MCVはCIB教室プログラム「分子生物学（MACBET）」のメンバーです。これらの成果を導く研究は、スペイン競争力のある経済大臣賞（CTQ2015-66206-C2-2-RおよびSAF2015-72961-MCVへのEXP）であるSalut Carlos IIIスペイン研究所（PI12 / 01667からMCV） ）、マドリード地方政府（S2010 / BD-2316〜MCV）、欧州委員会（フレームワークプログラム7（FP7））プロジェクトComplexINC（MCVへの契約番号279039）資金提供者は、研究デザイン、データの収集と分析、出版の決定、または原稿の作成に何の役割も持たなかった。

注意：使用前に関連するすべての物質安全データシート（MSDS）を参照してください。このプロトコルで使用される化学物質のいくつかは有毒で腐食性があります。ヒュームフードや個人用保護具（安全眼鏡、手袋、ラボコート、フルレングスのズボン、閉じたつま先の靴など ）の使用を含む、フェノールを使用してtRNAの抽出を行う場合は、適切なプラクティスを使用してください。このプロトコールは、毒性のない核酸染色を使用する。代替染色の使用は、毒性および/または発癌性（ 例えば 、エチジウムブロマイド）の場合には、染色剤の追加の予防措置および特殊処分を必要とすることがある。 1.アガロースゲルの調製<ol><li> 2gのアガロースを秤量し、ガラス瓶に加えて2％w / vアガロースゲルを調製する。 </li><li> 100mLの1×トリス - ホウ酸塩 - エチレンジアミン四酢酸（EDTA）（TBE）ランニングバッファーをアガロース含有ボトルに加える。電子レンジで加熱して溶かします。 30秒間隔で、内容物を旋回させて混合するアガロースが完全に溶解するまでこのステップを繰り返す。アガロース溶液を約50〜60℃に冷却します。 </li><li>金型を作成するためにゲルトレーの開口部をテープで覆い、適切な櫛を配置してウェルを作り、溶融したアガロースをその中にキャストします。気泡の形成を避け、室温で凝固させる。 </li><li>固化したら、ゲルトレーを電気泳動装置に入れ、ゲルが完全に覆われるまでTBEバッファーで満たします。 </li></ol> tRNAの調製<ol><li> 大腸菌におけるExpress tRNA（UUU） <ol><li>午前中、発現ベクターpET23d-EcUUU 2 （ 大腸菌 tRNA（UUU）をコードする遺伝子を有する）で形質転換した凍結大腸菌 BL21（DE3）のバイアルを使用して、低塩Luriaブロス（LB）プレートに100μg/ mLのアンピシリンを補充した。コロニーが現れるまでプレートを逆さにして37℃のインキュベーターに入れてください（遅い午後oon）。 </li><li>よく増殖した単一コロニーを5 mL LB + 100μg/ mLアンピシリンに接種し、37℃で220 rpmで一晩増殖させます。 </li><li>翌朝、細胞をペレット（4℃で10分間6,500 xg）し、培地を5 mLの新鮮なLB + 100μg/ mLのアンピシリンで置き換え、再懸濁する。この懸濁液を使用して、200 mL LBプラス100μg/ mLアンピシリンに接種します。 37℃、220rpmで5時間増殖させる。 </li><li> 590nm（OD 590 ）の培養物の光学密度が0.6〜0.8に達したら、tRNA（UUU）遺伝子の発現を誘発するために1mM IPTGを培養物に添加する。 37℃で3時間インキュベートする。 </li><li>培養物を6,500 xgで10分間4℃で遠心分離して細胞を収穫する。 </li></ol></li><li> 溶解および抽出 <ol><li>細胞ペレットを5mLの溶解緩衝液（0.3M酢酸ナトリウム、10mM EDTA）に再懸濁する。この時点以降、オートクレーブしたバッファーを使用し、4℃ですべてのtRNA含有サンプルを保持してtRNA分解。 </li><li>ヒュームフード内の再懸濁した細胞ペレットに1容量の酸性フェノール（pH 4.3）を加える。逆に1分間混合して細胞を溶解し、10,000×g（10分間、4℃）で遠心分離する。 </li><li>有機（底）相を吸引しないように注意して、ピペットを用いて可溶性tRNA（UUU）（および他のtRNAプールのより小さい濃度）を含む上部の水相を集める。下層と、有機相と細胞破片からなるペレットを適切な容器に捨てる。 </li><li>可溶性（水性）相を2.5体積％100％v / vエタノールと4℃で1時間徹底的に混合してtRNAを沈殿させます。混合物を15,000 xgで遠心分離する（30分、4℃）。 </li><li>上清を注意深くデカントし、4mLゲル濾過バッファー（20mMリン酸ナトリウムまたはリン酸カリウム、pH7.4,0.1mM EDTA）にtRNAに富むペレットを再懸濁する。再懸濁したtRNAプール5μLを2％w / vアガロースゲル上で実行する。 注意：良質のtRNAは、単一バンド（50〜100bpの間の分子サイズ）として現れる。 </li></ol></li><li> tRNA（UUU）の精製 <ol><li>標準的なクロマトグラフィーの実践12に従って、予めゲルろ過緩衝液中で平衡化した高解像度分取ゲルろ過カラム（寸法：16×600mm、ベッド容量：120mL、解像度範囲：1,000〜70,000Da）に再懸濁したtRNA（UUU） （移動相）。サンプルを溶出するために流速を1 mL / minに設定します。 注：tRNA（UUU）ピークは約75.5 mLで溶出します。典型的には、培養物の0.5〜1.0mg / LのtRNAの収率が得られる。 </li><li> 2％w / vアガロースゲルで5〜10μLの各サンプルを電気泳動することにより、代表的な溶出量でサンプルを分析します。 </li></ol></li></ol>試料調製<ol><li>ロペス - エステパ（ Lopez-Estepa） らによる TcdAの発現および精製。 2 。 注：250μMまでTcdAを研究に使用することができる。 </li><li> 表1の対応する量のTcdAを適切に標識された1.5mL遠心分離管にピペットで入れる。 1.6mMのトリス （2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）（最終濃度）を添加し、ピペットを用いて穏やかに混合する。蓋を閉め、混合物を室温で5分間インキュベートする。 </li><li> 10μMのアデノシン三リン酸（ATP）および50mM MgCl 2 （最終濃度）を加える。ピペットで混合し、混合物を室温で5分間インキュベートする。 </li><li> 表1に従って精製tRNA（UUU）（セクション2.3）を加え、ピペットで混合し、室温で5分間インキュベートする。 </li><li>リン酸緩衝食塩水（PBS）を最終容量100μLまで添加する。適切に混合し、10％v / vの最終濃度にグリセロールを加える。 </li><li>サンプルをボルテックスし、チューブの内容物を短時間スピンダウンします（10,000 xg、1分、4℃）。 </li></ol> 4.ゲルローディングと電気泳動の開発<ol><li>泳動中にチャンバーを4℃に維持するために砕氷で満たされたトレーに電気泳動ユニットを置く。 </li><li>慎重に、5μLの各サンプルを対応するウェルにピペットで移す。適切なDNAサイズマーカーを加える。 </li><li>電極を電源ユニットの対応するスロットに差し込みます。電源装置の電源を入れ、電圧を100Vに設定し、ゲルを90分間流します。 </li></ol> 5. tRNA-タンパク質相互作用を観察するためのゲル染色<ol><li> 1mLの適切なDNA染色液と50mLのTBEを混合することによって染色溶液を調製する。汚染容器をアルミニウム箔で覆うことにより、汚染溶液を日光にさらさないようにしてください。 注：DNA染色は、通常10,000または20,000倍濃縮ストックとして保存されます。 </li><li>電気泳動の90分後、慎重にトレーからゲルを取り出し、染色溶液を入れた容器に入れる。室温でロッキングスピードの速いロッカーに置きます30分間放置する。 </li><li>染色容器からアガロースゲルを取り出し、余分な液体を取り除くためにセルロース組織または濾紙上に注意深く叩いて、トランスイルミネーターの上に直接置きます。 UV光を入れて、tRNAを含むバンドを可視化する。ゲルの写真を撮る。 </li><li> タンパク質染色（オプション）。 <ol><li>安全にDNA染色液を捨て、50mLのクーマシーブリリアントブルー（CBB）溶液で置換する。トレーを室温でロッカーに置き、一晩（&gt; 12時間）染色する。 CBB染色溶液を捨て、余分な色素を除去するために50mL PBSで置換する。ロッカーで1時間デスティネーションしてください。 </li></ol></li><li>軽質トランスイルミネーターでタンパク質を含むtRNA複合体を視覚化し、ゲルの写真を撮ってtRNA UVゲル画像と比較します。 </li></ol>

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	<li>Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gel+retardation+assay.">The gel retardation assay.</a> Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).</li><li>L&#243;pez-Estepa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+and+small-angle+X-ray+analysis+of+CsdL/TcdA+reveal+a+new+tRNA+binding+motif+in+the+MoeB/E1+superfamily.">The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily.</a> Plos One. 10 (4), e0118606 (2015).</li><li>Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cyclic+form+of+N6-threonylcarbamoyladenosine+as+a+widely+distributed+tRNA+hypermodification.">A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification.</a> Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).</li><li>Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+protein-protein+interactions+within+the+Cysteine+Sulfinate+Desulfinase+Fe-S+cluster+biogenesis+system.">Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system.</a> J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).</li><li>Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+heteromeric+CsdA-CsdE+cysteine+desulfurase,+assisting+Fe-S+cluster+biogenesis+in+Escherichia+coli.">Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).</li><li>Fried, M. G., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibrium+studies+of+the+cyclic+AMP+receptor+protein-DNA+interaction.">Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction.</a> J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).</li><li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions:+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system.">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assays+for+RNA-protein+complexes.">Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).</li><li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift.">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li><li>Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+mobility+shift+assays+to+detect+protein-RNA+interactions.">Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions.</a> Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).</li><li>Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+agarose+gel+electrophoretic+mobility+shift+assay+for+quantitating+protein:+RNA+interactions.">Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions.</a> Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).</li><li>Hagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel-filtration+chromatography.">Gel-filtration chromatography.</a> Curr Protoc Mol Biol. , (2001).</li></ol>

著者は何も開示することはない。

本明細書に記載のタンパク質-tRNAアガロースゲル遅延アッセイは、多くの方法で変更することができる。第1に、ゲル中のアガロースの割合を減少させて、ここで分析したもの（120kDa）よりも有意に大きいタンパク質-tRNA複合体の分離および可視化を可能にすることができる。第2に、標的タンパク質が熱不安定性である場合、電気泳動装置を冷たい部屋に移動させるか、電気泳動室内の氷パックを使用して生成された熱をすぐに消散させることにより、温度が最大許容温度未満に保たれるように、実行中。他の緩衝液組成物（ 例えば 、0.5X TB、トリスホウ酸塩）​​およびランニングパラメータ（&gt; 20V / cm）は、必要であればランタイムを短縮するように改変することができ、サンプル11に対して許容可能である。示唆されたMgCl 2濃度は、試料調製工程の間にRNA分解が観察される場合に減少され得る。なぜなら、2価のcati潜在的に核酸の切断を触媒することができる。 この技術の主な制限は、タンパク質-tsRNAのバンドが、アクリルアミドベースのゲル遅延法で見られるものよりもわずかに拡散していることであり、これはよりシャープで明瞭になる傾向がある。別の制限は、複数のサンプルの同時分析、および様々なサイズおよび電荷のタンパク質-tRNA複合体を分析する場合に、より幅広くより長いゲルが必要であることである。 既存の方法と比較して、タンパク質-tRNAアガロースゲル遅延アッセイは、試料調製から分析までの労力と時間を大幅に短縮する。アクリルアミドゲルは、有害な化学物質を含み、準備するのが面倒で、重合に長時間かかります。対照的に、アガロースゲルはシンプルで、流し込みが速く、毒性化学物質を含まない。実験は2時間で完了することができます。これには、ゲルをセットするための30分、サンプル調製のための15分（これはアガロースを冷却しながら行った）、電気泳動および可視化のために90分。 この方法の将来の応用は、このプロトコールで使用される検出方法を改良し、それをあまり豊富ではなく不安定なRNA種、またはごく少量でしか発現しないタンパク質複合体の検出に適用することができる。高感度フルオロフォアでRNAまたはタンパク質成分を標識することにより、より少量のタンパク質-RNA複合体の検出が可能になる。さらに、重複しない発光/励起ピークを有するフルオロフォアを使用することにより、異なるタンパク質および/またはRNA種が単一の実験で同時に視覚化され得る多重化実験が可能になり得る。 このプロトコルには3つの重要なステップがあります。最初で最も明らかな重要なステップは、tRNA（UUU）の発現および精製である。精製されたtRNA（UUU）の量が特定の最小検出限界（バンドあたり25〜200ngのtRNAの間）である場合）、または分解バンドがより低い分子サイズの汚染物質として明らかになる場合、tRNAは廃棄され、再精製されるべきである。 tRNA抽出中に酸性フェノール（pH4.3）を使用することは、RNAを可溶性に保ちながら選択的にDNAを沈殿させるため必須である。第2の重要なステップは、分析のためのタンパク質-tRNAサンプルの調製に関する。十分な量のタンパク質およびtRNAを使用して、形成されるすべての複合体の強固な検出を可能にしなければならない。タンパク質-tRNAのモル比は、平衡を複合体形成に向かわせるために調整しなければならない。第3の重要なステップは電気泳動である。 TBEバッファーは新鮮なもの（再使用されない）で使用する必要があります。プロテイン-tRNA複合体が安定し、変性しない温度（通常4〜10℃）でアガロースゲルを保つ必要があります。例えば、電気泳動チャンバーを氷で囲み、可能であれば、実験を実行することによって、電気泳動全体の間、アガロースゲルを冷たく保つように注意しなければならない4℃の冷たい部屋に放置する。 本発明者らは、TcdA-tRNA（UUU）をモデル系として使用し、アクリルアミド電気泳動の代わりにアガロースゲル電気泳動を使用してタンパク質tRNA複合体を分析し、直接的に分析する方法を実証した。後者は完了に時間がかかり、かなり面倒です。この方法を用いて、2％w / vアガロースゲル（8cmゲルフォーマット）での電気泳動分離を90分未満で達成することができる。これは、タンパク質-tRNA相互作用の解析に便利なツールであり、複数のサンプルを同時に分析することができます。 tRNAおよび/またはタンパク質突然変異体の変異体は、この方法を用いて結合および安定性についてスクリーニングすることができる。

<html>ゲル遅延アッセイ1 （電気泳動移動度シフトアッセイ、EMSAとしても知られている）は、タンパク質 - 核酸相互作用を研究し特徴付けるために設計された電気泳動法である。これは、精製された成分またはタンパク質（ 例えば 、細胞溶解物）または核酸（ 例えば 、tRNA）の複雑な混合物のいずれかを用いて、タンパク質-DNAならびにタンパク質-RNA相互作用ならびに特にtRNAとtRNA結合タンパク質との相互作用の分析を可能にするプール）。本発明者らは、精製tRNA（UUU）とアンチコドンステムループ（ASL）においてA37に結合したトレオニルカルバモイル側鎖を環化するN 6 -トレノニルカルバモイルアデノシン（t 6 A）デヒドラターゼであるTcdAとの相互作用の研究にゲル遅延アッセイを適用した。 tRNAの環状t 6 （ct 6 A） 2への変換。 TcdAはCsdL 3としても知られており、tcdA / csdL遺伝子は、 csdAおよびcsdE遺伝子5を有するクラスターを形成し、システインスルフリナーゼ脱硫酵素（CSD）系のシステインデスルフラーゼおよび硫黄受容体をコードし、 インビボで TcdA機能を維持する必要がある3 。 ゲル遅延アッセイの背後にある論理的根拠は、遊離核酸分子は、その大きな負電荷のためにアクリルアミドまたはアガロースゲルの前面に迅速に移動するが、同じ核酸のタンパク質複合体の電気泳動移動度は劇的に減少するということである。移動度の減少は、核酸 - タンパク質複合体における「シフト」として視覚化され、これは別個のバンドとして解決する。正に帯電した、より大きな核酸 - タンパク質複合体は、ゲル上の移動度のより大きなシフトまたは減少を示す。 複合体の電荷中和は普遍的な現象であるためタンパク質 - 核酸複合体については、ゲル遅延アッセイを広範囲の複合体および核酸型に適用することができる。この方法は、単純で安価であり、最小限の設備で実験室で実施することができる。少量のタンパク質とtRNAしか必要としません。これは、通常はより多くの量の試料を消費する代替的な生物物理学的技術に対して利点である。 ゲル遅延アッセイは、転写因子の研究に広く使用されている。アッセイは、多くの異なるDNA配列の転写因子の結合動力学、強度および特異性を分析するために用いられてきた。この分野では、EMSAが最初に開発されたのは確か6,7であった 。 RNA 8,9,10,11およびtRNA分子を用いたゲル遅延アッセイもリボソーム研究に用いられている我々がここで行ったように、転写後にtRNAヌクレオシドを修飾する酵素を分析することである。 多くの異なるパラメーターが、温度、タンパク質およびtRNAサンプルの品質、および結合の強さなどのゲル遅延アッセイの結果に影響を及ぼす。実験の慎重な計画と実行は、遊離核酸とタンパク質結合種の結果の解釈にとって非常に重要です。ここでは、プロモーターがShine-Dalgarnoリボソーム結合部位を欠く発現ベクターにクローニングされたtRNA（UUU）をコードする合成遺伝子を使用し、大量のtRNA 2の合成を導く。この詳細なプロトコールは、一般的なミスを避けながらtRNAゲル遅延実験を行うための明確なガイドを提供することを意図している。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21(DE3)</td><td>Novagen</td><td>70235</td><td>DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction.</td></tr><tr><td>pET23d</td><td>Novagen</td><td>69748-3</td><td>pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter.</td></tr><tr><td>LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated</td><td>Melford</td><td>GL1703</td><td>Conventional LB Broth, High Salt, can also be used.</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10419313</td><td></td></tr><tr><td>Incubator Shaker (Thermostated)</td><td>NBS</td><td>Excella E24&amp;nbsp;</td><td>Any shaker incubator with temperature control can be used.</td></tr><tr><td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), &gt;=99%</td><td>Acros Organics</td><td>BP1755</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate, anhydrous, &gt;99%</td><td>Melford</td><td>B4017</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, &gt;99%</td><td>Acros Organics</td><td>AC327205000</td><td>Harmful if inhaled.</td></tr><tr><td>Centrifuge (refrigerated)</td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge (refrigerated) rotor</td><td>Eppendorf</td><td>5430/5430P</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sorvall</td><td>RC5C</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge rotor</td><td>Sorvall</td><td>SLA-3000</td><td></td></tr><tr><td>Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 &amp;plusmn; 0.2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4682</td><td>Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive</td></tr><tr><td>Ethanol absolute for analysis, 100% v/v</td><td>Merck Millipore</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, &gt;=99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate, KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>48,730,250</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 Superdex 75&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28989333</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Melford</td><td>MB1200</td><td></td></tr><tr><td>Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl]</td><td>Melford</td><td>T1513</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Melford</td><td>B0503</td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td>Haier</td><td>HDA-2070M</td><td></td></tr><tr><td>TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td>Corrosive to metals and skin.</td></tr><tr><td>ATP [Adenosine 5&amp;prime;-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, &gt;=99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;), anhydrous, &gt;=98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl), &gt;99%</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl), &gt;99%</td><td>Melford</td><td>P0515</td><td></td></tr><tr><td>NZYDNA Ladder VI</td><td>NZYtech</td><td>MB8901</td><td></td></tr><tr><td>Power supply</td><td>Consort</td><td>EV261</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis unit</td><td>Real Laboratory</td><td>RELSMINI10</td><td></td></tr><tr><td>Real Safe nucleic acid staining</td><td>Real Laboratory</td><td>RBMSAFE</td><td>20,000X stock</td></tr><tr><td>UV Transilluminator (G:Box/EF)</td><td>Syngene</td><td>2216498</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0770</td><td></td></tr><tr><td>Rocker (Gyro-Rocker)</td><td>Stuart</td><td>SSL3</td><td></td></tr><tr><td>Mixer Vortex&amp;nbsp;</td><td>Fisher brand</td><td>13214789</td><td></td></tr></tbody></table>

protein-trna agarose gel retardation assays for the analysis of the n6-threonylcarbamoyladenosine tcda function

本発明者らは、 大腸菌における tRNA（UUU）の発現および精製のための方法およびtRNA（U6U）脱水酵素であるTcdAへのtRNA（UUU）の結合のゲル遅延アッセイによる分析を実証し、トレオニルカルバモイルtRNAのアンチコドンステムループ（ASL）においてA37に結合した側鎖を環状t 6 A（ct 6 A）に変換する。 tRNA（UUU）をコードする合成遺伝子の転写は、1mMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を用いて大腸菌で誘導され、tRNAを含む細胞は誘導24時間後に収穫される。 RNA画分は酸性フェノール抽出法を用いて精製する。純粋なtRNAは、小型のtRNA分子をより大きな無傷または断片化核酸から効率的に分離するゲル濾過クロマトグラフィーによって得られる。 tRNA（UUU）へのTcdA結合を分析するために、TcdAをtRNA（UUU）と混合し、4℃で天然アガロースゲル上で分離する。遊離tRNA（UUU）はより速く移動し、TcdA-tRNA（UUU）複合体はゲルの染色時に観察される移動性遅延を受ける。我々は、TcdAがtRNA（UUU）結合酵素であることを示す。このゲル遅延アッセイを用いて、TcdA突然変異体および添加剤および他のタンパク質が結合に及ぼす影響を研究することができる。

大量のtRNA（UUU）は、強力な誘導性T7プロモーターの制御下で大腸菌でtRNA遺伝子を発現させることによって得ることができる。発現されたtRNA（UUU）は、細胞質に蓄積し、天然に豊富なtRNAのプールに富む。 EMSAグレードのtRNAを得るために、捕獲/抽出工程およびゲル濾過/研磨工程からなる2段階精製プロセスを利用した。捕獲/抽出工程は、タンパク質、細胞破片、DNA、およびtRNA（および他のRNA分子）の抽出の同時沈殿を達成するためにpH 4.3のフェノールを使用する。この段階で、全tRNAプールの量は、2％w / vアガロースゲル上での電気泳動によって評価することができる。第2のステップは、分子種に応じてRNA種を分離するゲルろ過クロマトグラフィーを組み込む。 254 nmでのUVトレースを使用して分離をモニターし、主要な溶出ピークを同定します（ 図1上）。ピーク画分の代表的なアリコートを分析のために2％w / vアガロースゲル上に流した（ 図1の 下 ）。大部分のtRNA分子は、クロマトグラフィー操作（ここでは、120mLのベッドサイズのカラムで75.5mL）の単一ピーク（中央）で共溶出する。単一の過剰発現種（tRNA（UUU）など）を含むプールを分離する場合、プール中のtRNA分子の90％以上がその特定のtRNAに属し、残りの分子は天然に豊富なtRNAに対応する。二次ピークは、tRNA含有中心ピークの前後に観察される。これまでのピークは、部分的に分解されたより大きなRNA分子（画分26および32; 図1の棒）および精製操作の終わりのピークは、非常に小さなRNAおよび混入物を含む（画分45および51; 図1のバー）。画分を中央ピークの下にプールした後（画分39〜43; UV分光法によって、および/または2％w / vアガロースゲル上での分子サイズ標準との比較によって、精製tRNAの量を定量することができる（ 図1の棒）。 TcdAおよびtRNA（UUU）サンプルは、半対数サンプリングスキーム（ 表1 ）を用いて1.0〜10.0の異なるモル比で混合し、2％w / vアガロースゲル（ 図2 ）で分離することができます。タンパク質-tRNA複合体の安定性および結合の化学量論に依存して、1つまたはいくつかのバンドをゲル上に可視化することができる。 TcdA-tRNA（UUU）では、タンパク質とtRNAの両方を含む単離されたバンドとして走る化学量論的複合体が形成される。典型的には、遊離tRNAはより速く移動し、ゲルの底で観察され得るが、より負に荷電しにくく、サイズがより大きいタンパク質-tRNA複合体はより遅く移行する傾向がある。 図2は、<html> TcdA-tRNA（UUU）複合体の2％w / vアガロースゲルを用いた。 図2では、TcdAのみおよびtRNAのみのバンドが陰性対照として機能する。 TcdA：tRNA（UUU）のモル比が増加するにつれて、遊離tRNAバンドを犠牲にして形成されたTcdA-tRNA（UUU）複合体の量が増加する。遊離tRNAの強度は、TcdAの量が増加するにつれて減少することに留意されたい。形成される第1の複合体は、TcdA二量体あたり1つのtRNA分子を含む2：1の化学量論的複合体である（10,20または30μMのTcdAを有するレーンで見ることができる）。 TcdA飽和度では、TcdAサブユニットの両方がそれぞれ1つのtRNA（UUU）分子に結合した2：2の化学量論的複合体を含む、より大きな分子量のTcdA-tRNA（UUU）複合体が発達する（30,50または75μM）。 TcdA（50または75μM）を有する最後の2つのレーンは、反応中のすべてのtRNAに結合し、遊離tRNAバンドを欠いている。 tp_upload / 55638 / 55638fig1.jpg &quot;/&gt; 図1：ゲルろ過によるtRNA（UUU）の精製。 254nmで記録した高分解能分取ゲル濾過カラムでのtRNA（UUU）のゲル濾過のクロマトグラム（上）。 tRNA（UUU）が豊富なtRNAプールを含む最高ピークは約75.5mLで溶出されます。種々のtRNA溶出画分のアリコートを用いて2％w / vアガロースゲル（底部）を流した。 M、分子サイズはしご。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55638/55638fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55638/55638fig2.jpg" /> 図2：TcdAおよびtRNA（UUU）を用いたゲル遅延アッセイ。 EMSAは、TcdAへのtRNAの物理的結合の証拠を提供する。試料を2％w / vアガロースゲル上で4℃で90分間泳動させた。一定量のtRNA（UUU）、7.5μlMを可変量のTcdAと混合し（ 表1参照）、電気泳動の実行中にタンパク質-tRNA複合体を分離した。ゲルを染色し、UVトランスイルミネーターで視覚化した。各レーンは5μLのサンプルを含む。 M、分子サイズはしご。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55638/55638fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

アガロースゲル遅延アッセイによるtRNA（UUU）の産生および酵素TcdAとの複合体におけるtRNA（UUU）の分析のためのプロトコールが提示される。

タンパク質分析のためのタンパク質tRNAアガロースゲルリターデーションアッセイ<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; - スルホニルカルバモイルアデノシンTcdA機能

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

protein-trna-agarose-gel-retardation-assays-for-analysis-n6

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

9.7K ビュー.  Spanish National Research Council (CSIC). アガロースゲル遅延アッセイによるtRNA（UUU）の産生および酵素TcdAとの複合体におけるtRNA（UUU）の分析のためのプロトコールが提示される。 

ビデオ: Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical probe that targets the enzyme&#39;s active sites. A reporter tag introduced into the probe allows for the detection of the labeled enzyme by in-gel fluorescence scanning, protein blot, fluorescence microscopy, or liquid chromatography-mass spectrometry. Here, we describe the preparation and use of the compound ARN14686, a click chemistry activity-based probe (CC-ABP) that selectively recognizes the enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA). NAAA is a cysteine hydrolase that promotes inflammation by deactivating endogenous peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-alpha agonists such as palmitoylethanolamide (PEA) and oleoylethanolamide (OEA). NAAA is synthesized as an inactive full-length proenzyme, which is activated by autoproteolysis in the acidic pH of the lysosome. Localization studies have shown that NAAA is predominantly expressed in macrophages and other monocyte-derived cells, as well as in B-lymphocytes. We provide examples of how ARN14686 can be used to detect and quantify active NAAA ex vivo in rodent tissues by protein blot and fluorescence microscopy.

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Here, we describe the preparation and use of an activity-based probe (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oxoazetidin-3-yl]carbamate) that allows for the detection and quantification of the active form of the proinflammatory enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA), both in vitro and ex vivo.

調製と<em&gt;インビボ</em&gt;アクティビティベースのプローブの使用のために<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine酸アミダーゼ

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

生化学

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of the three most common causes of death from parasitic disease. The agent of amebiasis is the amoeba parasite Entamoeba histolytica that exists under two stages: the infective cyst found in food or water and the invasive trophozoite living in the intestine. The clinical manifestations of amebiasis range from being asymptomatic to colitis, dysentery or liver abscesses. E. histolytica is one of the rare unicellular parasite with 5-methylcytosine (5mC) in its genome. 1, 2 It contains a single DNA methyltransferase, Ehmeth, that belongs to the Dnmt2 family. 2 A role for Dnmt2 in the control of repetitive elements has been established in E. histolytica, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 and Drosophila. 6 Our recent work has shown that Ehmeth methylates tRNAAsp, and this finding indicates that this enzyme has a dual DNA/tRNAAsp methyltransferase activity. 7 This observation is in agreement with the dual activity that has been reported for D. discoideum and D. melanogaster. 8 The functional significance of the DNA/tRNA specificity of Dnmt2 enzymes is still unknown. To address this question, a method to determine the tRNA methyltransferase activity of Dnmt2 proteins was established. In this video, we describe a straightforward approach to prepare an adequate tRNA substrate for Dnmt2 and a method to measure its tRNA methyltransferase activity.

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 Ehmeth Enzyme

This protocol describes the preparation of a synthetic tRNA substrate for the Entamoeba histolytica DNA/tRNA methyltransferase 2 (Dnmt2) homolog Ehmeth and the measure of its methyltransferase activity. This experimental approach can be used for investigating the activity of other Dnmt2 proteins.

赤痢アメーバのDNAとtRNAメチルトランスフェラーゼDnmt2（Ehmeth）酵素を用いたin vitro tRNAのメチル化アッセイに

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of ...

免疫・感染学

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase activity. Although TERT is named as a reverse transcriptase, structural and phylogenetic analyses of TERT demonstrate that TERT is a member of right-handed polymerases, and relates to viral RNA-dependent RNA polymerases (RdRPs) as well as viral reverse transcriptase. We firstly identified RdRP activity of human TERT that generates complementary RNA stand to a template non-coding RNA and contributes to RNA silencing in cancer cells. To analyze this non-canonical enzymatic activity, we developed RdRP assay with recombinant TERT in 2009, thereafter established in vitro RdRP assay for endogenous TERT. In this manuscript, we describe the latter method. Briefly, TERT immune complexes are isolated from cells, and incubated with template RNA and rNTPs including radioactive rNTP for RdRP reaction. To eliminate single-stranded RNA, reaction products are treated with RNase I, and the final products are analyzed with polyacrylamide gel electrophoresis. Radiolabeled RdRP products can be detected by autoradiography after overnight exposure.

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) synthesizes not only telomeric DNA but also double-stranded RNA through RNA-dependent RNA polymerase activity. Here, we describe a newly established assay to detect RNA-dependent RNA polymerase activity of endogenous TERT.

テロメラーゼ逆転写酵素蛋白質の RNA 依存 RNA ポリメラーゼ活性の半定量的な検出

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

遺伝学

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these epigenetic marks is accomplished by sequential oxidation by ten-eleven translocation dioxygenases (TET1-3), followed by the thymine-DNA glycosylase-dependent base excision repair. Inactivation of the TET2 gene due to genetic mutations or by other epigenetic mechanisms is associated with a poor prognosis in patients with diverse cancers, especially hematopoietic malignancies. Here, we describe an efficient single step purification of enzymatically active untagged human TET2 dioxygenase using cation exchange chromatography. We further provide a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) approach that can separate and quantify the four normal DNA bases (A, T, G, and C), as well as the four modified cytosine bases (5-methyl, 5-hydroxymethyl, 5-formyl, and 5-carboxyl). This assay can be used to evaluate the activity of wild type and mutant TET2 dioxygenases.

Here, we present a protocol for an efficient single step purification of the active untagged human ten-eleven translocation-2 (TET2) 5-methylcytosine dioxygenase using ion-exchange chromatography and its assay using a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)-based approach.

10-11 転流 2 5-メチルシトシン ジオキシゲナーゼの LC MS/MS による分析法の開発や効率的に精製

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

TRNA イソペンテニル トランスフェラーゼ活性を検出する体外の試金

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.

RNAメチルトランスフェラーゼ活性分析のための抗体フリーアッセイ

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic macrocycles that exhibit differential cytostatic and cytotoxic properties in specific cell lines, depending on the identities of the chelated metal and functional groups. The unique behavior of functionalized corroles towards specific cell lines introduces the possibility of targeted chemotherapy.
Many anticancer drugs are evaluated by their ability to inhibit RNA transcription. Here we present a step-by-step protocol for RNA transcription in the presence of known and potential inhibitors. The evaluation of the RNA products of the transcription reaction by gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy provides information on inhibitive properties of potential anticancer drug candidates and, with modifications to the assay, more about their mechanism of action.
Little is known about the molecular mechanism of action of corrole cytotoxicity. In this experiment, we consider two corrole compounds: gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (Ga(tpfc)) and freebase analogue 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (tpfc). An RNA transcription assay was used to examine the inhibitive properties of the corroles. Five transcription reactions were prepared: DNA treated with Actinomycin D, triptolide, Ga(tpfc), tpfc at a [complex]:[template DNA base] ratio of 0.01, respectively, and an untreated control.
The transcription reactions were analyzed after 4 hr using agarose gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy. There is clear inhibition by Ga(tpfc), Actinomycin D, and triptolide.
This RNA transcription assay can be modified to provide more mechanistic detail by varying the concentrations of the anticancer complex, DNA, or polymerase enzyme, or by incubating the DNA or polymerase with the complexes prior to RNA transcription; these modifications would differentiate between an inhibition mechanism involving the DNA or the enzyme. Adding the complex after RNA transcription can be used to test whether the complexes degrade or hydrolyze the RNA. This assay can also be used to study additional anticancer candidates.

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole and its freebase analogue exhibit low micromolar cell cytotoxicity. This manuscript describes an RNA transcription reaction, imaging RNA with an ethidium bromide-stained gel, and quantifying RNA with UV-Vis spectroscopy, in order to assess transcription inhibition by corroles and demonstrates a straightforward method of evaluating anticancer candidate properties.

アン<em&gt;インビトロ</em&gt;酵素アッセイは、ガリウム（III）とHによる転写阻害を測定する<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15トリス（ペンタフルオロフェニル）corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

生物工学

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

ヌクレオカプシドアニーリング媒介電気泳動（NAME）アッセイは、HIV-1ヌクレオカプシド阻害剤の迅速な同定を可能にする

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent advancements in CD spectroscopy have enabled the study of DNA-protein interactions and conformational dynamics of DNA in different microenvironments in detail for a better understanding of transcriptional regulation in vivo. The area around a potential transcription zone needs to be unwound for transcription to occur. This is a complex process requiring the coordination of histone modifications, binding of the transcription factor to DNA, and other chromatin remodeling activities. Using CD spectroscopy, it is possible to study conformational changes in the promoter region caused by regulatory proteins, such as ATP-dependent chromatin remodelers, to promote transcription. The conformational changes occurring in the protein can also be monitored. In addition, queries regarding the affinity of the protein towards its target DNA and sequence specificity can be addressed by incorporating mutations in the target DNA. In short, the unique understanding of this sensitive and inexpensive method can predict changes in chromatin dynamics, thereby improving the understanding of transcriptional regulation.

The interaction of an ATP-dependent chromatin remodeler with a DNA ligand is described using CD spectroscopy. The induced conformational changes on a gene promoter analyzed by the peaks generated can be used to understand the mechanism of transcriptional regulation.

DNA-タンパク質相互作用を研究するためのCD分光法

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and lifespan. In addition, telomerase protects the mitochondria from oxidative stress and confers resistance to apoptosis, suggesting its possible importance for the surviving of non-mitotic, highly active cells such as neurons. We previously demonstrated the ability of novel telomerase activators to increase telomerase activity and expression in the various mouse brain regions and to protect motor neurons cells from oxidative stress. These results strengthen the notion that telomerase is involved in the protection of neurons from various lesions. To underline the role of telomerase in the brain, we here compare the activity of telomerase in male and female mouse brain and its dependence on age. TRAP assay is a standard method for detecting telomerase activity in various tissues or cell lines. Here we demonstrate the analysis of telomerase activity in three regions of the mouse brain by non-denaturing protein extraction using CHAPS lysis buffer followed by modification of the standard TRAP assay.
In this 2-step assay, endogenous telomerase elongates a specific telomerase substrate (TS primer) by adding TTAGGG 6 bp repeats (telomerase reaction). The telomerase reaction products are amplified by PCR reaction creating a DNA ladder of 6 bp increments. The analysis of the DNA ladder is made by 4.5% high resolution agarose gel electrophoresis followed by staining with highly sensitive nucleic acid stain.
Compared to the traditional TRAP assay that utilize 32P labeled radioactive dCTP&#39;s for DNA detection and polyacrylamide gel electrophoresis for resolving the DNA ladder, this protocol offers a non-toxic time saving TRAP assay for evaluating telomerase activity in the mouse brain, demonstrating the ability to detect differences in telomerase activity in the various female and male mouse brain region.

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.

タンパク質分析のためのタンパク質tRNAアガロースゲルリターデーションアッセイ

要約

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調製と

赤痢アメーバのDNAとtRNAメチルトランスフェラーゼDnmt2（Ehmeth）酵素を用いたin vitro tRNAのメチル化アッセイに

テロメラーゼ逆転写酵素蛋白質の RNA 依存 RNA ポリメラーゼ活性の半定量的な検出

10-11 転流 2 5-メチルシトシンジオキシゲナーゼの LC MS/MS による分析法の開発や効率的に精製

TRNA イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を検出する体外の試金

RNAメチルトランスフェラーゼ活性分析のための抗体フリーアッセイ

アン

ヌクレオカプシドアニーリング媒介電気泳動（NAME）アッセイは、HIV-1ヌクレオカプシド阻害剤の迅速な同定を可能にする

DNA-タンパク質相互作用を研究するためのCD分光法

マウス脳のさまざまな領域におけるテロメラーゼ活性：非放射性テロメラーゼリピート増幅プロトコル（TRAP）アッセイ

タンパク質分析のためのタンパク質tRNAアガロースゲルリターデーションアッセイ

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調製と

赤痢アメーバのDNAとtRNAメチルトランスフェラーゼDnmt2（Ehmeth）酵素を用いたin vitro tRNAのメチル化アッセイに

テロメラーゼ逆転写酵素蛋白質の RNA 依存 RNA ポリメラーゼ活性の半定量的な検出

10-11 転流 2 5-メチルシトシン ジオキシゲナーゼの LC MS/MS による分析法の開発や効率的に精製

TRNA イソペンテニル トランスフェラーゼ活性を検出する体外の試金

RNAメチルトランスフェラーゼ活性分析のための抗体フリーアッセイ

アン

ヌクレオカプシドアニーリング媒介電気泳動（NAME）アッセイは、HIV-1ヌクレオカプシド阻害剤の迅速な同定を可能にする

DNA-タンパク質相互作用を研究するためのCD分光法

マウス脳のさまざまな領域におけるテロメラーゼ活性：非放射性テロメラーゼリピート増幅プロトコル（TRAP）アッセイ

10-11 転流 2 5-メチルシトシンジオキシゲナーゼの LC MS/MS による分析法の開発や効率的に精製

TRNA イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を検出する体外の試金