Nos gustaría agradecer a Kaisa Ikkala por su invaluable asistencia técnica y ayuda perspicaz cuando actualizándose en este método, así como más tarde durante la aplicación a nuestras preguntas de investigación central. También queremos agradecer al centro de animales de laboratorio y Anna Meller por su ayuda con la planificación de las directrices de la labor veterinaria.

Todos los experimentos son aprobados por la Junta Nacional experimento animal.
1. preparaciones
<ol><li>Preparar todas las soluciones y guardar en temperatura ambiente, salvo indicación en contrario. Siga las regulaciones de eliminación de residuos a disponer utilizada materiales y soluciones.</li>
	<li>Uso NMRI y ICR marginado las existencias, entre 4-12 semanas de edad y sexo. Si se utiliza la cepa C57BL/6, siga el método de preparación de ketamina-medetomidina en paso 1.3.2. Para otras medidas, siga las instrucciones descritas en 1.3.3.-1.3.5.</li>
	<li>Preparar la medicina veterinaria fresco y a tiempo antes de iniciar la operación. Carprofeno se utilizará más adelante, así no es necesario preparar en este momento.<ol>
<li>0,375 mL de la mezcla para preparar una solución de medetomidina ketamina para la anestesia, (stock concentración 50 mg/mL) de ketamina (Ketaminol veterinario) con 0.25 mL (concentración de la madre 1 mg/mL) de medetomidina (Cepetor veterinario) y añadir 1,25 mL de estéril 0,9% NaCl. Administrar 0.15 mL/20 g de peso del ratón (7.5 mg/kg y 1 mg/kg, medetomidina y ketamina).</li>
		<li>0,375 mL de la mezcla para preparar una solución más diluida de medetomidina ketamina para la anestesia en ratones C57BL/6, (stock concentración 50 mg/mL) de ketamina con 0.25 mL (concentración de la madre 1 mg/mL) de medetomidina y añadir 2,5 mL de estéril 0,9% NaCl. Administrar 0.15 mL/20 g de peso del ratón (3.75 mg/kg y 0,5 mg/kg de medetomidina y ketamina). Nota: Este es un paso alternativo, sólo para adultos ratones C57BL/6.</li>
		<li>Para preparar buprenorfin analgesia, Añadir 0,1 mL (concentración madre 0,3 mg/mL) de buprenorfin a 1,9 mL de estéril 0,9% NaCl. Administrar 0,2 mL/20 g de peso del ratón (0,15 mg/kg).</li>
		<li>Para preparar atipamezole para descontinuar la anestesia, Añadir 0,1 mL (archivo de concentración 5 mg/mL) de atipamezole a 4,9 mL de 0.9% NaCl. Administrar 0.15 mL/20 g de peso del ratón (0,75 mg/kg).</li>
		<li>Para la analgesia durante la postanestesia usar carprofeno. Añadir 0,1 mL (archivo de concentración 50 mg/mL) de carprofeno a 4,9 mL de 0.9% NaCl. Administrar 0.15 mL/20 g de peso del ratón (7.5 mg/kg).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar la solución de tinción fluorescente<ol>
<li>Para la visualización de la abrasión bajo la luz azul cobalto (figura 1), utilice una solución fluorescente. Preparar una solución de fluoresceína 0.1% primera medición 10 mg de sal de fluoresceína con una escala fina y luego agregar a 10 mL en solución salina tamponada con fosfato (PBS).</li>
		<li>Proteger la solución de fluoresceína de la luz y agitar durante 5 minutos en un agitador. Nota: La solución de fluoresceína es sensible a la luz; mantener la solución de cubierta de la luz. Esta solución se puede conservar de + 4 ° C durante 2-3 días. Para el uso, es útil para la solución de fluoresceína en un gotero que se usa para las gotas. Utilice un filtro estéril al pasar la solución a la botella del cuentagotas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Limpie la punta de fresa ocular antes y después de su uso; primero con el PBS y luego con el 70% EtOH. Si hace una abrasión a varios ratones durante la misma operación, siga los pasos de limpieza entre cada ratón.</li>
	<li>Poner la placa calentada en el (+ 37 ° C) y coloque una toalla de papel en él.</li>
</ol>2. corneal abrasión
PRECAUCIÓN: Use ropa protectora (bata, guantes) cuando manejo de ratones. Pesar el ratón para calcular el volumen del medicamento a administrar.
<ol><li>Utilice el método de scruffing una mano para manejar el ratón23. Administrar la mezcla de ketamina-medetomidina por vía intraperitoneal (i.p.) a la izquierda parte inferior del abdomen. Coloque el ratón en una jaula individual y esperar a dormirse. Esto normalmente toma menos de 5 minutos. Entonces, administrar buprenorfin primero y luego atipamezole mediante inyecciones i.p.. Utilice la misma técnica de manipulación. Nota: Una vez que se da la anestesia, el protocolo debe no ser pausado en cualquier momento.</li>
	<li>Antes de continuar, compruebe que la placa caliente es caliente. Coloque el ratón anestesiado en la placa de calefacción. El nivel de la anestesia es buena si está ausente el reflejo de la cola, pero el reflejo del dedo del pie está presente. Comprobar estos reflejos pellizcando la cola y cualquier dedo del pie con los dedos o pinzas. No use fuerza excesiva. Anestesia será durante 20-25 minutos.</li>
	<li>Para crear una abrasión, use las rebabas ocular limpia. Gire la base de las rebabas para activar la vibración que es imprescindible hacer la abrasión. Sentir la vibración en la mano, cuando la fresa está funcionando correctamente.<ol>
<li>Abrir un ojo a la vez manteniendo los párpados por separado con los dedos. Entonces firmemente tocar las rebabas a la córnea y mover el instrumento hacia adelante y hacia atrás así como hacia los lados en la superficie ocular. La vibración de la fresa realiza el cero; no presione, agitar o rasgar la córnea. En la córnea central, 20 movimientos en la superficie de abrasión son suficientes para inducir la herida. No levante las rebabas y tratar de permanecer en la región de la córnea para ser desgastado. Adquirir una abrasión de tamaño estándar se requieren varias rondas de práctica.</li>
	</ol>
 Nota: Se logra antes de abrasión Corneal asepsia utilizando betadine solución oftálmica.</li>
</ol>3. la proyección de imagen la abrasión
<ol><li>Se ilumina la región erosionada utilizando fluoresceína solución y luz de pluma azul cobalto (figura 1). La superficie ocular aparece descolorida en la luz ambiental. Después de la aplicación de fluoresceína, la región erosionada aparece en verde cuando se ilumina el ojo con el lápiz de luz.<ol>
<li>Si es necesario, abra los ojos desgastados semejantemente como en 2.3 y administrar una gota de solución de fluoresceína desde el frasco cuentagotas. Lave el ojo una vez con PBS o 0.9% NaCl para reducir el fondo de la fluoresceína. Use un gotero o una pipeta para el lavado. Aspirar el líquido, con una toallita suave y limpia las pestañas, si es necesario. El exceso de líquido se recoge generalmente la frontera nasal del ojo, cerca de la abertura del canal lagrimal. PRECAUCIÓN: Evite tocar la córnea al suplemento como abrasiones menores podrían ser inducidas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tome fotos de la abrasión corneal.<ol>
<li>Para obtener imágenes similares durante cada sesión de imagen, herramientas accesorio constante para la luz de la pluma azul cobalto y la cámara (figura 2). Este protocolo proporciona una instalación fácil de repetir (figura 2).<ol>
<li>Para colocar la luz de la pluma y la cámara, utilice una lámpara de mesa con un brazo flexible y abrazadera y un brazo de cámara ajustable con una pinza, respectivamente. Atadura de cables el lápiz a la lámpara de mesa y la posición justo por encima de los ojos de ratón. Posicionamiento diferente la luz puede alterar la visualización de la abrasión. Una sugerencia para el posicionamiento de estas herramientas se describe en la figura 2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilice la cámara SLR para tomar fotografías del ojo. Coloque el animal en una distancia deseada y la posición y el enfoque la cámara (1:12) en la luz de la habitación. Después de eso, cerca de todas las luces excepto la luz de la pluma azul cobalto. Nota: La manija ligera de pluma de la cinta hacia abajo o utilizar una banda elástica para mantener la luz en todo el tiempo durante la proyección de imagen. Esto podría ayudar si la imagen se vuelve borrosa. Es más fácil llevar a cabo la etapa de proyección de imagen con un colega.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. despertar después de abrasión Corneal
<ol><li>Administrar buprenorfin primero y luego atipamezole mediante inyecciones i.p.. Utilice la misma técnica de manipulación como en 2.1.</li>
	<li>Coloque una gota de ungüento de ojo ácido antibacteriano, fucidin (Isathal) a los ojos desgastados y no desgastado para hidratar y mantener la superficie ocular limpio de bacterias después de la anestesia.</li>
	<li>Como el ratón se despertará en 5-20 minutos en la placa de calefacción, observar el ratón durante el período de reactivación Post-anestésico. Cuando se convierte en móvil, coloque en una jaula individual. Nota: Si despertar lleva más tiempo, coloque el ratón en la jaula con una almohadilla caliente o colocar la jaula entera en el plato caliente y supervisar regularmente el ratón. Mientras que la anestesia desaparece, el ratón típicamente sacude y llega hacia arriba con el cuerpo anterior. Este comportamiento debe volver a la normalidad en 3-4 horas y luego se puede colocar el ratón a una jaula compartida.</li>
	<li>Administrar carprofen i.p. para el ungüento de analgesia y el ojo en dos días consecutivos después de la abrasión, semejantemente como en los pasos 2.2. y 4.2.</li>
</ol>5. la proyección de imagen durante la cicatrización de heridas
<ol><li>En este protocolo, tiempo de uso puntos 18 h y 72 h después de la abrasión para observar el cierre de la herida.<ol>
<li>Imagen consecutiva, anestesiar los ratones como explicado en 2.2.</li>
		<li>Tomar fotografías como se explica en 3.</li>
		<li>Despertar de los animales con atipamezole i.p. y supervisar del periodo como se explica en 4.3. Nota: Si no continuar con el seguimiento, eutanasia el ratón después de 5.1.2. Eutanasia se describe en 6.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. córnea colección e inclusión en parafina
<ol><li>Después del último punto de tiempo, sacrificar el animal. Coloque el ratón en una cámara que puede estar llena de CO2. Llenan el aire de la cámara de CO2. Cuando el animal está inmóvil, dislocarse las vértebras cervicales tirando firmemente de la base de la cola y presionando la región del cuello al mismo tiempo. PRECAUCIÓN: Siempre seguir las directrices del cuerpo de protección de los animales locales.</li>
	<li>Recoger el globo ocular entero cortando una abertura en la piel al lado del ojo con las tijeras de disección. Colocar las tijeras en el globo ocular y cortar el nervio ocular para el globo ocular fuera de la órbita. Usar pinzas si el ojo no sale fácilmente.<ol>
<li>Hacer un agujero en la parte posterior del ojo, del lado de retina, con una aguja de 26G para permitir la libre penetración de soluciones dentro del ojo. Nota: No deje que el ojo se convierten en seco, en cambio, colocar en PBS hasta continuar con el protocolo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recoger el globo ocular en un tubo de 2 mL con PBS. No hacer una pausa en el experimento en este momento.</li>
	<li>Quite la PBS y globos oculares en paraformaldehído al 4% (PFA) de + 4 ° C durante 4-5 horas.</li>
	<li>Mover el globo ocular fijo a una cinta de tejido para el proceso de tejido. Utilice un pañuelo de procesamiento de la máquina y el siguiente programa:<ol>
<li>Lavar con PBS.</li>
		<li>Incubar 2 x 45 min en etanol al 70% a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar h 2 x 1 en 94% de etanol a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar 3 x 45 min en etanol absoluto a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar 3 x 1 h en xileno, a temperatura ambiente y xileno pasado a 37 ° C.</li>
		<li>Incubar 3 x 1 h en parafina a 60 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de proceso de tejido, incorporar el globo ocular en parafina líquida (+ 60 ° C) usando un bloque de inclusión de tejidos. Colocar el ojo dentro del bloque de modo que mira hacia los lados y el borde periférico es hacia arriba. Que el bloque de solidificar en un plato fresco de 5 a 10 minutos.</li>
</ol>7. parafina secciones de la córnea
<ol><li>Preparar el microtomo para el seccionamiento según instrucciones de la institución o del fabricante. PRECAUCIÓN: Tenga cuidado al manipular la cuchilla de micrótomo sharp.</li>
	<li>Lugar un baño María con agua ultrapura a temperatura ambiente al lado del microtomo y otro con agua ultrapura calientan a 50 ° C.</li>
	<li>Hacer secciones de 5 μm espesor del globo ocular. Nota: La lente se rompe fácilmente durante el seccionamiento. Para evitar esto, limpie la superficie con un paño húmedo cada vez que se inicia una nueva fila de secciones de corte. Utilizar agua para humedecer el tejido.</li>
	<li>Ponga las secciones al lado de uno al otro en el baño de agua temperatura ambiente y luego moverlos a la bañera de agua caliente con la ayuda de un portaobjetos de vidrio. Se extienden las secciones en el baño de agua caliente hasta relajación todas las arrugas y el mate de las secciones se convierten.</li>
	<li>Secar los portaobjetos de vidrio con secciones durante la noche a + 37 ° C.</li>
	<li>Coloque las secciones de las diapositivas manteniendo el portaobjetos durante 1 minuto en un plato caliente en + 60 ° C. Después de esto, las secciones pueden ser directamente procesadas para la coloración de immunohistological métodos o almacenadas a + 4 ° C.</li>
</ol>

<ol>
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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K14+++Compound+niches+are+present+on+the+mouse+cornea+early+after+birth+and+expand+after+debridement+wounds.">K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds.</a> Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).</li><li>Boote, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Assessment+of+Ultrastructure+and+Light+Scatter+in+Mouse+Corneal+Debridement+Wounds.">Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (6), 2786 (2012).</li><li>Pal-Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP9+cleavage+of+the+&#946;4+integrin+ectodomain+leads+to+recurrent+epithelial+erosions+in+mice.">MMP9 cleavage of the &#946;4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).</li><li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+the+study+of+recurrent+corneal+epithelial+erosions:+alpha9beta1+integrin+implicated+in+progression+of+the+disease.">A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hería los métodos son herramientas populares para estudiar diferentes aspectos de la homeostasis de la córnea y patologías. El modelo de abrasión ofrece un método bien-controlado para hacer frente a problemas relevantes en Oftalmología. Sin embargo, ciertos puntos críticos en el protocolo son destacar. En particular, los detalles descritos en relación con la medicina veterinaria, herida curativa línea de tiempo y resultado están optimizados para el uso con cepas NMRI y ICR exogámica, pero pueden variar entre cepas de ratones26. Con este protocolo, los animales experimentales permanece anestesiados durante aproximadamente 20 minutos. Esto da una ventana corta pero suficiente tiempo para llevar a cabo la abrasión. Sin embargo, al usar las rebabas del ocular, la abrasión del sí mismo es una operación muy rápida y debe ser posible realizar en este período de tiempo.
Fácil y accesible la visualización es una de las principales ventajas del modelo de abrasión. Combinado con métodos de biología molecular, esto abre posibilidades para el estudio de las células epiteliales con gran detalle. Córnea erosionada puede ser procesado histológico o inmunológicos tinción de y proteínas o ácidos nucleicos puede ser recogidos y examinados aún más. Pajoohesh-Ganji et al. demostró que el gen patrones de expresión en el cambio de células epiteliales corneales con insulto córnea con una cuchilla rasgunõs27. Para asegurar el muestreo controlado, le recomendamos que imágenes de las abrasiones se toman inmediatamente después de la operación y colecciones muestra siguen exactamente los plazos previstos.
Este protocolo tiene usos más allá de la examinación de epitelización corneal. Por ejemplo, la abrasión del limbus córneo, el nicho de células madre de la córnea, puede utilizarse para el estudio de la dinámica de la célula de vástago7. Demostró que la región no desgastado del epitelio seguían siendo normal durante el proceso de curación, sin embargo algunos autores afirman que la membrana del sótano y del subyacente keratocytes stromal se ven afectados por el ocular las rebabas24,28. La eliminación de la membrana basal se puede estimar con la tinción de la membrana basal específica. Además, repetidas abrasiones sobre una línea de tiempo más largo podrían revelar interesantes patrones curativos. En este protocolo, no observamos la arquitectura del epitelio sobre una persecución a largo plazo. Ambos desafilar bisturí y lesiones oculares burr han demostrado una mayor incidencia de erosiones corneales después de una a varias semanas después de lesión24,29,30. Esto debe tener en cuenta cuando se utiliza el modelo de abrasión para estudios a largo plazo. Sin embargo, estudios centrados en erosiones corneales pueden interesar este protocolo.
Otros modelos hiriente se describen largamente por Stepp et al. en revisión5. Juntos, este protocolo y los enfoques existentes ofrecen opciones versátiles para examinar tanto cuestiones biológicas fundamentales, así como problemas clínicos prácticos.

Las capas epiteliales de numerosos órganos están expuestas a lesiones. Sin embargo, también contienen la capacidad de compensar la pérdida de tejido por medio de la cicatrización de heridas. La córnea ofrece un excelente modelo para estudiar la cicatrización de heridas. Forma la superficie externa del ojo y proporciona una capa protectora para la delicada maquinaria ocular. Así, la córnea funciona como una barrera física frente a patógenos y la pérdida de agua. Se compone de tres capas; epitelio, estroma y endotelio. El epitelio de la córnea es la capa más externa de la córnea. Las células epiteliales mantienen la función barrera de la córnea adhiriéndose estrictamente entre sí mediante uniones estrechas1,2,3. Membrana córnea acelular de la basal, la membrana de Bowman, separa el epitelio del estroma extensa, que contiene keratocytes refractaria. En el estroma, las células endoteliales canal de nutrientes, agua y oxígeno a la capa superior.
Abrasiones corneales son muy comunes en la clínica4. Lesiones en la córnea son diversas, pero en gran parte son causadas por pequeñas partículas como polvo o arena, arañazos u otros objetos extraños. El protocolo aquí había descrito pretende reproducir un tipo clínico de abrasión epitelial corneal. De esta manera, este protocolo proporciona un método controlable y seminal para los médicos y científicos corneales aplicar en sus estudios. Hemos realizado un ensayo de reparación en vivo lesiones en la córnea murina por causar lesiones en el tejido con una fresa rasgunõs ocular, el Algerbrush II. Aquí apuntamos la abrasión sólo al epitelio corneal central y dejar las otras partes del órgano sin daño. Así, el protocolo es ideal para el estudio de la célula epitelial corneal dinámica o la membrana basal durante re-epithelialization, célula de la migración, proliferación y diferenciación en vivo5. Recientemente, este modelo se utilizó para analizar la dinámica de la célula progenitora en la córnea murina, así como para conocer la capacidad de las células epiteliales corneales diferenciadas en el restablecimiento del nicho de células madre corneales después de lesión6,7. Después de la abrasión, la córnea vuelve a su normal transparencia y resistencia a la tracción. Curiosamente, un estudio en vitro indicó que re-epithelialization ocurre sin creciente de la célula proliferación8. Este protocolo describe la línea de tiempo de curación sin interrupciones en la córnea de ratón. Así, el método es aplicable para probar el efecto de las drogas en patrones y la velocidad de cicatrización.
La córnea se ha utilizado extensivamente para estudios de heridas. Sin embargo, muchos estudios han dependido de otros modelos de la lesión. Un modelo bien establecido de lesión corneal es la quemadura alcalina que se realiza mediante la aplicación de hidróxido de sodio (NaOH) con o sin papel de filtro sobre la superficie corneal9. Exposición alcalina produce una lesión grande y difusa que no sólo afecta el epitelio corneal, sino también la conjuntiva y el tejido conectador9,10. Soluciones alcalinas fuertes han demostrado inducir neovascularización9, opacificación y úlceras corneales. Las células inflamatorias invaden el estroma normalmente dentro de las 6 h y permanecen allí hasta las 24 h11. Por lo tanto, alcalino es un método recomendable en estudios relacionados con la activación stromal. Otro tipo de daño químico puede ser infligida por aplicar dimetilsulfóxido (DMSO) en la córnea9,10. Otros modelos de lesiones comúnmente usados incluyen heridas incisionales que penetran a través de las heridas de tejido conectador y keratectomy, que se limitan a la parte superior del tejido conectador14,15. Estos métodos también son útiles para responder a preguntas sobre cicatrización estromal. Lesiones diferentes modelos tienen sus ventajas y desventajas. Abrasión o desbridamiento, del epitelio corneal se desarrolló inicialmente utilizando bisturís rasgunõs o cuchillas en vivo ex córneas16. Este método ha sido más tarde usado en vivo en el ratón, rata y conejo17,18,19,20,21,22. Con las rebabas del ocular (figura 1), quitamos sólo una región seleccionada del epitelio, dejando el resto del epitelio afectado. Esta manera, es posible orientar precisamente la supresión epitelial a diferentes partes de la córnea. Además, el tamaño de la abrasión puede ser evaluado con la tinción de fluoresceína. Además, aquí seguimos cierre de abrasión durante el período de cicatrización.
Este método presenta varias ventajas, i) incluyendo la localización exacta del sitio de la abrasión, que no es posible con lesión química, ii) la abrasión es rápida de realizar, y iii) es no invasivo. Adjunto, describimos el método utilizando el ratón NMRI exogámica como modelo, sin embargo esto podría aplicarse a la amplia gama de modelos genéticos del ratón, así como a la rata y el conejo, que son modelos comunes utilizados para estudiar la interrupción córnea humana.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NMRI mouse</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>use sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Vetmedic</td>
			<td>Vnr087896</td>
			<td>Market name: Cepetor Vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Intervet</td>
			<td>Vnr511485</td>
			<td>Market name: Ketaminol Vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorfin</td>
			<td>Invidior</td>
			<td>3015248</td>
			<td>Market name: Temgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezol</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td>Vnr471953</td>
			<td>Market name: Antisedan Vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>Vnr027579</td>
			<td>Market name: Norocarp Vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% fucidin acid eye ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>Vnr080899</td>
			<td>Market name: Isathal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip)</td>
			<td>Algerbrush</td>
			<td>6.39768E+11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt Blue pen light</td>
			<td>SP Services</td>
			<td>DE/003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Kunz Instruments</td>
			<td>2007-0217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital SLR camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable camera arm and clamp</td>
			<td>Neewer</td>
			<td>10086132</td>
			<td>Height 28 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table lamp with a flexible arm and a clamp</td>
			<td>Prisma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft wipe</td>
			<td>KimtechScience</td>
			<td>7552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection toolset</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needles</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>303800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue casette</td>
			<td>Sakura Finetech</td>
			<td>4118F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processing machine ASP200S</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>UN1307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>K95523361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm</td>
			<td>Sakura Finetech</td>
			<td>4123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Microm</td>
			<td>HM355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath for sectioning</td>
			<td>Orthex</td>
			<td>60591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath for sectioning</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HI1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>S35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Th.Geyer GmbH &#38; Co.</td>
			<td>7,695,019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MPGP04001</td>
			<td>MilliQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>PFA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing

La córnea murina ofrece un excelente modelo para estudiar la cicatrización de heridas. La córnea es la capa más externa del ojo y es la primera defensa a la lesión. De hecho, el tipo más común de lesión de ojo encontrado en clínica es una abrasión corneal. Aquí, utilizamos un ocular burr para inducir una abrasión, resultando en la eliminación del epitelio corneal en vivo sobre ratones anestesiados. Este método permite la interrupción epitelial específica y reproducible, dejando otras áreas intactas. Además, describimos la visualización del epitelio erosionada con tinción de fluoresceína y proporcionar consejos concretos sobre cómo visualizar la córnea erosionada. Luego, seguimos la línea de tiempo de cicatrización 0, 18 y 72 h después de la abrasión, hasta que la herida es re-epithelialized. El modelo de abrasión epitelial de la lesión corneal es ideal para los estudios sobre proliferación de células epiteliales, la migración y la reepitelización de las capas corneales. Sin embargo, este método no es óptimo para estudiar la activación estroma durante la cicatrización de heridas, porque las rebabas del ocular no penetran a las capas de células estromales. Este método también es adecuado para aplicaciones clínicas, por ejemplo, pre-clínica prueba de eficacia de la droga.

Este protocolo describe un modelo para infligir una lesión de abrasión en la córnea de ratón y sugiere cómo seguir y visualizar el proceso de curación después de la abrasión. Recientemente, se empleó este método para estudiar el papel de células progenitoras epiteliales corneales durante6de cicatrización. El uso de herramientas establecidas es la clave para un experimento exitoso de la abrasión. Nosotros y otros, hemos utilizado las rebabas ocular Algerbrush II (figura 1) para realizar las abrasiones6,7,24. Esta herramienta tiene una punta rasgunõs rebabas de 0,5 mm de tamaño que cepillos en lugar de taladros o tijeras el epitelio corneal ausente. Así, esta herramienta es la opción recomendada para una lesión de abrasión en la córnea.
Una parte central de este modelo es que la región afectada puede visualizarse sin esfuerzo en los intervalos deseados. En la Figura 3A, se presenta el uso de fluoresceína tinción en combinación con una fuente de luz azul cobalto (figura 1) para visualizar el sitio de abrasión. En este experimento, se realizó una gran herida en la córnea central y dejó la córnea periférica intacta (Figura 3A). Además, había desgastado sólo el ojo izquierdo de cada ratón y mantienen el ojo derecho, bilateral como un control no desgastado. Las muestras oculares bilaterales seguían siendo negativas para señal de fluoresceína, que sugiere que no se someten a cualquier pérdida de la célula durante el experimento y así la función así como muestras de control. Sin embargo, la señal verde en los bordes del ojo muestra la solución de fluoresceína que acumuló en la ensambladura entre el ojo y el párpado. La abrasión es mayor a 0 h, inmediatamente después de la lesión (Figura 3A). Era notablemente más pequeño después de 18 h y, en este caso, se encuentra cerca de la frontera superior del ojo. Sin embargo, el epitelio cierra la región expuesta a una velocidad igual de todos lados de la abrasión. En particular, en 72 h, las heridas, no hay señal verde era visible. Esto indica que el epitelio corneal fue completamente re-epithelialized por 72 h después de la abrasión.
Con este método, nos encaminadas a centrarse la abrasión solamente en el epitelio corneal, por lo que las capas más profundas de la córnea intacta. La eliminación del epitelio corneal era evidente de secciones histológicas en la figura 3B. A las 0 h, el borde de la abrasión se muestra como una repisa estrecha, acelular que es continua de forma regular, epitelio corneal gruesas capas de la célula 4-5. Limbus, borde periférico del epitelio corneal, presenta una región de ejemplo que no fue afectada por la abrasión en la línea de tiempo experimental todo (72 h). Además, las secciones histológicas indican que las capas más profundas de la córnea, el estroma y el endotelio, no fueron perjudicados por las rebabas del ocular. Estos dos tejidos parecían similares en muestras de ojos desgastados y bilateral. En poste-lesión de 18 h, el proceso de curación es activo y re-epithelialization está llevando a cabo. Esto fue sugerido por la aparición de una vanguardia. La vanguardia contiene sólo 1-2 capas de células epiteliales y abarca la región expuesta antes de que la estratificación puede ocurrir25. En consonancia con los resultados en la Figura 3A, la superficie fue completamente re-epithelialized por 72 h, cuando los frentes migratorios habían cubierto la herida y una vez más estuvieron presentes todas las capas epiteliales. Las secciones histológicas del ojo bilateral confirman (Figura 3A) que los ojos de control permanecieron intactos durante el período de observación.
Por último, proporcionamos evidencia que el modelo de abrasión se limita al epitelio corneal y no invocar una respuesta estromal a lesiones, tales como neovascularization. La figura 4 muestra la córnea murina a las 18 h después de la abrasión. Basado en la visión macroscópica, este momento no se mostraban una respuesta estromal, lo que indica que nuestro protocolo no interrumpa las capas más profundas de la córneas. En comparación, una lesión alcalina con 0,75 mol/L NaOH inmediatamente inducida por neovascularización en el estroma. Dada la neovascularización rápida en lesiones alcalino, los puntos del tiempo en nuestro método de proporcionan pruebas para descartar la posibilidad de respuesta en el tejido conectador.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58071/58071fig1.jpg"> Figura 1: herramientas esenciales para abrasión epitelial corneal. La izquierda es una vibrante rebabas ocular. La luz de la pluma azul cobalto en la derecha se utiliza para la tinción con fluoresceína visible. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58071/58071fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58071/58071fig2.jpg"> Figura 2: imagen de la abrasión corneal. (A) herramientas para la proyección de imagen son un brazo de cámara ajustable con abrazadera (izquierda), la cámara SLR (centro) y una lámpara de mesa con brazo flexible y abrazadera (derecha). La luz de la pluma azul cobalto está ligada a la cúpula de la lámpara con dos bridas. (B) una visión general de la configuración de imagen; la distancia de cada herramienta de Unión está marcada en la imagen en cm. Dos pinzas son 6 cm de la placa de calor y el ratón se coloca 10 cm de distancia del borde de la placa de calor. (C) un vistazo a la imagen de abrasión con propuesta distancia y posición en el ojo de ratón en cm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58071/58071fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58071/58071fig3.jpg"> Figura 3: detección y localización de la abrasión corneal. Ojos de ratón (A) en 0, 18 y 72 h después de la abrasión. Señal de fluoresceína marca la región erosionada en verde brillante, mientras que todas las demás regiones en el epitelio permanecen oscuras. Ojos bilaterales sirven como controles. Línea punteada marca los bordes de la herida y la mancha blanca en cada ojo, es el reflejo de la cámara. (B) histológico seccionadas y hematoxilina y eosina tinción muestras de los ojos de ratón en 0, 18 y 72 h después de la abrasión. Limbo es la frontera que rodea el epitelio corneal por todos los lados. Astérix marca el borde de la abrasión. Barra de escala es 100 μm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58071/58071fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58071/58071fig4.jpg"> Figura 4: abrasión Corneal no activar una estroma respuesta. Exposición alcalina con 0,75 mol/L NaOH seguido de irrigación con 0.9% NaCl produce neovascularización de la córnea (ojo recogido inmediatamente después del tratamiento). Abrasión con las rebabas ocular no muestra neovascularización incluso después de 18 h. abrasión sitio es marcado con una línea discontinua. La escala de la barra 1 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58071/58071fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Cicatrización de heridas de abrasión epitelial corneal con rebabas Ocular como un modelo de córnea

Este protocolo describe un método para causar una abrasión en la superficie ocular del ratón y seguir la herida en proceso de curación después de eso. El protocolo aprovecha de una ocular rebabas a eliminar parcialmente el epitelio de superficie del ojo en ratones anestesiados.

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

corneal-epithelial-abrasion-with-ocular-burr-as-model-for-cornea

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

20.2K vistas.  University of Helsinki. Este protocolo describe un método para causar una abrasión en la superficie ocular del ratón y seguir la herida en proceso de curación después de eso. El protocolo aprovecha de una ocular rebabas a eliminar parcialmente el epitelio de superficie del ojo en ratones anestesiados.

Video: Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are administered 1. This uniqueness has made the cornea pocket assay one of the most used models for angiogenesis studies. The cornea composes multiple layers of cells. It is therefore possible to embed a pellet containing the angiogenic factor of interest in the cornea to investigate its angiogenic effect 2,3. Here, we provide a step by step demonstration of how to (I) produce the angiogenic factor-containing pellet (II) embed the pellet into the cornea (III) analyze the angiogenesis induced by the angiogenic factor of interest. Since the basic fibroblast growth factor (bFGF) is known as one of the most potent angiogenic factors 4, it is used here to induce angiogenesis in the cornea.

The cornea is unique in that it lacks vascular tissues. However, robust blood vessel growth and survival can be induced in the cornea by potent angiogenic factors. Therefore, the cornea can provide with us a valuable tool for angiogenic studies. This protocol demonstrates how to perform the mouse model of cornea pocket assay and how to assess the angiogenesis induced by angiogenic factors using this model.

Un modelo de ratón de la Prueba de bolsillo para el Estudio de la angiogénesis de córnea

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Investigación

Medicina

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

Modelo murino de Curación de Heridas

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The etiology of IBD remains unknown and current therapeutic strategies are based on the unspecific suppression of the immune system. The development of treatments that specifically target intestinal inflammation and epithelial wound healing could significantly improve management of IBD, however this requires accurate detection of inflammatory changes. Currently, potential drug candidates are usually evaluated using animal models in vivo or with cell culture based techniques in vitro. Histological examination usually requires the cells or tissues of interest to be stained, which may alter the sample characteristics and furthermore, the interpretation of findings can vary by investigator expertise. Digital holographic microscopy (DHM), based on the detection of optical path length delay, allows stain-free quantitative phase contrast imaging. This allows the results to be directly correlated with absolute biophysical parameters. We demonstrate how measurement of changes in tissue density with DHM, based on refractive index measurement, can quantify inflammatory alterations, without staining, in different layers of colonic tissue specimens from mice and humans with colitis. Additionally, we demonstrate continuous multimodal label-free monitoring of epithelial wound healing in vitro, possible using DHM through the simple automated determination of the wounded area and simultaneous determination of morphological parameters such as dry mass and layer thickness of migrating cells. In conclusion, DHM represents a valuable, novel and quantitative tool for the assessment of intestinal inflammation with absolute values for parameters possible, simplified quantification of epithelial wound healing in vitro and therefore has high potential for translational diagnostic use.

Accurate assessment of anti-inflammatory effects is of utmost importance for the evaluation of potential new drugs for the treatment of inflammatory bowel disease. Digital holographic microscopy provides assessment of inflammation in murine and human colonic tissue samples as well as automated multimodal evaluation of epithelial wound healing in vitro.

Multimodal Fase cuantitativa de imágenes con Digital holográfica Microscopía evaluación exacta de la inflamación intestinal Curación de heridas y epitelial

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients with impeded blood flow or with large wounds might be prolonged. Cell-based therapies have appeared as a new technique for the treatment of diabetic ulcers, and cell-sheet engineering has improved the efficacy of cell transplantation. A number of reports have suggested that adipose-derived stem cells (ASCs), a type of mesenchymal stromal cell (MSC), exhibit therapeutic potential due to their relative abundance in adipose tissue and their accessibility for collection when compared to MSCs from other tissues. Therefore, ASCs appear to be a good source of stem cells for therapeutic use. In this study, ASC sheets from the epididymal adipose fat of normal Lewis rats were successfully created using temperature-responsive culture dishes and normal culture medium containing ascorbic acid. The ASC sheets were transplanted into Zucker diabetic fatty (ZDF) rats, a rat model of type 2 diabetes and obesity, that exhibit diminished wound healing. A wound was created on the posterior cranial surface, ASC sheets were transplanted into the wound, and a bilayer artificial skin was used to cover the sheets. ZDF rats that received ASC sheets had better wound healing than ZDF rats without the transplantation of ASC sheets. This approach was limited because ASC sheets are sensitive to dry conditions, requiring the maintenance of a moist wound environment. Therefore, artificial skin was used to cover the ASC sheet to prevent drying. The allogenic transplantation of ASC sheets in combination with artificial skin might also be applicable to other intractable ulcers or burns, such as those observed with peripheral arterial disease and collagen disease, and might be administered to patients who are undernourished or are using steroids. Thus, this treatment might be the first step towards improving the therapeutic options for diabetic wound healing.

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Adipose-derived stem cells (ASCs) are easily isolated and harvested from the fat of normal rats. ASC sheets can be created using cell-sheet engineering and can be transplanted into Zucker diabetic fatty rats exhibiting full-thickness skin defects with exposed bone and then covered with a bilayer of artificial skin.

Creación y el transplante de una hoja de células madre derivadas de adiposo (ASC) en un modelo de curación de herida diabética

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is often capped with biocompatible materials in order to expedite pulpal wound healing. The ultimate goal is to regenerate reparative dentin, a physical barrier that functions as a "biological seal" and protects the underlying pulp tissue. Although this direct pulp-capping procedure has long been used in dentistry, the underlying molecular mechanism of pulpal wound healing and reparative dentin formation is still poorly understood. To induce reparative dentin, pulp capping has been performed experimentally in large animals, but less so in mice, presumably due to their small sizes and the ensuing technical difficulties. Here, we present a detailed, step-by-step method of performing a pulp-capping procedure in mice, including the preparation of a Class-I-like cavity, the placement of pulp-capping materials, and the restoration procedure using dental composite. Our pulp-capping mouse model will be instrumental in investigating the fundamental molecular mechanisms of pulpal wound healing in the context of reparative dentin in vivo by enabling the use of transgenic or knockout mice that are widely available in the research community.

We describe a step-by-step method of performing direct pulp capping on mice teeth for the evaluation of pulpal wound healing and reparative dentin formation in vivo.

Desarrollo de un Modelo de recubrimiento pulpar directo para la Evaluación de la Pulpa Curación de Heridas y formación de dentina reparadora en ratones

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated experimental procedures, while potentially lacking in precision. In vitro culture of epithelial cell lines provides a suitable platform for researching the cell migratory behavior in wound healing and the impact of treatments on these cells. The physiology of epithelial cells is often studied in non-confluent conditions; however, this approach may not resemble natural wound healing conditions. Disrupting the epithelium integrity by mechanical means generates a realistic model, but may impede the application of molecular techniques. Consequently, microscopy based techniques are optimal for studying epithelial cell migration in vitro. Here we detail two specific methods, the artificial wound scratch assay and the artificial migration front assay, that can obtain quantitative and qualitative data, respectively, on the migratory performance of epithelial cells.

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

This manuscript describes how incision-like lesions made on cultured epithelial cell monolayers conveniently model wound healing in vitro, allowing for imaging by confocal or laser scanning microscopy, and which can provide high-quality quantitative and qualitative data for studying both cell behavior and the mechanisms involved in migration.

Métodos basados en microscopía para la evaluación de la migración de células epiteliales durante la cicatrización de la herida In Vitro

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two dimensional (2D) and three dimensional (3D) culture has generated a wealth of information not only about corneal biology but also about wound healing, myofibroblast biology, and scarring in general. The goal of the protocol is an assay system for quantifying myofibroblast development, which characterizes scarring. We demonstrate a corneal organ culture ex vivo model using pig eyes. In this anterior keratectomy wound, corneas still in the globe are wounded with a circular blade called a trephine. A plug of approximately 1/3 of the anterior cornea is removed including the epithelium, the basement membrane, and the anterior part of the stroma. After wounding, corneas are cut from the globe, mounted on a collagen/agar base, and cultured for two weeks in supplemented-serum free medium with stabilized vitamin C to augment cell proliferation and extracellular matrix secretion by resident fibroblasts. Activation of myofibroblasts in the anterior stroma is evident in the healed cornea. This model can be used to assay wound closure, the development of myofibroblasts and fibrotic markers, and for toxicology studies. In addition, the effects of small molecule inhibitors as well as lipid-mediated siRNA transfection for gene knockdown can be tested in this system.

A protocol for an ex vivo corneal organ culture model useful for wound healing studies is described. This model system can be used to assess the effects of agents to promote regenerative healing or drug toxicity in an organized 3D multicellular environment.

Ex Vivo modelo de cultura órgano córneo para la curación de heridas estudios

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Targeting Gray Rami Communicantes in Selective Chemical Lumbar Sympathectomy

Chemical lumbar sympathectomy (CLS) is a commonly used, minimally invasive procedure for the treatment of conditions including ischemic diseases of the lower extremities, hyperhidrosis, etc. It is commonly practiced to position the puncture needle tip in front of the anterior fascia of the psoas major muscle and inject the inactivating agent around the sympathetic trunk, which is defined as conventional CLS. Although relatively rare, ureteropelvic damage is the most frequently reported complication of conventional CLS and can cause serious harm to patients. We found that injecting the inactivating agent behind the anterior fascia, which only targets gray rami communicantes, helped achieve therapeutic efficacy in&#160;vasodilation, sweat reduction, and pain relief comparable to conventional CLS, and serious complications were largely reduced. We define this procedure as selective CLS. Here, we present a protocol of selective CLS. The precise needle tract and accurate evaluation of the spreading of the contrast agent are critical to ensure that the drug is injected behind the anterior fascia of the psoas major muscle. The needle tip is at approximately one-third the dividing line of the vertebral body in the lateral view of a lumbar X-ray. The contrast is mainly confined around the needle tip and spreads outward and downward along the psoas muscle fibers. In this way, the anterior fascia provides a natural barrier for the ureteropelvic area, and the psoas major muscle provides a natural barrier for the lumbar nerve root. There are several highlights of this article, including 1) a detailed description of the selective CLS procedures, 2) an explanation of the anatomical basis for the implementation of selective CLS, and 3) an explanation of the differences between selective and conventional CLS.

We present a protocol for selective chemical lumbar sympathectomy (CLS), which inactivates only gray rami communicantes and not the sympathetic trunk. Selective CLS can help achieve therapeutic efficacy in vasodilation, sweat reduction, and pain relief that are comparable to conventional CLS, and serious complications, particularly ureteropelvic damages, can be reduced.

Targeting Communicantes grises del Rami en Sympathectomy Lumbar químico selectivo

Chemical lumbar sympathectomy (CLS) is a commonly used, minimally invasive procedure for the treatment of conditions including ischemic diseases of the ...

A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for experimental investigations as they are normally needed for transplantation. Endothelial cell cultures often do not translate well to in vivo situations. Due to the biostructural characteristics of non-human corneas, stromal swelling during cultivation induces substantial corneal endothelial cell loss, which makes it difficult to perform cultivation for an extended period of time. Deswelling agents such as dextran are used to counteract this response. However, they also cause significant endothelial cell loss. Therefore, an ex vivo organ culture model not requiring deswelling agents was established. Pig eyes from a local slaughterhouse were used to prepare split corneal buttons. After partial corneal trephination, the outer layers of the cornea (epithelium, bowman layer, parts of the stroma) were removed. This significantly reduces corneal endothelial cell loss induced by massive stromal swelling and Descemet&#39;s membrane folding throughout longer cultivation periods and improves general preservation of the endothelial cell layer. Subsequent complete corneal trephination was followed by the removal of the split corneal button from the remaining eye bulb and cultivation. Endothelial cell density was assessed at follow-up times of up to 15 days after preparation (i.e., days 1, 8, 15) using light microscopy. The preparation technique used allows a better preservation of the endothelial cell layer enabled by less stromal tissue swelling, which results in slow and linear decline rates in split corneal buttons comparable to human donor corneas. As this standardized organo-typically cultivated research model for the first time allows a stable cultivation for at least two weeks, it is a valuable alternative to human donor corneas for future investigations of various external factors with regards to their effects on the corneal endothelium.

Here, a step-by-step protocol for the preparation and cultivation of porcine split corneal buttons is presented. As this organo-typically cultivated organ culture model shows cell death rates within 15 days, comparable to human donor corneas, it represents the first model allowing long-term cultivation of non-human corneas without adding toxic dextran.

Un modelo de cultivo de órgano endotelial Corneal porcino usando botones de córnea divididos

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for ...

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the optical breakdown at the laser focus. Acoustic shock waves and cavitation bubbles are generated, causing tissue rupture. Bubble sizes and pressure amplitudes vary with pulse energy and position of the focal point. In this study, enucleated porcine eyes were positioned in front of a commercially available Nd:YAG laser. Variable pulse energies as well as different positions of the focal spots posterior to the cornea were tested. Resulting lesions were evaluated by two-photon microscopy and histology to determine the best parameters for an exclusive detachment of corneal endothelial cells (CEC) with minimum collateral damage. The advantages of this method are the precise ablation of CEC, reduced collateral damage, and above all, the non-contact treatment.

Here, we present a protocol to detach corneal endothelial cells (CEC) from Descemet&#8217;s membrane (DM) using a neodymium:YAG (Nd:YAG) laser as an ex vivo disease model for bullous keratopathy (BK).

Desarrollo de un Modelo Experimental No Invasivo, Asistido por Láser de Pérdida Celular Endotelial Corneal

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...