岬-ブラジル、研究集会-ブラジル、FAP/DF の金融支援に感謝いたします。原稿の校正のため博士ヒューゴ コスタ ・ パエスに感謝しております。

1. ソリューションとメディア
<ol><li>2 X ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 1640 媒体、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、サブロー ・ デキスト ロース ・ スープ、表 1に従ってサブロー デキスト ロース寒天培地を準備します。</li>
</ol>2. 真菌の菌の成長条件
<ol><li>必要になるまで、-80 ° c、35% のグリセロールで凍結する在庫としてすべての真菌系統を格納します。</li>
	<li>各実験の前に次の手順を実行します。<ol>
<li>カンジダ ・ アルビカンス系統。<ol>
<li>ストックのバイアルを解凍し、200 μ L をキャップと撹拌 (200 rpm) 30 ° C で一晩文化滅菌 50 mL ポリプロピレン チューブにサブロー ブドウ糖液 10 mL に転送します。チューブを傾斜し、文化のよりよい通気を少し開いてキャップを残すしてください。</li>
		</ol>
</li>
		<li>クリプトコッカス ・ ネオフォルマンス系統。<ol>
<li>冷凍ストック バイアル表面をこすり。サブロー ・ ブドウ糖寒天培地プレート上に細胞をプレートし、30 ° C で 48 時間インキュベート隔離されたコロニーの目に見える成長は後に、、最大 15 日間のパラフィン フィルムで封冷蔵庫 (4 ° C) でプレートを維持します。</li>
			<li>生殖不能のつまようじまたは滅菌接種ループを用いた平板から中型の隔離されたコロニーを収集し、滅菌 50 mL の円錐管にサブロー ブドウ糖液 10 mL に接種します。撹拌 (200 rpm) 30 ° C で約 24 時間インキュベートします。</li>
			<li>24 時間培養を超えないようにします。チューブを傾斜し、よい通気を少し開いてキャップを残すしてください。常に、これは抗菌薬耐性に影響を与える重要な要因ですので、各テストの前に細胞の生育を標準化することをお勧めします。 注: 両方の菌が急速な伝播実験では、30 ° C で栽培されたが、温度を研究、たとえば臨床治療 (37 ° C) の目的を反映するように変更できます。最も重要なは、この最初の孵化時間の各真菌の分離の事前確立・再現性を確保するためのすべてのテスト全体で維持する必要があります。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>菌の増殖後室温で 5 分間 1,200 x g で円錐管を遠心分離によって細胞を収集します。上澄みを廃棄し、PBS の 10 mL を加えます。</li>
	<li>再懸濁します細胞と遠心分離機再び室温で 5 分間 1,200 x g で。</li>
	<li>PBS 洗浄と遠心分離をさらに 2 回繰り返します。第 3 洗浄後 2 X RPMI 1640 媒体 (ペレットのサイズ) によると 5 mL の細胞を再懸濁します。</li>
	<li>1: 100 または縮尺希釈 (細胞懸濁液の濁度) に応じて遠心管に 1 mL を準備します。</li>
	<li>この希釈 10 μ L 分注検定商工会議所に配置し、顕微鏡下での 4 つのコーナー領域内のセルの合計数をカウントします。計算式で濃度: (総細胞数/4) × 希釈係数 x 104 (商工会議所希釈定数)。<ol>
<li>生存数と成長条件が検討されている分離の体系的に関連付けられた場合は、100% の生存率を検討してください。 注: 標準化と生存率のカウントの品質管理することができる抗菌感受性試験 (EUCAST) 抗真菌酵母10 最小阻止濃度 (MIC) 法に関する欧州委員会に従ってバック メッキ.</li>
		<li>場合は調査の下で分離の成長/生存率の相関関係が確立されていない、フロキシン B11、トリパン ブルーなどの死んだ細胞を選択的に色の染料の援助と検定で生きているセルをカウントすることによって菌の生存率を測定します。12、ヤヌス グリーン13か。場合にのみ、この時点の人口の生存率は 90% 以上は、このプロトコルの真菌細胞を使用します。 注: デッド/生きている染料が選択の菌とも限りません。使用する前にそれらをテストしてください。たとえば、トリパン ブルー色素はクリプトコッカスとうまく働きません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>その後、2 X RPMI 1640 培地で細胞懸濁液を準備 (2 X 調整 RPMI 1640 培地で接種)。96 ウェルのプレートは、各プレートの 5 mL の量を検討してください。<ol>
<li>C. アルビカンス株すべての 4 x 103セル/mL のストックの細胞懸濁液を準備します。この濃度は各ウェル (2 x 103セル/mL) の最終的な細胞濃度の 2 X です。</li>
		<li>クリプトコッカス菌 2 x 10 のセル4セル/mL のストック文化を準備します。この濃度 (1 × 104セル/mL) 各ウェルで最後のセル濃度 2 倍であります。</li>
		<li>他の菌濃度、培養時間に関連して特定の研究にとって理想的である知られている抗真菌剤でテストします。菌の代謝と複製の時間を考慮します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ペプチド (不明なエージェント)
<ol><li>-20 ° C で凍結乾燥させたペプチドを格納し、それらを各実験の前に脱イオン水に溶解します。一度水に溶解したストレージの最大時間は、各ペプチドの性質によって異なります。</li>
	<li>試金 (2 X) でテスト最高の最終濃度 2 倍の因数を準備します。理想的には、凍結融解サイクルを避けるために 1 つの時間の使用のための十分なペプチドの因数の数が少ないを準備します。 注: 濃度の選択は、文学とペプチドの性質に基づく必要があります。約 100 μ m、ペプチドのシリアル希薄を開始し減少するか、または得られた結果によってこの濃度範囲を増加させることをお勧めします。</li>
</ol>4. 参照抗真菌薬 (ポジティブ コントロール)
<ol><li>水で希釈したそれらのため: 分析の最高濃度の 2 X ソリューションの準備 (セクション 5 を参照してください: ステップの希釈の抗真菌の試金)。<ol>
<li>C. アルビカンス菌のフルコナゾールの 128 μ G/ml またはキャスポファンギンの 128 μ g/mL の溶液を準備します。両方のプレート濃度 64 μ g/mL になります。</li>
		<li>クリプトコッカス菌のアムホテリシン b (水溶性溶液) 32 μ g/mL の溶液を準備します。プレート濃度 16 μ G/ml になります。 注: 通常アムホテリシン B 希釈ジメチルスルホキシド (DMSO) でこの抗真菌剤は水には溶けにくいので。ただし、市販水溶性アムホテリシン B 製剤があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>有機溶剤で希釈した抗真菌薬のため: X、DMSO に原液 100 を用意し、その使用のための水で 10 倍に希釈します。 注: したがって、井戸に DMSO の最終濃度が 1% を超えてください。制御が必要ないくつかの菌類を容認しないもこの濃度、溶媒のことを考えると 1 %dmso を含んでいる媒体で菌をなるも。DMSO は感光性を覚えて、だから箔プレート カバーまたは潜伏期間の持続期間のための暗い部屋に配置。</li>
</ol>5. 抗真菌アッセイ
注: In vitro抗真菌アッセイがいくつかの変更と臨床と研究室の標準研究所 (CLSI) M27 A3 ガイドラインからスープの希釈感受性試験に基づいて実行されます。
<ol><li>各ペプチドが 2 倍連続希釈を準備し、50 μ L の最終巻にポリスチレン 96 ウェル マイクロ プレートで抗真菌薬を制御します。<ol>
<li>最高の 2 倍の濃度で抗真菌剤/ペプチドの 100 μ L 必要な列に最終濃度 1-3、行内 A. 追加ピペットを使用して</li>
		<li>マルチ チャンネル ピペットを使用して、行 B h で、他の井戸に 50 μ L の滅菌水を追加します。</li>
		<li>最高濃度 (行 A) と井戸の 50 μ L を削除、次の濃度 (B 列) の次に移し、均質化します。</li>
		<li>最低濃度で井戸まで上記の手順を繰り返して、この井戸 (列 H) の 50 μ L を廃棄します。水だけで空のコントロールまたは負/成長コントロールのいずれかを列 11、12 (行 A、B、C) を残します。</li>
		<li>(1-3 列と列 11 (負/成長制御)); 各ウェルに RPMI 1640 中調整接種 × 2 の 50 μ L を追加します。C. albicansの最終濃度になり 2 x 103セル/mL、最終濃度クリプトコッカス菌 104セル/mL になります。</li>
		<li>空白のコントロールを準備 (50 μ L の水 + 50 μ L 2 セルなし X RPMI 1640 媒体) 負/成長制御 (50 μ L 水 + 抗真菌薬なし 50 調整 μ L 接種 2 X RPMI 1640 媒体) と記載されている上記のウェル プレートに負荷。</li>
	</ol>
</li>
	<li>テストするそれぞれの化合物のプロシージャは、選択した抗真菌コントロール (4-10 列) を繰り返します。 注: シリアル希薄することができる垂直方向に、下の実験としてまたは水平方向 (すなわち、与えられた化合物/抽出テストする必要があるの希釈液の数が 8 個以上場合) のプレートに。<ol>
<li>化合物を参照する場合薬、またはそのコンポーネントのいずれかが感光性、削減された光でアッセイを行う、箔、板をカバーまたは孵化中に暗い部屋に配置。</li>
	</ol>
</li>
	<li>次のオプションの推奨事項を検討してください。<ol>
<li>蒸発を削減とガス交換を許可する明確なカバー プレートとプレートをシールします。</li>
		<li>プレートが、湿気のある商工会議所;それも蒸発を減らすのに役立ちます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>クリプトコッカスの揺れ 200 rpm 37 ° c 24 時間または 48 h 48 h、 c. アルビカンス株すべての版を孵化させなさい。最終的な音量 (100 μ L) により、波及効果が発生しません。 注: 有意差が認められなかった 24 h でマイク測定値とC. albicansの緊張のための 48 時間の間。それにもかかわらず、48 時間の測定値は、視覚化やすくなっています。</li>
	<li>潜伏期間前後倒立光学顕微鏡の援助と汚染の兆候を確認する同様の形態変化を確認するすべての井戸を観察します。 注: 読みすることができます視覚的に行うし、実験の終わりに撮影します。読む前にプレートを少しホモジナイズしてください。読み取りは、600 の外径を測定することによっても実行できます nm、細胞塊またはフィラメント現象は観察されていません。</li>
	<li>別の日に少なくとも 3 回の実験を実行します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neglected+epidemic:+fungal+infections+in+HIV/AIDS.">A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS.</a> Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).</li><li>Romani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+to+fungal+infections.">Immunity to fungal infections.</a> Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).</li><li>Pfaller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+drug+resistance:+mechanisms,+epidemiology,+and+consequences+for+treatment.">Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment.</a> Am J Med. 125 (1 Suppl), S3-S13 (2012).</li><li>Hancock, R. E., Diamond, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cationic+antimicrobial+peptides+in+innate+host+defences.">The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences.</a> Trends Microbiol. 8 (9), 402-410 (2000).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snake+cathelicidin+from+Bungarus+fasciatus+is+a+potent+peptide+antibiotics.">Snake cathelicidin from Bungarus fasciatus is a potent peptide antibiotics.</a> PLoS One. 3 (9), e3217 (2008).</li><li>Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AaeAP1+and+AaeAP2:+novel+antimicrobial+peptides+from+the+venom+of+the+scorpion,+Androctonus+aeneas:+structural+characterisation,+molecular+cloning+of+biosynthetic+precursor-encoding+cDNAs+and+engineering+of+analogues+with+enhanced+antimicrobial+and+anticancer+activities.">AaeAP1 and AaeAP2: novel antimicrobial peptides from the venom of the scorpion, Androctonus aeneas: structural characterisation, molecular cloning of biosynthetic precursor-encoding cDNAs and engineering of analogues with enhanced antimicrobial and anticancer activities.</a> Toxins (Basel). 7 (2), 219-237 (2015).</li><li>Benincasa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungicidal+activity+of+five+cathelicidin+peptides+against+clinically+isolated+yeasts.">Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts.</a> J Antimicrob Chemother. 58 (5), 950-959 (2006).</li><li>CLSI. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibiliy Testing of Yeasts; Approved Standard -Third Edition. CLSI document M27-A3. , (2008).</li><li>Guilhelmelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+Scorpion+Venom-Derived+Antifungal+Peptides+against+Planktonic+Cells+of+Candida+spp.+and+Cryptococcus+neoformans+and+Candida+albicans+Biofilms.">Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms.</a> Front Microbiol. 7, 1844 (2016).</li><li>Roongruangsree, U. T., Kjerulf-Jensen, C., Olson, L. W., Lange, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+Tests+for+Thick+Walled+Fungal+Spores+(ex:+Oospores+of+Peronospora+manshurica).">Viability Tests for Thick Walled Fungal Spores (ex: Oospores of Peronospora manshurica).</a> Journal of Phytopathology. 123 (3), 244-252 (1988).</li><li>Boedijn, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+as+stain+for+fungi.">Trypan blue as stain for fungi.</a> Stain Technol. 31 (3), 115-116 (1956).</li><li>Goihman-Yahr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+plating+efficiency+and+estimation+of+viability+of+suspensions+of+Paracoccidioides+brasiliensis+yeast+cells.">Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells.</a> Mycopathologia. 71 (2), 73-83 (1980).</li><li>Tati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histatin+5-spermidine+conjugates+have+enhanced+fungicidal+activity+and+efficacy+as+a+topical+therapeutic+for+oral+candidiasis.">Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58 (2), 756-766 (2014).</li><li>Petrou, M. A., Shanson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+Cryptococcus+neoformans+by+the+NCCLS+microdilution+and+Etest+methods+using+five+defined+media.">Susceptibility of Cryptococcus neoformans by the NCCLS microdilution and Etest methods using five defined media.</a> J Antimicrob Chemother. 46 (5), 815-818 (2000).</li><li>Zaragoza, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+analysis+of+variables+for+standardization+of+antifungal+susceptibility+testing+of+nonfermentative+yeasts.">Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts.</a> Antimicrob Agents Chemother. 55 (4), 1563-1570 (2011).</li><li>Rodriguez-Tudela, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+shaking+on+antifungal+susceptibility+testing+of+Cryptococcus+neoformans:+a+comparison+of+the+NCCLS+standard+M27A+medium,+buffered+yeast+nitrogen+base,+and+RPMI-2%+glucose.">Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).</li><li>Beggs, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+phase+in+relation+to+ketoconazole+and+miconazole+susceptibilities+of+Candida+albicans.">Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans.</a> Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).</li><li>Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungicidal+properties+of+defensin+NP-1+and+activity+against+Cryptococcus+neoformans+in+vitro.">Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro.</a> Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).</li></ol>

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希釈テスト目標化合物、化合物の少量を使用して潜在的な抗真菌活性を解析したり、同時に濃度の範囲でそれをテストします。したがって、潜在的な新規抗真菌化合物のスクリーニングの最初のステップとしては、このプロトコルの使用をお勧めします。ここで提示されたプロトコルは、抗真菌療法診療所の選択を支援するために設計、M27 A3 プロトコルに基づいており、さまざまな新しい抗真菌化合物に適応することができます。全体的に、このプロトコルは、抽出物、化合物の物理化学的機能に集中できます。メディアの化合物がヒスタチン 514に及ぼす RPMI など真菌の細胞との相互作用をブロックして、たとえば、アッセイの潜在的な候補を効果が表示誤って。この場合、RPMI が干渉するときの代替メディアはモップ pH 715酵母窒素ベース (YNB) バッファーです。
参照抗真菌結果がガイドラインの範囲内である限り、プロトコルも変更前の成長条件、菌濃度、培養温度、光に敏感なコンポーネントをできます。参照抗真菌は、テスト菌種の現在の療法に基づくべき。さらに、参照がある場合それは潜在的な薬剤-例えば、テスト菌モデルに対して抗真菌活性を有する知られている抗菌ペプチドに似た性質をもつ化合物-追加の参照コントロールとして使用する必要があります。
菌に合わせてニーズを研究する前の成長条件を変更できます。プロトコルのように、クリプトコッカス、 C. albicansのよりよい伝播 30 ° C で育った。それにもかかわらず、この温度は菌の代謝によって変更できます: たとえば、ひふの酵母フォームを維持するために 37 ° C で成長を必要とし、その遅い重複率が、5-7 日間栽培する必要があります。したがって、潜在的な新しい薬をテストするため真菌特性を理解することが不可欠です。さらに、年齢、使用細胞の成長の段階は、各研究の目的に従って定義する必要があり。、最も重要なは、最初の孵化時間の事前確立・再現性を確保するためのすべてのテストの全体で維持する必要があります。.
同様に場合化合物/抽出や参照抗真菌剤希釈液は光に敏感の手順は、追加削減された光での作業、箔、板をカバー、中に暗い部屋にプレートを配置するなど、その劣化を防ぐためにインキュベーション時間。
また、湿気の多い部屋のプレートを配置することによって外部の井戸を使用していない、水、またはそれらを充填空井戸水の添加と、エッジ効果及び蒸発を減少することができます。
このメソッドを使用するときの主な制限の 1 つは、殺菌や菌の効果間の区別ではなく、テストされた化合物の阻害活性に重点です。しかし、目的は潜在的な新しい抗真菌剤の高速スクリーニング明確な肯定的な (' クリア/非混濁 ' 井戸) と負 ('濁り' 井戸) の結果初期視覚評価マイク、識別するのに役立ちます化合物研究に関心のさらに、その新規化合物のスクリーニングの全体的なコストの削減。
これらの新しい化合物の作用機序が不明なために、阻害、または肯定的な井戸をめっきまたはライブ/デッド染料の使用など、いくつかの追加の手順を追加することによって真菌細胞を殺すために化合物の能力を決定するこれと同じプロトコルを使用できます。他のマイナーな修正は、市松模様の滴定試金のためのプロトコルを使用して他の薬剤化合物の相乗効果を識別する追加できます。
アッセイの読書は通常カビない抗真菌剤 (負/成長コントロール) と井戸の成長と比較して異なる条件下での視覚的な分析によって実行されます、それ行うことがもできます 600 その外径を測定することにより nm。ただし、OD 測定は同種のソリューションの正確なが、いくつかの菌は塊を破るために-法の精度など、潜伏期間中にフィラメント現象の結果としてカンジダ属で育ちます。
その一方で、CLSI M27 A3 ガイドラインと比較すると、ここで説明されたプロトコルの主要な利点の 1 つはのような非発酵菌のためのメディアのアカウント曝気にかかることがクリプトコッカス。また、CLSI ガイドラインは、真菌の成長およびマイク定義のインキュベーションの長期間必要になるため、小さな初期接種のみ使用します。いくつかの研究は、高いイニシャル乳酸菌と培養中板を振動がマイク定量16,17に重大な影響なし抗真菌薬感受性テストを向上させることを実証しています。我々 のプロトコルは、CLSI ガイドラインによって提案された 72 h と比較して、48 時間以内の潜伏期の短い期間でクリプトコッカスに対する新しい化合物の MIC を正確に決定できます。
別の利点は、我々 のプロトコルが 200 μ L 抗真菌のアッセイに必要なテストの新しい化合物の量を減らすための CLSI ガイドラインが推奨する代わりに 100 μ L の最終巻を使うことです。しかし、外部井戸の蒸発が、問題になる可能性がありますが、すでに蒸発を減らすこのセクションで説明するソリューションは、アッセイの結果を損なうことがなく使用できます。
さらに、プレートに直接希釈を行うと入り込んで、マイクロ遠心チューブ用の CLSI 希釈ガイドライン、マルチ チャンネル ピペットを使用できます。このプロトコルのアセンブリは CLSI ガイドラインの 1 つより少ない複雑も少ない材料を使用します。
真菌の細胞作製に関連する重要なステップとして可能な限り新鮮な細胞の使用であります。また、文化の年齢18,19時抗真菌薬感受性の違いについての文献でいくつかのレポートがあるので、同じ成長段階でセルですべてのアッセイを実行することが重要です。指令系統の慎重な選択も重要です。非常に敏感なまたはほとんど孤立した種は、抗真菌の可能性の明確な映像を限らない。同様に、アッセイに多くの変数を追加するサブ養殖の手順を回避することをお勧めします。たとえば、(これは速く成長) カンジダ菌、我々 は液体媒体に直接接種することによって寒天プレート ステップをバイパスすることを好みます。
テストする物理化学的特徴抽出物または化合物が考慮すべき重要なことを覚えています。たとえば、抽出物または化合物が、水以外の溶媒に溶解する適切な真菌の増殖制御を持っていることを確認する必要がありますそれだけで菌と同じ溶媒濃度を含まれます。これは、観察、成長阻害がテストの化合物ではなく溶剤のためではないことを保証または抽出することです。などの溶媒の割合を削減するテスト最高の濃度よりも少なくとも 100 倍高い濃度で薬を溶解、希釈 DMSO 抗真菌薬の CLSI M27A3 勧告に従うほうが可能性のケースでは、プレート。
安定性については、分析の抽出物または化合物の小さい因数を維持することをお勧めします。適当な温度、因数の過剰な操作で単一のアッセイ、凍結融解サイクルを避けることができる抽出物または化合物が冷凍保存されている場合、必要なボリュームを格納することによって。
最後に、最も基本的な手順の 1 つがマイクロ プレート シリアル希釈精度与えられた連続希釈に沿ってピペッティング エラーが伝達されます。今後は、ピペットの精度と適切な分注技術は、再現性を確保するため最優先されます。だから、不可欠だピペット校正を使用して常にチェック、ボリュームが追加、各ウェルから削除された場合は正しいです。ピペット チップに薬剤からの痕跡が残ることまたはその残渣を確認します。化合物は、先端に固執する傾向がある場合、希釈間ヒントを切り替える方が良いことがあります。

真菌感染症となっている重要な医学的関心最近数十年でがん治療と HIV/エイズとともに生きる人の受診者など免疫不全の個体数の増加を主因は増大したことや臓器1,2を移植しました。ただし、使用可能な抗真菌薬の非常に限られた配列とそれらにカビ抵抗性の報告数の増加が全身性真菌症3の治療法に関する主要な問題に貢献します。
新規抗真菌化合物の潜在的なソースは、抗菌ペプチド (アンペア)、感染4彼らの生得の免疫反応の一部として多くの生物によって生成される小さなカチオン性ペプチドです。それにもかかわらず、真菌病原体に対するこれらの化合物をテストするスクリーニング法は標準化されていません。異なったプロシージャは、時に同じモデル微生物5,6,7アンペアの抗真菌活性を評価するために使用されています。これらの相違点といくつかのプロトコルの細部の欠乏は、化合物とフラワーの再現性比較を複雑にします。
新しい薬剤の候補者の試験を標準化する方法の 1 つは、臨床などの臨床現場における抗真菌薬感受性を定義するために使用し、実験室標準研究所 (CLSI) M27 A3 のガイドラインに従うことです。ただし、これらの抗真菌薬感受性試験が厳しすぎると考慮しない代謝の変化を考察種類を渡って、彼らはのみいくつかの [エージェントの確立されました。たとえば、とることはありません考慮非発酵性酵母の代謝の必要な。
このプロトコルにより、将来の抗真菌活性物質の活動の評価と抗真菌ペプチドの検索ここに実装されています。それは、新しい化合物8,9のスクリーニングを最適化修正 CLSI M27 A3 ガイドラインからスープ希釈感受性テストに基づいています。これらの変更はコントロールとして参照を抗真菌薬の使用で結果を標準化しながら、最適の事前テスト成長少量化合物の温度や初期とさまざまなメディアでのバリエーションの使用を許可します。ウェル培養皿の使用で、このメソッドでは、画面多数の化合物の迅速かつ確実に可能です。
その固有の柔軟性のため化合物のいくつかの適応で、他の微生物に対する別の化学の授業でこのプロトコルを使用することができます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Media and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31800-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um s&#243;dio, completa o nome dele please)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Use to buffer 2X RPMI medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Din&#226;mica</td>
			<td>1528-1</td>
			<td>137 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>3040-01</td>
			<td>2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V000129</td>
			<td>10 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60230</td>
			<td>2 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Sabouraud dextrose broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>238230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Sabouraud Dextrose Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>210950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V000123</td>
			<td>35% for (solu&#231;&#227;o de estoque? Criopreserva&#231;&#227;o?)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Para dilui&#231;&#227;o das drogas na dilui&#231;&#227;o seriada</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifungal drugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluconazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspofungin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dish petri</td>
			<td>J.Prolab</td>
			<td>0304-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Solution Reservoir</td>
			<td>KASVI</td>
			<td>K30-208</td>
			<td>Use to pippet the solutions using the multichannel pippet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and other materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E200MV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MegaFuge 16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Ethik Technology</td>
			<td>403-3D</td>
			<td>Set to 37&#176; C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Excella E25</td>
			<td>Set to 37&#176; C, 200 RPM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber, Neubauer</td>
			<td>BOECO Germany</td>
			<td>BOE 13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>HTL</td>
			<td>5123</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

broth microdilution in vitro screening: an easy and fast method to detect new antifungal compounds

真菌感染症になっている最後の十年の重要な医療条件ですが使用可能な抗真菌薬の数は限られています。このシナリオでは、新しい抗真菌薬のサーチが必要です。ここで報告されるプロトコルは、抗真菌薬のプロパティの画面のペプチドにメソッドを詳しく説明します。それは潜在的な新しい抗真菌薬としての抗菌ペプチドの研究に合わせて変更と臨床と研究室の標準研究所 (CLSI) M27 A3 ガイドラインからスープの希釈感受性テストに基づいています。このプロトコルは、抗真菌化合物の活性を評価する機能の試金を記述および調査の下の分子の特定のクラスに合わせて簡単に変更可能性があります。法は、少量を使用して 96 ウェル プレートで実行される、大規模スクリーニングは、特に場合は、自動設定で実施時間の短時間で完了できます。この手順では、標準化された、調節可能な臨床プロトコルが真菌症の治療を改善するために新しい分子のベンチ作業の追求を助けることができる方法を示しています。

マイクは、潜伏期間の終わりに目に見えるカビを完全に阻害する最も低い抗菌化合物の濃度として定義されます。任意も濁度負/増殖制御井戸に似ていますが、明確なメディア空井戸のようで、よくは肯定的な結果を考慮この議定書の目的は画面の潜在的な抗真菌薬の高速メソッドを持っているため、否定的な考え。ただし、指定されたアンプは菌や殺菌するかどうかを知ることに興味がある場合肯定的な井戸からメディアもサブロー ・ デキスト ロース寒天培地の上にメッキしたり別の生存率テストでチェックします。
新規化合物の作用のメカニズムは知られている、したがって、菌分離 (チェック要領、テーブル、または文献データ) チェックする前に、予想される範囲内参照抗真菌にあるかどうかを確認する不可欠です、(この場合、アンプ; に化合物のテストのマイク図 1と図 2) 条件が理想的であることを確認します。尊敬される範囲には該当しない場合、は、かどうか、観察された変更はテスト化合物にのみを決定することになるので、実験を再実行する必要があります。同様に前に、と形態と汚染の変化をチェックするための潜伏期間後、光学顕微鏡の下ですべての井戸を観察することが重要です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57127/57127fig1.jpg"> 図 1。クリプトコッカス ・ ネオフォルマンススープ希釈アッセイを用いたに対して 3 つのペプチドの抗真菌活性評価。菌濃度が 1 × 104セル/mL。3 つのペプチドを調べた (AMP1、列 3 に 1;AMP2、列 5 に 7;AMP3、列 10 に 8) 濃度が 100 μ M (A 行) から 0.78 μ M (列 H) に至るまで。成長制御と空白列 11 と 12 で、それぞれ。培養 48 時間後デジタル カメラでイメージを得ました。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57127/57127fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57127/57127fig2.jpg"> 図 2。3 ペプチド スープ微量液体希釈法によるカンジダに対しての抗菌活性の評価。菌の濃度は、2 × 103セル/mL。3 つのペプチドを調べた (AMP1、列 3 に 1;AMP2、列 6 に 4;AMP3、列 7 に 9) 濃度が 100 μ M (A 行) から 0.78 μ M (列 H) に至るまで。成長制御とダミーのアッセイに含まれていたが、写真には表示されません。培養 48 時間後デジタル カメラでイメージを得ました。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57127/57127fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
図 1と図 2の観察、48 h はクリプトコッカスとC. albicansの両方の正と負の井戸を視覚的に区別するのに十分な時間です。クリプトコッカスの結果が 24 時間を得られたことは注目に値するは変更せず CSLI のガイドラインの下でより早い。各 3 通、正と負の井戸およびしたがって各化合物のマイクが簡単に識別できます。複数化合物の分子がメリットのさらなる調査の選択については同様の高速のマイク測定が可能になります。一方、図 3は、例希釈段階不適切なピペッティングからそう悪い結果です。これは、列 5、列 C、クリプトコッカス成長の違いがあるところ全体でレプリケートします (列 5-7) で観察できます。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57127/57127fig3.jpg"> 図 3。シリアル希釈アッセイで複製技術でエラーの例です。イメージは、100 μ M (A 行) から 0.78 μ M (列 H) に至るまでのアンプのシリアル希薄を示しています。クリプトコッカスの成長の差が列のレプリケートの間存在 5-7 行 C、ピペッティングのエラーの最も可能性の高いため希釈の準備中。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57127/57127fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
プレートの解釈、図 1にある抗真菌クリプトコッカス、濃度が 100 μ から様々 な AMP3 に AMP1 の 1-3 列、AMP2、5-7 列および列 8-10 にあるに対して 3 つの異なるアンプ用0.78 μ m (列 H) M (A 行)。空白のコントロールは列、12 C に行 A に置かれた一方、列 11、行 A から C に置かれたの負/成長制御(列 1-3、行 A ~ C) AMP1、AMP2 (列 5-7、行 A ~ D) 高濃度でメディアは半透明とそこには目に見える成長はありません。対照的に、低濃度で井戸は不透明 (列 1-3、行 D H と列 5-7 行 E H)。したがって、C の行は、AMP2 のマイクがそれぞれ行開発、25 μ M、12.5 μ M、すなわち、AMP1 のマイクを含むと見なされます。AMP3 は、テストすべての濃度で菌が成長するにつれて再評価する必要があります。AMP3 の再検討、テスト中は抗菌性化合物、微生物汚染の干渉またはエージェントへの菌の高い抵抗のテストができる原因を特定する必要があります。最後の可能性のためそれはテスト濃度範囲を拡大する必要があります。いいえ抑制とコントロールの井戸は同質、600 で OD 測定によっても評価できるように観察、nm。
図 2、3 の異なるペプチドはalbicansに対するテストされました。AMP1 用マイク (列 1-3)、AMP2 (列 4-6) と AMP3 (列 7-9) それぞれ 50 μ M、6 μ M、25 μ M であった。C. アルビカンス孵化の温度におけるフィラメント現象のため観察できますなし抑制とコントロールの井戸の塊で困難に読書の外径測定に使用します。
時に、井戸の成長は観察されません。(に備えてどの成長コントロールも表示ない成長) メディアまたはエージェントに高い感受性の毒素汚染可能性があります (その場合、成長コントロールが成長を示す)。したがって、後者の場合の濃度範囲の減少は、必要かもしれません。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>媒体</td>
			<td colspan="2">準備</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">
2 X ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 1640 中-500 mL
</td>
			<td colspan="2">10.4 g RPMI 1640 (補われる L-グルタミンとフェノールレッド; 炭酸なし)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">3-330 mM (Nmorpholino) プロパン酸(モップ)
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
PH を 7.0 に調整水酸化ナトリウム</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">滅菌ろ過 (0.22 μ M フィルター)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td>
			<td colspan="2">137 mM NaCl</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2.7 mM KCl</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">10 mM Na2HPO4
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2 mM KH2PO4
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">オートクレーブで 121 ° C、15 分。</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">サブロー ・ デキスト ロース ・ スープ</td>
			<td colspan="2">500 mL の蒸留水で粉末 15 g。</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">NaOH で pH 7.0 に調整します。</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">オートクレーブで 121 ° C、15 分。</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">サブロー ・ ブドウ糖寒天培地</td>
			<td colspan="2">500 mL の蒸留水で粉末 32.5 g。</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">NaOH で pH 7.0 に調整します。</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">オートクレーブで 121 ° C、15 分。</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1。メディアおよび試薬の準備。

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Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

抗真菌化合物をスクリーニングするための簡単と適応のスープ微量液体希釈法。

スープ希釈の in Vitroスクリーニング: 新しい抗真菌化合物を検出するための簡単かつ高速メソッド

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

broth-microdilution-vitro-screening-an-easy-fast-method-to-detect-new

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

18.7K ビュー.  University of Brasília. 抗真菌化合物をスクリーニングするための簡単と適応のスープ微量液体希釈法。

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Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult retinal neurons in vitro. Procedures for preparing retinal cell cultures start with the dissection, digestion and trituration of the retina, and end with the plating of isolated retinal cells on dishes made especially for use with laser tweezers. These dishes are divided into a cell adhesive half and a cell repellant half. The cell adhesive side is coated with a layer of Sal-1 antibodies, which provide a substrate upon which our cells grow. Other adhesive substrates could be used for other cell types. The cell repellant side is coated with a thin layer of poly-HEMA. The cells plated on the poly-HEMA side of the dish are trapped with the laser tweezers, transported and then placed adjacent to a cell on the Sal-1 side to create a pair. Formation of cell groups of any size should be possible with this technique. "Laser-tweezers-controlled micromanipulation" means that the investigator can choose which cells to move, and the desired distance between the cells can be standardized. Because the laser beam goes through transparent surfaces of the culture dish, cell selection and placement are done in an enclosed, sterile environment. Cells can be monitored by video time-lapse and used with any cell biological technique required. This technique may help investigations of cell-cell interactions.

This video describes the manipulation of cultured neurons using laser tweezers in vitro.

体外で分離された神経細胞を操作するためのレーザーピンセットを使用して

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult ...

生物学

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level. There are several methods, both in vitro and in vivo, to evaluate protein binding, and at least two methods that complement the shortcomings of each other should be conducted to obtain reliable insights. 
For an in vivo assay, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay represents the most popular and least invasive approach that enables to detect protein-protein interaction within living cells, as well as identify the intracellular localization of the interacting proteins 1,2. In this assay, non-fluorescent N- and C-terminal halves of GFP or its variants are fused to tested proteins, and when the two fusion proteins are brought together due to the tested proteins&#x2019; interactions, the fluorescent signal is reconstituted3-6. Because its signal is readily detectable by epifluorescence or confocal microscopy, BiFC has emerged as a powerful tool of choice among cell biologists for studying about protein-protein interactions in living cells 3. This assay, however, can sometimes produce false positive results. For example, the fluorescent signal can be reconstituted by two GFP fragments arranged as far as 7 nm from each other due to close packing in a small subcellular compartment, rather that due to specific interactions7.
Due to these limitations, the results obtained from live cell imaging technologies should be confirmed by an independent approach based on a different principle for detecting protein interactions. Co-immunoprecipitation (Co-IP) or glutathione transferase (GST) pull-down assays represent such alternative methods that are commonly used to analyze protein-protein interactions in vitro. However, iIn these assays, however, the tested proteins must be readily soluble in the buffer that supportsused for the binding reaction. Therefore, specific interactions involving an insoluble protein cannot be assessed by these techniques.
 Here, we illustrate the protocol for the protein membrane overlay binding assay, which circumvents this difficulty. In this technique, interaction between soluble and insoluble proteins can be reliably tested because one of the proteins is immobilized on a membrane matrix. This method, in combination with in vivo experiments, such as BiFC, provides a reliable approach to investigate and characterize interactions faithfully between soluble and insoluble proteins. In this article, binding between Tobacco mosaic virus (TMV) movement protein (MP), which exerts multiple functions during viral cell-to-cell transport8-14, and a recently identified plant cellular interactor, tobacco ankyrin repeat-containing protein (ANK) 15, is demonstrated using this technique.

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Testing protein-protein interaction is indispensable for dissection of protein functionality. Here, we introduce an in vitro protein-protein binding assay to probe a membrane-immobilized protein with a soluble protein. This assay provides a reliable method to test interaction between an insoluble protein and a protein in solution.

タンパク質のメンブレンオーバーレイアッセイ：可溶性および不溶性タンパク質間の相互作用をテストするためのプロトコル in vitroで</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

心筋細胞における高速カルシウムフラックスの測定

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

HeLa細胞のトランスフェクションに続いてGaussiaルシフェラーゼmRNA のインビトロ転写とキャッピングの

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Construction of an Affordable and Easy-to-Build Zebrafish Facility

In vivo biomedical research is pivotal to translate in vitro findings into clinical advances. Small academic institutions with limited resources find it virtually impossible to build and maintain typical rodent facilities for research. Zebrafish research has been demonstrated to be a valuable alternative for in vivo research in pharmacology, physiology, development and genetic studies. This article demonstrates that a functional zebrafish facility can be built in an easy and affordable manner. We demonstrate that such a facility could be built in about one working day with minimal tools and expertise. The cost of the 27 1.8 L fish tank zebrafish facility constructed in this study was approximately $1,500. We estimate that the maintenance of an initial working 150 fish colony for 3 months is $1,000. This project involved students, who were introduced to aquaculturing of zebrafish for research proposes.

A Zebrafish facility suitable for breeding and in vivo research is built in an easy and affordable manner. Maintenance is minimal. This facility is ideal for student involvement and independent research.

手ごろな価格で簡単に構築ゼブラフィッシュ施設の建設

In vivo biomedical research is pivotal to translate in vitro findings into clinical advances. Small academic institutions with limited resources find it ...

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high quality plant chromosome spreads is challenging due to the rigid cell wall. One of the approved methods for the preparation of plant chromosomes is a so-called drop preparation, also known as drop-spreading or air-drying technique. Here, we present a protocol for the fast preparation of mitotic chromosome spreads suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes. This method is an improved variant of the air-dry drop method performed under a relative humidity of 50%-55%. This protocol comprises a reduced number of washing steps making its application easy, efficient and reproducible. Obvious benefits of this approach are well-spread, undamaged and numerous metaphase chromosomes serving as a perfect prerequisite for successful FISH analysis. Using this protocol we obtained high-quality chromosome spreads and reproducible FISH results for Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum and Secale cereale.

A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.

植物におけるFISHのための適切な高速空気乾燥滴下染色体製造方法

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

指向進化方法で<em&gt;サッカロマイセス・セレビシエ</em&gt;：変異体ライブラリーの作成およびスクリーニング

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

工場ポリソームプロファイリングのための簡単​​な方法

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

ギャップ結合細胞間コミュニケーション：毒物および毒素の有害効果を評価するための機能バイオマーカー、および天然物の健康上の利点

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

An Easy and Flexible Inoculation Method for Accurately Assessing Powdery Mildew-Infection Phenotypes of Arabidopsis and Other Plants

Reducing crop losses due to fungal diseases requires improved understanding of the mechanisms governing plant immunity and fungal pathogenesis, which in turn requires accurate determination of disease phenotypes of plants upon infection with a particular fungal pathogen. However, accurate disease phenotyping with unculturable biotrophic fungal pathogens such as powdery mildew is not easy to achieve and can be a rate-limiting step of a research project. Here, we have developed a safe, efficient, and easy-to-operate disease phenotyping system using the Arabidopsis-powdery mildew interaction as an example. This system mainly consists of three components: (i) a wooden inoculation box fitted with a removable lid mounted with a stainless steel or nylon mesh of ~50 &#181;m pores for inoculating a flat of plants with fungal spores, (ii) a transparent plastic chamber with a small front opening for minimizing spore escape while conducting inoculation inside, and (iii) a spore-dislodging and distribution method for even and effective inoculation. The protocols described here include the steps and parameters for making the inoculation box and the plastic chamber at a low cost, and a video demonstration of how to use the system to enable even inoculation with powdery mildew spores, thereby improving accuracy and reproducibility of disease phenotyping.

We present a protocol for constructing a simple spore-distribution system consisting of an inoculation box with a ~50 &#181;m mesh and a transparent plastic chamber. This can be used to evenly inoculate plants with powdery mildew spores, thereby enabling accurate and reproducible assessment of disease phenotypes of plants under study.

シロイヌナズナなどのうどんこ病感染表現型を正確に評価するための簡便かつ柔軟な接種法

Reducing crop losses due to fungal diseases requires improved understanding of the mechanisms governing plant immunity and fungal pathogenesis, which in ...