イノベーション ジョン r. エヴァンス リーダー基金 (35017)、キャンパス アルバータ州革新プログラムおよびアルバータ州省の自然科学と工学研究会のカナダ発見助成 (RGPIN-2017-05463)、カナダの財団によって資金が供給されたこの作品経済発展と貿易。

注: RNA はリボヌクレアーゼ (RNases) による劣化に非常に敏感です。RNA のままを維持する標準的な予防策を講じる。手袋を頻繁に変更します。プロトコルのすべての手順でフィルター処理されたピペット チップ、ヌクレアーゼ フリー容器、ヌクレアーゼ フリー化学物質を使用します。ヌクレアーゼ フリーの使用またはピロ炭酸ジエチルエステル (DEPC)-すべてのソリューションのための水を処理します。
1. 溶液の調製
<ol><li>Toeprinting バッファーを準備: 20 mM トリス-HCl (pH 7.6)、100 mM KOAc、2.5 mM Mg(OAc)2, 5% (w/v) スクロース, 2 mM ジチオトレイトール (DTT) と 0.5 mM スペルミジン。<ol>
<li>凍結融解の繰り返しを避けるために-20 ° C で使い捨ての因数で DTT とスペルミジンを保存します。 注: DTT とスペルミジン使用の直前に toeprinting バッファーに追加する必要があります。DTT とスペルミジンを欠けているソリューションは、-20 ° C で保存できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>85 mM 5'-グアニル imidodiphosphate (GMP PNP) と 91 mM アデノシン三リン酸 (ATP) の因数を準備します。因数-20 ° C で保存します。</li>
	<li>6% ポリアクリルアミド-7 M 尿素ゲル ミックス 450 mL を準備: 67.5 mL 40 %acrylamide:bis-アクリルアミド (19:1)、尿素、112.5 x TBE (トリス、ホウ酸塩、thylenediaminetetraacetic 酸 (EDTA)) 5 mL と 120 mL の水の 189 g。37 ° C の水浴または攪拌しながらホット プレート上に温暖化によって、尿素を溶かします。ソリューションをフィルター (e.g。、0.2 μ m 硝酸セルロース真空フィルター)。 注: ソリューションは 4 ° C で少なくとも 1 か月間保存できます。 注意: アクリルアミド単量体は皮膚を通して吸収される神経毒です。皮膚への接触を避けるために大きい心配を取る (すなわち。 保護メガネ、手袋、白衣、)。ポリアクリルアミドは重合 100% 完了するまで続行できません、注意して処理も必要があります。</li>
	<li>ホルムアミド ローディングの染料の準備: 95% ホルムアミド、18 ミリメートルの EDTA、0.025% (w/v) ナトリウム dodecyl 硫酸塩 (SDS)、0.025% (w/v) ブロモフェノールの青、0.025% (w/v) キシレンシアノール。-20 ° C にてストア</li>
	<li>プライマー (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' IRDye 800 付いた端) の 1 nmol を 100 μ L の 10 pmol/μ L の作業濃度の水に溶解します。光から保護使い捨て因数 (約 10 μ L) で-20 ° C で保存します。</li>
</ol>2. mRNA の準備
<ol><li>適切なテンプレートからポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) による mRNA の合成 DNA テンプレートの増幅 (すなわち。、ゲノム DNA やプラスミド DNA、必要に応じて)。高忠実度の製造元の指示に従って DNA ポリメラーゼを使用し次の反応条件 (35 サイクル): 溶融、98 ° C、10 s;アニール、53 ° C、20 s;拡張、72 ° C、30 秒。 注: 前方のプライマー (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) RNA のトランスクリプション; のように T7 プロモーターが組み込まれています逆のプライマー (5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG) 51 チミン残基には、転写の RNA のポリ A の尾を提供が含まれます。RNA生体外でプラスミド DNA から転写もあることに注意してください。</li>
	<li>体外に適切な転写キットを使用は、IRES 含む RNA または DNA のテンプレートから頂いた RNA に議事録します。製造元の指示に従ってください。標準の 20 μ L 反応ボリュームの RNA のサンプルを準備します。37 ° C で 30 分間、RNase フリーの DNase の 2 ユニットと新しく合成した RNA を扱う</li>
	<li>110 に DNase 処理 RNA を希釈ヌクレアーゼ フリー水 μ L は、室温で 20,000 × g で 110 μ L 酸フェノール、渦 5 s、3 分間遠心を追加。新しい 1.5 mL および microfuge の管に水相の 100 μ L を削除 10 μ L の 3 M 酢酸ナトリウムと渦 2 s 追加、100% エタノール, 渦 5 s の 3 つのボリュームを追加して、一晩-20 ° C で RNA を沈殿させます。</li>
	<li>遠心分離機 > 4 ° C と上清を捨て、30 分 20,000 × g。冷たい 70% (v/v) エタノール 500 μ l 添加の餌を洗浄し、遠心分離を繰り返します。限り可能と風乾清吸引 5 ~ 10 分のペレットは、ペレットが外れないように注意してください。</li>
	<li>ヌクレアーゼ フリー水 0.5 μ g/μ L の作業濃度を生成するための適切な量の RNA を再懸濁します。これは-80 ° C で保存または、すぐに使用できます。</li>
</ol>3. Toeprinting 反応
<ol><li>ウサギ網状赤血球ライセート (RRL、ヌクレアーゼ扱われない)、RNase 阻害剤、91 mM ATP (最終 1.82 mM) の 1 μ L と 85 mM GMP PNP (1.7 mM 最終) 1.5 mL および microfuge の管の 1 μ L の 1 μ L (40 台) のミックス 15 μ L。30 の ° c で 5 分間インキュベートします。 注: RRL は、凍結融解の繰り返しを避けるために単一の使用のため検体必要があります。重要な制御は、RRL、RNA の二次構造のため逆のトランスクリプションの自然な休止時間を明らかにするために不足している反応です。このコントロールの RRL を交換する toeprinting バッファーを追加します。</li>
	<li>RNA の 0.5 μ g (1 μ L) を追加し、30 の ° c で 5 分間インキュベートします。</li>
	<li>Toeprinting バッファーの 22 μ L を追加し、30 ° C、3 分で孵化させなさい。</li>
	<li>0.5 μ L (5 pmol) IRDye 標識プライマーを追加し、氷上で 10 分間インキュベートします。</li>
	<li>25 mM の dNTPs の 2 μ L を追加 (最終濃度: 1 mM)、2 Toeprinting バッファーの 3.5 μ、1 μ L の鳥 Myeloblastosis ウイルス逆転写酵素 (RT-AMV) 100 mM Mg(OAc)2μ L。最終巻は 50 μ L です。</li>
	<li>45 分 30 ° C で反応を孵化させなさい。</li>
	<li>ヌクレアーゼ フリー水の 200 μ L を追加し、25:24:1 フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール (pH 約 8.0) の 250 μ L を即座に抽出します。渦 5 s と 20,000 × g で室温で 3 分間遠心します。新しい 1.5 mL および microfuge の管に水相を削除 100% エタノール, 渦 5 s の 3 つのボリュームを追加して、-20 ° C で一晩沈殿します。</li>
	<li>遠心分離機 > 4 ° C と上清を捨て、30 分 20,000 × g。冷たい 70% (v/v) エタノール 500 μ L の DNA の餌を洗います。遠心分離機 > 4 ° C で 15 分間 20,000 × gくらい上清を吸引と 5 ~ 10 分のペレット、ペレットが外れないように気をつけて乾燥した空気。</li>
	<li>ヌクレアーゼ フリー水 6 μ l 中でペレットを溶解し、ホルムアミド ローディングの染料の 3 μ L を追加します。</li>
</ol>4. シーケンス反応
<ol><li>チェーンの終端文字として dideoxynucleotides (ddNTPs) を使用して、標準的な配列の反作用のための 2.1 からの DNA のテンプレートそして 3.4 の手順から IRDye 標識プライマーを使用します。該当の DNA シーケンス キットを使用し、製造元の指示に従ってください。</li>
	<li>ホルムアミド ローディングの染料の 3 μ L の各シーケンス反応のミックス 6 μ L は。</li>
</ol>5. ゲル法と電気泳動の配列の作製
メモ: このプロトコル ゲル ベースの蛍光イメージャと 21 cm × 23 cm × 0.2 mm のゲルを使用してが必要な場合、他のシーケンサーやゲル-サイズ、合わせることができます。
<ol><li>0.2 mm スペーサー ショート (23 × 25 cm)、100% エタノールで長い (30 × 25 cm) ガラス板を徹底的に掃除します。空気が乾燥。</li>
	<li>6% ポリアクリルアミド-7 M 尿素ゲルのミックス 30 mL を混ぜて 10% (w/v) 過硫酸アンモニウム (AP) の 200 μ L、テトラメチルエチレンジアミン (TEMED) の 20 μ L。泡を避けるために世話、ゲルを注ぎなさい、' サメの歯 ' ゲル櫛を挿入します。室温で 1 h の重合にゲルを許可します。</li>
	<li>シーケンス装置を組み立てるし、1 で貯水池を埋める x TBE。</li>
	<li>中古 1500 V で実行 15 分の 55 の ° C の温度を達成するまで。</li>
	<li>配列のゲルの上に 5 分負荷 1 μ L 85 ° C まで (から 3.9 または 4.2 の手順) サンプル/読み込み染料混合物を加熱します。</li>
	<li>8 h の 1500 V でゲルを実行します。マシンは、リアルタイムでバンドを読み取ります。</li>
	<li>装置を分解し、アクリルアミドゲルと連続したバッファーを破棄します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+just+scanning:+the+importance+of+cap-independent+mRNA+translation+initiation+for+cellular+stress+response+and+cancer.">More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer.</a> Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).</li><li>Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Eukaryotic+Initiation+Factors+during+Cellular+Stress+and+Cancer+Progression.">Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression.</a> J Nucleic Acids. 2016, 8235121 (2016).</li><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+translational+control.">Molecular mechanisms of translational control.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).</li><li>Anthony, D. D., Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+40+S+and+80+S+complexes+with+mRNA+as+measured+by+sucrose+density+gradients+and+primer+extension+inhibition.">Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition.</a> J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).</li><li>Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extension+inhibition+analysis+of+translation+initiation+complexes.">Extension inhibition analysis of translation initiation complexes.</a> Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).</li><li>Shirokikh, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+ribosome-mRNA+complexes+at+different+translation+stages.">Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages.</a> Nucleic Acids Res. 38 (3), 15 (2010).</li><li>Thakor, N., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRES-mediated+translation+of+cellular+messenger+RNA+operates+in+eIF2alpha-+independent+manner+during+stress.">IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).</li><li>Liwak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+PDCD4+represses+internal+ribosome+entry+site-mediated+translation+of+antiapoptotic+proteins+and+is+regulated+by+S6+kinase+2.">Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2.</a> Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).</li><li>Thakor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mRNA+recruits+the+ribosome+via+eIF3-PABP+bridge+to+initiate+internal+translation.">Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation.</a> RNA Biol. , 1-15 (2016).</li><li>Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+IRES-mediated+translation+of+the+c-myc+and+BiP+mRNAs+by+the+poly(A)+tail+is+independent+of+intact+eIF4G+and+PABP.">Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP.</a> Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).</li><li>Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+search+for+structurally+similar+cellular+internal+ribosome+entry+sites.">A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites.</a> Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).</li><li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+a+single+GTP+is+used+in+the+formation+of+80+S+initiation+complexes.">Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes.</a> J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).</li><li>Arnaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+34-Kilodalton+Isoform+of+Human+Fibroblast+Growth+Factor+2+Is+Cap+Dependently+Synthesized+by+Using+a+Non-AUG+Start+Codon+and+Behaves+as+a+Survival+Factor.">A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor.</a> Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).</li><li>Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+48S+translation+preinitiation+complexes+into+80S+initiation+complexes+as+revealed+by+toeprinting.">Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting.</a> FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).</li><li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+selective+mRNA+translation+in+mammalian+cells+by+polysome+profiling.">Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling.</a> J Vis Exp. (92), e52295 (2014).</li><li>Duncan, C. D. S., Mata, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cycloheximide+on+the+interpretation+of+ribosome+profiling+experiments+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe.</a> Sci Rep. 7 (1), 10331 (2017).</li><li>Beck, H. J., Janssen, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Translation+Initiation+Regulation+Mechanism+in+Escherichia+coli+ptrB+Mediated+by+a+5'-Terminal+AUG.">Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5'-Terminal AUG.</a> J Bacteriol. 199 (14), (2017).</li></ol>

著者は開示する利害の対立があります。

Toeprinting は、高度に制御された状況下での翻訳開始複合体の形成を支援する目的の RNA の能力を直接測定する強力な手法です。このプロトコルは toeprinting の簡略化手法を記述する哺乳類の Rna。ウサギ網状赤血球ライセート (RRL)、リボソーム、eIFs、イニシエーターの便利なソースとして使用されます、tRNA、IRESトランス-要因 (ITAFs) の演技します。実験者は選択の彼らの RNA を提供し、自分で選択した特定の補因子と toeprinting 反応を補うことができます。例えば、翻訳開始複合体対80 48 s は、toeprints7の蛍光強度分布に基づく区別できます。観察開始複合体は使用されるグアニン塩基の種類によって異なります。ここで説明した XIAP IRES、場合 GMP PNP プラス ATP 安定 48 開始前複合体、18 + 17≥ toeprint 分布によって特徴付けられる > +19。GMP PNP 架橋ブロック 48 ステップ13で翻訳開始、参加するリボソームのサブユニットを阻害する GTP アナログです。対照的に、GTP、ATP、または ATP と GTP toeprint 配布 +17 < 18 > +198によって特徴付けられる 80 年代開始の複合体を安定させます。
ユーザーは、toeprint を希望する RNA の種類を考慮する必要があります。IRES 要素などの帽子独立した機構の研究目的は、RNA が体外の市販キットと転写することができます。ただし、すべての哺乳類の RNA は 5' キャップ構造を持っている、この toeprinting メソッドを受けることが。頂いた mRNA は、適切なキットを使用して生成する必要があります。いずれの場合も、製造元のプロトコルに密接に従うべき、高品質の RNA の準備の手順で重要なステップを表します。もう一つの重要な点は 3.7 の手順でフェノールの抽出する必要があります実施; 中性以上でこの段階で酸フェノールを使用すると、新しく合成された cDNA は失われます。ステップ 3.5 で使用されるマグネシウム酢酸の濃度は、逆のトランスクリプションの効率に影響を与えることができます各 mRNA の最適化する必要があります注目に値するです。
いくつかのキーのコントロールが、toeprint の特異性を確保するため必要です。まず、RRL やヌクレオチドの不在で堅牢な toeprint が観察されなかった.これにより、観察された逆のトランスクリプションの一時停止はリボソーム RNA 複合体よりもむしろ安定した RNA 二次構造または逆のトランスクリプション反作用自体のいくつかの欠陥のため。第二に、toeprint する必要がありますがないかどうかは開始コドンの変異を観察。これにより、リボソームは、具体的には RNA の開始コドンと複合体を形成して、リボソーム複合体の 3' 端が付いて、ユーザーが正しく開始コドン。これは代替開始コドン14にリボソームを集めることがあります IRES の要素、特に重要です。同様に、XIAP IRES8の場合と同様、toeprint をポリ A テールの不在で損なわれる可能性があります。ただし、いくつかの IRES 要素は CrPV IRES10など、ポリ A テールの不在で toeprints を形成します。最後に、適切な toeprint に加えて他の逆のトランスクリプションの一時停止を観察します。これらは単に、RNA の二次構造の安定のため一時停止を表すことができます。 または彼らはリボソームの RNA の15の他の場所に開始コドンからスライド前記「リボソーム ジャンプ」と呼ばれる現象が原因かもしれません。これらの可能性を区別するために toeprinting 反応をシクロヘキシミド8、効果的に開始コドンのリボゾームを固定化し、ジャンプ リボソームによる代替 toeprints を減らす必要があります存在下で実行できます。特に、異なる Mrna が数および強度の逆転写一時停止にすることを意味別の二次構造を持っている (すなわち。、背景のバンド) も異なります。
この技法の可能な制限は mRNA体外にリボソーム募集て翻訳開始複合体の形成は必ずしも翻訳がで体内に発生します。したがって、toeprinting は生体内で翻訳を測定する手法と組み合わせると特に強力 (e.g。、ポリソーム16をプロファイリング) と結果として得られるタンパク質レベル (e.g。、西部の分析)。
最近の技術は「リボソーム プロファイリング」(「リボソーム ・ フット プリント"とも呼ばれます) 総細胞 mRNA リボソームの存在を測定する高スループット RNA シーケンスを使用する前記。これはリボソーム募集トランスクリプトーム規模を測定するための強力な手法です。リボソームのプロファイリングに固有シクロヘキシミド、Mrna にリボソームを安定させるなどの試薬の使用です。リボゾームの不均衡な数は、5' 非翻訳領域 (UTR)、非正規の翻訳開始17として誤って解釈されることができますが、非具体的停滞していることができます潜在的欠点と言えます。Toeprinting、シクロヘキシミドは手順は、このような誤検知の可能性を否定することの不可欠な部分ではありません。さらに、任意の単一の mRNA で研究できるより詳細に toeprinting、多くの制御実験とイテレーションを行うに安易である (例えば、リボソーム採用、ポリ A テールのいくつかの点変異の影響有無をテスト)。時間がかかり、コストが制御実験実験をプロファイリング リボソームのコンテキストでの同等の配列を実行することです。Toeprinting はこうして高スループット シーケンス ベースの手法を相補的なアプローチと翻訳規則8,9,10のメカニズムの解明を目指して研究のためまだ一般的 18。

翻訳は、ほとんどの携帯電話のエネルギーを消費すると厳しく規制された1を翻訳には理にかなって。逆に、翻訳の制御不全- とタンパク質出力の結果として変化-がん1,2などのストレス応答と疾患の状態が多くみられます。翻訳調節の主な利点は、細胞が様々 な刺激3に対応するため、タンパク質の出力を変更することが速度です。翻訳の規制はこのように細胞の生存と死1,2,3に影響を与えることができる重要なメカニズムを表します。翻訳の手順の開始はほとんど高度規制で複雑な3です。簡単に言えば、真核生物の Mrna には翻訳のために不可欠であるほとんど常に 5' m7G キャップが含まれています。真核生物の開始因子 eIF4E、eIF4A、eIF4G 帽子依存した開始が必要です (キャップ認識複合体) の mRNA の 5' 端と対話します。43 細胞リボソーム複雑、eIF2 バインド イニシエーターを含む tRNA および eIF3、mRNAを介してeIF3 と eIF4G の相互作用の 5' 端に募集しています。開始前複合体は eIF4A 援用 mRNA をスキャンすると思った (RNA ヘリカーゼ) 開始コドン (AUG) が見つかるまで。48 s 開始複合体が形成されその後、tRNA はリボソームの P サイトに配信。最後に、60 s と 40 s リボソームのサブユニットは翻訳伸長1,3,4に続いて 80 年代開始複合体の形成に統一されています。対照的に、内部リボソームのエントリ サイト (沢のカキツバタ) は、開始コドン3に直接 subunit 40 代を募集して 5' キャップの要件をバイパスします。生理的ストレス条件キー一般的な真核生物の開始因子 (eIFs) の変更による mRNA 翻訳を減衰させます。しかし、ストレス応答タンパク質をエンコードよく特定の Mrna の選択的な翻訳を可能にする非正規翻訳開始機構、癌のような病気の状態で非正規翻訳開始の破綻が関与して1,2。 細胞の沢のカキツバタなど、控えめな RNA 規制要素32,などの Mrna の翻訳を可能にします。
翻訳調節の 1 つの特に興味深い側面は、正規と非正規の特定の mRNA の翻訳のメカニズムを理解することです。Toeprinting は、特定の Rnaの生体外の翻訳開始機構の詳細な解明ができるテクニックです。Toeprinting の全体的な目標はどのシーケンス、構造要素またはアクセサリーを決定するために翻訳開始さまざまな条件下でリボソーム複合体の形成を核に関心の RNA の能力を評価するには要因は、効率的な翻訳開始に必要です。たとえば、リボソーム募集を 5' キャップの不在で妨げが、IRES の存在によって刺激があります。
技術の原理は体外にある開始複合体フォーム、し、逆に書き写すように翻訳のコンポーネント (または浄化されたコンポーネント) を含む細胞抽出物の存在下でそれを孵化、関心の RNA を転写特定のプライマー RNA。安定 RNA リボソーム複合体にはリボソームのいわゆる 'toeprint'5,6、7の 3' 端に失速する逆のトランスクリプションが原因となります。
このプロトコル、ribosomal 亜単位、eIFs、Trna、IRESトランスで-因子 (ITAFs) は便利なウサギ網状赤血球ライセート (RRL) に寄贈します。このプロトコルの別の利点は、標識プライマーではなく、蛍光標識したプライマーとジェル ベースの蛍光イメージャの使用です。これは、プライマーを標識化と同様にゲルを乾燥増に公開するなど、追加の手順を排除します。蛍光バンドより高い解像度を可能にするゲルの実行中に、リアルタイムに記録されます。アポトーシス蛋白 (XIAP) IRES RNA の上限なし X リンク阻害剤は、キャップ Mrna はこのテクニック8でも分析できますがここでは、例として使用されます。
セル lysates の翻訳プロセスの最終的な出力を測定する西部の分析とは異なり toeprinting、RNA の翻訳開始複合体形成を測定するための in vitroアプローチです。この還元主義的アプローチは、基板や翻訳開始因子の非常に詳細な研究 (e.g、キャップまたは国連おおわれた mRNA IRES の構造、有無、ポリ A の尾、特定の蛋白質の要因の規定の。など)。したがって、翻訳8のさまざまなモードや mRNA の構造の沢のカキツバタなどタンパク質合成9,10の効果を研究する toeprinting を使用できます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1045px;" width="1043">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:405px;">DEPC (Diethyl pyrocarbonate)</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:191px;">D5758-100ML</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TRIS base, Ultrapure</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4109-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KOAc (Potassium acetate)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PB0438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>MB0326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose, molecular biology grade</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>573113-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spermidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>85558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GMP-PNP (Guanosine 5&#8242;-[&#946;,&#947;-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ATP (Adenosine 5&#8242;-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40%</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>A0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Urea</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>UB0148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">500mL bottle top filtration units, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1823.101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Formamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9037-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EDTA (disodium salt, dihydrate)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>EB0185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SDS</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SB0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bromophenol blue</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>BDB0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xylene cyanol FF</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>XB0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MEGAshortscript T7 transcription kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Acid Phenol:Chloroform (5:1)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:405px;">25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:191px;">15593-049</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated.</td>
			<td>Green Hectares, USA</td>
			<td></td>
			<td>Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RiboLock RNase Inhibitor (40 U/&#181;L)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>E00382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 mM dNTPs</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172, 56173, 56174, 56175</td>
			<td>Mix equal parts for a stock of 25 mM each.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AMV-RT, 10 U/&#181;L</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M5101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>707701KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Model 4200 IR2 DNA analyzer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td></td>
			<td>Product has been discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APS (Ammonium Persulfate)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>AB0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TEMED</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>TB0508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Phusion High Fidelity Polymerase</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:191px;">M0530</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Turbo Dnase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toeprinting analysis of translation initiation complex formation on mammalian mrnas

翻訳開始は、タンパク質合成の律速段階で細胞でタンパク質出力を調節する重要なポイントを表します。タンパク質合成の調節は、細胞のストレス応答するキーと不全、癌などの多くの病気の状態の中心。例えば、帽子独立した方法で細胞ストレスは減衰キャップ依存主導によるグローバル翻訳の阻害につながるが、特定のストレス応答タンパク質群選択的に変換されます。これらの特定の Mrna の翻訳のため、細胞内部リボソームのエントリ サイト (沢のカキツバタ) などの控えめな RNA 規制要素を許可します。このような Mrna の同定とそれらの調節機構の解析、分子生物学の主要な領域をされています。翻訳開始に関連した、Toeprinting、RNA の構造と機能の研究の方法です。Toeprinting の目標は体外の能力を評価するためにどのシーケンス、構造要素、またはアクセサリー要因がリボソームに関与しているを決定するためにさまざまな条件下でリボソームと安定な錯体を形成する RNA を転写バインド-効率的な翻訳開始前のカーソル。西部の分析やポリソームのプロファイリングなどの他の技術と一緒に翻訳開始制御機構の堅牢な特性の toeprinting ことができます。

8,10体外帽子独立した翻訳開始をサポートする XIAP IRES の能力は前述しました。Toeprinting は XIAP IRES 開始複合体のメカニズムの詳細を調査する重要な技術です。XIAP IRES (図 1A) を含む mRNA は DNA コンストラクトだったの in vitro転写、toeprinting 分析を受けます。ここで使用される IRES XIAP mRNA の突然変異体の変形は、図 1Bで表されます。XIAP mRNA リボソーム複合体の逆のトランスクリプションをもたらした典型的な toeprints +17 +19 に下流 (図 1C、1 レーン) は 8 月の nt。これはリボソーム募集開始コドンと安定したリボソーム RNA 複合体5,6、7の形成を表しています。リボソームの募集は、以前に報告した11として (図 1C、レーン 9)、ポリ A テールの不在で強く損なわれました。Toeprint の形成が観察された toeprint はない構造誘起確認不在 RRL と GMP PNP (図 1C、8 レーン) と開始コドンの変異体 (図 1C, 7 車線) でも強く損なわれました。逆のトランスクリプションの一時停止が、実際には、開始複合体形成に固有です。Toeprint の形成は、5' polypyrimidine 管 (PPT) 変異体 (図 1C、2 車線) と 3' PPT 変異 (図 1C、第 4 レーン)、IRES の構造 (図 1B) を混乱させるため損なわれた8 ,10,12。Toeprint の形成は、PPT の変異体は、5' キャップ (図 1C, 3 と 5 レーン) と転写されたときに復元されました。Toeprint の形成は、PPT 二重突然変異体 (図 1C、6 レーン)、二次構造 (図 1B)10を復元するため、復元されました。一緒に、これらのデータは XIAP IRES の二次構造が非キャップ RNA の翻訳開始の重要ですが、IRES の構造は帽子依存した翻訳開始のため不可欠であることを示します。IRES の構造の不在で 5' キャップの特定の要件をさらに示すためには、ヒト β-グロビン (HBB) mRNA は toeprinting 分析 (図 1D) を受けた。5' キャップ (図 1D、1 レーン) の不在で toeprint は観察されなかったが、リボソームは正常に頂いた HBB RNA (図 1D、2 車線) に採用されました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57519/57519fig1.jpg"> 図 1.Toeprinting 分析は、IRES uncapped XIAP IRES RNA の翻訳開始複合体の形成のための二次構造の重要性を確認します。(A)この分析で使用される XIAP IRES RNA、DNA コンストラクトの模式図。Toeprinting プライマーの 3' 末端は 42 開始コドンの下流 bp。(B) WT XIAP IRES (左上)、5' PPT 変異体 (右上)、3' PPT 変異 (左下)、及び PPT 二重変異体 (右下) の二次構造。「PPT 変異' は、IRES8,10,12の二次構造を混乱させる重要な polypyrimidine 管の点突然変異 (AA に UU) を指します。開始コドンは箱入りです。点突然変異は、アスタリスク (*) で示されます。(C) GMP PNP と ATP に RRL のフォームの翻訳開始複合体に XIAP IRES の亜種の能力の Toeprinting 分析が扱われます。開始コドン AUG が開始コドンの変異で AAC に置き換えられました。ポリ A の尾に欠けている RNA をするためには、生体外のトランスクリプション テンプレートを使って逆プライマーは、ポリ T 管を単に欠けていた。(D)開始複合体は (しかしない非キャップ) キャップ 5' UTR ヒト β - グロビン (HBB) に結成されました。パネル (C) と (D) 一番左 4 レーン各車線上記 dideoxy ヌクレオチドの配列の反作用を表すシーケンスは、各パネルの左側に表示されます。フロリダ州、フルレングス。特に指定しない限り、すべての Rna は解凍されました。この図は、前の出版物8,10から変更されています。<a href="/files/ftp_upload/57519/57519fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

哺乳類の Mrna の翻訳開始複合体形成の Toeprinting 分析

体外の能力を計測する Toeprinting の目的は、リボソームさまざまな条件の下でフォームの翻訳開始複合体に RNA を転写しました。このプロトコルは toeprinting 哺乳類の RNA のための方法を記述してキャップ依存、IRES 駆動の両方の翻訳を勉強する使用ことができます。

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

toeprinting-analysis-translation-initiation-complex-formation-on

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.4K ビュー.  University of Lethbridge. 体外の能力を計測する Toeprinting の目的は、リボソームさまざまな条件の下でフォームの翻訳開始複合体に RNA を転写しました。このプロトコルは toeprinting 哺乳類の RNA のための方法を記述してキャップ依存、IRES 駆動の両方の翻訳を勉強する使用ことができます。

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Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Cryomilled哺乳動物細胞からのタンパク質複合体の親和性のキャプチャ

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

生化学

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological materials. Such approaches have received considerable attention in research on the boundary between living and nonliving matter and have been used to construct artificial cells over the past two decades. In particular, Giant Vesicles (GVs) have often been used as artificial cell membranes. In this paper, we describe the preparation of GVs encapsulating highly packed microspheres as a model of cells containing highly condensed biomolecules. The GVs were prepared by means of a simple water-in-oil emulsion centrifugation method. Specifically, a homogenizer was used to emulsify an aqueous solution containing the materials to be encapsulated and an oil containing dissolved phospholipids, and the resulting emulsion was layered carefully on the surface of another aqueous solution. The layered system was then centrifuged to generate the GVs. This powerful method was used to encapsulate materials ranging from small molecules to microspheres.

Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.

油中水型エマルションの遠心分離により巨大ベシクルカプセル化微小球の調製

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

グローバルを測定する定量的蛍光ローカライズ翻訳

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

炭水化物輸送基質結合タンパク質 SP0092 の生化学的および構造特性

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

カエノラブディティス ・ エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form loose callus on Murashige and Skoog (MS) basal media with the plant hormones 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D, 1.0 mg L-1) and kinetin (KT, 0.1 mg L-1). Callus formed after 3 or 4 rounds of subculturing, each lasting 28 days. Loose callus (about 3 g) was then inoculated into B5 liquid media containing the same plant hormones and was cultured in a shaking incubator (120 rpm) in the dark at 25 &#177; 1 &#176;C. After 3&#8722;4 subcultures, a cell suspension derived from tea leaf was established at a subculture ratio ranging between 1:1 and 1:2 (suspension mother liquid: fresh medium). Using this platform, six insecticides (5 &#181;g mL-1 each thiamethoxam, imidacloprid, acetamiprid, imidaclothiz, dimethoate, and omethoate) were added into the tea leaf-derived cell suspension culture. The metabolism of the insecticides was tracked using liquid chromatography and gas chromatography. To validate the usefulness of the tea cell suspension culture, the metabolites of thiamethoxan and dimethoate present in treated cell cultures and intact plants were compared using mass spectrometry. In treated tea cell cultures, seven metabolites of thiamethoxan and two metabolites of dimethoate were found, while in treated intact plants, only two metabolites of thiamethoxam and one of dimethoate were found. The use of a cell suspension simplified the metabolic analysis compared to the use of intact tea plants, especially for a difficult matrix such as tea.

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

This work presents a protocol for establishing a cell suspension culture derived from tea (Camellia sinensis L.) leaves that can be used to study the metabolism of external compounds that can be taken up by the whole plant, such as insecticides.

茶由来の新たに確立された細胞懸濁液培養における6種の全身殺虫剤の代謝に関する研究(カメリアシネンシスL.葉

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed extensive studies of cap-dependent translation and its regulation, high resolution kinetic characterization of this translation pathway is still lacking. Recently, we developed an in vitro assay to measure cap-dependent translation kinetics with single-molecule resolution. The assay is based on fluorescently labeled antibody binding to nascent epitope-tagged polypeptide. By imaging the binding and dissociation of antibodies to and from nascent peptide&#8211;ribosome&#8211;mRNA complexes, the translation progression on individual mRNAs can be tracked. Here, we present a protocol for establishing this assay, including mRNA and PEGylated slide preparations, real-time imaging of translation, and analysis of single molecule trajectories. This assay enables tracking of individual cap-dependent translation events and resolves key translation kinetics, such as initiation and elongation rates. The assay can be widely applied to distinct translation systems and should broadly benefit in vitro studies of cap-dependent translation kinetics and translational control mechanisms.

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Tracking individual translation events allows for high-resolution kinetic studies of cap-dependent translation mechanisms. Here we demonstrate an in vitro single-molecule assay based on imaging interactions between fluorescently labeled antibodies and epitope-tagged nascent peptides. This method enables single-molecule characterization of initiation and peptide elongation kinetics during active in vitro cap-dependent translation.

キャップ依存翻訳キネティクス解析のための インビトロ 単分子イメージングアッセイ

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of galectin-3 into the splicing pathway is addressed in this paper. Sedimentation of HeLa cell nuclear extracts on 12%-32% glycerol gradients yields fractions enriched in an endogenous ~10S particle that contains galectin-3 and U1 snRNP. We now describe a protocol to deplete nuclear extracts of U1 snRNP with concomitant loss of splicing activity. Splicing activity in the U1-depleted extract can be reconstituted by the galectin-3 - U1 snRNP particle trapped on agarose beads covalently coupled with anti-galectin-3 antibodies. The results indicate that the galectin-3 - U1 snRNP - pre-mRNA ternary complex is a functional E complex leading to intermediates and products of the splicing reaction and that galectin-3 enters the splicing pathway through its association with U1 snRNP. The scheme of using complexes affinity- or immuno-selected on beads to reconstitute splicing activity in extracts depleted of a specific splicing factor may be generally applicable to other systems.

This article describes the experimental procedures for (a) depletion of U1 snRNP from nuclear extracts, with concomitant loss of splicing activity; and (b) reconstitution of splicing activity in the U1-depleted extract by galectin-3 - U1 snRNP particles bound to beads covalently coupled with anti-galectin-3 antibodies.

ガレクチン-3 - ビーズ上のU1 snRNP複合体によるスプライシング活性の相補

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the structure and function of an RNA can be modulated by various trans-acting factors, such as proteins, metabolites or other RNAs. Frameshifting RNA molecules, for instance, are regulatory RNAs located in coding regions, which direct translating ribosomes into an alternative open reading frame, and thereby act as gene switches. They may also adopt different folds after binding to proteins or other trans-factors. To dissect the role of RNA-binding proteins in translation and how they modulate RNA structure and stability, it is crucial to study the interplay and mechanical features of these RNA-protein complexes simultaneously.&#160;This work illustrates how to employ single-molecule-fluorescence-coupled optical tweezers to explore the conformational and thermodynamic landscape of RNA-protein complexes at a high resolution. As an example, the interaction of the SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting element with the trans-acting factor short isoform of zinc-finger antiviral protein is elaborated. In addition, fluorescence-labeled ribosomes were monitored using the confocal unit, which would ultimately enable the study of translation elongation. The fluorescence coupled OT assay can be widely applied to explore diverse RNA-protein complexes or trans-acting factors regulating translation and could facilitate studies of RNA-based gene regulation.

This protocol presents a complete experimental workflow for studying RNA-protein interactions using optical tweezers. Several possible experimental setups are outlined including the combination of optical tweezers with confocal microscopy.