Vorremmo ringraziare Kaisa Ikkala per la sua preziosa assistenza tecnica e aiuto perspicace quando sta attuando questo metodo e anche più tardi durante l'attuazione alle nostre domande di ricerca centrale. Vorremmo anche ringraziare il laboratorio Animal Center e Anna Meller per aiutarla con le linee guida del lavoro veterinario di pianificazione.

Tutti gli esperimenti sono approvati dal Consiglio nazionale esperimento sugli animali.
1. preparati
<ol><li>Tutte le soluzioni di preparare e tenere a temperatura ambiente, se non diversamente indicato. Seguire le normative sullo smaltimento dei rifiuti per dispose utilizzato materiali e soluzioni.</li>
	<li>Uso NMRI e ICR esogami scorte, fra 4-12 settimane di età e di entrambi i sessi. Se si utilizza il ceppo C57BL/6, seguire il metodo di preparazione di ketamina-medetomidina nel passaggio 1.3.2. Per altre fasi, seguire le istruzioni descritte in 1.3.3.-1.3.5.</li>
	<li>Preparare la medicina veterinaria fresco e in tempo prima di iniziare l'operazione. Carprofen verrà utilizzato in seguito, quindi non è necessario prepararlo a questo punto.<ol>
<li>Per preparare una soluzione di ketamina-medetomidina per anestesia, mescolare 0,375 mL (concentrazione di riserva 50 mg/mL) di ketamina (Ketaminol Vet) con 0,25 mL (concentrazione di riserva 1 mg/mL) di medetomidina (Cepetor Vet) e aggiungere 1,25 mL di sterile 0,9% NaCl. Amministrare 0,15 mL/20 g di peso del mouse (7,5 mg/kg, ketamina e 1 mg/kg, medetomidina).</li>
		<li>Per preparare una soluzione più diluita di ketamina-medetomidina per anestesia su topi C57BL/6, mescolare 0,375 mL (concentrazione di riserva 50 mg/mL) di ketamina con 0,25 mL (concentrazione di riserva 1 mg/mL) di medetomidina e aggiungere 2,5 mL di sterile 0,9% NaCl. Amministrare 0,15 mL/20 g di peso del mouse (3,75 mg/kg, ketamina e 0,5 mg/kg, medetomidina). Nota: Questo è un passo alternativo, solo per topi C57BL/6 adulti.</li>
		<li>Per preparare buprenorfin per analgesia, aggiungere 0,1 mL (stock concentrazione 0,3 mg/mL) di buprenorfin a 1,9 mL di sterile 0,9% NaCl. Amministrare il peso del mouse di 0,2 mL/20 g (0,15 mg/kg).</li>
		<li>Per preparare atipamezolo interrompendo l'anestesia, aggiungere 0,1 mL (concentrazione di riserva 5 mg/mL) di atipamezolo a 4,9 mL dello 0,9% NaCl. Amministrare il peso del mouse 0,15 mL/20 g (0,75 mg/kg).</li>
		<li>Per analgesia durante la post-anestesia utilizzare carprofen. Aggiungere 0,1 mL (concentrazione di riserva 50 mg/mL) di carprofen a 4,9 mL dello 0,9% NaCl. Amministrare 0,15 mL/20 g di peso del mouse (7,5 mg/kg).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare soluzione colorante fluorescente<ol>
<li>Per visualizzare l'abrasione sotto la luce blu cobalto (Figura 1), utilizzare una soluzione fluorescente. Preparare una soluzione di fluorescina di 0,1% di prima misura 10 mg di sale della fluorescina con una scala fine e quindi aggiungerlo a 10 mL di soluzione salina tampone fosfato (PBS).</li>
		<li>Proteggere la soluzione di fluorescina da luce e agitare per 5 minuti su un agitatore. Nota: La soluzione di fluorescina è sensibile alla luce; mantenere la soluzione coperta dalla luce. Questa soluzione può essere conservata a + 4 ° C per 2-3 giorni. Per l'uso, è utile posizionare la soluzione della fluorescina in una bottiglia contagocce che viene utilizzata per collirio. Utilizzare un filtro sterile-quando si sposta la soluzione per il flacone con contagocce.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pulire la punta di burr oculare prima e dopo l'uso; prima con PBS e poi con 70% EtOH. Se effettua un'abrasione ai topi diversi durante la stessa operazione, eseguire le fasi di pulizia tra ogni mouse.</li>
	<li>Mettere la piastra riscaldata su (+ 37 ° C) e posizionare un asciugamano di carta su di esso.</li>
</ol>2. corneale abrasione
Attenzione: Utilizzare abiti protettivi (guanti, camice da laboratorio) quando movimentazione topi. Pesare il mouse per stimare il volume di farmaco da somministrare.
<ol><li>Utilizzare il metodo scruffing con una sola mano per gestire il mouse23. Somministrare la miscela di ketamina-medetomidina intraperitonealmente (i.p.) all'addome inferiore sinistra. Posizionare il mouse a una gabbia individuale e aspettare che si addormenti. Questo richiede in genere meno di 5 minuti. Quindi, amministrare buprenorfin prima e poi atipamezolo via i.p. iniezioni. Utilizzare la stessa tecnica di movimentazione. Nota: Una volta che l'anestesia è dato, il protocollo non dovrebbe essere sospesa in qualsiasi momento.</li>
	<li>Prima di continuare, verificare che la piastra sia calda. Posizionare il mouse anestetizzato sulla piastra riscaldata. Il livello di anestesia è buono se il riflesso di coda è assente, ma il riflesso di punta è presente. Controllare questi riflessi pizzicando la coda e qualsiasi punta con le dita o pinze. Non applicare una forza eccessiva. L'anestesia sarà di 20-25 minuti.</li>
	<li>Per rendere un'abrasione, utilizzare la bava oculare pulita. Ruotare la base della bava per attivare la vibrazione che è essenziale per rendere l'abrasione. Sentite la vibrazione in mano, quando la bava sta funzionando correttamente.<ol>
<li>Aprire un occhio alla volta tenendo le palpebre separatamente con le dita. Quindi saldamente toccare la bava alla cornea e muoversi avanti e indietro anche lo strumento come lateralmente sulla superficie oculare. La vibrazione della bava si esibirà il gratta e Vinci; non premere, scuotere o strappare la cornea. Nella cornea centrale, 20 movimenti sulla superficie di abrasione sono sufficienti per indurre la ferita. Non sollevare la bava e cercare di rimanere nella regione di cornea per essere abrasa. L'acquisizione di un'abrasione dimensioni standard richiederà diversi giri di pratica.</li>
	</ol>
 Nota: Asepsi corneale possono essere ottenuto prima all'abrasione utilizzando betadine soluzione oftalmica.</li>
</ol>3. l'abrasione di imaging
<ol><li>Illuminare l'area abrasa utilizzando blu cobalto penna luce (Figura 1) e soluzione di fluorescina. La superficie oculare appare incolore in luce ambiente. Dopo l'applicazione della fluorescina, regione abrasa reagisce in verde quando illuminando l'occhio con la penna luminosa.<ol>
<li>Se necessario, aprire l'occhio abrasa similmente come 2.3 e amministrare una goccia della soluzione di fluorescina dal flacone con contagocce. Lavare l'occhio una volta con PBS o 0,9% NaCl per ridurre di fondo della fluoresceina. Utilizzare un contagocce o una pipetta per il lavaggio. Aspirare il liquido via con un panno morbido e pulire le ciglia, se necessario. Il liquido in eccesso si raccoglie solitamente al bordo nasale dell'occhio, vicino all'apertura del canale lacrima. Attenzione: Evitare di toccare la cornea mentre cleaining abrasioni minori potrebbero essere indotti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Scattare foto dell'abrasione cornea.<ol>
<li>Per ottenere immagini simili durante ogni sessione di imaging, è possibile utilizzare strumenti di attacco costante per la luce di penna blu cobalto e la fotocamera reflex (Figura 2). Questo protocollo fornisce un programma di installazione che è facile da ripetere (Figura 2).<ol>
<li>Per collegare la penna illuminante e la fotocamera, utilizzare una lampada da tavolo con un braccio flessibile e morsetto e braccio regolabile per una telecamera con un morsetto, rispettivamente. Fascetta di penna ottica per la lampada da tavolo e la posizione appena sopra l'occhio del mouse. Posizionamento la luce in modo diverso potrebbe alterare la visualizzazione dell'abrasione. Un suggerimento per il posizionamento di questi strumenti è descritto nella Figura 2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilizzare la fotocamera reflex per scattare foto dell'occhio. Metti l'animale in una distanza desiderata e la posizione e la messa a fuoco della fotocamera (01:12) in luce ambiente. Dopo di che, chiudere tutte le altre luci tranne la luce di penna blu cobalto. Nota: L'impugnatura della penna luce del nastro verso il basso o utilizzare un elastico per tenere la luce accesa tutto il tempo durante la formazione immagine. Questo potrebbe aiutare se l'immagine diventa sfocata. È più semplice di eseguire il passaggio di imaging con un collega.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. svegliarsi dopo abrasione corneale
<ol><li>Amministrare buprenorfin prima e poi atipamezolo via i.p. iniezioni. Utilizzare la stessa tecnica di movimentazione come in 2.1.</li>
	<li>Mettere una goccia di unguento acido occhio fucidin antibatterico, (Isathal) agli occhi sia abrasi e non-raspato per idratare e mantenere la superficie oculare pulito da batteri dopo l'anestesia.</li>
	<li>Come il mouse si sveglierà in 5-20 minuti sulla piastra riscaldata, osservare il mouse durante il periodo di risveglio post-anestetico. Quando diventa mobile, posto in una gabbia individuale. Nota: Se svegliarsi richiede più tempo, posizionare il mouse nella gabbia con un pad riscaldato o collocare l'intera gabbia sulla piastra riscaldata e monitorare regolarmente il mouse. Mentre l'anestesia svanisce, il mouse in genere scuote e raggiunge verso l'alto con il corpo anteriore. Questo comportamento dovrebbe tornare alla normalità in 3-4 ore e quindi è possibile inserire il mouse indietro per una gabbia condivisa.</li>
	<li>Amministrare il carprofen i.p. per analgesia e occhio unguento per due giorni consecutivi dopo l'abrasione, similmente come in passaggi 2.2. e 4.2.</li>
</ol>5. imaging durante la guarigione della ferita
<ol><li>In questo protocollo, tempo di utilizzo punti 18 e 72 h dopo abrasione ad osservare la chiusura della ferita.<ol>
<li>Per l'imaging consecutivi, anestetizzare i topi come spiegato al punto 2.2.</li>
		<li>Scattare foto come spiegato in 3.</li>
		<li>Sveglia gli animali con atipamezolo i.p. e monitorare il periodo di risveglio, come spiegato al punto 4.3. Nota: se non continuando il follow-up, eutanasia il mouse subito dopo 5.1.2. L'eutanasia è descritto in 6.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. cornea insieme e inclusione in paraffina
<ol><li>Dopo l'ultimo punto di tempo, il sacrificio dell'animale. Posizionare il mouse in una camera che può essere riempita con CO2. Riempiono l'aria di camera di CO2. Quando l'animale è immobile, slogare vertebre cervicali tirando con forza dalla base della coda e premendo la regione del collo verso il basso allo stesso tempo. Attenzione: Seguire sempre le linee guida del corpo locale benessere degli animali.</li>
	<li>Raccogliere l'intero bulbo oculare dal taglio di un'apertura nella pelle al lato dell'occhio con le forbici di dissezione. Mettere le forbici sotto il bulbo oculare e tagliare il nervo oculare per far comparire il bulbo oculare fuori orbita. Utilizzare pinze se l'occhio non esce facilmente.<ol>
<li>Fare un foro sulla parte posteriore dell'occhio, sul lato della retina, con un ago da 26G per consentire la penetrazione gratuito delle soluzioni all'interno dell'occhio. Nota: Non lasciare che l'occhio diventa secca, invece, posto in PBS fino continuando con il protocollo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Raccogliere il bulbo oculare in una provetta da 2 mL con PBS. Non mettere in pausa l'esperimento a questo punto.</li>
	<li>Rimuovere PBS e difficoltà bulbi oculari in paraformaldeide al 4% (PFA) a + 4 ° C per 4-5 ore.</li>
	<li>Spostare il bulbo oculare fisso su una videocassetta di tessuto per l'elaborazione del tessuto. Utilizzare un tessuto lavorazione macchina e il seguente programma:<ol>
<li>Risciacquare con PBS.</li>
		<li>Incubare 2 x 45 min in etanolo al 70% a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubare 2 x 1 h in etanolo al 94% a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubare 3 x 45 min in etanolo assoluto a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubare 3 x 1 h in xilene, a temperatura ambiente e ultimo xilene a 37 ° C.</li>
		<li>Incubare 3 x 1 h in cera di paraffina a 60 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo la lavorazione del tessuto, incorporare il bulbo oculare in paraffina liquida (+ 60 ° C) utilizzando un blocco di incorporamento del tessuto. Posto l'occhio all'interno del blocco in modo che esso sta osservando obliquamente e il bordo periferico è rivolto verso l'alto. Lasciate che il blocco solidificare su una piastra fredda per 5-10 minuti.</li>
</ol>7. paraffina sezioni della Cornea
<ol><li>Preparare il microtomo per il sezionamento secondo le istruzioni dell'istituzione o del produttore. Attenzione: Fare attenzione a maneggiare la lama tagliente del microtomo.</li>
	<li>Posto un bagnomaria con acqua ultrapura a temperatura ambiente al lato del microtomo e l'altra con acqua ultrapura riscaldata a + 50 ° C.</li>
	<li>Fare 5 µm spessore sezioni del bulbo oculare. Nota: La lente si rompe facilmente durante il sezionamento. Per evitare questo, pulire la superficie di taglio con un tessuto umido ogni volta che viene avviata una nuova fila di sezioni. Usare acqua di rubinetto per inumidire il tessuto.</li>
	<li>Inserire le sezioni accanto a altro nel bagno d'acqua temperatura ambiente e quindi spostarli la vasca di acqua calda con l'aiuto di un vetrino. Allungare le sezioni nel bagno acqua calda fino a quando tutte le pieghe e rilassarsi e il mascherino sezioni diventano.</li>
	<li>Asciugare i vetrini con le sezioni durante la notte a + 37 ° C.</li>
	<li>Collegare le sezioni per le diapositive tenendo il vetrino per 1 minuto su un piatto riscaldato a + 60 ° C. Dopo questo, le sezioni possono essere direttamente trattate per immunohistological metodi di colorazione, o conservate a + 4 ° C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yi, X., Wang, Y., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+epithelial+tight+junctions+and+their+response+to+lipopolysaccharide+challenge.">Corneal epithelial tight junctions and their response to lipopolysaccharide challenge.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 41 (13), 4093-4100 (2000).</li><li>Wang, Y., Chen, M., Wolosin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZO-1+In+Corneal+Epithelium;+Stratal+Distribution+and+Synthesis+Induction+by+Outer+Cell+Removal.">ZO-1 In Corneal Epithelium; Stratal Distribution and Synthesis Induction by Outer Cell Removal.</a> Experimental Eye Research. 57 (3), 283-292 (1993).</li><li>Sugrue, S. P., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZO1+in+Corneal+Epithelium:+Association+to+the+Zonula+Occludens+and+Adherens+Junctions.">ZO1 in Corneal Epithelium: Association to the Zonula Occludens and Adherens Junctions.</a> Experimental Eye Research. 64 (1), 11-20 (1997).</li><li>Jackson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+eye-pads+on+healing+of+simple+corneal+abrasions.">Effect of eye-pads on healing of simple corneal abrasions.</a> British Medical Journal. 2 (5200), 713 (1960).</li><li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals.">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).</li><li>Kalha, S., Shrestha, B., Sanz Navarro, M., Jones, K. B., Klein, O. D., Michon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1++Progenitor+Cell+Dynamics+in+Murine+Cornea+During+Homeostasis+and+Wound+Healing.">Bmi1+ Progenitor Cell Dynamics in Murine Cornea During Homeostasis and Wound Healing.</a> Stem Cells. , (2018).</li><li>Nasser, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal-Committed+Cells+Restore+the+Stem+Cell+Pool+and+Tissue+Boundary+following+Injury.">Corneal-Committed Cells Restore the Stem Cell Pool and Tissue Boundary following Injury.</a> Cell Reports. 22 (2), 323-331 (2018).</li><li>Kaplan, N., Fatima, A., Peng, H., Bryar, P. J., Lavker, R. M., Getsios, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA2/Ephrin-A1+Signaling+Complexes+Restrict+Corneal+Epithelial+Cell+Migration.">EphA2/Ephrin-A1 Signaling Complexes Restrict Corneal Epithelial Cell Migration.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (2), 936 (2012).</li><li>Bai, J. -. Q., Qin, H. -. F., Zhao, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+on+mouse+model+of+grade+II+corneal+alkali+burn.">Research on mouse model of grade II corneal alkali burn.</a> International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).</li><li>Chan, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+matrix+metalloproteinase-12+following+corneal+injury.">Protective effects of matrix metalloproteinase-12 following corneal injury.</a> Journal of Cell Science. 126, 3948-3960 (2013).</li><li>Byeseda, S. E., Burns, A. R., Dieffenbaugher, S., Rumbaut, R. E., Smith, C. W., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1+is+necessary+for+epithelial+recruitment+of+gammadelta+T+cells+and+efficient+corneal+wound+healing.">ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of gammadelta T cells and efficient corneal wound healing.</a> American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).</li><li>Amitai-Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Lineage+Tracing+of+Corneal+Cells+Using+Multi-color+Fluorescent+Reporter+Mice.">A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53370 (2015).</li><li>Amitai-Lange, A., Altshuler, A., Bubley, J., Dbayat, N., Tiosano, B., Shalom-Feuerstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+Tracing+of+Stem+and+Progenitor+Cells+of+the+Murine+Corneal+Epithelium.">Lineage Tracing of Stem and Progenitor Cells of the Murine Corneal Epithelium.</a> Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).</li><li>Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;V&#946;6+Integrin+Promotes+Corneal+Wound+Healing.">&#945;V&#946;6 Integrin Promotes Corneal Wound Healing.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 52 (11), 8505 (2011).</li><li>Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Thrombospondin-1+in+Repair+of+Penetrating+Corneal+Wounds.">Role of Thrombospondin-1 in Repair of Penetrating Corneal Wounds.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (9), 6262 (2013).</li><li>Gipson, I. K., Kiorpes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+sheet+movement:+Protein+and+glycoprotein+synthesis.">Epithelial sheet movement: Protein and glycoprotein synthesis.</a> Developmental Biology. 92 (1), 259-262 (1982).</li><li>Danjo, Y., Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+&amp;#34;purse+string&amp;#34;+filaments+are+anchored+by+E-cadherin-mediated+adherens+junctions+at+the+leading+edge+of+the+epithelial+wound,+providing+coordinated+cell+movement.">Actin &amp;#34;purse string&amp;#34; filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the epithelial wound, providing coordinated cell movement.</a> Journal of Cell Science. 111, 3323-3332 (1998).</li><li>Lyu, J., Joo, C. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt-7a+up-regulates+matrix+metalloproteinase-12+expression+and+promotes+cell+proliferation+in+corneal+epithelial+cells+during+wound+healing.">Wnt-7a up-regulates matrix metalloproteinase-12 expression and promotes cell proliferation in corneal epithelial cells during wound healing.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21653-21660 (2005).</li><li>Nagata, M., Nakamura, T., Hata, Y., Yamaguchi, S., Kaku, T., Kinoshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JBP485+promotes+corneal+epithelial+wound+healing.">JBP485 promotes corneal epithelial wound healing.</a> Science Reports. 5, 14776 (2015).</li><li>Stepp, M. A., Zhu, L., Cranfill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+beta+4+integrin+expression+and+localization+in+vivo+in+response+to+corneal+epithelial+injury.">Changes in beta 4 integrin expression and localization in vivo in response to corneal epithelial injury.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 37 (8), 1593-1601 (1996).</li><li>Stepp, M. A., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+alpha+9+integrin+and+tenascin+during+epithelial+regeneration+after+debridement+in+the+cornea.">Upregulation of alpha 9 integrin and tenascin during epithelial regeneration after debridement in the cornea.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 45 (2), 189-201 (1997).</li><li>Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BALB/c+and+C57BL6+mouse+strains+vary+in+their+ability+to+heal+corneal+epithelial+debridement+wounds.">BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds.</a> Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).</li><li>. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques Available from: <a target="_blank" href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques">https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques</a> (2018)</li><li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+the+basement+membrane+enhances+corneal+wound+healing.">Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing.</a> Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).</li><li>Suzuki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-matrix+and+cell-cell+interactions+during+corneal+epithelial+wound+healing.">Cell-matrix and cell-cell interactions during corneal epithelial wound healing.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 22 (2), 113-133 (2003).</li><li>Sato, Y., Seo, N., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+differences+between+FVB+and+C57BL/6+mice+affect+hypnotic+susceptibility+to+pentobarbital,+ketamine+and+nitrous+oxide,+but+not+isoflurane.">Genetic background differences between FVB and C57BL/6 mice affect hypnotic susceptibility to pentobarbital, ketamine and nitrous oxide, but not isoflurane.</a> Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 50 (5), 553-556 (2006).</li><li>Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K14+++Compound+niches+are+present+on+the+mouse+cornea+early+after+birth+and+expand+after+debridement+wounds.">K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds.</a> Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).</li><li>Boote, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Assessment+of+Ultrastructure+and+Light+Scatter+in+Mouse+Corneal+Debridement+Wounds.">Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (6), 2786 (2012).</li><li>Pal-Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP9+cleavage+of+the+&#946;4+integrin+ectodomain+leads+to+recurrent+epithelial+erosions+in+mice.">MMP9 cleavage of the &#946;4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).</li><li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+the+study+of+recurrent+corneal+epithelial+erosions:+alpha9beta1+integrin+implicated+in+progression+of+the+disease.">A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Metodi di ferimento sono popolari strumenti per studiare diversi aspetti dell'omeostasi cornea e patologie. Il modello di abrasione offre un metodo ben controllato per risolvere problemi rilevanti in Oftalmologia. Tuttavia, alcuni punti critici nel protocollo sono la pena sottolineare. In particolare, i dettagli descritti per quanto riguarda la medicina veterinaria, timeline di guarigione della ferita ed il risultato sono ottimizzati per l'uso con le scorte nazionali di NMRI e ICR, ma possono variare tra i ceppi di topi26. Con questo protocollo, gli animali sperimentali rimarrà anestetizzati per circa 20 minuti. Questo dà una finestra breve ma sufficiente di tempo per eseguire l'abrasione. Tuttavia, quando si utilizza la bava oculare, rendendo l'abrasione si è un'operazione molto rapida e dovrebbe essere possibile eseguire in questo lasso di tempo.
Facile e accessibile la visualizzazione è uno dei principali vantaggi del modello all'abrasione. In combinazione con metodi di biologia molecolare, questo apre la possibilità per studiare le cellule epiteliali in grande dettaglio. Abrasione cornee possono essere elaborate per istologico o immunologica macchiatura e proteine o acidi nucleici possono essere raccolti e ulteriormente esaminati. Pasculli-Giuffrida et al hanno mostrato quel gene espressione modelli nel cambiamento delle cellule epiteliali corneali all'insulto cornea con una lama smussate27. Per garantire il campionamento controllato, si consiglia di immagini di abrasioni sono presi immediatamente dopo l'operazione e campionari seguono esattamente le tempistiche previste.
Questo protocollo ha usi oltre l'esame di epithelialization corneale. Ad esempio, abrasione del limbus corneale, la nicchia delle cellule staminali della cornea, può essere utilizzate per studiare cellule staminali dinamiche7. Abbiamo mostrato che la regione non-raspato dell'epitelio sono rimanere normale durante il processo di guarigione, tuttavia alcuni autori sostengono che la membrana dello scantinato e il sottostante cheratociti stromali sono interessati dall'oculare Bava24,28. La rimozione della membrana dello scantinato può essere stimata con la macchiatura specifica della membrana dello scantinato. Inoltre, abrasioni ripetute nel corso di una sequenza temporale più lungo potrebbero rivelare interessanti modelli di guarigione. In questo protocollo, non abbiamo osservato l'architettura dell'epitelio nel corso di un inseguimento a lungo termine. Entrambi attenuarono il bisturi e lesioni oculari burr hanno mostrato un'aumentata incidenza di erosioni corneali dopo uno a parecchie settimane dopo la ferita24,29,30. Questo dovrebbe essere tenuto a mente quando si utilizza il modello di abrasione per studi a lungo termine. Tuttavia, studi focalizzati su erosioni corneali potrebbero trovare utile questo protocollo.
Altri modelli ferentesi sono descritti a lungo da Stepp, et al. , in una recensione5. Insieme a questo protocollo e gli approcci esistenti forniscono opzioni versatili per esaminare questioni biologiche fondamentali nonché problemi clinici pratici.

Strati epiteliali di numerosi organi sono esposti alle lesioni. Tuttavia, essi contengono anche la capacità di compensare la perdita di tessuto attraverso la guarigione della ferita. La cornea offre un eccellente modello per studiare la guarigione della ferita. Forma la superficie esterna dell'occhio e fornisce uno strato protettivo per il macchinario di oculare sensibile. In tal modo, cornea funziona come una barriera fisica per gli agenti patogeni e perdita di acqua. Si compone di tre strati; epitelio, stroma ed endotelio. L'epitelio della cornea costituisce lo strato più esterno della cornea. Cellule epiteliali mantengono la funzione di barriera della cornea aderendo strettamente tra loro attraverso giunzioni strette1,2,3. Una acellular della membrana dello scantinato cornea, membrana di Bowman, separa l'epitelio dallo stroma esteso, che contiene keratocytes refrattario. Sotto lo stroma, cellule endoteliali canale nutrienti, acqua e ossigeno allo strato superiore.
Abrasioni corneali sono molto comuni in clinica4. Lesioni alla cornea sono diverse, ma in gran parte sono causate da particelle piccole come polvere o sabbia, graffi o altri corpi estranei. Il protocollo qui descritto mira a riprodurre un tipo clinicamente rilevante di abrasione corneale epiteliale. In tal modo, questo protocollo fornisce un metodo controllabile e seminale per i medici e gli scienziati corneali implementare i propri studi. Abbiamo eseguito un test di riparazione del pregiudizio in vivo sulla cornea Murina da abrasione del tessuto con una bava oculare offuscato, il Algerbrush II. Qui, ci rivolgiamo l'abrasione solo all'epitelio cornea centrale e lasciare le altre parti dell'organo senza danni. Così, il protocollo è ideale per studio delle cellule epiteliali corneali dynamics o la membrana dello scantinato durante riepitelizzazione, cell migrazione, proliferazione e differenziamento in vivo5. Recentemente, questo modello è stato utilizzato per analizzare le dinamiche di cellule progenitrici nella cornea murina pure quanto a svelare la capacità delle cellule epiteliali corneale differenziate nel ristabilire la nicchia delle cellule staminali corneali dopo lesioni6,7. Dopo abrasione, la cornea torna alla sua normale trasparenza e resistenza alla trazione. Interessante, uno studio in vitro hanno indicato che riepitelizzazione avviene senza cellula aumentata proliferazione8. Questo protocollo descrive la sequenza temporale di guarigione senza interruzioni nella cornea murina. Il metodo è così applicabile per testare l'effetto delle droghe sulla guarigione modelli e velocità.
La cornea è stato ampiamente utilizzata per studi di cicatrizzazione. Tuttavia, molti studi hanno fatto affidamento su altri modelli della ferita. Un modello ben consolidato della lesione corneale è l'ustione alcalina che viene eseguita mediante l'applicazione di idrossido di sodio (NaOH) con o senza filtro di carta sulla superficie corneale9. L'esposizione alcalina provoca una ferita grande e diffusa che colpisce non solo l'epitelio corneale, ma anche la congiuntiva e lo stroma9,10. Soluzioni fortemente alcaline hanno dimostrati di indurre ulcere corneali, opacification e neovascolarizzazione9. Cellule infiammatorie invadono lo stroma in genere entro 6 ore e vi rimangono fino a 24 h11. Così, la ferita alcalina è un metodo consigliabile negli studi relazionati all'attivazione stromal. Un altro tipo di ferita chimica può essere inflitto applicando solfossido dimetilico (DMSO) sulla cornea9,10. Altri modelli di lesione comunemente usati includono ferite incisionale che penetrano attraverso le ferite keratectomy e stroma, che sono limitate alla parte superiore del stroma14,15. Questi metodi sono anche utili per rispondere a domande riguardanti la guarigione della ferita stromal. Modelli di diverse lesioni hanno i loro vantaggi e svantaggi. Abrasione o sbrigliamento, dell'epitelio corneale è stato sviluppato utilizzando offuscati bisturi o lame su ex vivo cornee16. Questo metodo è stato successivamente utilizzato in vivo sul topo, ratto e coniglio17,18,19,20,21,22. Utilizzando la bava oculare (Figura 1), togliamo solo un'area selezionata dell'epitelio, lasciando inalterato il resto dell'epitelio. In questo modo, è possibile indirizzare con precisione la rimozione epiteliale in diverse parti della cornea. Inoltre, la dimensione di abrasione è valutabile con la macchiatura della fluorescina. Inoltre, qui seguiamo chiusura abrasione durante il periodo di guarigione.
Questo metodo presenta diversi vantaggi, i) tra cui precisa posizione del sito di abrasione, che non è possibile con ferita chimica, ii) l'abrasione è veloce da eseguire, e iii) è non invasivo. Qui, descriviamo il metodo utilizzando il mouse NMRI nazionali come un modello, tuttavia questo potrebbe essere applicato per la vasta gamma di modelli genetici murini, così come per il ratto e coniglio, che sono comuni modelli usati per studiare la rottura cornea umana.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NMRI mouse</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>use sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Vetmedic</td>
			<td>Vnr087896</td>
			<td>Market name: Cepetor Vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Intervet</td>
			<td>Vnr511485</td>
			<td>Market name: Ketaminol Vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorfin</td>
			<td>Invidior</td>
			<td>3015248</td>
			<td>Market name: Temgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezol</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td>Vnr471953</td>
			<td>Market name: Antisedan Vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>Vnr027579</td>
			<td>Market name: Norocarp Vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% fucidin acid eye ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>Vnr080899</td>
			<td>Market name: Isathal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip)</td>
			<td>Algerbrush</td>
			<td>6.39768E+11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt Blue pen light</td>
			<td>SP Services</td>
			<td>DE/003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Kunz Instruments</td>
			<td>2007-0217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital SLR camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable camera arm and clamp</td>
			<td>Neewer</td>
			<td>10086132</td>
			<td>Height 28 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table lamp with a flexible arm and a clamp</td>
			<td>Prisma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft wipe</td>
			<td>KimtechScience</td>
			<td>7552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection toolset</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needles</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>303800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue casette</td>
			<td>Sakura Finetech</td>
			<td>4118F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processing machine ASP200S</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>UN1307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>K95523361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm</td>
			<td>Sakura Finetech</td>
			<td>4123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Microm</td>
			<td>HM355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath for sectioning</td>
			<td>Orthex</td>
			<td>60591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath for sectioning</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HI1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>S35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Th.Geyer GmbH &#38; Co.</td>
			<td>7,695,019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MPGP04001</td>
			<td>MilliQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>PFA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing

La cornea murina fornisce un eccellente modello per studiare la guarigione della ferita. La cornea è lo strato più esterno dell'occhio e così è la prima difesa per infortunio. Infatti, il tipo più comune di lesioni oculari trovati nella clinica è un'abrasione cornea. Qui, utilizziamo un oculare burr per indurre un'abrasione conseguente rimozione dello epitelio corneale in vivo sui topi anestetizzati. Questo metodo consente per rottura epiteliale mirata e riproducibile, lasciando altre aree intatte. In più, descriviamo la visualizzazione dell'epitelio abrasa con la macchiatura della fluorescina e fornire consigli concreti su come visualizzare la cornea abrasa. Quindi, seguiamo la linea temporale di guarigione delle ferite 0, 18 e 72 h dopo abrasione, fino a quando la ferita è re-epithelialized. Il modello di abrasione epiteliale della lesione corneale è ideale per gli studi sulla riepitelizzazione degli strati corneali, la migrazione e la proliferazione delle cellule epiteliali. Tuttavia, questo metodo non è ottimo per studiare l'attivazione stromal durante la guarigione delle ferite, perché la bava oculare non penetrano negli strati di cellule stromali. Questo metodo è anche adatto per applicazioni cliniche, ad esempio, i test pre-clinici di efficacia del farmaco.

Questo protocollo descrive un modello per infliggere un danno all'abrasione alla cornea del mouse e suggerisce come seguire e visualizzare il processo di guarigione dopo abrasione. Recentemente, abbiamo usato questo metodo per studiare il ruolo delle cellule progenitrici epiteliali corneali durante6di cicatrizzazione. L'uso di strumenti consolidati è la chiave per un esperimento di successo all'abrasione. Noi ed altri, abbiamo utilizzato la bava oculare di Algerbrush II (Figura 1) per eseguire l'abrasioni6,7,24. Questo strumento ha una punta di burr offuscato di 0,5 mm in dimensioni che spazza via piuttosto che esercitazioni o cesoie dell'epitelio corneale. Così, questo strumento è la scelta consigliata per un infortunio di abrasione sulla cornea.
Una parte centrale di questo modello è che l'area interessata può essere visualizzato senza sforzo a intervalli desiderati. In Figura 3A, presentiamo l'uso di fluorescina che macchia in combinazione con una fonte di luce blu cobalto (Figura 1) per visualizzare il sito di abrasione. In questo esperimento, abbiamo effettuato una grande ferita nella cornea centrale e lasciato la cornea periferica intatta (Figura 3A). Inoltre, abbiamo raspato solo l'occhio sinistro di ogni mouse e conservato l'occhio destro, bilaterale come un controllo non-raspato. I campioni di occhio bilaterali sono rimasti negativi per segnale della fluorescina, che suggerisce che essi non subiscono alcuna perdita di cellule durante l'esperimento e così funzionare bene come campioni di controllo. Tuttavia, segnale verde nei bordi dell'occhio visualizzato la soluzione di fluorescina che accumulato nella giunzione tra l'occhio e la palpebra. L'abrasione era più grande a 0 h, immediatamente dopo la lesione (Figura 3A). Dimensioni notevolmente più ridotte dopo 18h ed era, in questo caso, si trova vicino al confine superiore dell'occhio. Tuttavia, l'epitelio si chiude la regione esposta a una velocità uguale da tutti i lati dell'abrasione. In particolare, a 72 h post-ferimento, nessun segnale verde era visibile. Questo indica che l'epitelio corneale completamente è stato re-epithelialized di 72 h dopo l'abrasione.
Con questo metodo, abbiamo puntato l'abrasione solo sull'epitelio cornea, di messa a fuoco in modo che gli strati più profondi della cornea è rimasto intatti. La rimozione dell'epitelio corneale era evidente da sezioni istologiche nella Figura 3B. A 0 h, il bordo dell'abrasione è mostrato come una sporgenza stretta, acellulare che è continua da un normale, l'epitelio corneale spessi strati 4-5 delle cellule. Il limbus, bordo periferico dell'epitelio corneale, presenta un'area di esempio che non ha risentita l'abrasione durante l'intera timeline sperimentale (72 h). Inoltre, le sezioni istologiche indicato che gli strati più profondi della cornea, lo stroma e l'endotelio, non sono stati danneggiati dalla bava oculare. Questi due tessuti è sembrato simili nei campioni abrasi e bilaterali dell'occhio. A alberino-ferita di 18 h, il processo di guarigione è attivo e riepitelizzazione è in corso. Ciò è stata suggerita dall'apparenza di un bordo d'attacco. Il bordo iniziale contiene solo 1-2 strati di cellule epiteliali e copre la regione esposta prima di ri-stratificazione può verificarsi25. In linea con i risultati in Figura 3A, la superficie completamente è stato re-epithelialized di 72 h, quando il migrazione dei fronti avevano coperto la ferita e tutti gli strati epiteliali erano ancora presenti. Le sezioni istologiche dall'occhio bilaterale ha confermato (Figura 3A) che gli occhi di controllo è rimasto intatti durante il periodo di osservazione.
Infine, forniamo la prova che il modello di abrasione è limitato all'epitelio cornea e non richiama una risposta stromal di ferita, quali il neovascularization. La figura 4 Mostra la cornea murina a 18 h dopo abrasione. Basato su vista macroscopico, questo punto del tempo non ha visualizzato una risposta stromale, indicando così che il nostro protocollo non interrompere gli strati corneali più profondi. In confronto, una ferita alcalina con 0,75 mol/L di NaOH indotto immediatamente neovascularization nello stroma. Dato il rapido neovascularization alcalina lesioni, i punti di tempo nel nostro metodo forniscono la prova per escludere la possibilità di risposta nello stroma.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58071/58071fig1.jpg"> Figura 1: strumenti essenziali per abrasione corneale epiteliale. Sulla sinistra c'è una vibra Bava oculare. La luce di penna blu cobalto a destra viene utilizzata per portare la macchia di fluorescina visibile. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58071/58071fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58071/58071fig2.jpg"> Figura 2: Imaging l'abrasione cornea. (A) strumenti per l'imaging sono un braccio regolabile per una telecamera con morsetto (a sinistra), la fotocamera reflex (centro) e una lampada da tavolo con braccio flessibile e morsetto (a destra). La luce di penna blu cobalto è legata alla cupola della lampada con due fascette. (B) una vista generale del setup imaging; la distanza di ogni attrezzo di attacco è contrassegnata nell'immagine in cm. Entrambi i morsetti sono 6 cm di distanza la piastra di calore e il mouse è posizionato a 10 cm dal bordo della piastra calore. (C) un'occhiata più da vicino l'imaging di abrasione con proposta di distanza e la posizione all'occhio del mouse in cm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58071/58071fig2large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58071/58071fig3.jpg"> Figura 3: rilevamento e localizzazione dell'abrasione cornea. (A) gli occhi di Mouse a 0, 18 e 72 h dopo abrasione. Segnale della fluorescina contrassegna la regione abrasa in verde brillante, mentre tutte le altre regioni nell'epitelio rimangano scuri. Bilaterali occhi fungono da comandi. Linea tratteggiata segna i confini della ferita e la macchia bianca in ogni occhio è il riflesso dalla fotocamera. (B) istologicamente sezionato ed ematossilina ed eosina macchiato campioni degli occhi del mouse a 0, 18 e 72 h dopo l'abrasione. Limbus è il bordo che circonda l'epitelio corneale da tutti i lati. Asterix segna il limite dell'abrasione. Barra della scala è 100 µm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58071/58071fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58071/58071fig4.jpg"> Figura 4: abrasione corneale non attiva una risposta stromal. L'esposizione alcalina con 0,75 mol/L di NaOH seguita da irrigazione con 0,9% NaCl produce neovascularization corneale (occhio raccolto immediatamente dopo il trattamento). All'abrasione con la bava oculare non mostra nessun neovascularization anche dopo 18 h. abrasione sito è segnato con una linea tratteggiata. Scala bar 1 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58071/58071fig4large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Guarigione delle ferite di abrasione epiteliale corneale con oculare Burr come un modello per Cornea

Questo protocollo descrive un metodo per infliggere un'abrasione sulla superficie oculare del mouse e a seguire da allora in poi il processo di cicatrizzazione. Il protocollo si avvale di un oculare burr parzialmente rimuovere l'epitelio di superficie dell'occhio nei topi anestetizzati.

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

20.2K Views.  University of Helsinki. Questo protocollo descrive un metodo per infliggere un'abrasione sulla superficie oculare del mouse e a seguire da allora in poi il processo di cicatrizzazione. Il protocollo si avvale di un oculare burr parzialmente rimuovere l'epitelio di superficie dell'occhio nei topi anestetizzati.

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A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are administered 1. This uniqueness has made the cornea pocket assay one of the most used models for angiogenesis studies. The cornea composes multiple layers of cells. It is therefore possible to embed a pellet containing the angiogenic factor of interest in the cornea to investigate its angiogenic effect 2,3. Here, we provide a step by step demonstration of how to (I) produce the angiogenic factor-containing pellet (II) embed the pellet into the cornea (III) analyze the angiogenesis induced by the angiogenic factor of interest. Since the basic fibroblast growth factor (bFGF) is known as one of the most potent angiogenic factors 4, it is used here to induce angiogenesis in the cornea.

The cornea is unique in that it lacks vascular tissues. However, robust blood vessel growth and survival can be induced in the cornea by potent angiogenic factors. Therefore, the cornea can provide with us a valuable tool for angiogenic studies. This protocol demonstrates how to perform the mouse model of cornea pocket assay and how to assess the angiogenesis induced by angiogenic factors using this model.

Un modello murino del saggio Cornea Pocket Study Angiogenesi

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Ricerca

Medicina

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

Modello murino di guarigione delle ferite

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The etiology of IBD remains unknown and current therapeutic strategies are based on the unspecific suppression of the immune system. The development of treatments that specifically target intestinal inflammation and epithelial wound healing could significantly improve management of IBD, however this requires accurate detection of inflammatory changes. Currently, potential drug candidates are usually evaluated using animal models in vivo or with cell culture based techniques in vitro. Histological examination usually requires the cells or tissues of interest to be stained, which may alter the sample characteristics and furthermore, the interpretation of findings can vary by investigator expertise. Digital holographic microscopy (DHM), based on the detection of optical path length delay, allows stain-free quantitative phase contrast imaging. This allows the results to be directly correlated with absolute biophysical parameters. We demonstrate how measurement of changes in tissue density with DHM, based on refractive index measurement, can quantify inflammatory alterations, without staining, in different layers of colonic tissue specimens from mice and humans with colitis. Additionally, we demonstrate continuous multimodal label-free monitoring of epithelial wound healing in vitro, possible using DHM through the simple automated determination of the wounded area and simultaneous determination of morphological parameters such as dry mass and layer thickness of migrating cells. In conclusion, DHM represents a valuable, novel and quantitative tool for the assessment of intestinal inflammation with absolute values for parameters possible, simplified quantification of epithelial wound healing in vitro and therefore has high potential for translational diagnostic use.

Accurate assessment of anti-inflammatory effects is of utmost importance for the evaluation of potential new drugs for the treatment of inflammatory bowel disease. Digital holographic microscopy provides assessment of inflammation in murine and human colonic tissue samples as well as automated multimodal evaluation of epithelial wound healing in vitro.

Multimodale Quantitative Phase Imaging con Digital olografico microscopia Valita accuratamente guarigione infiammazione intestinale e epiteliale della ferita

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients with impeded blood flow or with large wounds might be prolonged. Cell-based therapies have appeared as a new technique for the treatment of diabetic ulcers, and cell-sheet engineering has improved the efficacy of cell transplantation. A number of reports have suggested that adipose-derived stem cells (ASCs), a type of mesenchymal stromal cell (MSC), exhibit therapeutic potential due to their relative abundance in adipose tissue and their accessibility for collection when compared to MSCs from other tissues. Therefore, ASCs appear to be a good source of stem cells for therapeutic use. In this study, ASC sheets from the epididymal adipose fat of normal Lewis rats were successfully created using temperature-responsive culture dishes and normal culture medium containing ascorbic acid. The ASC sheets were transplanted into Zucker diabetic fatty (ZDF) rats, a rat model of type 2 diabetes and obesity, that exhibit diminished wound healing. A wound was created on the posterior cranial surface, ASC sheets were transplanted into the wound, and a bilayer artificial skin was used to cover the sheets. ZDF rats that received ASC sheets had better wound healing than ZDF rats without the transplantation of ASC sheets. This approach was limited because ASC sheets are sensitive to dry conditions, requiring the maintenance of a moist wound environment. Therefore, artificial skin was used to cover the ASC sheet to prevent drying. The allogenic transplantation of ASC sheets in combination with artificial skin might also be applicable to other intractable ulcers or burns, such as those observed with peripheral arterial disease and collagen disease, and might be administered to patients who are undernourished or are using steroids. Thus, this treatment might be the first step towards improving the therapeutic options for diabetic wound healing.

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Adipose-derived stem cells (ASCs) are easily isolated and harvested from the fat of normal rats. ASC sheets can be created using cell-sheet engineering and can be transplanted into Zucker diabetic fatty rats exhibiting full-thickness skin defects with exposed bone and then covered with a bilayer of artificial skin.

Creazione e il trapianto di un foglio di cellule staminali di derivazione adiposa (ASC) in un modello diabetico di guarigione

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is often capped with biocompatible materials in order to expedite pulpal wound healing. The ultimate goal is to regenerate reparative dentin, a physical barrier that functions as a "biological seal" and protects the underlying pulp tissue. Although this direct pulp-capping procedure has long been used in dentistry, the underlying molecular mechanism of pulpal wound healing and reparative dentin formation is still poorly understood. To induce reparative dentin, pulp capping has been performed experimentally in large animals, but less so in mice, presumably due to their small sizes and the ensuing technical difficulties. Here, we present a detailed, step-by-step method of performing a pulp-capping procedure in mice, including the preparation of a Class-I-like cavity, the placement of pulp-capping materials, and the restoration procedure using dental composite. Our pulp-capping mouse model will be instrumental in investigating the fundamental molecular mechanisms of pulpal wound healing in the context of reparative dentin in vivo by enabling the use of transgenic or knockout mice that are widely available in the research community.

We describe a step-by-step method of performing direct pulp capping on mice teeth for the evaluation of pulpal wound healing and reparative dentin formation in vivo.

Sviluppo di un modello diretto Pulp-capping di valutazione dei polpa dentale guarigione delle ferite e riparativa dentina formazione nei topi

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated experimental procedures, while potentially lacking in precision. In vitro culture of epithelial cell lines provides a suitable platform for researching the cell migratory behavior in wound healing and the impact of treatments on these cells. The physiology of epithelial cells is often studied in non-confluent conditions; however, this approach may not resemble natural wound healing conditions. Disrupting the epithelium integrity by mechanical means generates a realistic model, but may impede the application of molecular techniques. Consequently, microscopy based techniques are optimal for studying epithelial cell migration in vitro. Here we detail two specific methods, the artificial wound scratch assay and the artificial migration front assay, that can obtain quantitative and qualitative data, respectively, on the migratory performance of epithelial cells.

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

This manuscript describes how incision-like lesions made on cultured epithelial cell monolayers conveniently model wound healing in vitro, allowing for imaging by confocal or laser scanning microscopy, and which can provide high-quality quantitative and qualitative data for studying both cell behavior and the mechanisms involved in migration.

La microscopia basato su metodi per la valutazione della migrazione delle cellule epiteliali durante In Vitro la guarigione arrotolata

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two dimensional (2D) and three dimensional (3D) culture has generated a wealth of information not only about corneal biology but also about wound healing, myofibroblast biology, and scarring in general. The goal of the protocol is an assay system for quantifying myofibroblast development, which characterizes scarring. We demonstrate a corneal organ culture ex vivo model using pig eyes. In this anterior keratectomy wound, corneas still in the globe are wounded with a circular blade called a trephine. A plug of approximately 1/3 of the anterior cornea is removed including the epithelium, the basement membrane, and the anterior part of the stroma. After wounding, corneas are cut from the globe, mounted on a collagen/agar base, and cultured for two weeks in supplemented-serum free medium with stabilized vitamin C to augment cell proliferation and extracellular matrix secretion by resident fibroblasts. Activation of myofibroblasts in the anterior stroma is evident in the healed cornea. This model can be used to assay wound closure, the development of myofibroblasts and fibrotic markers, and for toxicology studies. In addition, the effects of small molecule inhibitors as well as lipid-mediated siRNA transfection for gene knockdown can be tested in this system.

A protocol for an ex vivo corneal organ culture model useful for wound healing studies is described. This model system can be used to assess the effects of agents to promote regenerative healing or drug toxicity in an organized 3D multicellular environment.

Ex Vivo modello di cultura di organo corneale per la guarigione delle ferite studi

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Targeting Gray Rami Communicantes in Selective Chemical Lumbar Sympathectomy

Chemical lumbar sympathectomy (CLS) is a commonly used, minimally invasive procedure for the treatment of conditions including ischemic diseases of the lower extremities, hyperhidrosis, etc. It is commonly practiced to position the puncture needle tip in front of the anterior fascia of the psoas major muscle and inject the inactivating agent around the sympathetic trunk, which is defined as conventional CLS. Although relatively rare, ureteropelvic damage is the most frequently reported complication of conventional CLS and can cause serious harm to patients. We found that injecting the inactivating agent behind the anterior fascia, which only targets gray rami communicantes, helped achieve therapeutic efficacy in&#160;vasodilation, sweat reduction, and pain relief comparable to conventional CLS, and serious complications were largely reduced. We define this procedure as selective CLS. Here, we present a protocol of selective CLS. The precise needle tract and accurate evaluation of the spreading of the contrast agent are critical to ensure that the drug is injected behind the anterior fascia of the psoas major muscle. The needle tip is at approximately one-third the dividing line of the vertebral body in the lateral view of a lumbar X-ray. The contrast is mainly confined around the needle tip and spreads outward and downward along the psoas muscle fibers. In this way, the anterior fascia provides a natural barrier for the ureteropelvic area, and the psoas major muscle provides a natural barrier for the lumbar nerve root. There are several highlights of this article, including 1) a detailed description of the selective CLS procedures, 2) an explanation of the anatomical basis for the implementation of selective CLS, and 3) an explanation of the differences between selective and conventional CLS.

We present a protocol for selective chemical lumbar sympathectomy (CLS), which inactivates only gray rami communicantes and not the sympathetic trunk. Selective CLS can help achieve therapeutic efficacy in vasodilation, sweat reduction, and pain relief that are comparable to conventional CLS, and serious complications, particularly ureteropelvic damages, can be reduced.

Targeting grigio Rami Communicantes nello Sympathectomy lombare chimico selettivo

Chemical lumbar sympathectomy (CLS) is a commonly used, minimally invasive procedure for the treatment of conditions including ischemic diseases of the ...

A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for experimental investigations as they are normally needed for transplantation. Endothelial cell cultures often do not translate well to in vivo situations. Due to the biostructural characteristics of non-human corneas, stromal swelling during cultivation induces substantial corneal endothelial cell loss, which makes it difficult to perform cultivation for an extended period of time. Deswelling agents such as dextran are used to counteract this response. However, they also cause significant endothelial cell loss. Therefore, an ex vivo organ culture model not requiring deswelling agents was established. Pig eyes from a local slaughterhouse were used to prepare split corneal buttons. After partial corneal trephination, the outer layers of the cornea (epithelium, bowman layer, parts of the stroma) were removed. This significantly reduces corneal endothelial cell loss induced by massive stromal swelling and Descemet&#39;s membrane folding throughout longer cultivation periods and improves general preservation of the endothelial cell layer. Subsequent complete corneal trephination was followed by the removal of the split corneal button from the remaining eye bulb and cultivation. Endothelial cell density was assessed at follow-up times of up to 15 days after preparation (i.e., days 1, 8, 15) using light microscopy. The preparation technique used allows a better preservation of the endothelial cell layer enabled by less stromal tissue swelling, which results in slow and linear decline rates in split corneal buttons comparable to human donor corneas. As this standardized organo-typically cultivated research model for the first time allows a stable cultivation for at least two weeks, it is a valuable alternative to human donor corneas for future investigations of various external factors with regards to their effects on the corneal endothelium.

Here, a step-by-step protocol for the preparation and cultivation of porcine split corneal buttons is presented. As this organo-typically cultivated organ culture model shows cell death rates within 15 days, comparable to human donor corneas, it represents the first model allowing long-term cultivation of non-human corneas without adding toxic dextran.

Un modello di cultura dell'organo endoteliale porcina utilizzando i pulsanti corneali divisi

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for ...

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the optical breakdown at the laser focus. Acoustic shock waves and cavitation bubbles are generated, causing tissue rupture. Bubble sizes and pressure amplitudes vary with pulse energy and position of the focal point. In this study, enucleated porcine eyes were positioned in front of a commercially available Nd:YAG laser. Variable pulse energies as well as different positions of the focal spots posterior to the cornea were tested. Resulting lesions were evaluated by two-photon microscopy and histology to determine the best parameters for an exclusive detachment of corneal endothelial cells (CEC) with minimum collateral damage. The advantages of this method are the precise ablation of CEC, reduced collateral damage, and above all, the non-contact treatment.

Here, we present a protocol to detach corneal endothelial cells (CEC) from Descemet&#8217;s membrane (DM) using a neodymium:YAG (Nd:YAG) laser as an ex vivo disease model for bullous keratopathy (BK).

Sviluppo di un modello sperimentale non invasivo e assistito dal laser della perdita di cellule endoteliali corneale

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...