私たちは彼の貴重なアドバイス、サポート、およびMS機器へのアクセスだけでなく、優れた技術サポートのためのさんケリーR.モロイのための教授ブライアンT. Chaitに感謝します。我々はコピー編集との支援のために氏ケリーベアに感謝します。この作品は、NIHの助成金P41GM109824、P41GM103314、およびP50GM107632によって部分的にサポートされていました。

The authors declare that they have no competing financial interests.

これら3つのプロトコルは、（1）、低温ミリングによって固体破壊のための細胞を調製（2）遊星ボールミルで破損を達成、及び（3）との複合体中の目的のタンパク質を捕獲アフィニティー細胞粉末からの抽出物を製造するために、タンデムで働きますその生理学的相互作用。多くの異なる細胞溶解技術は、破砕、衝撃、せん断、および/または圧力を用いて機械的/物理的なアプローチ、並びに化学/酵素的アプローチ、異なる長所と短所49,50と各含め、存在します。各研究者は、細胞破壊とタンパク質抽出のための任意の選択されたアプローチは、経験的な最適化（後述）を必要とバイアス51,52を導入する可能性があることを念頭に置いて、彼らの分析のために最も適切な方法を模索することを奨励されています。機械的方法は、タンパク質複合体を破壊することができ、高い熱および/または剪断力を生成することができます。低温ミリングはトンのための試料のLN 2冷却を採用したおかげで加熱効果を回避しますプロセスの彼の継続時間。遊星ボールミルは、粒子サイズ減少53,54の構成要素として、せん断応力などの衝撃や摩擦力、に依存することが理解されます。設定では、我々は、タンパク質複合体の変性を観察していないと報告しました。実際、我々は、抽出されたと明らかに無傷〜50 MDA核膜孔複合体11と「穏やかな」界面活性剤に基づく溶解7を採用する準備よりも高い比活性を示す酵素的に活性なレトロトランスポゾンを取得しました。細胞溶解の化学的/酵素的方法は、細胞の内容物は、 インビトロ環境、細胞膜と構造的高分子の破壊をサポートするが、タンパク質複合体の完全性の維持のために適していないかもしれない（ES中に放出されるという制限に悩まさ） 興味を持っている。しばしば、目的のタンパク質と形成された複合体の成分も標的複合体を安定化させるために必要な条件のいずれもは事前に知られています。固体製粉の主な利点は、破損や抽出がソース材料を可能にして、未結合であり、追加された液体の自由準備（または下-80℃で）保存され、集め、そして便利にオンデマンド実験のために取得することです。 例えば、親和性捕獲のためのインビトロの条件で最適化探索すること。タンパク質相互作用は、従って、抽出剤の量を最小限にする生理学的相互作用を維持するのに有利であることができ、高濃度55,56で最も安定です。一方、実用的な考慮事項があります - タンパク質複合体は、親和性媒体と標的複合体を付き合うためには、不溶性凝集体の自由、細胞外および非粘性水性相に分割する必要があります。さらに、 インビトロでの環境（pH、塩濃度など ）をある程度標準化と制御体系及び再現性のために必要とされます。広報抽出している私たちを見つけます希釈範囲でoduced 1：4-1：9（ワット：v）の品質の結果が得られる実用的かつ理論的な懸念を、満たします。さらに、親和性媒体に細胞抽出物の最適な割合を決定する必要があります。これは、親和性媒体の様々な量と抽出物の滴定により経験的に行われ、さらに以下に説明するように、実験の信号対雑音比で検出可能な効果を有し得ます。標的タンパク質の優れた減少は、典型的には、標的タンパク質の可溶性画分の≥70％であるが、&gt; 90％であることが望ましいと抽出条件の慎重なパラメータで達成することができます。多くのこのような実用的な考慮事項は、参考文献1に記載されています。自家製の選択肢が生存可能であるが、常磁性ビーズは、特殊なマイクロチューブホルダーにネオジム磁石を使用して操作されています。ホルダ内に配置されたとき、ビーズは、磁場の影響下でチューブの側に集まります。次いで、溶液を、ジなしに除去することができますビーズをsturbing。 ここで使用される遊星ボールミルで開発提示低温ミリングプロトコルの1つの制限は、（ 材料の表を参照してください）、材料の最小量を効果的にミルに必要な、このデバイス（&gt; 1グラム）を用いて細胞の粉末を回収していることです。このような量は容易に多くの微生物、細胞株、およびモデル生物を用いて得られ、また多くの場合、実験動物から切除した組織を用いて達成することができます。しかしながら、特定の細胞株が不足することができる量および動物の組織に成長することは非常に困難であり得ます。材料のより少ない量は比較的達成粉末繊度を犠牲にしているが、潜在的に、より小さなコンテナを利用し、他のデバイスを使用して粉砕することができます。また、メカニカルミリング装置のコストは、いくつかの研究室のために非常に高価であり得ます。害虫を用いて手で最も低コスト、を含む、代替的なセットアップ14-19の番号を使用して達成することができる低温ミリングルとモルタル、破損効率が大幅に低下したが。親和性捕捉プロトコルは、典型的には、溶液と標的タンパク質と複合体を捕捉するため、したがって、最大の潜在的に最大のタンパク質抽出を容易にするために、細胞溶解の高効率化を目指します。一方、それはインビトロスプライシング酵母のために実証されている最大の溶解が、インビトロ生化学的活性57,58 内で最大と等しくないことを抽出します。我々はこれまでにテストしたシステムでは、このような問題は認められておらず、低温ミリング時したがって、意図的に私たちの細胞破壊を限定するものではありません。 インビトロ酵素アッセイのために最適化する場合にもかかわらず、この可能性を念頭に置くべきです。典型的には：低温ミリングは、細胞を破壊するための極めて有効な方法であるが不均一な凝集体は、時には目視により観察することができるので、超音波処理の制限された量は、多くの場合、哺乳動物の組織から製造均質全細胞抽出物の利点抽出条件で塩（100から300 mM）の非イオン性界面活性剤（0.1から1パーセントv / v）の濃度を低〜中程度を使用。我々は、これらの凝集体の存在は、その後の親和性捕捉の収率および/または品質を低下させることができることが観察されているので、我々は日常的に（それらが肉眼で観察されていない場合であっても）、それらを分散させるために超音波処理を実施します。凝集体は、以前に粉砕された酵母細胞58からの抽出物で報告されたものに匹敵する凝集膜断片、と一致しています。超音波処理はまた、DNAを切断し、溶液中にクロマチン断片を遊離する、しかし、このプロトコルに適用される超音波処理の程度はかなりDNAを断片化しないためにいくつかのプロトコルで使用されています。関心のある特定のタンパク質に対する優れた親和性リガンドまたは抗体の限られた入手可能（または高コスト）が、別の障害であってもよいです。市販の親和性試薬の広い配列は、モデル生物ゲノムタグ付けやtrのに適しているときに活用することができますアフィニティータグ融合物として目的のタンパク質の発現を可能にする異所性発現ベクターでansfection。しかし、カスタム抗体の生産がますます可能になっており、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方は、アフィニティー捕捉用途に良好に行うことができます。これらの多くの考慮も参照1で詳細に説明します。 親和性媒体の細胞溶解法及び選択が結果に影響を与えることができる方法の例は、 図1に示されています。別の抽出剤によって発揮される効果の例は、参考文献1,11,24に見ることができます。これらおよび他の実験パラメータは、それが困難なのFPを識別すること、親和性捕捉の品質に影響を与える、非特異的な汚染物質を除去するために、「ビーズプロテオーム」と計算手法のリポジトリがFPを40〜43を識別するのを支援するために開発されているからです。それにもかかわらず、このようなアプローチだけsubstit限られた程度59に最適な試料調製のためのUTE。ベストプラクティスを観察し、経験的に親和性捕捉実験を最適化することはさらに後述する、下流の分析のために最高品質のサンプルを提供します。サンプル純度を向上させることができる容易に実現練習は、ネイティブの溶出です。天然の溶出は、最も頻繁に更なる実験のために、インタクトなアフィニティー単離されたタンパク質複合体を得るために使用されます。それはしばしば、サンプルの純度を向上させるように、それはまた、単独で、このために使用することができます。しかし、 図1、パネルIIに示されているように、サンプルの純度を向上させるために、ネイティブ溶出能力は、細胞抽出物中の標的タンパク質の存在量に対する親和性媒体の量を正確に滴定に依存してもよい-媒体が過剰である場合、空いパラトープはネイティブに溶出した画分で観察可能なFPタンパク質のオフターゲットの蓄積を可能にすることができます。ここに記載される試薬および手順を用いて、それは、h私たちの経験をされたよう我々の実験へのFPの唯一最大の貢献者は、かつて生きた細胞のコンテキストから削除標識タンパク質自身であること。 （ 図1.II及び図S1）。このような場合には、抗原の非存在下で無関係なプロテオームを生じる親細胞系コントロールはない実用的な価値があります。同様に、標的抗原以外のものを欠いているタグのみ、またはスパイクのコントロールのために。したがって、我々は直接定量MSを用いてポスト溶解タンパク質相互作用の蓄積を測定するI-DIRT 7,38を 、いつでも実用的に実装します。プロトコルのステップ3.2.7で述べたように、ネイティブの溶出のための手順は、使用する親和性システムの詳細によって異なります。天然の溶出は、最も一般的に親和性媒体から複合体を放出するタグのタグ付けされたタンパク質複合体またはタンパク質分解的切断の競合的置換により達成されます。小さなエピトープタグからなるいくつかの親和性システムがfoは、存在しますRエピトープ自体がタグ付けされたタンパク質複合体60の競合溶出のために有用なペプチドとして利用可能です。同様に、いくつかのプロテアーゼは、具体的には、戦略的に親和性タグを付けた融合タンパク質に61を置か同族部位を切断するために利用可能です。選択された親和性システムの仕様に応じて、適切な溶出方式を採用してもよいです。 一般に、得られた結果の品質を大幅に試料調製の品質によって影響を受けます。ケアと精度を維持しながら、可能な限り迅速にこれらのプロトコルの各ステップを慎重かつ正確に動作することが重要である、と。各操作の効率を理解するために、各工程を経て、目的のタンパク質の分配を追跡することをお勧めします。たとえば、次の問題の細胞または組織における目的のタンパク質がどのように豊富にありますか？おそらく、研究対象のタンパク質（およびその複合体）は、質量特徴づけるために挑戦されます低量による分析。精製された複合体は、一般的なタンパク質染色（約ナノグラム範囲）によって検出可能である場合には、質量分析が成功する可能性が高いです。関心の捕捉タンパク質のみ感受性増強化学発光ウェスタンブロッティング（約ピコグラム範囲）によって検出することができる場合には、質量分析法が有効である可能性が低いです。目的のタンパク質が細胞中で豊富であっても、それが作製された細胞抽出物中にどのように豊富ですか？溶液に、タンパク質のパーティションを行うか、ペレット中にいるのですか？後者の場合、新たな抽出溶液は、回復を改善することができることを考案することができます。細胞抽出物は、親和性媒体と組み合わされた後、どのように効果的にタンパク質が捕捉されますか？タンパク質は、その後の洗浄を介して結合したままでいますか？どのような他の同時精製タンパク質についてはどうですか？プロトコルの適切なステップで、各サンプルのアリコートを保存することにより、これらの質問は簡単に目的のタンパク質に対して、通常、ウェスタンブロッティングによって、答えることができますまたは一般的なタンパク質染色が、他のアッセイもまた、適切であり得ます。 1属性または他の最大化になされるべきトレードオフがあるかもしれませんが、各ステップを最適化することは、捕捉した複合体の収率および純度を向上させます。 多くの研究者のための親和性捕捉の典型的なアプリケーションは、目的のタンパク質の数が少ないためにin vivoでの相互作用に候補を同定することです。これらの候補は、一般に、物理的相互作用の生物学的重要性を実証するために、in vivoでの直交アプローチによって検証に供されます。親和性捕捉はまた、（ほぼ）プロテオーム全体に観察されたタンパク質を同時精製生体内複合体中の推定に関する計算推論を容易にリストを生成するための高スループットの研究によって採用されています。このような研究の多くの例が文献に見出すことができます。このアプローチは、探求人の賛成で任意のターゲットに対して捕獲の条件の最適化を見送りますyの目標;など、推論された複合体自体はほとんど完全に無傷で任意のサンプル中の高純度取得されていません。むしろ、多数の異なる親和性捕捉サンプルの間で観察された組成物中の部分的な重複が推論42の基礎として使用されています。両方のアプローチは、インタラクトームの我々の理解に貴重なデータを貢献します。それにもかかわらず、親和性捕捉の1つの主な利点は、それが頻繁に努力は手順を最適化するために行われることを条件とする、無傷で高度に精製された複合体を得る機会を提供しないことです。私たちは、アプローチの将来は生理的相互作用の色域をより正確に評価し、さらに下流の生化学的、酵素学、および構造研究でより頻繁に使用するために、内因性のタンパク質複合体11の捕獲を最適化する使いやすさと効率性を高めることにあると信じています例えば 、7,9,23を参照します。

A correction was made to: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. The References section has been updated from:
<ol start="29">
	<li>Cristea, I. M., &#38; Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).</li>
	<li>Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63&#8211;117 (2005).</li>
	<li>Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321&#8211;349 (1964).</li>
	<li>Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404&#8211;427 (1964).</li>
	<li>Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680&#8211;685 (1970).</li>
	<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., &#38; Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856&#8211;2860 (2006).</li>
	<li>DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A.N., Padovan, J. C., &#38; Zhang, W. MALDI Sample Preparation. rockefeller.edu at &#60;http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html&#62; (2006).</li>
	<li>Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624&#8211;637 (2011).</li>
	<li>Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., &#38; Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752&#8211;1756 (2005).</li>
	<li>Wang, X., &#38; Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46&#8211;57 (2008).</li>
	<li>Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223&#8211;239 (2008).</li>
	<li>Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861&#8211;879 (2010).</li>
	<li>Armean, I. M., Lilley, K. S., &#38; Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1&#8211;13 (2013).</li>
	<li>Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).</li>
	<li>Cheeseman, I. M., &#38; Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).</li>
	<li>Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3&#8211;22 (2008).</li>
	<li>Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285&#8211;303 (2009).</li>
	<li>Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., &#38; Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403&#8211;3408 (2015).</li>
	<li>Glatter, T., Ahrn&#233;, E., &#38; Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).</li>
	<li>Zhao, Q.-Q., Yamada, S., &#38; Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29&#8211;36 (1989).</li>
	<li>Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., &#38; Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B 21 (7), 078201 (2012).</li>
	<li>Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345&#8211;347 (1982).</li>
	<li>Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597&#8211;604 (2001).</li>
	<li>Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).</li>
	<li>Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).</li>
	<li>Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., &#38; Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783&#8211;784 (2007).</li>
	<li>Zhao, X., Li, G., &#38; Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093&#8211;8 (2013).</li>
	<li>Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283&#8211;293 (2011).</li>
	<li>Williams, R. J., &#38; Lyman, C. M. A neutral buffered standard for hydrogen ion work and accurate titrations which can be prepared in one minute. J Am Chem Soc. 54 (5), 1911&#8211;1912 (1932).</li>
	<li>Johnson, M. Detergents: Triton X-100, Tween-20, and More. labome.com. 3 (163) (2013).</li>
	<li>Deppert, W. R., &#38; Luka&#265;in, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839&#8211;862 (1999).</li>
	<li>Ugwu, S. O., &#38; Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86&#8211;108 (2004).</li>
	<li>Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603&#8211;617 (2009).</li>
	<li>Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359&#8211;376 (2012).</li>
</ol>
to:
<ol start="29">
	<li>Ball Mills - Guidelines for sample amount and ball charge. 1&#8211;3at &#60;http://www.retsch.com/products/milling/ball-mills/planetary-ball-mill-pm-100/information-downloads/&#62; Retsch GmbH (2014).</li>
	<li>Cristea, I. M., &#38; Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).</li>
	<li>Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63&#8211;117 (2005).</li>
	<li>Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321&#8211;349 (1964).</li>
	<li>Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404&#8211;427 (1964).</li>
	<li>Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680&#8211;685 (1970).</li>
	<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., &#38; Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856&#8211;2860 (2006).</li>
	<li>DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A.N., Padovan, J. C., &#38; Zhang, W. MALDI Sample Preparation. rockefeller.edu at &#60;http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html&#62; (2006).</li>
	<li>Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624&#8211;637 (2011).</li>
	<li>Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., &#38; Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752&#8211;1756 (2005).</li>
	<li>Wang, X., &#38; Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46&#8211;57 (2008).</li>
	<li>Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223&#8211;239 (2008).</li>
	<li>Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861&#8211;879 (2010).</li>
	<li>Armean, I. M., Lilley, K. S., &#38; Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1&#8211;13 (2013).</li>
	<li>Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).</li>
	<li>Cheeseman, I. M., &#38; Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).</li>
	<li>Deppert, W. R., &#38; Luka&#265;in, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839&#8211;862 (1999).</li>
	<li>Ugwu, S. O., &#38; Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86&#8211;108 (2004).</li>
	<li>Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603&#8211;617 (2009).</li>
	<li>Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359&#8211;376 (2012).</li>
	<li>Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3&#8211;22 (2008).</li>
	<li>Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285&#8211;303 (2009).</li>
	<li>Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., &#38; Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403&#8211;3408 (2015).</li>
	<li>Glatter, T., Ahrn&#233;, E., &#38; Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).</li>
	<li>Zhao, Q.-Q., Yamada, S., &#38; Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29&#8211;36 (1989).</li>
	<li>Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., &#38; Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B 21 (7), 078201 (2012).</li>
	<li>Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345&#8211;347 (1982).</li>
	<li>Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597&#8211;604 (2001).</li>
	<li>Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).</li>
	<li>Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).</li>
	<li>Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., &#38; Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783&#8211;784 (2007).</li>
	<li>Zhao, X., Li, G., &#38; Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093&#8211;8 (2013).</li>
	<li>Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283&#8211;293 (2011).</li>
</ol>

A correction was made to: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. The References section has been updated.

Erratum: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

提示された手順の一般的なアプリケーションは、interactomicキャラクタリゼーション1のための目的の内在性タンパク質複合体の高い収率および純度を安定させ得ることです。主にタンパク質で構成さの両方を安定かつ一過関連巨大分子複合体の動的ネットワークは、細胞プロセス2,3を調整することが理解されます。タンパク質-タンパク質相互作用を同定するための多くの実験的なアプローチがあるが、親和性捕捉は、単離および生理学的なタンパク質複合体4-6を解剖するために最も広く用いられる方法の一つです。また、この技術は、読み出したデータポイントとしてだけでなく、物理的なエンティティとして、巨大分子複合体が得られるという利点を有します。有利には、得られた複合体は、このようにして、追加の下流の生化学的、酵素的、および構造的アッセイ7~9の宿主で使用することができます。提示されたプロトコルはproteiをマッピングする必要性に応えて開発されてきましたN - タンパク質相互作用ネットワークと細胞生物学のエフェクター分子としての役割に高分子複合体を特徴づけます。これらは、組織培養で増殖させた哺乳動物細胞への適用に関して詳述されているが、適切なシステム固有のひねり所与の生物学的試料の広い範囲にも等しく適用可能です。 親和性捕獲の歴史は、最初の免疫アフィニティークロマトグラフィー実験で逆世紀初頭に広がって - 一般的に免疫沈降（IP）として、今日と呼ばれるものに似ている - 1950年代初期によって文献に登場します。技術の主流の使用は、本10-13に、この世紀の変わり目で開発します。多様な細胞および分子生物学的研究は、少なくとも過去40年間14-19のために極低温で粉砕することにより、細胞の機械的破損を利用してきました。そして、（超）常磁性ビーズを用いた分子の分離は、BECを持っています過去20年間20以上の青梅ますます一般的。これらの異なる技術を組み合わせることで相乗的に自分自身と、より広い研究コミュニティによって生成される作業の広範な体によって証明されるように、1タンパク質複合体親和性捕捉実験で得られる結果を改善するのに役立っている7,9,11,18,19,21 -23。支持結果を図1に示されています。 警告および有効アフィニティー捕捉実験の実行に適用する考慮事項の収集文献1に見出すことができます。典型的には、この方法は、最も適切である：（I）これまで未知の同時精製タンパク質（探索的分析）を同定するためにタンパク質の質量分析（MS）を使用し、すなわち 、目的のタンパク質の相互作用をカタログ。特定の相互作用パートナーの存在について（II）アッセイ、 すなわち、特定のタンパク質または中に疑われるタンパク質の限定セットを検出するために、MSまたはウェスタンブロットを使用金利（仮説検定）のタンパク質とteract。または（III）追加の技術（取後処理）によるさらなる研究のために、目的のタンパク質を含む内因的に組み立てられたタンパク質複合体を準備します。親和性捕捉実験レジームに着手する前に、標的タンパク質は、目的の天然の標的タンパク質に対して、または融合タンパク質に付​​加されたタグに対して、典型的にIP能力の抗体に結合する高品質の親和性試薬を有することが不可欠です。すべての一般的な親和性のキャプチャと組み合わせて使用​​され、ウェスタンブロット法、およびタンパク質MS（例えばクーマシーブルー、シプロルビー、または銀、以下のSDS-PAGEなど）の一般的なタンパク質染色：場所で実験的な読み出しの適切なメソッドを持つことも重要です1。提示されたプロトコルは、親和性媒体としての抗体結合磁性ビーズを利用しています。親和性媒体の機能は、最初に、いくつかの実験パラメータを利用してテストで検証することができるが、各実験は、経験的に1,11,24を最適化すべきで最良の結果を得ます。プロトコルは3独特の相に分離されている：凍結細胞材料の（1）調製; （2）低温で固体粉砕による細胞破壊を。 （3）タンパク質の抽出および抗体結合常磁性ビーズを用いたアフィニティー・キャプチャー。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1304">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Growth media &#38; cell culturing implements</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:403px;">For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">500 cm^2 culture dishes</td>
			<td style="width:172px;">Corning</td>
			<td>431110</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large beaker (1-2L)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rectangular ice pan&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>13-900-747</td>
			<td>For producing frozen cells (I), &#38; cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large cell scrapers</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-100-242</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid nitrogen&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">50 ml conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td>For producing frozen cells (I), &#38; cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 ml Luer lock syringe</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leur lock syringe caps</td>
			<td>www.dymax.com</td>
			<td>T11182</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml tube rack, 4 position</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Styrofoam box</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Planetary ball mill, PM 100&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.540.0001&#160;</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel milling jar, 50 ml&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>01.462.0149</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel milling balls, 20 mm &#216;&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>05.368.0062</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm&#160;&#160;</td>
			<td style="width:172px;">www.marcorubber.com</td>
			<td>T1044-2.62x44.63</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">mini-LN2 decanter</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;">see Ref 19</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 ml PTFE jar insulator (optional)</td>
			<td style="width:172px;">Retsch</td>
			<td style="width:164px;">custom order</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">PTFE puck insulator (optional)</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;">The Rockefeller University</td>
			<td>For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">5 bar/500 KPA pressure relief valve (optional)</td>
			<td style="width:172px;">http://www.leeimh.com/</td>
			<td style="width:164px;">558 series check valve</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">1.5 - 2 ml microfuge tubes</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Extractant</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:567px;">cOmplete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:172px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:164px;">11873580001</td>
			<td style="width:403px;">For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Microtip sonicator, Q700</td>
			<td style="width:172px;">Qsonica</td>
			<td style="width:164px;">Q700</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">low intensity 1/16&#8221; microtip probe</td>
			<td style="width:172px;">Qsonica</td>
			<td style="width:164px;">4717</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Bench-top refrigerated microcentrifuge</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Dynabeads M-270 Epoxy</td>
			<td style="width:172px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:164px;">14302D</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III); see reference 19</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Sample rotator&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Neodymium magnet</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:164px;">123-21D&#160;</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">DTT</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-PAGE system</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-polyacrylamide gel</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Protein Stain</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein complex affinity capture from cryomilled mammalian cells

親和性捕捉は、さらなる研究のために内因性のタンパク質複合体を単離するための有効な手法です。抗体と組み合わせて使用​​すると、この技術は、しばしば、免疫沈降法とも呼ばれます。親和性捕捉は、ベンチスケールで、高スループットの状況で適用することができます。タンパク質の質量分析法と組み合わせると、親和性捕捉は、インタラクトーム解析の主力であることが証明されました。関連する多くの工程を実行するために、潜在的に多くの方法がありますが、次のプロトコルは、私たちに好まメソッドを実装します。 2つの機能は独特である。親和性媒体として、細胞抽出物、および抗体結合常磁性ビーズを製造するためcryomilled細胞粉末の使用。多くの場合、我々は、多くの従来の親和性捕捉の実践で得られたものよりも優れた結果を得ました。低温ミリングは、細胞破壊の他の形態に関連した多くの問題を回避します。 denatを回避しながら、それは、材料の効率的な破壊を提供します加熱または発泡に関連付けられレーションの問題。これは、巨大分子解離を軽減、抽出のポイントにネイティブのタンパク質濃度の上昇を保持します。これは有害な酵素活性を制限し、抽出されたタンパク質は、溶液中で費やす時間を短縮し、それは、親和性媒体によるタンパク質の非特異的吸着を減少させることができます。ミクロンスケールの磁気アフィニティー媒体はますます伝統的なagarose-とセファロースベースのメディアを交換し、最後の数年間で、より一般的になってきました。磁気媒体の主な利点は、典型的には、低い非特異的タンパク質吸着を含みます。いかなるサイズ排除限界ない結合タンパク質複合体は、ビーズ表面上ではなく、細孔内で発生するからです。および操作の容易さと磁石を使用して処理します。

図1は 、パネルIは、低温ミリングと磁性ビーズは、サンプルの品質を向上させるために一緒に働くことができることを示しています。パネルIA-Cは、親和性捕捉のために使用される不溶性の媒体を含む材料を回収プロテオーム19に影響を与えることができることを示しています。目的のタンパク質は、精製されたFLAGタグ化細菌アルカリホスファターゼ（BAP）は、ヒト細胞抽出物に添加しました。 BAPは、特異的に相互作用し、ヒトタンパク質を同時精製することが期待されていません。 SDS-PAGEおよびクーマシー染色によって判断同時精製タンパク質の署名は、使用される媒体に依存して変化しました。ミクロンスケールの磁気ビーズは、非特異的タンパク質吸着の比較的低いレベルを示す、クリーンなプロファイルを示しました。パネルIDおよびIEは、細胞溶解の方法は、回収されたプロテオームに影響を与えることができることを示します。提供された例では、内因性のタンパク質複合体は、（NEXT 37複合体）、アフィニティーcaptuに供しましたcyromilledまたは超音波処理した細胞からの再19を抽出します 。細胞抽出物はcryomilled細胞粉末から作製した場合、より少ない高質量の汚染物質が観察されました。 内因性タンパク質複合体を研究するために、アフィニティー捕捉を用いたチャレンジは、偽陽性（FPS）から目的のタンパク質の真正な生理学的相互作用を区別することは困難であり得ることです。 FPおよび/または対象自体のタンパク質に非特異的チューブ及び容器への吸着、親和性媒体、抗体またはアフィニティーリガンドを含む多くのソースから生じ得ます。その結果、かなりの努力が取得プロセスの最適化に専念しなければなりません。 FPの検出は、さまざまなツールの多くは、41-43 38-40実験と計算手法を含め、異なる長所と短所で各開発されているために中心的な課題のまま。私たち自身の実験において、我々は以前にFのパターンを指摘しました対照細胞抽出物とα-FLAG磁気媒体のインキュベーション後に得られた結合Pタンパク質は、それは3xFLAGタグ融合タンパク質の存在下で得られたパターンは異なっていました。さらに、これらのFPは3xFLAGペプチド7とのインキュベーションにより培地から放出され得ます。この観察は、日和見同族エピトープの非存在下でα-FLAGのパラトープへのFPの結合と一致しています。多くの研究は、親和性捕捉のための模擬対照として、タグの付いていない「親細胞株」を使用するので、このFPの背景の性質を理解することは重要です。これらのコントロールは、したがって、タグタンパク質との相互作用の特異性を決定するのは不適切かもしれません。抗体パラトープが占有またはされていないときに私たちの親和性媒体によって貢献したバックグラウンド結合を決定するために、我々は3xFLAGの存在下または非存在下で（ないタグ付きタンパク質が発現しない）モックα-FLAG磁気媒体を用いたアフィニティー捕獲実験及びHEK 293T細胞抽出物を実施しましたペプチドスパイクインチ結果を図1、パネルIIに示されています。簡潔には、α-FLAG磁気媒体は、500mMのNaClと30分間、20mMのHEPES-ナトリウムpH7.4中の1％V /トリトンX-100 Vを含む（≳10ミリグラム/ mlの総タンパク質）、細胞抽出物中でインキュベートしました。培地は、次いで競合変性溶出を達成するために、ネイティブまたはSDS-PAGE試料緩衝液でα-FLAGのパラトープに結合した任意のタンパク質を置換するために1mg / mlの3xFLAGペプチドと共にインキュベートしました。加えて、同じ実験を細胞抽出物に1μg/ mlおよび3xFLAGペプチドを10μg/ mlのスパイクしたときに行きました。すべての溶出画分をSDS-PAGE及び銀染色に供しました。我々は、その同族のエピトープの不在下で、α-FLAG媒体は3xFLAGペプチドで溶出させることができるバックグラウンドタンパク質の検出可能なレベルを捕捉していることを観察-実施例の図1-IIによって提供される、優勢な種は37の間で観察されました50kDaの。で溶出パターンSDS-PAGEサンプル緩衝液は、さらなる顕著な種と、同等でした。しかし、1 / mlの3xFLAGペプチドの存在下で、FPは、親和性媒体への結合は検出レベル未満まで除去し、いずれかの天然または変性溶出画分では観察されませんでした。この結果は、3xFLAG /α-FLAG M2の場合のように空いて抗体パラトープが、その同族エピトープの不在下で無差別であること、さらには高い親和性で、そのエピトープに結合する抗体についての親和性捕捉の間に得られたプロテオームに大きく貢献することができることを示唆していますペアリング。それはまた、多くの場合、非特異的結合を軽減するために選択された高濃度の塩を用いて、非常にストリンジェントな条件は、抗原/抗体相互作用の非存在下で無効であり得ることをsuggestd。フォローアップするために、我々は、SDS-PAGEによる分析だけでなく、定量的MS（ 図S1）を含む、同様の実験を行いました。定量化347タンパク質のうち、我々はすべてのタンパク質が1（偽ディスコのために保存することが観察されとても率= 1％; 3xFLAGペプチドが対照試料をスパイクと比較して、 表S1）は 3xFLAGタグ化ベイトタンパク質と関連していました。これらの結果は、我々の実験で観察されたタンパク質の圧倒的多数は、タグタンパク質と同時精製する可能性があるか、占有されていないα-FLAGのパラトープの副産物オフターゲットであることを示しています。我々の経験では、高い信号対雑音親和性捕捉の結果は、鋭い豊富でおおよそ化学量論的なバンドだけでなく、他の暗いバンドのバックグラウンド染色の不足の離散パターンでSDS-PAGEおよびタンパク質染色に例示されています。この原則の多数の例は、参照11で見ることができます。 低温ミリング時（推奨）PTFE絶縁体を使用するための動機は、フライス加工時の瓶の温暖化の速度を低下させる粉砕プロセス中に繰り返さLN 2冷却の負担を軽減し、氷の度合いを軽減することです瓶で形成。これは、一貫性のあるフライス性能を容易にし、細胞粉末の取り扱いが容易になります。例えば絶縁体は、基準27（パック）中に見出され、 図2に示されている、（スリーブ・アンド・パック）以下にすることができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54518/54518fig1.jpg" /> 図1：代表的な結果を選択します。 （I）このパネルでは、基準19から変更されています。クーマシーブルーSDSポリアクリルアミドゲルを染色しました。 （LEFT）ミクロンスケールの磁気ビーズは、オフターゲットアガロースベースのメディアよりも結合低く表示されます。 （A）磁性ビーズ; （B）従来のアガロース; （C）鉄含浸（磁気）アガロース;それぞれ、抗FLAG M2抗体に結合され、FLAGタグ、細菌アルカリホスファターゼ（BAP;標識）を捕捉するために使用cryomilled HEK-293細胞から産生された抽​​出物に添加。アガロースベースの精製非特異的吸着（非標識バンド）のより高いレベルを示しました。内因性タンパク質複合体を精製するために使用される場合cryomilled HeLa細胞から産生される（右）の抽出物を超音波処理することによって製造されるものより抗体結合磁性ビーズ上に低いオフターゲットの吸着を示します。 LAPタグ44 RBM7はNEXT複合19,37（D）を精製するために、ポリクローナル抗GFP抗体に結合された磁気ビーズを用いて捕捉親和性cryomilled粉末から製造抽出しました。無傷の細胞の超音波処理によって生成さ（E）を抽出します。縦の黒いバーが高質量の非特異的相互作用は、超音波処理した試料に濃縮されていることが観察されるゲルの領域を強調しています。黒い矢印が予想される特定の相互作用を示した（ラベル）。レーンD及びEで〜50kDaの観察のバンドはラマIgG重鎖に起因しています。 （II）銀は、SDSポリアクリルアミドゲルを染色しました。 HEK-293上で行う（STD）モックアフィニティー捕捉T細胞は、標準的な方法で抽出します。捕捉した後、結合した物質の溶出は、（N）を1mg / mlの3xFLAGペプチドまたはSDS-PAGE試料緩衝液で溶出変性（D）と非変性溶出を介して達成されました。基準色として（PB 1）。しかし3xFLAGペプチドは、親和性媒体にα-FLAGのパラトープをブロックするために1μg/ mlの抽出液に含まれていました。 PB 1としてではなく、10 / mlの3xFLAGペプチドの存在下で（PB 10）。 IgGの関連バンドと3xFLAGペプチドは標識されています。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54518/54518fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54518/54518fig2.jpg" /> 図2：スリーブ・アンド・パックのPTFE絶縁体。 250mlのPTFEジャーが示されている（1）。 50 mlのステンレス鋼製ミリングジャー（2）PTFEジャー（3）の内側にフィットし、提供しますサイクル間の工場内に設置された製粉ジャーを残す機会。上側のPTFE絶縁体パック（2）は、クランプアセンブリと瓶のふたとの間で使用されています。インストールジャーと絶縁体アセンブリ（3）を冷却するために、LN 2は、瓶を囲む、絶縁体の体内に直接追加されます。ミリングの次のサイクルが開始することができます。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54518/54518fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 推奨濃度 </td><td> ノート </td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td> 0.1〜0.5 M </td><td>高濃度（&gt; 300 mM）の全タンパク質の抽出を改善し、低バックグラウンドを維持する傾向があるが、いくつかの他の方法で安定した間を剥ぎ取ることができます俳優。 150mMの以下の濃度は、典型的には、非特異的バックグラウンドを減少させるのに有効ではありません。 </td></tr><tr><td>酢酸アンモニウム</td><td> 0.2〜2 M </td><td>二つのバッファからなる塩は、それは、中性pHの溶液57が得られます。より高い濃度は、いくつかのタンパク質複合体を安定化させます。酸性溶液は、アンモニア損失のアカウントに古い、不適切に保存された結晶性ストックから生じる可能性があります。追加のpH緩衝剤または塩は、酢酸アンモニウムを含む抽出に必要とされません。得られた結果を調節するために塩化ナトリウムと組み合わせてもよいです。 </td></tr><tr><td>トゥイーン20 </td><td> 0.1％v / vの</td><td>非イオン性界面活性剤58。典型的にはNaClで組み合わせます。 </td></tr><tr><td>トリトンX-100 </td><td> 0.5から1パーセントv / vの</td><td>非イオン性界面活性剤58。通常、NaClまたはNH 4 CH 3 CO 2 Hのいずれかと組み合わせ</td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> 5 mMの</td><td>両性イオン界面活性剤58 &lt;/ SUP&gt;。典型的にはNaClで組み合わせます。 </td></tr><tr><td>サルコシル</td><td> 1 mMの</td><td>バックグラウンドを減少させ、潜在的にバイナリ接続性を明らかにし、安定な複合体の成分を取り除くことができる陰イオン界面活性剤58。典型的にはNaClで組み合わせます。 </td></tr><tr><td rowspan="2">トリス-Cl </td><td> 20 mMの</td><td rowspan="2"> pK aは4°C、25°Cで8.1で8.8の。 </td></tr><tr><td> （pHは8.0） </td></tr><tr><td rowspan="2"> HEPES-ナ</td><td> 20 mMの</td><td rowspan="2"> pK aは4°C、25°Cで7.5で7.8の。 NaOHまたはKOHが抽出に使用される塩（ 例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはCH 3 CO 2 K）に応じたpH平衡化に用いました。 </td></tr><tr><td> （pH7.4）で</td></tr></tbody></table> 表1：精製タンパク質複合体のために有用ないくつか提案さ試薬。この表リットル私たちが提案した作業濃度で、ヒト細胞株から精製タンパク質複合体のために有用であることが分かってきたいくつかの試薬をISTS。典型的な抽出剤製剤は、pH緩衝剤、塩、洗剤1,11,24,45-48が含まれています 。ベストプラクティスは、所望の結果をもたらす試薬の少なくとも複雑な組み合わせを識別することです。 <img alt="図S1" src="/files/ftp_upload/54518/54518figS1.jpg" /> 図S1は：偽陽性の精製（MAP-）SILAC分析の後混ぜます。 I.概略図：この実験では（pLD401から発現）3xFLAGタグORF2pタンパク質複合体は、それぞれ、重鎖及び軽標識HEK-293T細胞7から精製しました。光標識細胞抽出物を、競合阻害によって3xFLAGタグ付きORF2pの親和性捕捉を防止するために、3xFLAGペプチドでスパイクしました。これは、非仕を発生する可能性があるタンパク質の結合をブロックすることが期待されていません磁気媒体または抗体の非paratopic構造に的。磁気ビーズから溶出した後、重鎖と軽サンプルは、混合後の精製および定量MSで分析したサンプルのいずれかに関連するタンパク質の割合を決定するために（39-SILAC MAP）。 表S1にあり、さらに方法論詳細。 II。銀は軽および重標識材料は同等の結果（HとLを比較）を得ていることを示すゲルを染色し、3xFLAGスパイクイン（LI）の存在下で実施精製が競争的に阻害されたこと。以下は、 表S1に記載されているように、混合H及び前ゲルベースプロテオーム解析にLI画分、からなるクマシーブルーG-250染色ゲルプラグ。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54518/54518figS1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> 表S1：MAP-SILAC。このシートは、図S1で説明したMAP-SILAC実験の実行時に得られたデータが含まれています。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54518/Table_S1.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells at JoVE.com

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

ここでは、極低温固体ミリングによって、哺乳動物細胞を破壊し、得られた細胞粉末から細胞抽出物を生成し、そして抗体結合ミクロンスケールの常磁性ビーズ上にアフィニティー捕捉により、目的のタンパク質複合体を単離するためのプロトコルを説明します。

Cryomilled哺乳動物細胞からのタンパク質複合体の親和性のキャプチャ

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

protein-complex-affinity-capture-from-cryomilled-mammalian-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

14.8K ビュー.  The Rockefeller University. ここでは、極低温固体ミリングによって、哺乳動物細胞を破壊し、得られた細胞粉末から細胞抽出物を生成し、そして抗体結合ミクロンスケールの常磁性ビーズ上にアフィニティー捕捉により、目的のタンパク質複合体を単離するためのプロトコルを説明します。 

ビデオ: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

真核細胞からのタンパク質複合体のタンデムアフィニティー精製

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

生化学

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional gene regulation (PTGR) of messenger RNAs (mRNAs). In the past few years, a number of mRNA-bound proteomes from yeast and mammalian cell lines have been successfully isolated through the use of a novel method called &#34;mRNA interactome capture,&#34; which allows for the identification of mRNA-binding proteins (mRBPs) directly from a physiological environment. The method is composed of in vivo ultraviolet (UV) crosslinking, pull-down and purification of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) by oligo(dT) beads, and the subsequent identification of the crosslinked proteins by mass spectrometry (MS). Very recently, by applying the same method, several plant mRNA-bound proteomes have been reported simultaneously from different Arabidopsis tissue sources: etiolated seedlings, leaf tissue, leaf mesophyll protoplasts, and cultured root cells. Here, we present the optimized mRNA interactome capture method for Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts, a cell type that serves as a versatile tool for experiments that include various cellular assays. The conditions for optimal protein yield include the amount of starting tissue and the duration of UV irradiation. In the mRNA-bound proteome obtained from a medium-scale experiment (107 cells), RBPs noted to have RNA-binding capacity were found to be overrepresented, and many novel RBPs were identified. The experiment can be scaled up (109 cells), and the optimized method can be applied to other plant cell types and species to broadly isolate, catalog, and compare mRNA-bound proteomes in plants.

Here, we present an interactome capture protocol applied to Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts. This method critically relies on in vivo UV crosslinking and allows for the isolation and identification of plant mRNA-binding proteins from a physiological environment.

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

炭水化物輸送基質結合タンパク質 SP0092 の生化学的および構造特性

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation of protein synthesis is the key to cellular stress-response, and dysregulation is central to many disease states, such as cancer. For instance, although cellular stress leads to the inhibition of global translation by attenuating cap-dependent initiation, certain stress-response proteins are selectively translated in a cap-independent manner. Discreet RNA regulatory elements, such as cellular internal ribosome entry sites (IRESes), allow for the translation of these specific mRNAs. Identification of such mRNAs, and the characterization of their regulatory mechanisms, have been a key area in molecular biology. Toeprinting is a method for the study of RNA structure and function as it pertains to translation initiation. The goal of toeprinting is to assess the ability of in vitro transcribed RNA to form stable complexes with ribosomes under a variety of conditions, in order to determine which sequences, structural elements, or accessory factors are involved in ribosome binding&#8212;a pre-cursor for efficient translation initiation. Alongside other techniques, such as western analysis and polysome profiling, toeprinting allows for a robust characterization of mechanisms for the regulation of translation initiation.

Toeprinting aims to measure the ability of in vitro transcribed RNA to form translation initiation complexes with ribosomes under a variety of conditions. This protocol describes a method for toeprinting mammalian RNA and can be used to study both cap-dependent and IRES-driven translation.

哺乳類の Mrna の翻訳開始複合体形成の Toeprinting 分析

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 の 1: タンパク質・ タンパク質代謝物の複合体の並列解析のための親和性の浄化をワンステップ

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the translocon at the outer (TOC) and inner (TIC) chloroplast membranes. The TOC and TIC complexes are multimeric and probably contain yet unknown components. One of the main goals in the field is to establish the complete inventory of TOC and TIC components. For the isolation of TOC-TIC complexes and the identification of new components, the preprotein receptor TOC159 has been modified N-terminally by the addition of the tandem affinity purification (TAP) tag resulting in TAP-TOC159. The TAP-tag is designed for two sequential affinity purification steps (hence "tandem affinity"). The TAP-tag used in these studies consists of a N-terminal IgG-binding domain derived from Staphylococcus aureus Protein A (ProtA) followed by a calmodulin-binding peptide (CBP). Between these two affinity tags, a tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site has been included. Therefore, TEV protease can be used for gentle elution of TOC159-containing complexes after binding to IgG beads. In the protocol presented here, the second Calmodulin-affinity purification step was omitted. The purification protocol starts with the preparation and solubilization of total cellular membranes. After the detergent-treatment, the solubilized membrane proteins are incubated with IgG beads for the immunoisolation of TAP-TOC159-containing complexes. Upon binding and extensive washing, TAP-TOC159 containing complexes are cleaved and released from the IgG beads using the TEV protease whereby the S. aureus IgG-binding domain is removed. Western blotting of the isolated TOC159-containing complexes can be used to confirm the presence of known or suspected TOC and TIC proteins. More importantly, the TOC159-containing complexes have been used successfully to identify new components of the TOC and TIC complexes by mass spectrometry. The protocol that we present potentially allows the efficient isolation of any membrane-bound protein complex to be used for the identification of yet unknown components by mass spectrometry.

We here present a proven and tested protocol for the purification of chloroplast protein import complexes (TOC-TIC complex) using the TAP-tag. The one-step affinity-isolation protocol can potentially be applied to any protein and be used to identify new interaction partners by mass spectrometry.

タップのタグを使用して葉緑体トランスロコン タンパク質複合体の親和性の浄化

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis of transcriptome and gene expression by qPCR and RNA sequencing. Comprehensive transcriptome and gene expression analysis of specific cell types in complex tissues and organs will be critical to understand cellular and molecular mechanisms by which genes are regulated and their association with tissue homeostasis and organ functions. In this article, we demonstrate the methodology for isolation of ribosome-bound RNA directly in vivo in the vascular endothelia of animal lungs as an example. The specific materials and procedures for tissue processing and RNA purification will be described, including the assessment of RNA quality and yield as well as real time qPCR for arteriogenic gene assays. This approach, known as translating ribosome affinity purification (TRAP) technique, can be utilized for characterization of gene expression and transcriptome analysis of certain cell types directly in vivo in any specific type in complex tissues.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

We present an approach to purify ribosome-bound mRNA from vascular endothelial cells (ECs) directly in mouse brain, lung and heart tissues via EC-specific genetic tag of enhanced green fluorescence protein (EGFP)in ribosomes in combination with RNA purification.

生体内細胞からのRNA単離に対するリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall process costs. Alternative, cost-effective capture steps are therefore valuable for industrial-scale manufacturing, where large quantities of a single mAb are produced. Here we present a method for the immobilization of a DsRed-based epitope ligand to a cross-linked agarose resin allowing the selective capture of the HIV-neutralizing antibody 2F5 from crude plant extracts without using Protein A. The linear epitope ELDKWA was first genetically fused to the fluorescent protein DsRed and the fusion protein was expressed in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) plants before purification by immobilized metal-ion affinity chromatography. Furthermore, a method based on activated cross-linked agarose was optimized for high ligand density, efficient coupling and low costs. The pH and buffer composition and the soluble ligand concentration were the most important parameters during the coupling procedure, which was improved using a design-of-experiments approach. The resulting affinity resin was tested for its ability to selectively bind the target mAb in a crude plant extract and the elution buffer was optimized for high mAb recovery, product activity and affinity resin stability. The method can easily be adapted to other antibodies with linear epitopes. The new resins allow gentler elution conditions than Protein A and could also reduce the costs of an initial capture step for mAb production.

In this procedure, a DsRed-based epitope ligand is immobilized to produce a highly selective affinity resin for the capture of monoclonal antibodies from crude plant extracts or cell culture supernatants, as an alternative to Protein A.

アフィニティクロマトグラフィー樹脂の急速な発達のための活性化架橋アガロース - ケーススタディとしての抗体捕捉

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty acids via a labile thioester bond. S-acylation, which is emerging as a widespread regulatory mechanism, can modulate almost all aspects of the biological activity of proteins, from complex formation to protein trafficking and protein stability. The recent progress in understanding of the biological function of protein S-acylation was achieved largely due to the development of novel biochemical tools allowing robust and sensitive detection of protein S-acylation in a variety of biological samples. Here, we describe acyl resin-assisted capture (Acyl-RAC), a recently developed method based on selective capture of endogenously S-acylated proteins by thiol-reactive Sepharose beads. Compared to existing approaches, Acyl-RAC requires fewer steps and can yield more reliable results when coupled with mass spectrometry for identification of novel S-acylation targets. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between fatty acid species attached to cysteines via the same thioester bond.

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) is a highly sensitive, reliable and easy to perform method to detect reversible lipid modification of cysteine residues (S-acylation) in a variety of biological samples.

アシル樹脂アシスト捕捉によるプロテインS-アシル化の検出

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...