Este método pode responder a perguntas sobre química de proteínas e descoberta de medicamentos, como quais condições estabilizam uma proteína? Quais mutações afetam a termoestabilidade de uma enzima? E quais ligantes se ligam a um alvo proteico?
As principais vantagens desta técnica são que ela é rápida, facilmente realizada em um laboratório padrão, e perfeitamente adequada para aplicações de médio a alto rendimento. Para preparar a amostra de proteína, transfira 10 microliters de cada condição de uma tela de estabilidade para o poço correspondente de uma placa de poço 96 usando uma pipeta multicanal para economizar tempo. Em seguida, prepare um mililitro de aproximadamente um miligrama por solução de proteína mililitro em um sistema tampão apropriado.
Se realizar um ensaio de mudança térmica, adicione corante de laranja SYPRO à amostra de proteína a uma concentração final de 20X. Misture por inversão ou um breve vórtice. Agora transfira 10 microliters da solução proteica para cada poço da placa 96.
Velou e centrífuga a placa de 96 poços por dois minutos a 600 vezes G para garantir que a amostra de proteína e o componente da tela sejam misturados. Resseque a tela de estabilidade no fundo do poço e armazene a tela a quatro graus Celsius por até quatro meses. Para realizar o experimento TSA, abra a gaveta de amostras pressionando firmemente o travessão no lado direito da gaveta.
Coloque a bandeja 96 bem no sistema RTPCR com bem A-one para a parte de trás esquerda. Clique no novo botão de experimento para começar a configurar um experimento TSA. Na guia Propriedades do experimento, clique na opção Curva de derretimento quando perguntado, que tipo de experimento você deseja configurar?
Em seguida, clique na outra opção quando perguntado, quais reagentes você deseja usar para detectar a sequência de destino? Na configuração de placa, defina alvos e amostras, digite um nome de destino e, em seguida, defina Repórter como ROX. E quencher como Nenhum.
Na configuração de placa, atribua alvos e amostras, selecione o corante para usar como referência passiva como Nenhum. Na mesma guia, atribua todos os poços da placa 96 ao nome de destino inserido na etapa anterior. Na guia Método executar, exclua etapas até que haja um total de três.
Defina o primeiro passo para 25 graus Celsius, com uma velocidade de 100% e tempo de cinco segundos. Defina o segundo passo para 95 graus Celsius, com uma taxa de rampa de 1% e tempo de um minuto. Por fim, defina o terceiro passo para o 95º grau Celsius com uma velocidade de 100% e tempo de cinco segundos.
Escolha coletar dados usando o menu de coleta de dados suspensos ou clicando no ícone de coleta de dados. Ajuste o volume de reação por poço para 20 microliters. Clique no botão Iniciar execução para iniciar o experimento TSA.
NanoDSF pode ser usado para sondar a estabilidade térmica proteica sem o uso de corantes extrínsecos. As amostras podem ser preparadas em 96 placas de poço, como descrito anteriormente no protocolo, mas sem adicionar qualquer corante laranja SYPRO. Abra a gaveta de amostras pressionando o botão Gaveta Aberta.
Certifique-se de que o equipamento está limpo, jogando especial atenção para qualquer poeira perto do rack de amostra. Se o sistema tiver espelho de dispersão de volta limpe-o usando etanol e um tecido livre de fiapos. Carregue os capilares com aproximadamente 10 microliters de cada poço da placa do poço 96 tocando uma extremidade do capilar na solução.
E, em seguida, coloque o capilar nos suportes capilares correspondentes do rack de amostra. Tenha cuidado para não contaminar o meio dos capilares com impressões digitais, pois isso poderia interferir com leituras de fluorescência durante todo o experimento. Imobilize os capilares com uma tira de vedação magnética.
Inicie uma varredura preliminar para detectar a posição e intensidade de cada capilar pressionando o botão Iniciar a varredura de descoberta na guia Discovery Scan. Aumente ou diminua a força de excitação incidente de uma potência inicial de 10% até que o pico de cada varredura capilar seja entre 4.000 e 12.000 unidades. Na guia Melting Scan, uma varredura de derretimento, definindo a opção Inclinação de temperatura para 7,0 graus por minuto.
Temperatura inicial a 25 graus Celsius. E temperatura final a 95 graus Celsius. Em seguida, inicie o experimento nanoDSF pressionando o botão Iniciar o Derretimento.
Repita estas etapas para preparar as amostras para um experimento completo. Uma vez configurado o experimento completo, navegue até a guia Melting Scan e programe uma varredura de derretimento, definindo a opção Inclinação de temperatura para 1,0 graus Celsius por minuto. Temperatura inicial a 25 graus Celsius.
E temperatura final a 95 graus Celsius. Finalmente, inicie o experimento nanoDSF pressionando o botão Iniciar o Derretimento. T m é usado como medida quantitativa de estabilidade térmica proteica em um benchmark para comparar a favorabilidade de diferentes condições.
Aqui são mostrados resultados amostrais da tela salgada, exemplificando as propriedades estabilizadoras térmicas do cloreto de amônio em direção à lisozyme. A comparação dos valores T m de lysozyme com a tela de pH revela que o acordo entre TSA e nanoDSF é geralmente bom, mas nanoDSF mostra uma tendência a identificar valores T m ligeiramente mais altos em turnos T m ligeiramente maiores do que o TSA. Há uma tendência geral de aumento da estabilidade com a diminuição dos valores de pH.
A gama de valores T m obtidos usando diferentes sistemas tampão com valores de pH idênticos pode ser significativa. Para combinações de lysozyme de condições que produzem os maiores valores TSA T m de cada tela de estabilidade foram testadas para sondar para um efeito combinado sinérgico. Há um aumento geral nos valores de T m à medida que mais componentes do sistema tampão são adicionados.
Um afeto sinérgico perceptível pode ocorrer quando os componentes individuais de um buffer são otimizados e combinados com as telas de estabilidade. Seguindo esta técnica, outros métodos como a cristalização podem ser usados para determinar a estrutura tridimensional de uma proteína e desvendar a base molecular para ligação de ligantes. Além de fornecermos uma visão sobre a estabilidade da proteína como parte do projeto Virus-X, esta técnica é aplicável a uma ampla gama de sistemas de descoberta e desenvolvimento de medicamentos.
