著者に感謝 t. パーマーと H. バブー (スタンフォード大学脳神経外科)図4 マウスの Npc。 ベクター アートを提供するために使用され、クリエイティブ ・ コモンズ表示 3.0 Unported ライセンス (https://creativecommons.org/ の下で仏医術から適応licenses/by/3.0/legalcode)。この作業の一環で、スタンフォード大学ナノ共有施設 (SNSF)、賞 ECCS 1542152 下の国立科学財団によってサポートを行った。N.A.S. は、サポートから国立科学研究所の一般医療の健康の国民の協会 (32 GM 008412) を認めています。C.M.M. は、博士フェローシップ (F31 EB020502) と Siebel 学者プログラムの NIH NRSA からサポートを認めています。S.C.H. では、再生医療 (RT3-07948)、国立衛生研究所 (U19 AI116484 と R21 EB018407)、全米科学財団 (DMR 1508006)、およびカリフォルニア工科大学からサポートを認めています。この研究は、ユーニス · ケネディ · シュライバー国立衛生研究所の子と人間の開発 (NICHD)、国立研究所によってサポートされている再生のリハビリテーション研究・ トレーニング (AR3T)、連合から資金を受けてください。神経疾患と脳卒中 (NINDS)、医用イメージング、生体 (NIBIB) 賞を受賞番号 P2CHD086843 の下で健康の国立研究所の国立研究所。内容は著者の責任と健康の国民の協会の見解を必ずしも表さない。

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組換え蛋白質の表現および浄化は、再現性の高い生体材料を合成する強力なツールです。商品化された分子クローニングの出現を主因カスタム プラスミド購入できますいくつかのサプライヤーから ELPs のような材料で作業時間を大幅に削減します。同様に、元の仕事は、連邦契約によって支えられた非営利使用するため今後の作業になりますとプラスミドを元の研究室から直接要求できます。ELP の完全なアミノ酸シーケンスは、いくつかの ELP の亜種31以前公開されています。しかし、式から組換え蛋白質の最終的な浄化のプロセスは一般的に還元利回りや低品質の製品につながることができます重要な手順の数を含みます。ELP の準備のための最も一般的な問題のいくつかは、次のいずれかで発生する: 細菌の膜と熱サイクルを通じて (3) 蛋白質の浄化を妨害する、ストアドの細菌の在庫の品質 (1) (2) の最初の凍結融解サイクルします。
蛋白質の表現および他非生物材料の生産の手段の主な違いは我々 がポリマーを合成する遺伝子組換えホストの生物学的機械を活用しています。その後、このテクニックは、独自の制限がある: 細胞死または損傷。細胞死は最も一般的プレートまたは比較的ゆっくりと成長異常に小さいコロニーをストリー キング後細菌コロニー数の減少としてそれ自身を明示します。細菌株は場合は、慎重に維持安定したまま年;ただし、繰り返し使用や冷凍庫の故障による連続凍結融解サイクルは、細胞生存率を削減したり、DNA の損傷につながることができます。典型的な BL21 細菌株は浮遊細胞と混合量 10% と 40% のグリセロールの間使用します。グリセロールの目的は、凍結中の氷の結晶を核から膜の損傷を減らすことです。そのため、低濃度の使用 (< 10%) 高濃度ながら、侵害された膜につながることができます (> 40%) 在庫が細胞死につながるをフリーズすることがないために十分に凝固点を抑制することができます。ただし、最適なグリセロール濃度の中でも細菌の在庫する必要がありますできません完全に雪解けするグリセロールからの再凍結および細胞毒性から膜損傷の組み合わせになるために削減在庫生存率および DNA 損傷。したがって、それは細菌の在庫が低いコロニー カウントの結果をまたは (式中に低速 OD600ランプに入る率として現れる) 一貫して遅い速度で細胞を分裂していることが観察されてプラスミッドを再変換し、新しい在庫が単純なこの問題を解決する最初のアプローチ。これを念頭においては細菌の在庫の長期的な維持および DNA の完全性を確保するため冷凍水で、細胞内ではなく精製 DNA としてあなたのプラスミッドのコピーを格納するが最善です。この方法で DNA を保存すると、失敗した株式や冷凍庫の故障など予期しないイベントは、元の DNA の信頼性の高いソースを変換に使用することができますになります。
ELP 作製のもう一つの重要なステップは、式のホストからターゲット蛋白質の浄化です。エシェリヒア属大腸菌からの蛋白質の抽出は、連続凍結融解サイクルをさらに配合の懸濁細胞ライセート、凍結時に全体を形成する核の氷の結晶を使用して細胞壁を壊すことによって達成されます。細胞壁を破壊するための代替方法は、超音波やプレスなど利用できます。特に、ライセートの連続凍結融解は、有利なだけ冷凍庫とない他の専門機器が必要です。ただし、この手順は、DNA、RNA および蛋白質の汚染物、ターゲット蛋白質を低下させる可能性があるプロテアーゼに加えて特異的解放します。したがって、汚染を避けるため、収量、デオキシリボヌクレアーゼ (DNase) 私と phenylmethanesulfonyl フッ化物 (PMSF) 細胞、DNA を低下させるし、それぞれプロテアーゼを阻害するライセートに追加されますを削減します。DNase 添加する前に DNA の存在を観察できます視覚的に再懸濁細胞全体 '糸' 外観として次の雪どけライセート。DNase は積極的にこの DNA を低下し、細胞ライセート遠心分離によって浄化しやすく粘度を削減します。細胞ライセートが完全に液体に表示されることと、糸の外観は表示されなくなりますを確保することによって、最適な DNA の分解を視覚的に確認できます。我々 は mL 細胞ライセートあたり DNase の ~0.1 mg 添加が必要な分解を達成するために十分であることを実際に観察しました。しかし、DNA の存在は、まだ観察される場合より DNase 追加できます続いて撹拌の追加の 2、3 時間。ライセートの十分に融解する可能性が前に DNase が途中で追加した場合、同様の問題が発生する可能性も。この場合より冷たい温度は、DNase の早期不活性化による DNA 分解の効率を制限できます。この問題を避けるためには、それはしばしば治療の前に約 8 時間解凍し再懸濁のペレットを許可することをお勧めです。さらに、低蛋白質収量が報告される、DNA の破壊が十分なされている場合プロテアーゼから潜在的なタンパク質分解をさらに軽減する多く PMSF 添加が必要。
ELPs の最適な表現を確保するための追加の考慮事項は、利点について十分に理解と選択した抗生物質の限界もあります。ここでは、アンピシリン耐性遺伝子を含んでいる pET15b ベクトルは蛋白質の表現を使用しました。機能的には、ペットのベクター シリーズ専用の次の成功誘導32,33ターゲット蛋白質に細菌の蛋白質の表現の 50% の重要な蛋白質の表現を可能にします。ただし、アンピシリン選択抗生物質として最適な表現を妨げる可能性のあるいくつかの制限があります。まず、大腸菌の存在下でアンピシリンの劣化、β-ラクタマーゼのリリースのため急速に発生します。アンピシリンの十分な量が低下した場合プラスミドのアンピシリン エンコーディング (すなわちELP エンコーディング プラスミッド) が全く失われます。その結果、ELPs 期間が長くなる場合は、好ましい表現を許可する ELP エンコーディング遺伝子の十分な量を確保する連続した時点で、バイオマーカ発現量を慎重に監視する必要があります。Β-ラクタマーゼの蓄積のトラブルシューティングのための可能な方法はスターター文化をスピンダウンさせなど表現媒体を接種する前に抗生物質フリー培地で細胞を再懸濁します。このプロセスは効果的に抗生物質分解酵素の転送を制限し、確実に大部分のセルのターゲット蛋白質符号化ベクトル。また、アンピシリンは約 2 〜 3 週間の限られた寿命であります。したがって、使用する前に 2 週間の最大 4 ° C で蛋白質の表現のための培養皿を保存する必要があります。最後に、スターターと表現メディア、アンピシリン原液でアンピシリンの有効性を確保するため使用べきである作り出された新鮮なすぐに前に、長期的なストレージが少ない効果的な抗生物質につながる可能性がありますので。
LCST の存在は熱サイクルを通じて ELPs の簡単な浄化のためことができます。具体的には、高温、塩の存在下では、エントロピーの力は難溶となりその後ポリマー豊富なコアセルベート相を形成する非を引き起こします。その一方で、低温非水溶性のままかつ溶液に容易に溶解します。遠心分離手順を収集し、引き続いて非 ELP を含む段階を破棄すると相まってこれら 2 つの温度の政体間で循環蛋白質を集中し、同時に ELP 以外の汚染物質の存在を低減します。
ただし、どこ ELPs は、この精製過程で失われることがいくつかの段階があります。まず、すべての冷たいスピンの前に蛋白質含有溶液は 9.0 の pH に強アルカリします。このより高い pH で脱プロトン化は、効果的に帯電状態のまま、さらに溶解性を高める蛋白質のバックボーンにあるアミノ酸。したがって、この手順を上記またはタンパク質分解の十分な時間を許可しないは、非可溶性タンパク質を遠心分離中にペレットし、破棄するように収量の削減につながることができます。
同様に、ターゲット蛋白質は、ELP のペレットとの熱スピン処理中に失われることができます。当初は、塩化ナトリウムは、ELP の容解性を減らすためにタンパク質が豊富な上清に追加されます。塩は、水相から分離する蛋白質の原因のタンパク質と水の分子間静電相互作用を保護する仕事します。この効果はエントロピー効果により、さらに周囲の非含水「cage」を分解し、、蛋白質の集合を強制するソリューションを加熱することによって増幅されます。タンパク質濃度 (すなわち。 最初の熱サイクル)、塩だけで添加はしばしばこの相分離を引き起こすに十分な。ただし、タンパク質の濃度を増加させる (すなわち。、熱サイクル後)、と塩との対話を以下の二次汚染物質は、ELP をより容易に沈殿させます。結果として、塩を余りにすぐに追加する場合可能性がありますになる物理的に陥れ蛋白質を集計することによって効果的に、溶液の塩濃度が低下したとさらに蛋白質の沈殿物を制限します。したがって、塩はゆくソリューションを通じて配布する十分な時間を確保して 3 つの小型バッチで追加する必要があります。最後の注意点としてのいずれかを介して ELP バックボーンにバリエーションさらにエラスチンのような地域のゲスト残渣を変更またはバイオ アクティブ領域に変更することができます LCST 挙動に大きく影響します。したがって、タンパク質の亜種間で最適なタンパク質の収量を確保するため、pH、塩濃度、塩の種類を最適化するために重要な (e.g。、一価または二価) 冷・温のスピンのため。
低下は、ELP が浄化手順のいずれかの中に発生したかどうかを容易に判断に使用できるので、完了するプロトコル SDS ページを実行することをお勧めします。簡単に言えば、ELP は清熱スピンの後に検出された場合、タンパク質はされて効果的に沈殿しません。同様に、ELPs は、可溶化されたペレット寒いスピンを次のサンプルで指定されている場合、タンパク質はされている効果的に解散しません。
ELP ヒドロゲルは、合成または天然由来材料に比べて多くの利点を提供しています。具体的には、アミン反応性架橋剤 THPC の使用は、タンパク質架橋の低コスト、シンプルで、可変機構を与えます。ただし、注意すべき架橋プロトコル内で異なる制限があります。THPC は酸素に敏感で、それがすばやく反応効率の低下不適切な条件下で保存されている場合。さらに、第一級アミンとの反応性、原因 THPC は周囲のアミン類が豊富なメディアまたはそれらの細胞の表面の蛋白質と反応するかもしれません。したがって、ELP ヒドロゲルを形成する架橋効率で可能な外因性タンパク質交差反応性、したがって、減少を抑える細胞ペレットとメディア汚染を避けるため勧めします。最後に、この架橋メカニズム リジン残基を含まない生体活性領域シーケンスを排除し、したがって、いくつかの細胞接着モチーフの潜在的な統合を制限 (例えば.、IKVAV34)。これらの制限の変更に対処するためアジ化と bicyclononyne (BCN) ELP バックボーンに反作用パートナーは、前述した27としてのバイオ直交架橋。
ELP LCST 挙動がハイドロゲル微細構造の決定に重要な役割を果たしていることに注意してください。温度、LCST 上記体制で ELPs は、マトリックスの気孔率に影響を与えることができる蛋白質が豊富で、タンパク質欠乏相の形成とマトリックス9の架橋効率につながる解決から沈殿させます。ELP LCST 上関連する生理学的温度 (〜 37 ° C) でほとんどの細胞培養実験を行うために、これらの効果が考慮されなければなりません。効果的に架橋し、フォーム ヒドロゲル相互接続されたタンパク質ネットワーク、リジンから第一級アミン必要があります THPC 架橋剤が物理的にアクセス。ELP 集計が十分な架橋に達する前に発生した場合、アクセスできないとこうして架橋に参加することはできません ELPs タンパク質豊富なフェーズ内に閉じ込められた可能性があります。この制限に対処するためのプロトコル、ヒドロゲルへの予備的な架橋は、ELP の熱相転移を経る前に室温で初期 15 分架橋期間が必要です。この室温培養にはゲルの架橋を完成させるための 37 ° C でさらに 15 分インキュベーションが続きます。この手順は、十分な架橋と ELP 素材の堅牢な再現性のあるゲル化にとって重要です。
結論としては、ELP を用いて作製した組換え蛋白質ゲルは、タンパク質配列およびしたがって 3 D の細胞の微小環境の例外的な可変性を提供しています。ELP のポリマーは、生体内および生体外でシステムの様々 な LCST 言動により簡単に精製、高収率で表現できることが示さと生体適合性をされています。エシェリヒア属大腸菌の組換えのホストとしての使用は、ポリマーの分子量と機能の完全な制御の近くに上昇を与えるシンプルで安価な手順を提供します。併せて、この技法は、堅牢な可変特性と 3 D の細胞の種類の広い範囲の文化を可能にするハイドロゲル プラットフォームの再現性にできます。最後に、この ELP ハイドロゲル プラットフォームは qRT PCR、西部のしみ、DNA 抽出、細胞免疫染色9など多くの下流の生化学的アッセイを受けやすい。

過去世紀にわたって基礎的な細胞生物学の研究のための不可欠なツールセットに二次元 (2 D) 組織文化を開発しました。さらに、2 D の細胞培養のため比較的低コストでシンプルなプロトコルは、多くの生物的および医学の分野での採用につながっています。しかし、過去の研究を示しています伝統的な 2 D のプラットフォームは、それら収集した体内から著しく逸脱、原因の貴重な時間と資金を無駄に臨床的に方向づけられた研究1,2のための結果につながること 3。我々 と他のこの不一致は最適な増殖と種々 の細胞の成熟に必要なことができる 2D サーフェス上で培養した細胞に提供されるネイティブ生化学的および生物物理学的手がかりの不足に帰因するかもしれないことを仮定します。
これらの制限および助け橋 2 D の間のギャップに対処するための in vitroとin vivoの研究、研究者がある電池封止材1,4,5 の開発した三次元 (3 D) ゲル プラットフォーム ,6。ヒドロゲルは細胞外マトリックス (ECM) の生体内での組織のような機械的性質と栄養素の急速な輸送を可能にする構造の水膨潤により内因性の微小環境を要約する理想的な材料と7,8の要因シグナリングします。さらに、足場の力学的および生化学的特性を独立に制御する 3 D ゲルを設計できます。行列力学9,10、11,12と細胞接着配位子13,14,15の両方がよくセルに影響を与える知られています。生体外で動作し、体内。したがって、可変プロパティと 3 D ゲルは、セルとその微小環境の因果関係を研究するためのプラットフォームを提供しています。理想的な 3 D ゲルのマトリックスのための基準は、単純な非細胞電池封止材、生理学的に関連する機械的性質の独立した可変性およびネイティブな細胞接着モチーフの模倣者に含まれます。
両方合成 (e.g、ポリエチレング リコール、ポリ乳酸、ポリ (グリコール酸)) および自然由来 (e.g。、アルギン酸、コラーゲン、マトリゲル) ヒドロゲル文化プラットフォーム 2D体外に利点があります。しかし、また適用性を限る重大な欠点があります。まず、合成と天然物由来の多くのプラットフォームが必要な哺乳類細胞に潜在的に有毒することができます過酷な架橋条件につながる減少した細胞の生存率の7。また、多くの合成プラットフォームはネイティブ活性を欠いている、増加コストと複雑さの16を追加することができますセカンダリの化学反応によって修飾する必要があります。最後に、天然由来原料は通常本質的な生体活性ドメインを含みますが、しばしば高いバッチごとに変動に悩まされているため、比較的弱いゲル7,17を形成に制限が多い。
組換えタンパク質工学タンパク質シーケンスを明示的に制御により材料設計のためのユニークなツールセットを提示し、延長によって、最終的なハイドロゲルの潜在的な力学的および生化学的特性足場18。また、エシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) 蛋白質を表現するためのよく知られている生物学的機械を活用し、材料生産できる低コストで一貫して限られたインター-内-バッチ可変。ここで紹介するエラスチン様タンパク質 (ELP) は 3 つのエンジニア リング ドメイン: 抗体のタグを介して蛍光ラベリングを可能に (1) の T7 および His6 タグ、弾性力学特性を付与し、化学のエラスチンのような地域 (2)架橋、(3) 細胞接着モチーフのエンコード 'バイオ アクティブ' 地域。
エラスチンのような地域は、'効きます' アミノ酸サイト イソロイシン (イル) がある可能性がありますの 4 つはプロリンを除くすべてのアミノ酸に設計されている標準 (ヴァル Pro Gly 効きます-ペプチド-)5エラスチン シーケンスに基づいています。このシーケンスは、熱循環19,20を介して簡単な浄化後式の利用できる下の臨界溶液温度 (LCST) 行動と遺伝子組換え ELPs を与えます。この LCST プロパティは、異なる温度で熱骨材へゲスト '効きます' 残渣21,22を変更することでチューニングできます。
ここでは、5 つのエラスチンのような繰り返しの 1 つに「効きます」位置はリシン (Lys) アミノ酸のアミン提示酸架橋ハイドロゲルを利用されるに置き換えられていますいます。我々 の以前の仕事は、アミン反応性架橋剤テトラキス (ヒドロキシメチル) ホスホニウム塩 (THPC)23の反応特異性と堅牢な架橋を示しています。さまざまな全体蛋白質内容と架橋剤濃度による、生理学的に関連する剛性の範囲 (~0.5-50 kPa)9,23,24にまたがることチューニングできるゲルを生成することができるがおります。機械的特性をチューニングに加えて ELP 蛋白質のバックボーン内の標準的な細胞接着ドメインの統合から、ハイドロゲル内細胞接着の結果します。たとえば、非バインド 'RDGS' バリアント拡張フィブロネクチン由来 'RGDS' アミノ酸シーケンスの組み込むことで柔軟な形態、スクランブル中の細胞接着と細胞-マトリックス接着24が制限されます。総蛋白濃度と同様に、非接着タンパク質に細胞接着の比率を調節することによって効果的に配位子濃度の広い範囲でゲルを生成することができるがおります。その結果、種々 の細胞の最適な 3 D 文化のため個別にチューニングできる分離された生化学的および生物物理プロパティを持つハイドロゲル プラットフォームを開発しました。
剛性マトリックスと接着性リガンドの可変性に加え組換えヒドロゲルは細胞拡散、増殖、および4の 3 D のコンテキスト内での移行に必要なデザイン特定の材料劣化プロファイル機能を提供します。,9. この劣化は拡張 'RGDS'9またはエラスチンのようなシーケンス25を標的プロテアーゼの細胞分泌によって与えられます。ELP ヒドロゲルは、細胞生存率及び量的な逆の DNA ・ RNA ・ タンパク質抽出と同様に、免疫細胞化学を含む関数を勉強するために必要なその後の生化学的アッセイをサポートに示されています。トランスクリプション ポリメラーゼの連鎖反応 (qRT PCR) と西9 をしみ。ELP の亜種も、生体内でのモデルの数で使用されているし、免疫システム26忍容性が知られています。
一緒に取られて、ELP 電池封止材研究材料プラットフォームを誇るさまざまな生化学的および生物物理可変性のと同じ程度に欠ける、合成や天然物由来の素材プラットフォームと比較しての利点として、再現性。さらに、ELP のシンプルで非細胞毒性を使用さまざまな種類の細胞 (e.gひよこ後根神経節14,24、マウス神経前駆細胞9、ヒト間葉系幹細胞27、牛。新生児軟骨細胞28、ひと血管内皮細胞細胞29,30) 2 D 細胞培養と比較して内因性 3 D ECM のもっと生理学的に関連するモデルのことができます。ここで、recombinantly 由来の表現のためのプロトコルを提案する、3 d 可変ハイドロゲルのプラットフォームとして使用するための非細胞カプセル化。さらにダウン ストリームの蛍光標識とカプセル化された細胞の共焦点顕微鏡観察の方法論を提案します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="904">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Elastin-Like Protein Expression and Purification</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 cm Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70% Ethanol</td>
			<td>RICCA Chemical</td>
			<td style="width:123px;">2546.70-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A3920-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP1760-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">9002-18-0&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BL21(DE3)pLysS Competent Cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">C606003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:260px;">Amresco</td>
			<td style="width:123px;">0230-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA disodium salt, dihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">O2793-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A451-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP1755-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria Broth</td>
			<td style="width:260px;">EMD Millipore</td>
			<td>1.10285.5007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:123px;">52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td style="width:123px;">195381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S 8045-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe Filter Unit (0.22 &#956;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:123px;">SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terrific Broth</td>
			<td style="width:260px;">Millipore</td>
			<td style="width:123px;">71754-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.22 &#956;m syringe filters</td>
			<td style="width:260px;">Millipore</td>
			<td style="width:123px;">SLGV004SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 mm thick silicone sheet</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:123px;">70338-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well tissue culture plates&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:123px;">353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Biopsy Punch (2 mm)</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td style="width:123px;">33-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Biopsy Punch (4 mm)</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td style="width:123px;">33-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Biopsy Punch (5 mm)</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td style="width:123px;">33-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:123px;">21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">No. 1 12 mm glass coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">404861-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5% Tryspin/EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td style="width:123px;">15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:260px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">15701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:260px;">Roche</td>
			<td style="width:123px;">3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td style="width:123px;">D1306&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Donkey Serum</td>
			<td style="width:260px;">Lampire Biological Labs</td>
			<td style="width:123px;">7332100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488)</td>
			<td style="width:260px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:123px;">A-11017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546)</td>
			<td style="width:260px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:123px;">A-11071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:123px;">16210-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Mouse Nestin Primary Antibody</td>
			<td style="width:260px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">556309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Sox2 Primary Antibody</td>
			<td style="width:260px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:123px;">23064S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Nail Polish</td>
			<td style="width:260px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield Hardset Mounting Medium&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:123px;">H-1400&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of elastin-like protein hydrogels for encapsulation and immunostaining of cells in 3d

二次元 (2 D) 組織培養技術は、基礎的な細胞生物学の私達の理解に不可欠されています。ただし、従来の 2次元培養システムに欠けて結果の間で重要な結果として、三次元 (3 D) マトリックス切断収集の in vitroおよびin vivo。この制限に対処するため、研究者は体内細胞微小環境の生化学的および生物物理学的特性を模倣することができます 3 D のハイドロゲル培養プラットフォームを設計しました。この研究、3 D の細胞のカプセル化と下流の生化学的アッセイをサポートする材料のプラットフォームを開発する必要が動機となった。組換えタンパク質工学 3 D ゲル材料の設計と開発のユニークなツールセットを提供は、蛋白質シーケンスの特定のコントロールを可能にするあり、拡張子、合力の潜在的な力学的および生化学的特性行列。ここでは、recombinantly 由来エラスチン様タンパク質 (ELP) 独立可変の機械的性質と細胞接着リガンド濃度フォーム ヒドロゲルを使用ことができますの表現のためのプロトコルを提案する.さらに ELP ヒドロゲル内細胞のカプセル化の方法論を提案して、下流の分析と定量化のための細胞を埋め込まれたの後蛍光抗体染色します。

このプロトコルで使われる ELPs は 5 つの地域から成る: T7 タグ、His6 タグ、enterokinase (EK) 胸の谷間サイト、バイオ アクティブ領域およびエラスチンのような地域 (図 1)。T7 と His6 タグは、標準的な西部のしみの技術によって簡単に識別できます。EK の胸の谷間のサイトの紹介はタグ領域の酵素の除去のため必要な場合ことができます。バイオ アクティブ領域を拡張、フィブロネクチン由来の細胞接着 ('RGDS') または非接着剤 ('RDGS') シーケンスにエンコードします。最後に、エラスチンのような地域の中心部の繰り返しには THPC を介して架橋有効になり並ぶの繰り返しを含むイソロイシン31~ 32 ° C の LCST を達成するために、ゲストの残渣サイトでリジン グループが含まれています。
投稿式、SDS-PAGE または西部のしみは、分子量を視覚化し、T7 (MASMTGGQQMG) や His6 (HHHHHH) (図 2) などの抗体タグを含む ELPs の身元を確認する使用できます。制御条件の下で成功した式は両方の SDS ページ (図 2 a) を使用してこれらの蛋白質のおおよそ分子量 (~ 37 kDa) で 1 つの暗いバンドの存在によって表される高均質な製品を生成し、西部のしみ (図 2 b)。
制御不能の条件、西部のしみの低分子量のバンドの存在は、タンパク質の一部は完全に変換されませんでした/または式 (図 2) の後分解したを示唆しています。具体的には、ここで固まり、約 1 つの生体活性領域と 3 つのエラスチンのような地域 ('繰り返し')、重量またはターゲット蛋白質の約 4 分の 1 に相当する 〜 9 kDa で等間隔です。これらの小さい蛋白質のフラグメントがある通常より高い温度で式を行った場合 (> 32 ° C)図 2のように。これらの低分子量タンパク質の存在は予測不可能な機械的性質につながります。したがって、最終製品の品質を確保するため、定期的スクリーニング ポスト式はお勧めします。
ELP ベース ヒドロゲルの機械剛性は、ELP の濃度または THPC 反応グループ: ELP アミンの比率を操作することによって変更できます。同時に、任意の剛性体制内の非接着剤 (RDGS) シーケンスに、細胞接着 (RGDS) の ELP の変形の比率を変更することによって細胞接着リガンドの濃度を調整できます。これらの 2 つの変数を操作することによって機械的性質とリガンド濃度 (図 3) のスペクトルを持つゲルを生成できます。
3 D の ELP ヒドロゲル内のセルをカプセル化するには、必要な細胞数は媒体中に浮遊、細胞ペレット (図 4 a) を生成する遠心分離します。チューブから培地を吸引、セルは望ましい集中の ELP ソリューションで均一に再懸濁。次に、THPC ソリューションはセル/ELP の懸濁液に追加され、均質な混合物を形成するため徹底的に戻します。このソリューションは、迅速にピペットを使用して 24 ウェル プレート内滅菌シリコンモールドに転送され、各 (図 4 b) 常温、37 ° C 15 分で架橋を許可しました。最後に、媒体はウェル プレートに追加され、実験では 37 ° C で培養しました。
ライブ/デッド染色は細胞生存率と ELP ヒドロゲル内成功した細胞のカプセル化を評価するために使用できます。図 5に示すように、大人のマウスの神経前駆細胞 (Npc) の表示高細胞生存率 3% (w/v) ELP ハイドロゲル内 7 日間
3 D の ELP ヒドロゲルは以前正規 NPC タンパク質マーカー SRY (地域 Y を決定性) の発現を介して測定 NPC 幹メンテナンスをサポートする示されている-ボックス 2 (Sox2) と特異9。Npc は 3% (w/v) 低 THPC 架橋 Sox2 の核局在の免疫染色と顕微鏡を用いたイメージング (図 6) を介して細胞質の特異フィラメントのショー高発現 ELP ヒドロゲル カプセル化されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig1.jpg"> 図 1: 対応するアミノ酸配列と ELP の略図。本研究で使用される ELP には、抗体ベースのイメージング、細胞接着ドメイン導入のため生理活性領域弾性力学特性を付与でき、化学架橋エラスチンのような地域に T7 および His6 タグが含まれています。<a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig2.jpg"> 図 2: 分子量そして最終的な凍結乾燥製品の識別を確認する SDS のページおよび西部のしみのターゲット蛋白質の表現を検証できます。6 (HHHHHH) タグ SDS ページ(A)と T7 (MASMTGGQQMG) またはヒスチジンを使用して西部のしみの両方によって報告された 37 kDa の分子量で純粋なフルレングス ELP を実行(B) です。(C)。 ELP 表現のプロトコルで偏差による ELP の不純なバッチは、低分子量の ELPs の発現につながることができます。<a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig3.jpg"> 図 3:RGDS リガンド コンテンツ個別に調整できる ELP ヒドロゲル内機械的性質から。5% (w/v)、3% (w/v) ELP ヒドロゲル ~ 800 の横せん断係数がある Pa と 〜 400 Pa、それぞれ。THPC 反応グループ: ELP アミンの 1:1 の比率でゲルは 37 ° C に加熱、15 分間室温でクロスリンクしていましたおよび平衡測定前に 5 分のために。データは、平均 ± 標準偏差、 *p < 0.001。<a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig4.jpg"> 図 4:ELP ヒドロゲルの電池を封止材のスケマティック。(A).細胞中規模および小球形にされた遠心分離機を使用して単一細胞懸濁液に解離最初。チューブから培地を吸引とセルを再希望 ELP 溶液中に浮遊してよく混合します。最後に、THPC 架橋ソリューションを添加し、よく混合します。(B). THPC 添加の直後、ソリューションは、ピペットをシリコーン型にキャストされます。37 ° C で 2 番目 15 分インキュベーション続いて 15 分常温架橋へソリューションが許可します。媒体は、実験の期間のためによくカルチャに追加されます。<a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig5.jpg"> 図 5:神経前駆細胞は、ELP ヒドロゲルの高い生存率を維持します。神経前駆細胞の代表的なイメージは、3% (w/v) ELP で 7 日間培養後 1:1 架橋 (THPC 反応グループ: ELP アミン) とゲルをカプセル化します。緑: ライブ染色 (カルセイン AM);赤: 死んだ (エチジウム ホモ) を染色します。スケールバー = 100 μ m。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig6.jpg"> 図 6: 3 D の ELP ヒドロゲルは神経前駆細胞幹メーカー表現をサポートします。Sox2 を表現し、ELP ヒドロゲルの文化の 7 日後の蛋白質のネスチンの神経前駆細胞の蛍光イメージ。画像は、セル脂肪架橋 (THPC 反応グループ: ELP アミン) と 3% (w/v) ELP ゲルのカプセル化を示しています。青: DAPI (核);赤: Sox2;緑: ネスチンします。スケール バー = 25 μ m.<a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

組換え蛋白質設計ヒドロゲルは、ポリマー主鎖としたがって、細胞の微小環境の完全な可変性を可能にする彼ら 3 D 細胞培養のために有利です。ここでは、組換えのエラスチンのような蛋白質の浄化のプロセスと 3 D ゲル電池封止材への応用について述べる。

カプセル化と 3 D の細胞の免疫染色のエラスチン様タンパク質ゲルの生産

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

production-elastin-like-protein-hydrogels-for-encapsulation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.2K ビュー.  Stanford University. 組換え蛋白質設計ヒドロゲルは、ポリマー主鎖としたがって、細胞の微小環境の完全な可変性を可能にする彼ら 3 D 細胞培養のために有利です。ここでは、組換えのエラスチンのような蛋白質の浄化のプロセスと 3 D ゲル電池封止材への応用について述べる。

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Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

シングルセルおよび3D閉じ込めにおける単一胚を注文：ハイコンテントスクリーニングのための新しいデバイスを

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

生物工学

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

生産、特性評価および3D組織工学ヒト食道粘膜モデルの使用可能性

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

3D細胞培養のための肺細胞外マトリックスから調整可能なヒドロゲル

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

プライマリのグリア細胞の in Vitro Neuroinflammation のモデリングのための三次元ハイドロゲル文化を改善

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

世界的な細胞のマトリックスメタロプロテアーゼと 3 D ゲルの代謝活性を測定

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

ライブ顕微鏡イメージング下での3Dヒドロゲルの制御株

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, overburdening a microorganism with genetic modifications can reduce host fitness and productivity. This problem can be overcome by using dynamic control: inducible expression of enzymes and pathways, typically using chemical- or nutrient-based additives, to balance cellular growth and production. Optogenetics offers a non-invasive, highly tunable, and reversible method of dynamically regulating gene expression. Here, we describe how to set up light-controlled fermentations of engineered Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae for the production of chemicals or recombinant proteins. We discuss how to apply light at selected times and dosages to decouple microbial growth and production for improved fermentation control and productivity, as well as the key optimization considerations for best results. Additionally, we describe how to implement light controls for lab-scale bioreactor experiments. These protocols facilitate the adoption of optogenetic controls in engineered microorganisms for improved fermentation performance.

Optogenetic control of microbial metabolism offers flexible dynamic control over fermentation processes. The protocol here shows how to set up blue light-regulated fermentations for chemical and protein production at different volumetric scales.

微生物化学およびタンパク質生産のための光制御発酵

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.

3Dバイオプリンティングのための脂肪由来幹細胞スフェロイドの大規模自動生産

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Fragmenting Bulk Hydrogels and Processing into Granular Hydrogels for Biomedical Applications

Granular hydrogels are jammed assemblies of hydrogel microparticles (i.e., &#34;microgels&#34;). In the field of biomaterials, granular hydrogels have many advantageous properties, including injectability, microscale porosity, and tunability by mixing multiple microgel populations. Methods to fabricate microgels often rely on water-in-oil emulsions (e.g., microfluidics, batch emulsions, electrospraying) or photolithography, which may present high demands in terms of resources and costs, and may not be compatible with many hydrogels. This work details simple yet highly effective methods to fabricate microgels using extrusion fragmentation and to process them into granular hydrogels useful for biomedical applications (e.g., 3D printing inks). First, bulk hydrogels (using photocrosslinkable hyaluronic acid (HA) as an example) are extruded through a series of needles with sequentially smaller diameters to form fragmented microgels. This microgel fabrication technique is rapid, low-cost, and highly scalable. Methods to jam microgels into granular hydrogels by centrifugation and vacuum-driven filtration are described, with optional post-crosslinking for hydrogel stabilization. Lastly, granular hydrogels fabricated from fragmented microgels are demonstrated as extrusion printing inks. While the examples described herein use photocrosslinkable HA for 3D printing, the methods are easily adaptable for a wide variety of hydrogel types and biomedical applications.

This work describes straightforward, adaptable, and low-cost methods to fabricate microgels with extrusion fragmentation, process the microgels into injectable granular hydrogels, and apply the granular hydrogels as extrusion printing inks for biomedical applications.

バルクヒドロゲルの断片化と生物医学的応用のための粒状ヒドロゲルへの加工

Granular hydrogels are jammed assemblies of hydrogel microparticles (i.e., &#34;microgels&#34;). In the field of biomaterials, granular hydrogels have ...

Microengineering 3D Collagen Hydrogels with Long-Range Fiber Alignment

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark of cardiac and musculoskeletal tissues. To study cell response to aligned microenvironments in vitro, several protocols have been developed to generate COL1 matrices with defined fiber alignment, including magnetic, mechanical, cell-based, and microfluidic methods. Of these, microfluidic approaches offer advanced capabilities such as accurate control over fluid flows and the cellular microenvironment. However, the microfluidic approaches to generate aligned COL1 matrices for advanced in vitro culture platforms have been limited to thin "mats" (&lt;40 &#181;m in thickness) of COL1 fibers that extend over distances less than 500 &#181;m and are not conducive to 3D cell culture applications. Here, we present a protocol to fabricate 3D COL1 matrices (130-250 &#181;m in thickness) with millimeter-scale regions of defined fiber alignment in a microfluidic device. This platform provides advanced cell culture capabilities to model structured tissue microenvironments by providing direct access to the micro-engineered matrix for cell culture.

This protocol demonstrates the use of a microfluidic channel with changing geometry along the fluid flow direction to generate extensional strain (stretching) to align fibers in a 3D collagen hydrogel (&lt;250 &#181;m in thickness). The resulting alignment extends across several millimeters and is influenced by the extensional strain rate.

長距離繊維配向によるマイクロエンジニアリング3Dコラーゲンヒドロゲル

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark ...