BURUNLARI-Brezilya, CNPq-Brezilya, FAP/DF mali destek için teşekkür ediyoruz. El yazması gözden geçirilmesi için Dr. Hugo Costa Paes için minnettarız.

1. çözümler ve medya
<ol><li>2 X Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 orta, fosfat tamponlu tuz (PBS), Sabouraud dekstroz suyu ve Sabouraud dekstroz agar Tablo 1göre hazırlayın.</li>
</ol>2. mantar Inoculum büyüme koşulları
<ol><li>İhtiyaç kadar % 35 gliserol-80 ° C'de donmuş hisselerinde olarak tüm mantar suşları depolar.</li>
	<li>Her deneme önce aşağıdaki adımları uygulayın.<ol>
<li>Candida albicans suşları için:<ol>
<li>Bir hisse senedi şişe çözülme ve Sabouraud dekstroz suyu bir kap ve kültür gecede 30 ° C'de ajitasyon (200 devir/dakika) ile bir steril 50 mL polipropilen tüp 10 mL 200 µL aktarmak. Tüp eğim ve kapağı biraz kültür daha iyi havalandırma için açık bırakmak hatırlıyorum.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Cryptococcus neoformans suşları için:<ol>
<li>Hisse senedi bir şişe donmuş yüzeyi kazıyorum. Hücreleri Sabouraud dekstroz agar plakalar üzerine plaka ve 30 ° C'de 48 h için kuluçkaya Sonra görünür büyüme izole kolonileri tabak buzdolabında (4 ° C) ile parafin film 15 gün için kapalı tutun.</li>
			<li>Bir orta ölçekli izole koloni bir steril kürdan veya steril aşı döngü kullanarak plaka toplamak ve Sabouraud dekstroz suyu bir steril 50 mL konik tüp 10 mL aşılamak. Ajitasyon (200 devir/dakika) altında 30 ° C'de yaklaşık 24 h için kuluçkaya.</li>
			<li>24 saat kuluçka fazla olamaz. Tüp eğim ve kapağı biraz daha iyi havalandırma için açık bırakmak hatırlıyorum. Bu Antimikrobiyal direnç etkileyen önemli bir faktör olduğu için önce her test hücreleri büyüme aşamasında standardize etmek her zaman iyidir. Not: Her iki mantarlar bizim deneylerde hızlı yayılma için 30 ° C'de yetiştirilmiştir ancak sıcaklık çalışma, örneğin klinik tedavi (37 ° C) amaçlarını yansıtacak şekilde değiştirilebilir. En önemlisi, bu ilk kuluçka süresi önceden her mantar izole etmek için kurulan ve tekrarlanabilirlik emin olmak için tüm testler muhafaza gerekir.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sonra mantar büyüme, konik tüpler 1200 x g oda sıcaklığında 5 min için de centrifuging tarafından hücreleri toplamak. Süpernatant atın ve PBS 10 mL ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri ve santrifüj 1200 x g oda sıcaklığında 5 min için de tekrar resuspend.</li>
	<li>PBS yıkama ve aralıklarla iki kez daha tekrarlayın. Sonra üçüncü yıkama, 2 X RPMI-1640 orta 5 mL (göre Pelet boyutu) hücrelerde resuspend.</li>
	<li>1 mL 1: 100 veya 1:1,000 seyreltme (bağlı olarak hücre süspansiyon bulanıklık) bir microcentrifuge tüp hazırlayın.</li>
	<li>Bu seyreltme aliquot 10 µL hemasitometre odasında yerleştirin ve dört köşe çeyrek dairelerin mikroskop altında hücrelerde toplam sayısını saymak. Konsantrasyonu formülüne göre hesaplamak: (Toplam cep numarası/4) x seyreltme faktörü x 104 (odası seyreltme Sabit).<ol>
<li>% 100 canlılığı canlılığı sayar ve büyüme koşulları sistematik olarak okudu izole etmek için korelasyon düşünün. Not: Arka-kaplama uygun olarak Mayalar10 için antimikrobiyal duyarlılık testi (EUCAST) antifungal Minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) yöntemi Avrupa Komitesi tarafından standardizasyon ve kalite kontrol canlılığı sayıları yapılabilir .</li>
		<li>Büyüme/canlılığı korelasyon altında eğitim izole etmek için kurulmuştur değil, bir hemasitometre phloxine B11, trypan mavi gibi ölü hücreleri seçerek renk boya yardımı ile canlı hücrelerde sayarak mantar canlılığı ölçmek 12, veya Janus yeşil13. Mantar hücreleri yalnızca canlılık bu noktada nüfusunun % 90'ı ise veya yukarıda bu iletişim kuralı için kullan. Not: Ölü/canlı boyalar de seçim mantar ile çalışmayabilir. Lütfen onları kullanmadan önce sınayın. Örneğin, trypan mavi boya de C. neoformansile çalışmaz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bundan sonra hücre süspansiyonlar 2 X RPMI-1640 ortamda hazırlamak (2 X düzeltilmiş RPMI-1640 orta inoculum). 96-şey plakalar için her plaka için 5 mL hacmi göz önünde bulundurun.<ol>
<li>Tüm C. albicans suşları için 4 x 103 hücre/mL bir hisse senedi hücre süspansiyon hazırlamak. Bu 2 X her iyi (2 x 103 hücre/mL) son hücre konsantrasyon bölgedir.</li>
		<li>C. neoformans suşları için hücreleri 2 x 104 hücre/mL stok kültürünün hazırlayın. Bu iki kez her şey (1 x 104 hücre/mL) son hücre konsantrasyon bölgedir.</li>
		<li>Hangi konsantrasyon kuluçka süresi ile ilgili olarak belirli çalışma için ideal olacak bilinen bir antifungal ile diğer mantarlar için sınayın. Metabolizma ve çoğaltma zaman mantar göz önünde bulundurun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. peptidler (bilinmeyen Aracısı)
<ol><li>-20 ° C'de lyophilized peptidler depolamak ve onları her deneme önce deiyonize su geçiyoruz. Bir kez suda en fazla saklama süresi her peptid niteliğine bağlıdır.</li>
	<li>İki kez tahlil (2 X) test en son yoğun aliquots hazırlayın. İdeal olarak, aliquots ile yeterli peptid donma-çözülme döngüsü önlemek tek seferlik kullanım için az sayıda hazır olun. Not: Seçtiğiniz toplama bir edebiyat ve peptid özelliklerini dayanmalıdır. Bu seri dilutions peptid, yaklaşık 100 µM ile başlamak ve daha sonra azaltmak veya bağlı olarak elde edilen sonuçları bu konsantrasyon aralığı artırmak için önerilir.</li>
</ol>4. başvuru Antifungaller (pozitif denetimleri)
<ol><li>Bu suda seyreltilmiş için: en yüksek konsantrasyon analizi 2 X çözeltisi hazırlamak (bkz. Bölüm 5: Antifungal tahlil seyreltme adımları için).<ol>
<li>C. albicans suşları için bir çözüm Flukonazol 128 µg/mL veya 128 µg/mL caspofungin hazırlayın. Her ikisi için de plaka konsantrasyon 64 µg/mL olacaktır.</li>
		<li>C. neoformans suşları için bir çözüm olarak 32 µg/mL amfoterisin b (suda çözünen çözelti) hazırlayın. Plaka konsantrasyon 16 µg/mL olacaktır. Not: Bu anti-mantar kötü suda çözünür olduğundan normal Amfoterisin B Dimetil sülfoksit (DMSO), seyreltilmiş. Ancak, piyasada bulunan suda çözünen Amfoterisin B hazırlıklar vardır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Organik bir çözücü içinde seyreltilmiş Antifungaller için: 100 X hisse senedi DMSO çözümde hazırlamak, sonra su kullanmak için 10 X oranında seyreltin. Not: Böylece, kuyuda, DMSO son konsantrasyonu % 1'i geçmeyecektir. Verilen bu bazı mantarlar iyi çözücü bu konsantrasyon tahammül yok nerede mantar %1 DMSO denetimi olarak içeren medya artacak bir de gereklidir. DMSO ışığa duyarlı olduğunu unutmayın, bu yüzden plaka folyo ile kapak veya kuluçka dönemi süresince karanlık bir odaya yerleştirin.</li>
</ol>5. antifungal tahlil
Not: Vitro antifungal deneyleri suyu microdilution duyarlılık testi bazı değişiklikler klinik ve laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI) M27-A3 kurallarına göre gerçekleştirilir.
<ol><li>İki kat seri seyreltme her peptid, hazırlamak ve antifungal son hacmiyle 50 µL 96-şey polistren Mikroplaka içinde kontrol.<ol>
<li>Bir pipet kullanarak ekleyin antifungal/peptid 2 X konsantrasyon en yüksek 100 µL istediğiniz sütundaki son konsantrasyonu 1-3, içinde satır A.</li>
		<li>Bir çok kanallı pipet kullanarak, steril su 50 µL diğer wells, satırların H. B ekleyin.</li>
		<li>Wells en yüksek konsantrasyon (a satır) ile 50 µL kaldırmak, iyi bir sonraki konsantrasyonu (satır B) diğerine aktarmak ve homojenize.</li>
		<li>Kadar iyi en düşük konsantrasyon ile yukarıdaki adımları tekrarlayın ve bu iyi (satır H) 50 µL atın. Sütunları 11 ve 12 (satır A, B, C) boş denetim veya negatif/büyüme kontrol için sadece su ile bırakın.</li>
		<li>50 µL ayarlanan inoculum X 2 RPMI-1640 ortamda her şey (sütun 1-3 artı sütun 11 (negatif/büyüme denetimi)); ekleyin. C. neoformans suşları 104 hücre/mL olacaktır son konsantrasyonu C. albicans için 2 x 103 hücre/mL ve nihai toplama olacaktır.</li>
		<li>Boş denetimleri hazırlamak (50 µL su + 50 µL 2 X RPMI-1640 orta hücreleri olmadan) ve negatif/büyüme kontrol (50 µL su + 50 µL ayarlanabilir inoculum 2 X RPMI-1640 orta antifungal olmadan) ve yük içine iyi plaka yukarıda açıklandığı gibi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Test edilecek her bileşik için prosedür ve seçilen antifungal denetim (sütunlar 4-10) yineleyin. Not: Seri dilutions dikey olarak aşağıdaki deney olarak veya yatay olarak plaka (dilutions ekstresinin verilen bileşik/test edilmesi gereken sayısı sekiz veya daha fazla iseYani, ) yapılabilir.<ol>
<li>Bileşikler başvurursanız uyuşturucu, ya da herhangi bir bileşen ışığa duyarlı, düşük ışıkta tahlil yapmak, folyo ile kuruyucu veya karanlık bir odaya incubations sırasında yer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aşağıdaki isteğe bağlı önerileri göz önünde bulundurun.<ol>
<li>Bu yardımcı olur buharlaşma azaltmak gibi gaz değişimi, izin veren bir açık kapak plakasını ile plaka mühür.</li>
		<li>Plaka nemli bir odaya yerleştirin; Ayrıca buharlaşma azaltmak yardımcı olacaktır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plakayı 37 ° C'de 24 saat veya 48 h 48 h ve tüm C. albicans suşları için 200 C. neoformansiçin sallayarak RPM kuluçkaya. Alt son hacim (100 µL) hiçbir yayılma oluştuğunu sağlar. Not: 24 h mikrofon ölçümlere ve C. albicans suşları için 48 h arasında anlamlı bir fark gözlendi. Yine de, okuma, 48 h görselleştirmek kolaydır.</li>
	<li>Morfoloji de bulaşma belirtileri kontrol olarak değişiklikleri doğrulamak için kuluçka dönemi önce ve sonra ters bir optik mikroskobu yardımı ile tüm wells, gözlemlemek. Not: Okuma görsel olarak yapılır ve deneme sonunda fotoğraflandı. Her okumadan önce biraz plaka lunaparkçı. Okur da onun OD 600 ölçerek gerçekleştirilebilir hücre kümeler Eğer nm, ya da filamentation değil görülmektedir.</li>
	<li>Deneyler en az üç kez ayrı tarihlerde gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neglected+epidemic:+fungal+infections+in+HIV/AIDS.">A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS.</a> Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).</li><li>Romani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+to+fungal+infections.">Immunity to fungal infections.</a> Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).</li><li>Pfaller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+drug+resistance:+mechanisms,+epidemiology,+and+consequences+for+treatment.">Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment.</a> Am J Med. 125 (1 Suppl), S3-S13 (2012).</li><li>Hancock, R. E., Diamond, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cationic+antimicrobial+peptides+in+innate+host+defences.">The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences.</a> Trends Microbiol. 8 (9), 402-410 (2000).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snake+cathelicidin+from+Bungarus+fasciatus+is+a+potent+peptide+antibiotics.">Snake cathelicidin from Bungarus fasciatus is a potent peptide antibiotics.</a> PLoS One. 3 (9), e3217 (2008).</li><li>Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AaeAP1+and+AaeAP2:+novel+antimicrobial+peptides+from+the+venom+of+the+scorpion,+Androctonus+aeneas:+structural+characterisation,+molecular+cloning+of+biosynthetic+precursor-encoding+cDNAs+and+engineering+of+analogues+with+enhanced+antimicrobial+and+anticancer+activities.">AaeAP1 and AaeAP2: novel antimicrobial peptides from the venom of the scorpion, Androctonus aeneas: structural characterisation, molecular cloning of biosynthetic precursor-encoding cDNAs and engineering of analogues with enhanced antimicrobial and anticancer activities.</a> Toxins (Basel). 7 (2), 219-237 (2015).</li><li>Benincasa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungicidal+activity+of+five+cathelicidin+peptides+against+clinically+isolated+yeasts.">Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts.</a> J Antimicrob Chemother. 58 (5), 950-959 (2006).</li><li>CLSI. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibiliy Testing of Yeasts; Approved Standard -Third Edition. CLSI document M27-A3. , (2008).</li><li>Guilhelmelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+Scorpion+Venom-Derived+Antifungal+Peptides+against+Planktonic+Cells+of+Candida+spp.+and+Cryptococcus+neoformans+and+Candida+albicans+Biofilms.">Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms.</a> Front Microbiol. 7, 1844 (2016).</li><li>Roongruangsree, U. T., Kjerulf-Jensen, C., Olson, L. W., Lange, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+Tests+for+Thick+Walled+Fungal+Spores+(ex:+Oospores+of+Peronospora+manshurica).">Viability Tests for Thick Walled Fungal Spores (ex: Oospores of Peronospora manshurica).</a> Journal of Phytopathology. 123 (3), 244-252 (1988).</li><li>Boedijn, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+as+stain+for+fungi.">Trypan blue as stain for fungi.</a> Stain Technol. 31 (3), 115-116 (1956).</li><li>Goihman-Yahr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+plating+efficiency+and+estimation+of+viability+of+suspensions+of+Paracoccidioides+brasiliensis+yeast+cells.">Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells.</a> Mycopathologia. 71 (2), 73-83 (1980).</li><li>Tati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histatin+5-spermidine+conjugates+have+enhanced+fungicidal+activity+and+efficacy+as+a+topical+therapeutic+for+oral+candidiasis.">Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58 (2), 756-766 (2014).</li><li>Petrou, M. A., Shanson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+Cryptococcus+neoformans+by+the+NCCLS+microdilution+and+Etest+methods+using+five+defined+media.">Susceptibility of Cryptococcus neoformans by the NCCLS microdilution and Etest methods using five defined media.</a> J Antimicrob Chemother. 46 (5), 815-818 (2000).</li><li>Zaragoza, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+analysis+of+variables+for+standardization+of+antifungal+susceptibility+testing+of+nonfermentative+yeasts.">Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts.</a> Antimicrob Agents Chemother. 55 (4), 1563-1570 (2011).</li><li>Rodriguez-Tudela, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+shaking+on+antifungal+susceptibility+testing+of+Cryptococcus+neoformans:+a+comparison+of+the+NCCLS+standard+M27A+medium,+buffered+yeast+nitrogen+base,+and+RPMI-2%+glucose.">Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).</li><li>Beggs, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+phase+in+relation+to+ketoconazole+and+miconazole+susceptibilities+of+Candida+albicans.">Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans.</a> Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).</li><li>Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungicidal+properties+of+defensin+NP-1+and+activity+against+Cryptococcus+neoformans+in+vitro.">Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro.</a> Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Microdilution testleri bir hedef bahçedeki küçük miktarlarda kullanarak bileşik potansiyel antifungal etkinliğini analiz ve aynı zamanda konsantrasyonları bir dizi test. Buna göre bu iletişim kuralı tarama potansiyel yeni mantar önleyici bileşikler için bir ilk adım olarak önerilir. Burada sunulan Protokolü başlangıçta klinikler, antifungal tedavi seçiminde yardımcı olmak için tasarlanmış M27-A3 Protokolü dayanmaktadır ve yeni mantar önleyici bileşikler çeşitli için adapte edilebilir. Genel olarak, bu iletişim kuralını özü veya bileşik fizikokimyasal özellikleri üzerinde odaklanabilirsiniz. Örneğin, bir bileşik medya RPMI etkisi Histatin 514gibi mantar hücre ile etkileşimi engelleyebilir için tahlil potansiyel aday etkisiz yanlış görünebilir. Bu durumda, ne zaman RPMI engelleyen için alternatif bir orta BEZLERİ pH 715ile Maya azot Bankası (YNB) tampon var.
Başvuru antifungal sonuçları yönergeleri aralığı içinde olduğu sürece iletişim kuralı da değişiklikler öncesi büyüme koşulları, inoculum konsantrasyonu, inkübasyon sıcaklığı ve ışığa duyarlı bileşenleri sağlar. Başvuru antifungal test mantar türleri için geçerli terapi dayanmalıdır. Ayrıca, bir başvuru ise bileşik bu doğada potansiyel uyuşturucu – örneğin, test edilmiş mantar modeli karşı antifungal aktivite ile bilinen bir antimikrobiyal peptid benzer-bir ek başvuru denetimi olarak kullanılmalıdır.
Öncesi büyüme koşulları mantarlar uygun ve ihtiyaçlarını araştırma için değiştirilebilir. Protokolü olduğu gibi daha iyi yayma için 30 ° C'de, C. neoformans ve C. albicans yetiştirilmiştir. Yine de, bu sıcaklık mantarlar metabolizma bağlı olarak değiştirilebilir: Örneğin, Paracoccidioides brasiliensis 37 ° C'de mantar şeklini korumak için büyüme gerektirir ve onun yavaş çoğaltma oranı nedeniyle 5-7 gün için yetişkin olmak gerekiyor. Bu nedenle, potansiyel yeni uyuşturucu testi için mantar özellikleri anlamak önemlidir. Ayrıca, yaş ve kullanılan hücre büyüme aşamasında her çalışma amacı göre tanımlanmış olmalıdır ve, en önemlisi, ilk kuluçka süresi önceden kurulmuş ve tekrarlanabilirlik emin olmak için tüm testler muhafaza .
Bileşik/özü, başvuru antifungal veya seyreltici ışığa duyarlı ise, aynı şekilde, adımları ile düşük ışıklı, folyo ile plakalar kapsayan veya sırasında karanlık bir odasında Plakayı yerleştirmek gibi onun yıkımı önlemek için eklenmelidir Kuluçka kez.
Ayrıca, kenar efekti ve buharlaşma boş Wells, su ilavesi ile dış kuyu kullanmayan ve su ile veya doldurarak plaka nemli bir odaya yerleştirerek azalmış.
Bu yöntem kullanılırken ana sınırlamaları, mantar veya fungistatic etkileri arasında ayrım karşı test edilmiş bir bileşim, inhibitör etkinliği üzerindeki odağını biridir. Yine de, olası yeni antifungal, hızlı bir tarama hedefi olduğu gibi ilk görsel değerlendirme mikrofon ile net pozitif (' açık/sigara-bulanıklık' kuyu) ve negatif ('bulanıklık' kuyu) sonucu, yardımcı olur bileşikleri çalışmada ilgi tanımlamak daha fazla ve bu nedenle tarama yeni bileşikler için genel maliyetini azaltma.
Bu yeni bileşiklerin etki mekanizması bilinmemektedir, bu aynı iletişim kuralını bileşik'ın yeteneği inhibe veya pozitif wells kaplama veya canlı/ölü boya kullanarak gibi birkaç ilave adımlar ekleyerek mantar hücrelerini öldürmek belirlemek için kullanılabilir. Diğer küçük değişiklikler herhangi bir sinerjik etkisi Bahçedeki diğer ilaçlar ile tanımlamak için bir Dama Tahtası titrasyon tahlil için protokolünü kullanmak üzere ilave edilebilir.
Her ne kadar tahlil'ın okuma genellikle iyi büyüme yok antifungal ajan (negatif/büyüme denetimi) ile karşılaştırıldığında farklı koşullar altında mantar büyüme görsel analiz tarafından gerçekleştirilir, bu da onun OD 600 ölçerek yapılabilir nm. Ancak, aşırı doz ölçüm için homojen çözümler doğru olsa da, bazı mantarlar böylece kırma yöntemi – duyarlığını kümeleri : Örneğin, Candida spp. kuluçka dönemi sırasında filamentation sonucu olarak büyümek.
Öte yandan, burada, CLSI M27-A3 yönergeleri ile karşılaştırıldığında, açıklanan protokol önemli avantajlarından bunun hesabı havalandırma Mantarlar, Sigara fermantasyon için medyanın içine gibi alır biri C. neoformans. Ayrıca, CLSI yönergeleri sadece böylece mantar büyüme ve mikrofon tanımı için kuluçka uzun bir süre gerektiren küçük bir ilk inoculum kullanır. Bazı çalışmalar daha yüksek baş harfleri inoculums ve plaka kuluçka sırasında sallayarak mikrofon belirlenmesi16,17üzerinde önemli etkileri olmadan antifungal duyarlılık testleri geliştirmek gösterdi. Bizim protokol 48 72 h CLSI kurallar tarafından önerilen göre h içinde bir kısaltılmış kuluçka döneminde C. neoformans karşı yeni bileşikler için mikrofon tam olarak belirleyebilirsiniz.
Başka bir avantaj bizim protokol 200 µL CLSI kurallar, bu nedenle antifungal tayini için gerekli test edilmiş yeni bileşik miktarını azaltarak tarafından tavsiye yerine 100 µL son hacim kullanıyor olması. Ancak, buharlaşma dış Wells bir endişe olabilir ama zaten buharlaşma azaltmak için bu bölümde açıklanan çözümler tahlil sonuçları ödün vermeden kullanılabilir.
Ayrıca, doğrudan plaka dilutions performans ve böylece microcentrifuge tüpler kullanılacak CLSI seyreltme yönergelerin atlayarak, çok kanallı Pipetler kullanılabilir. Bu iletişim kuralı derleme CLSI yönergeleri olandan daha az karmaşık ve aynı zamanda daha az malzeme kullanır.
Mantar hücre hazırlık ile ilgili önemli bir adım olarak taze hücre kullanımıdır. Ondan beri var çeşitli raporlar antifungal duyarlılık farklılıkları hakkında edebiyat kültürü18,19yaş zaman hücreleri ile tüm deneyleri aynı büyüme aşamasında gerçekleştirmek önemlidir. Başvuru suşları dikkatli seçimi de önemlidir. Bir çok önemli veya nadiren izole tür antifungal potansiyeli net bir resim üretmeyebilir. Aynı şekilde, olarak fazla değişken tahlil için değil eklemek için alt kodlamayla adımları önlemek yardımcı olur. Örneğin, Candida suşları, (ki daha hızlı büyümek) için doğrudan sıvı medya inoculum yaparak agar plaka adım atlamak tercih ediyoruz.
Test edilecek fizikokimyasal özellikleri özü veya bileşik düşünmeye önemli olduğunu unutmayın. Örneğin, özü veya bileşik ihtiyaçları solventler dışında su içinde çözünmüş gerekir yaparsanız bir uygun mantar büyüme kontrol sahibi olmak emin yalnız mantar ile aynı çözelti konsantrasyonu içeren. Bu herhangi bir büyüme inhibisyon gözlenen test edilmiş bileşik yerine çözücü nedeniyle değil garanti ya da hulâsa etmektir. Bu durumda, uyuşturucunun en az 100 kere daha yüksek çözücü yüzdesi azaltmak için en test edilmiş yoğun bir konsantrasyon içinde eriterek gibi antifungal ilaçlar seyreltilmiş DMSO, CLSI-M27A3 önerilerini takip etmek daha iyi olabilir plaka.
İstikrar ile ilgili olarak, bu küçük aliquots analiz özleri veya bileşikler tutmak için tavsiye edilir. Tek bir tahlil uygun sıcaklık, aşırı aliquot manipülasyon ve dondurulmuş özleri veya bileşikler depolanıyorsa, donma-çözülme çevrimleri önlenebilir için gerekli birim depolayarak.
Son olarak, verilen bu pipetting herhangi bir hata ardışık dilutions yayılır en temel adımlardan birini Mikroplaka seri seyreltme doğruluğunu var. Şu andan itibaren pipet hassas ve uygun pipetting teknikleri tekrarlanabilirlik sağlamak için olağanüstü vardır. Yani, bu kalibre kullanım Pipetler ve her zaman onay doğru birimin eklenen ve kaldırılan her kuyudan ise zorunludur. Kalıntı veya eser uyuşturucuyu pipet ucu kalır değil emin olun. Bileşik ucuna kadar sopa eğilimindedir, ipuçları dilutions arasında geçiş yapmak daha iyi olur.

Mantar enfeksiyonları haline gelmiştir önemli bir tıbbi endişe son yıllarda önemli ölçüde ana toprak dolay iden bu kanser tedavisi ve HIV/AIDS ile yaşayan geçiyor gibi immün sayisi bir artış artış veya organ1,2nakledilmektedir. Ancak, çok sınırlı bir dizi kullanılabilir antifungal ilaçların ve onlara mantar direnç raporlarda artan sayıda büyük sorunlar sistemik Mikozlar3tedavi ile ilgili katkıda bulunur.
Yeni mantar önleyici bileşikler potansiyel kaynağı antimikrobiyal peptidler (Amper), enfeksiyon4onların doğuştan gelen bağışıklık yanıtı parçası olarak çoğu organizma tarafından üretilen küçük Katyonik peptidler vardır. Yine de, bu bileşiklerin mantar patojenlere karşı test etmek için tarama yöntemi standart değil. Farklı yordamlar aynı modeli mikroorganizma5,6,7bazen amper, antifungal faaliyetten değerlendirmek için kullanılmaktadır. Bu farklılıklar ve ayrıntılı olarak bazı protokoller eksikliği engellemektedir ve bileşikleri tekrarlanabilirlik arasında karşılaştırmalar karıştırmak.
Yeni ilaç adaylarının test standart hale getirmek için bir yol antifungal duyarlılık gibi klinik klinik ayarları tanımlamak için kullanılan kurallar ve laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI) M27-A3 yönergeleri takip etmektir. Ancak, bu antifungal duyarlılık testleri fazla kısıtlayıcıdır ve onlar sadece birkaç seçim maddeleri için kuruldu gibi metabolizma dikkate varyasyon içine türler arasında yapmayız. Örneğin, onlar sigara fermantasyon Mayalar metabolik ihtiyaçlarını dikkate almayın.
Bu iletişim kuralı değerlendirme faaliyet potansiyel antifungal bileşiklerin sağlar ve burada aramak için antifungal peptidler uygulanır. Suyu microdilution duyarlılık testi yeni bileşikler8,9tarama en iyi duruma getirme değişiklikler CLSI M27-A3 kurallarına dayanmaktadır. Bu değişiklikler sonuçları başvuru Antifungaller denetimleri olarak kullanımı ile standartlaştırılması ise en iyi ön-test büyüme için az miktarda bileşik, sıcaklık veya ilk inoculum ve farklı medya kullanımı için izin verir. Bu yöntemle çok iyi kültür Kaplamalar, kullanımı hızla ve güvenle bileşikler çok sayıda ekran olanak sağlar.
Doğal esnekliği nedeniyle bu protokolü farklı kimyasal sınıflar bileşiklerin ve birkaç uyarlamalar ile diğer mikroorganizmalar karşı kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Media and Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate</td><td>Thermo Fisher</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>3-(&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-morpholino) propane sulfonic acid&lt;em&gt; (MOPS) (o que a gente usa tem um s&amp;oacute;dio, completa o nome dele please)&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Use to buffer 2X RPMI medium</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Din&amp;acirc;mica</td><td>1528-1</td><td>137 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>J.T.Baker</td><td>3040-01</td><td>2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V000129</td><td>10 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60230</td><td>2 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud dextrose broth</td><td>BD</td><td>238230</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud Dextrose Agar</td><td>BD</td><td>210950</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V000123</td><td>35% for (solu&amp;ccedil;&amp;atilde;o de estoque? Criopreserva&amp;ccedil;&amp;atilde;o?)</td></tr><tr><td>Sterile water</td><td></td><td></td><td>Para dilui&amp;ccedil;&amp;atilde;o das drogas na dilui&amp;ccedil;&amp;atilde;o seriada</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antifungal drugs&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Fluconazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8929</td><td></td></tr><tr><td>Caspofungin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1160</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plastics&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Dish petri</td><td>J.Prolab</td><td>0304-5</td><td></td></tr><tr><td>96 well plate</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Solution Reservoir</td><td>KASVI</td><td>K30-208</td><td>Use to pippet the solutions using the multichannel pippet</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment and other materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optical microscope</td><td>Nikon</td><td>E200MV</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugue</td><td>Thermo Fisher</td><td>MegaFuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Ethik Technology</td><td>403-3D</td><td>Set to 37&amp;deg; C</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Excella E25</td><td>Set to 37&amp;deg; C, 200 RPM</td></tr><tr><td>Cell counting chamber, Neubauer</td><td>BOECO Germany</td><td>BOE 13</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette</td><td>HTL</td><td>5123</td><td></td></tr></tbody></table>

broth microdilution in vitro screening: an easy and fast method to detect new antifungal compounds

Mantar enfeksiyonları son yıllarda önemli bir sağlık sorunu haline gelmiştir, ancak kullanılabilir antifungal ilaçlar sayısı sınırlıdır. Bu senaryoda, yeni antifungal ilaçlar için arama gereklidir. Rapor burada protokol ekran peptidler bir yönteme antifungal özellikleri için ayrıntıları. Suyu microdilution duyarlılık testi olarak potansiyel yeni Antifungaller antimikrobiyal peptidler araştırma uygun değişiklikler klinik ve laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI) M27-A3 kurallarına dayanmaktadır. Bu iletişim kuralı antifungal bileşikler etkinliğini değerlendirmek için işlevsel bir tahlil açıklar ve soruşturma altında moleküllerin belirli herhangi bir sınıf uyacak şekilde kolayca değiştirilebilir. Deneyleri 96-şey levha küçük birimleri kullanarak gerçekleştirilen bu yana, büyük ölçekli bir tarama zaman, kısa bir miktarda Eğer özellikle bir otomasyon ortamda yürütülen tamamlanabilir. Bu yordamı bir standart ve ayarlanabilir klinik protokol Mantar hastalıkları tedavi geliştirmek için yeni moleküller tezgah-iş arayışı nasıl yardımcı gösterilmiştir.

Mikrofon tamamen kuluçka dönemi sonundaki görünür mantar büyümesini engeller en düşük antimikrobiyal bileşik toplama olarak tanımlanır. Amacı bu iletişim kuralı, ekran potansiyel Antifungaller hızlı bir yönteme sahip olduğundan, herhangi bir şey ile bulanıklık negatif/büyüme denetim wells için benzer ise herhangi bir şey ile açık kitle iletişim araçları için boş wells benzer olumlu bir sonuç olarak kabul edilir negatif olarak kabul. Ancak, belirli bir AMP fungistatic veya mantar olduğunu bilerek bir ilgi ise, olumlu kuyulardan Medya Ayrıca Sabouraud dekstroz Agar kaplama veya başka bir canlılık testi ile kontrol.
Bileşik bir romanın etki mekanizması bilinmemektedir olduğunu göz önüne alındığında, bu nedenle mantar (onay resmi kurallar, tabloları veya veri edebiyat) denetlemeden önce yalıtmak için başvuru antifungal beklenen aralıkta düşerse doğrulamak için gerekli test mikrofon bileşiği (Bu durumda, bir ampul; Şekil 1 ve Şekil 2) koşullar ideal olduğunu doğrulamak için. Eğer saygın aralığında düşmek değil, gözlenen değişiklikleri yalnızca test edilmiş bileşik nedeniyle olup olmadığını belirlemek imkansız olacağından deneme yeniden çalıştırmak gerekli olacaktır. Önce ve sonra morfoloji ve kirlenme değişiklikleri denetlemek için kuluçka dönemi bir optik mikroskop altında bütün wells gözlemlemek eşit derecede önemlidir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57127/57127fig1.jpg"> Şekil 1. Mantar önleyici faaliyet için suyu microdilution tahlil kullanarak Cryptococcus neoformanskarşı üç peptidler değerlendirilmesi. Mantar 1 x 104 hücre/mL bölgedir. Üç peptidler test edildi (AMP1, sütun 1-3; AMP2, sütun 5-7; AMP3, sütun 8-10) 100 µM (a satır) 0,78 µM (satır H) arasında değişen konsantrasyonları ile. Büyüme denetim ve boş sütunlar 11 ve 12, sırasıyla vardır. Görüntü bir dijital kamera ile kuluçka 48 saat sonra satın alınmıştır. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57127/57127fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57127/57127fig2.jpg"> Şekil 2. Mantar önleyici faaliyet için suyu microdilution tahlil kullanarak Candida albicans karşı üç peptidler değerlendirilmesi. Mantar 2 x 103 hücre/mL bölgedir. Üç peptidler test edildi (AMP1, sütun 1-3; AMP2, sütun 4-6; AMP3, sütunları 7-9) 100 µM (a satır) 0,78 µM (satır H) arasında değişen konsantrasyonları ile. Büyüme kontrol ve boş assay olarak dahil edildi, ama değil gözükmek içinde belgili tanımlık fotoğraf. Görüntü bir dijital kamera ile kuluçka 48 saat sonra satın alınmıştır. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57127/57127fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Şekil 1 ve Şekil 2gözlemlediği gibi 48 h yeterli zaman pozitif ve negatif wells görsel olarak C. neoformans ve C. albicansiçin ayırt etmektir. C. neoformans için sonuçları 24 h elde edilmiştir kayda değer değişiklik yapmadan CSLI kurallar altında daha erken. Her nüsha, pozitif ve negatif iyi ve her bileşik için mikrofon için bu nedenle, kolayca ayırt vardır. Bu hızlı mikrofon belirlenmesi için hangi molekülleri hak daha fazla araştırma seçimi gelince birden çok bileşikleri de olanak sağlar. Bu arada, şekil 3 fakir sonucunda yanlış seyreltme adımı sırasında pipetting gelen büyük olasılıkla örneğidir. Bu sütundaki 5, satır C, bir farkın C. neoformans büyüme çoğaltır (sütun 5-7) mevcut olduğu görülebilmektedir.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57127/57127fig3.jpg"> Şekil 3. Teknik bir hataya örnek olarak bir seri seyreltme tahlil çoğaltır. Görüntü 100 µM (a satır) 0,78 µM (satır H) arasında değişen amper seri bir seyreltme gösterir. C. neoformans büyüme farklılıkları çoğaltır sütunlar arasında mevcut seyreltme hazırlık sırasında 5-7, satır C, pipetting hata nedeniyle büyük olasılıkla. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57127/57127fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Tabakları gelince, şekil 1 ' de orada yorumudur antifungal bir tahlil karşı C. neoformanssütun 1-3 AMP1 için AMP2 için sütun 5-7 ve sütunları 8-10 AMP3 için değişen 100 µ konsantrasyonları ile yer alan, üç farklı amper için M (a satır) 0,78 µM (satır H). Boş denetim 12, satır A c sütununda yerleştirildi ise negatif/büyüme denetim sütun 11, satırları A'dan C'ye, yerleştirildi (Satırlar sütun 1-3, A-C) AMP1 ve AMP2 (satırlar sütun 5-7, A-D), yoğun yarı saydam ve orada medya olduğunu unutmayın hiçbir görünür büyüme içindir. Buna ek olarak, düşük konsantrasyonlarda kuyuları opak (sütun 1-3, satırları D-H ve sütun 5-7, satır E-H). Bu nedenle, satır C AMP2 için mikrofon satır D, yani, 25 µM ve 12.5 µM, sırasıyla ' AMP1 için mikrofon içerir kabul edilir. Mantar test tüm konsantrasyonlarda büyüdükçe AMP3 yeniden değerlendirilmek üzere olacaktır. AMP3 için reexamination testi orta bileşik, mikrobiyal kirlenme antifungal aktivite ile müdahale ediyor veya test aracısı mantar daha yüksek bir direnç olabilir nedenini belirlemek gereklidir. Son olasılık için test konsantrasyon aralığı artırmak gerekli olacaktır. Böylece onlar da aşırı doz ölçüm 600 tarafından değerlendirildi gözlemlediği gibi no inhibisyonu ve denetim wells homojen, nm.
Şekil 2gelince, üç ayrı peptidler C. albicanskarşı test edilmiştir. AMP1 için mikrofonlar (sütun 1-3), AMP2 (sütunlar 4-6) ve AMP3 (sütunlar 7-9) 50 µM, 6 µM ve 25 µM, sırasıyla vardı. C. albicans, filamentation kuluçka sıcaklık nedeniyle no inhibisyonu ve denetim wells, kümeleri içinde aşırı doz ölçüm okumak için kullanmak zorlaştırır görülebilmektedir.
Bazen, hiçbir büyüme wells görülmektedir. Bu toksin kirlenme (hiçbir büyüme de büyüme denetimleri bu durumda göster) medya veya aracı daha yüksek bir duyarlılık nedeniyle olabilir (Bu durumda, büyüme denetimlerini göster büyüme). Buna göre ikinci durumda konsantrasyon aralığı bir düşüş gerekli olabilir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Orta</td>
			<td colspan="2">Hazırlık</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">
2 X Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 orta – 500 mL
</td>
			<td colspan="2">10.4 g RPMI-1640 (desteklenen L-glutamin ve fenol kırmızı; bikarbonat olmadan)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">3 - 330 mM (N- morpholino) propan sülfonik asit (MOPS)
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
PH 7,0 ile küçültme/büyütme NaOH</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Filtrasyon (0,22 µM filtre) tarafından sterilize</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Fosfat tamponlu tuz (PBS)</td>
			<td colspan="2">137 mM NaCl</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2.7 mM KCl</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">10 mM Na2HPO4
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2 mM KH2PO4
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Otoklav 121° C'de 15 dakika.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Sabouraud dekstroz suyu</td>
			<td colspan="2">15 g toz 500 mL distile su içinde.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">PH 7,0 NaOH ile uyum</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Otoklav 121° C'de 15 dakika.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Sabouraud dekstroz Agar</td>
			<td colspan="2">32,5 g toz 500 mL distile su içinde.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">PH 7,0 NaOH ile uyum</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Otoklav 121° C'de 15 dakika.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. Medya ve reaktif hazırlık.

Watch this Scientific Journal Video about Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds at JoVE.com

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Mantar önleyici bileşikler ve özleri süzmek için bir kolay ve uyarlanabilir suyu microdilution yöntem.

Suyu Microdilution Vitro tarama: yeni mantar önleyici bileşikler algılamak için kolay ve hızlı bir yöntem

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

broth-microdilution-vitro-screening-an-easy-fast-method-to-detect-new

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

18.7K Görüntüleme.  University of Brasília. Mantar önleyici bileşikler ve özleri süzmek için bir kolay ve uyarlanabilir suyu microdilution yöntem.

Video: Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third most common infection in US hospitals. Different manifestations of candidiasis are associated with biofilm formation, both on host tissues and/or medical devices (i.e. catheters). Biofilm formation carries negative clinical implications, as cells within the biofilms are protected from host immune responses and from the action of antifungals. We have developed a simple, fast and robust in vitro model for the formation of C. albicans biofilms using 96 well microtiter-plates, which can also be used for biofilm antifungal susceptibility testing. The readout of this assay is colorimetric, based on the reduction of XTT (a tetrazolium salt) by metabolically active fungal biofilm cells. A typical experiment takes approximately 24 h for biofilm formation, with an additional 24 h for antifungal susceptibility testing. Because of its simplicity and the use of commonly available laboratory materials and equipment, this technique democratizes biofilm research and represents an important step towards the standardization of antifungal susceptibility testing of fungal biofilms.

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

We describe a simple, rapid and robust method for the formation of Candida albicans biofilms using 96 well microtiter plates and its utility in antifungal susceptibility testing of cells within biofilms.

İzleme Oluşumu ve Antifungal Duyarlılık Testi için 96 Şey microtiter Levha tabanlı Yöntemi Candida albicans Biyofilmler

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection in US hospitals1. These opportunistic infections pose a growing threat for an increasing number of compromised individuals, and carry unacceptably high mortality rates. This is in part due to the limited arsenal of antifungal drugs, but also to the emergence of resistance against the most commonly used antifungal agents. Further complicating treatment is the fact that a majority of manifestations of candidiasis are associated with the formation of biofilms, and cells within these biofilms show increased levels of resistance to most clinically-used antifungal agents2. Here we describe the development of a high-density microarray that consists of C. albicans nano-biofilms, which we have named CaBChip3. Briefly, a robotic microarrayer is used to print yeast cells of C. albicans onto a solid substrate. During printing, the yeast cells are enclosed in a three dimensional matrix using a volume as low as 50 nL and immobilized on a glass substrate with a suitable coating. After initial printing, the slides are incubated at 37 &deg;C for 24 hours to allow for biofilm development. During this period the spots grow into fully developed "nano-biofilms" that display typical structural and phenotypic characteristics associated with mature C. albicans biofilms (i.e. morphological complexity, three dimensional architecture and drug resistance)4. Overall, the CaBChip is composed of ~750 equivalent and spatially distinct biofilms; with the additional advantage that multiple chips can be printed and processed simultaneously. Cell viability is estimated by measuring the fluorescent intensity of FUN1 metabolic stain using a microarray scanner. This fungal chip is ideally suited for use in true high-throughput screening for antifungal drug discovery. Compared to current standards (i.e. the 96-well microtiter plate model of biofilm formation5), the main advantages of the fungal biofilm chip are automation, miniaturization, savings in amount and cost of reagents and analyses time, as well as the elimination of labor intensive steps. We believe that such chip will significantly speed up the antifungal drug discovery process.

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

We have developed a high-density microarray platform consisting of 3D nano-biofilms of C. albicans called CaBChip. The susceptibility profile of drugs tested on a CaBChip is comparable to the conventional 96-well plate model, suggesting that the fungal chip is ideally suited for true high-throughput screening of antifungal drugs.

Yüksek verim Antifungal İlaç Tarama Candida albicans Biyofilm Chip (Ca BChip)

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Biyomühendislik

Measuring Volatile and Non-volatile Antifungal Activity of Biocontrol Products

The protocol described is based on a plug-transfer technique that allows accurate determination of microorganism quantities and their developmental stages. A specified number of spores are spread on an agar plate. This agar plate is incubated for a defined period to allow the fungi to reach the expected developmental stage, except for spores where incubation is not required. Agar plugs covered by spores, hyphae, or mycelium are next withdrawn and transferred onto agar media containing the antifungal compound to be tested either placed at a distance from the fungi or in contact. This method is applicable to test both liquid extracts and solid samples (powders). It is particularly well suited for quantifying the relative contributions of volatile and non-volatile agents in bioactive mixtures and for determining their effects, specifically on spores, early hyphae, and mycelium.
The method is highly relevant for the characterization of the antifungal activity of biocontrol products, notably plant-derived products. Indeed, for plant treatment, the results can be used to guide the choice of mode of application and to establish the trigger thresholds.

We describe a modified agar-based method designed to quantify the antifungal effects of plant-derived products. Both volatile and non-volatile contributions to the antifungal activity can be assessed through this protocol. In addition, efficacy against fungi can be measured at key developmental stages in a single experimental setup.

Biyokontrol Ürünlerin Uçucu ve Uçucu Olmayan Antifungal Aktivitesinin Ölçülmesi

The protocol described is based on a plug-transfer technique that allows accurate determination of microorganism quantities and their developmental ...

Çevre

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, which are expressed as minimum inhibitory concentrations (MICs) are used in research for antimicrobial development and monitoring of resistance development and in the clinical setting for antimicrobial therapy guidance. Dalbavancin is a semi-synthetic lipoglycopeptide antimicrobial agent that was approved in May 2014 by the Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of acute bacterial skin and skin structure infections caused by Gram-positive organisms. The advantage of dalbavancin over current anti-staphylococcal therapies is its long half-life, which allows for once-weekly dosing. Dalbavancin has activity against Staphylococcus aureus (including both methicillin-susceptible S. aureus [MSSA] and methicillin-resistant S. aureus [MRSA]), coagulase-negative staphylococci, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus anginosus group, &#946;-hemolytic streptococci and vancomycin susceptible enterococci. Similar to other recent lipoglycopeptide agents, optimization of CLSI and ISO broth susceptibility test methods includes the use of dimethyl sulfoxide (DMSO) as a solvent when preparing stock solutions and polysorbate 80 (P80) to alleviate adherence of the agent to plastic. Prior to the clinical studies and during the initial development of dalbavancin, susceptibility studies were not performed with the use of P-80 and MIC results tended to be 2-4 fold higher and similarly higher MIC results were obtained with the agar dilution susceptibility method. Dalbavancin was first included in CLSI broth microdilution methodology tables in 2005 and amended in 2006 to clarify use of DMSO and P-80. The broth microdilution (BMD) procedure shown here is specific to dalbavancin and is in accordance with the CLSI and ISO methods, with step-by-step detail and focus on the critical steps added for clarity.

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

Dalbavansin için Başvuru sıvı mikrodilüsyon yöntemi<em&gt; İn Vitro</emAerobik Olarak Büyüyen Bakterilerin&gt; Duyarlılık Testi

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Hücre içi Hedefleme İnhibitörleri Etkinliği ve Sitotoksisite Taraması için sistem<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms

Candida species are the fourth-most common cause of systemic nosocomial infections. Systemic or invasive candidiasis frequently involves biofilm formation on implanted devices or catheters, which is associated with increased virulence and mortality. Biofilms produced by different Candida species exhibit enhanced resistance against various antifungal drugs. Therefore, there is a need to develop effective immunotherapies or adjunctive treatments against Candida biofilms. While the role of cellular immunity is well established in anti-Candida protection, the role of humoral immunity has been studied less.
It has been hypothesized that inhibition of biofilm formation and maturation is one of the major functions of protective antibodies, and Candida albicans germ tube antibodies (CAGTA) have been shown to suppress in vitro growth and biofilm formation of C. albicans earlier. This paper outlines a detailed protocol for evaluating the role of antibodies on biofilms formed by C. tropicalis. The methodology for this protocol involves C. tropicalis biofilm formation in 96-well microtiter plates, which were then incubated in the presence or absence of antigen-specific antibodies, followed by a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilide-2H-tetrazolium (XTT) assay for measuring the metabolic activity of fungal cells in the biofilm.
The specificity was confirmed by using appropriate serum controls, including Sap2-specific antibody-depleted serum. The results demonstrate that antibodies present in the serum of immunized animals can inhibit Candida biofilm maturation in vitro. In summary, this paper provides important insights regarding the potential of antibodies in developing novel immunotherapies and synergistic or adjunctive treatments against biofilms during invasive candidiasis. This in vitro protocol can be used to check the effect of potential new antifungal compounds on the metabolic activity of Candida species cells in biofilms.

A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms

A 96-well microtiter plate-based protocol using a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilide-2H-tetrazolium (XTT) reduction assay is described herein, to study antibodies' effects on biofilms formed by C. tropicalis. This in vitro protocol can be used to check the effect of potential new antifungal compounds on the metabolic activity of Candida species cells in biofilms.

Antikorların Candida tropicalis Biyofilmleri Üzerindeki Etkisini Değerlendirmek için Çözünür Tetrazolyum Bazlı İndirgeme Testi

Candida species are the fourth-most common cause of systemic nosocomial infections. Systemic or invasive candidiasis frequently involves biofilm formation ...

An In Vitro Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilm

Source: Chandley, P., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/64425">A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms.</a> J. Vis. Exp. (2022).
This video demonstrates an in vitro technique to study the effect of antibodies on fungal biofilms. The pathogenic fungus Candida tropicalis secretes a virulence factor secreted aspartyl proteinase 2 (Sap2), facilitating biofilm formation. Upon introducing a heat-inactivated serum containing Sap2-specific antibodies that inhibit biofilm maturation, the viability of the fungal cells is assessed using a chromogenic assay.

Antikorların Candida tropicalis Biyofilmi Üzerindeki Etkisini Değerlendirmek İçin Bir İn Vitro Test

1. C. tropicalis&#160;biofilm formation

	Prepare&#160;Candida&#160;biofilms in a 96-well flat-bottomed polystyrene microtiter plate as described earlier ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

İmmünoloji

Antikor Tabanlı Teknolojiler

Karakterizasyon ve Fonksiyonel Analiz

An In Vitro Broth Microdilution Assay for the Screening of Antifungal Compounds

Source: de-Souza-Silva, C. M., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/57127">Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates an in vitro assay to screen antifungal compounds using a broth microdilution assay. Test compounds are serially diluted in a microtiter plate and incubated with a fungal inoculum. Post-incubation, the plate is examined for wells without visible fungal growth to assess the antifungal potential of the test compounds and their minimum inhibitory concentration (MIC).

Antifungal Bileşiklerin Taranması için İn Vitro Et Suyu Mikrodilüsyon Testi

1. Solutions and Media

	Prepare 2X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium, phosphate-buffered saline (PBS), Sabouraud dextrose broth, and ...

İmmünodiyagnostik

İn Vitro ve İn Vivo Modeller

Real-Time Assessment of the Antifungal Activity of Primary Human Immune Cells

Source: Brunel, S. F. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/55444">Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus.</a>J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates live cell imaging for the analysis of antifungal activity in human neutrophils using fluorescent Aspergillus reporter conidia. Initially, both red and magenta fluorescence are detected within neutrophils, while red fluorescence decreases over time, indicating the degradation of conidia and confirming the antifungal activity of neutrophils.

Primer İnsan Bağışıklık Hücrelerinin Antifungal Aktivitesinin Gerçek Zamanlı Değerlendirmesi

All procedures involving human participants have been performed in compliance with the institutional, national, and international guidelines for human ...

Hücresel İmmünodiyagnostik

Evaluating the Effectiveness of a Test Compound against Mycobacteria in Broth

Source: Zheng, X., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/55273">System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates an in-broth assay to determine antibiotic efficacy against Mycobacterium tuberculosis. The bacterial culture is incubated with different concentrations of a bactericidal antibiotic. The bactericidal efficacy is measured by assessing the presence of viable bacteria using a resazurin assay.

Bir Test Bileşiğinin Et Suyundaki Mikobakterilere Karşı Etkinliğinin Değerlendirilmesi

1. Bacterial Strain and Growth Medium

	Make albumin dextrose and salt stock solution (ADS) by solubilizing 25 g of bovine serum albumin, 10.0 g of ...

Suyu Microdilution Vitro tarama: yeni mantar önleyici bileşikler algılamak için kolay ve hızlı bir yöntem

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler