvent être préparés dans 96 plaques de puits comme décrit précédemment dans le protocole, mais sans ajouter de colorant orange SYPRO. Ouvrez le tiroir de l’échantillon en appuyant sur le bouton Open Drawer.
Assurez-vous que l’équipement est propre, en jouant une attention particulière à toute poussière près de la grille de l’échantillon. Si le système a rétro-diffusion miroir le nettoyer à l’aide d’éthanol et un tissu sans peluche. Chargez les capillaires avec environ 10 microlitres de chaque puits de la plaque de puits 96 en touchant une extrémité du capillaire dans la solution.
Et puis placez le capillaire dans les supports capillaires correspondants de la grille d’échantillon. Veillez à ne pas contaminer le milieu des capillaires avec des empreintes digitales car cela pourrait interférer avec les lectures de fluorescence tout au long de l’expérience. Immobiliser les capillaires à l’aide d’une bande d’étanchéité magnétique.
Lancez une analyse préliminaire pour détecter la position et l’intensité de chaque capillaire en appuyant sur le bouton Démarrer découverte scan dans l’onglet Discovery Scan. Augmentez ou diminuez la force d’excitation de l’incident d’une puissance initiale de 10% jusqu’à ce que le pic de chaque balayage capillaire se situe entre 4000 et 12 000 unités. Dans le programme d’onglet Melting Scan, un balayage de fusion en fixant l’option Pente de température à 7,0 degrés par minute.
Commencez la température à 25 degrés Celsius. Et terminer la température à 95 degrés Celsius. Lancez ensuite l’expérience nanoDSF en appuyant sur le bouton Démarrer la fusion.
Répétez ces étapes pour préparer les échantillons pour une expérience complète. Une fois l’expérience complète mise en place, accédez à l’onglet Analyse de fusion et programmez un balayage de fusion en définissant l’option Pente de température à 1,0 degré Celsius par minute. Commencez la température à 25 degrés Celsius.
Et terminer la température à 95 degrés Celsius. Enfin, lancez l’expérience nanoDSF en appuyant sur le bouton Start Melting. T m est utilisé comme mesure quantitative de la stabilité thermique des protéines dans une référence pour comparer la favorabilité des différentes conditions.
Voici les résultats de l’échantillon de l’écran de sel, ilplifiant les propriétés thermiquement stabilisatrices du chlorure d’ammonium vers le lysozyme. La comparaison des valeurs T m du lysozyme avec l’écran de pH révèle que l’accord entre la TSA et le nanoDSF est généralement bon, mais nanoDSF montre une tendance à identifier des valeurs T m légèrement plus élevées dans les décalages T m légèrement plus grands que la TSA. Il y a une tendance générale à la stabilité croissante avec la baisse des valeurs de pH.
La plage de valeurs T m obtenues à l’aide de différents systèmes tampons avec des valeurs de pH identiques peut être significative. Pour les combinaisons lysozyme de conditions donnant les valeurs tsa t m les plus élevées de chaque écran de stabilité ont été testés pour sonder pour un effet combiné synergique. Il ya une augmentation générale des valeurs T m que plus de composants du système tampon sont ajoutés.
Un effet synergique notable peut se produire lorsque les composants individuels d’un tampon sont optimisés et combinés avec les écrans de stabilité. Suivant cette technique, d’autres méthodes telles que la cristallisation peuvent être utilisées pour déterminer la structure tridimensionnelle d’une protéine et démêler la base moléculaire de la liaison ligand. De plus, nous fournissons un aperçu de la stabilité des protéines dans le cadre du projet Virus-X, cette technique s’applique à un large éventail de systèmes de découverte et de développement de médicaments.
