このプロジェクトは、GM018568 の下で健康の国民の協会によって賄われていた。このプロトコルで行われた一部中心ナノスケール システム (CNS)、メンバーの国家ナノテクノロジー調整インフラストラクチャ ネットワーク (NNCI)、全米科学財団 NSF 賞第 1541959 の下でサポートされているの。中枢神経系は、ハーバード大学の一部です。多くのおかげでは、妊娠とここと装置の元のバージョンのビルドに示されるデバイスに使用されるマスター テンプレートを加工で自分の仕事のトーマス ・ ノーマンとネイサンの主原因です。また、ヨハン ・ アンデルセンと彼の貴重なコラボレーション アドバイスをありがとう、彼らのアドバイスや細菌マイクロ流体装置の継続的な改善の彼の研究室のメンバーに感謝します。

1. PDMS 装置鋳造
<ol><li>埃のない環境で PDMS ポリマーと 10:1 の比率で硬化剤を混ぜるし、ドガの少なくとも 10 分のための真空の下で。</li>
	<li>ポリスチレン ペトリ板に切れ目のないアルミ箔の部分にシリコン マスター (またはのエポキシまたはポリウレタン レプリカ) を配置します。表面の泡を破るに空気の穏やかな流れの深さの約 5 mm. ドガ ペトリ プレートで少なくとも 10 分間使用するマスター シェイプの上脱 PDMS 混合物を注ぐ。 注: 使用する 2 層デバイスの寸法に表示される付随 CAD ファイル5 (補足のファイル 1を参照してください)。プラスチック製レプリカ マスターが脱ガス; 中のフロートの一部このような場合は、きれいなプラスチック アプリケーター付きレプリカを押し下げます。</li>
	<li>60 ° C のオーブンで 1 時間、少なくとも PDMS を治すし、室温に冷却します。ペトリ プレートからマスターと硬化 PDMS を含むアルミ箔を削除します。マスターの後ろからアルミ箔を慎重に剥がし、慎重にマスターから PDMS の皮をむきます。 注: また、PDMS が治るかもしれない一晩室温で。シリコン ・ ウェハ マスターの相対的な脆弱性エポキシ接着剤を使用して 1/16 インチのウエハーを恒久的に結合することで解決できます-ウェハと同じサイズの厚いアルミ ディスク。</li>
	<li>ウェーハは通常 (補足ファイル 1参照) 寸法の違ういくつかのマイクロ流体デバイスを含む、クリーン、鋭いメスを使用してサイズを変更する 1 つのデバイスをカットします。 注: ルーチン枯草の仕事、C または付属の CAD ファイルに F が付いている 1.0 μ m 全体セル塹壕でデバイスを使用します。</li>
</ol>2. デバイス パンチと接合
<ol><li>半透明のオフィスのピースを配置はテープ パターン機能の可視性を高めるために装置のパターン側 (材料の表を参照してください)。入口と出口ポートは、(図 1) 表示されている流路の両端に円形の領域として識別されます。入口と出口のピンのデバイスに穴を開けるときは、視認性を向上させるため、細いマーカーを用いたドットの入口および出口をマークします。 注: に入口と出口のピンが混雑してないことを確認、他のすべてのチャネルはパンチ、最初にデバイスのアルファベット指定子のすぐ下にチャネル。</li>
	<li>パターン側がダウンして、PDMS デバイスを反転し、0.75 mm 生検パンチ; を使用してマークのドットをデバイスを通してパンチpunchings を破棄します。 注: 生検パンチによる穴は通常少しフレアのパンチがポリマーに入るために、デバイスが柄側を下とパンチをされています。逆向きでデバイスをパンチング穴パターン側がシャープな境界線を持っていることを保証します。</li>
	<li>顕微鏡を使用して、デバイスの入口と出口の部分にパンチ穴が重なっているを確認します。パンチ穴から PDMS の任意の余分なフラグメントを削除するのにには、先の細いピンセットを使用します。</li>
	<li>きれいなポリスチレン ペトリ プレートにデバイスと場所の両側からほこりを削除するのにには、粘着テープを使用します。100% イソプロピル アルコールとぬれ性とクリーン ルームで拭きます; 摩擦によって 22 × 40 mm カバーガラスを準備します。乾燥した埃のない空気または窒素のストリーム。</li>
	<li>パンチ PDMS デバイス機能側を洗浄カバー ガラスと一緒に酸素プラズマ クリーナー。<ol>
<li>プラズマ治療以下の設定でデバイス: 真空、70 mTorr;O2気圧、200 mTorr;持続時間 15 秒。電源、w. 30 プラズマ治療期間が終了した直後にデバイスとカバーガラスから削除、プラズマ クリーナー。</li>
		<li>PDMS を反転し、カバーガラスのセンターに配置パターン側連絡先ガラス;(入口と出口の領域の間を実行する) 供給チャンネルがカバー ガラスの長い軸に整列することを確認します。ガラスに対して PDMS シールように非常に軽く押し込みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>60 ° C で少なくとも 1 時間オーブンで組み立てられた装置を焼く焼成後、手動でデバイスの 1 つのコーナーにそっと押すことで、ガラス、PDMS が結合されるを確認します。 注: デバイスを結合すると、一度それが使 24 h 内でポリマーがプラズマ処理後の時間の増加とともにますます疎水性になるので</li>
</ol>3. マイクロ流体配管の準備
<ol><li>ポリマー (内径 (ID) 外径 (OD) 0.06 インチ 0.02 インチ) を適切な長さに使用する場合、シリンジ ポンプからスイッチング装置に達すると顕微鏡に取り付けたときにデバイスにチューブの長さをカットします。マイクロ流体のレーンがあるので多くの長さをカットします。</li>
	<li>切断および柔軟なシリコーンの管 (0.065 インチ OD 0.03 インチ ID) の"Y"のトップの棘、"Y"の下のバーブにシリコン チューブ 1 cm 長さ 2 cm 長さを割り当てることによって (使用する場合) ピンチ弁 Y 接合を組み立てる</li>
	<li>カット樹脂チューブ; の長さを 10 cm (または適切です)スイッチの接合部に 1 つの端を接続する"Y"の下のバーブに 1 cm シリコーン チューブ セグメントに挿入することにプラスチック注射器アダプターから曲がって約 90 ° 約 9 mm 針の端から削除されている 21 G 針にもう一方の端にそれらを接続します。</li>
	<li>21 G 鈍針を注射器からスイッチ装置管に針を挿入することによって実行されますチューブ セグメントの一方の端に接続します。Y ジャンクションの入口バルビツール剤のシリコーン チューブ セグメント チューブの各長さの他の端に挿入します。 注: 場所; でピンチ弁とジャンクションを保持する装置のいくつかの並べ替えを使用して、これは簡単にマイクロ ピペット チップ ボックス (図 2 D) から可能です。</li>
	<li>デバイスのプラグをコンセントから廃棄物を廃棄物を運ぶための樹脂チューブの長さをカットします。曲がった 21 G 針用意して上記のように一方の端にそれらを接続します。廃棄物ビーカーにチューブのもう一方の端をテープします。</li>
	<li>0.1 Mg/ml とウシ血清アルブミン (BSA) を含むメディアの適切なボリュームを準備し、目的のサイズと注射器の数を入力します。インレット チューブと負荷の注射器にシリンジ ポンプに接続されている準備された 21 G 針に BSA ロードされた注射器を接続します。 注: の各 20 mL 注射器でデバイスの 5 つのチャンネルを使用すると、典型的な実験。媒体が切り替えられる実験 5 シリンジの 2 銀行が必要になります。ここでは、最初の銀行を含むポンプ フェーズ 1 ポンプと呼ばれます、後のスイッチの中で、2 番目の銀行を含むポンプ フェーズ 2 ポンプと呼ばれます。</li>
	<li>高流量でシリンジ ポンプを実行して、入口配管から空気をパージ (> 500 μ L/分)、シリンジ ポンプを垂直方向に定位と上部に空気の泡をもたらすため注射器をタップして開始します。空気が注射器からパージされて、一度シリンジ ポンプを水平方向に配置、徐々 にタップかの除去、空気の泡を削除にスイッチ装置を注射器から高分子線をフリックします。(メディアの切り替え) の場合は、注射器の 2 番目の銀行のこのプロセスを繰り返します。</li>
	<li>空気の泡を削除後設定フェーズ 2 シリンジ ポンプ (すなわち、使用される媒体を第二に、スイッチの後) 1.5 μ L/分、流れを一時停止し。第 2 中期段階に対応する Y ジャンクションの分岐にフレキシブル チューブのセグメント上に小さなバインダー クリップを配置します。インレット チューブから 2 番目のメディアを削除するのには、少なくとも 30 分の適度なフロー率 (例えば、10 μ L/分) に相 1 シリンジ ポンプを実行し続ける Y ジャンクションの下流。</li>
</ol>4. セル文化準備
<ol><li>固定相に必要な媒体の興味のひずみの清酒を一晩、成長します。細菌の緊張は、セルがデバイスのチャネルから泳ぐしないでください、不動、セルをレンダリングする突然変異を含める必要があります。 注: このプロトコルでは、細菌株は枯草3610魔女A233Vの置換 (この突然変異を引き起こす螺旋状、防止の細胞の運動性ではなくまっすぐに鞭毛) を含む PrsbV- mNeonGreen細胞ストレスの記者と構成 Phyperspank- mNeptune (レッド) レポーターのセルを強調表示します。LB レノックス培地は、例のプロトコルで使用されます。マイクロ流体実験の代表的な菌株には、細胞の自動検出を容易にする 1 つ以上の蛍光転写記者と恒常生産、細胞質の蛍光タンパク質が含まれています。成長の欠陥は認められなかった LB レノックス豊富なメディアを使用した、しかし、分泌されるのでマイクロ流体条件下で最小限のメディアの枯草の成長が阻害されるかもしれないときシデロフォアは中型の流れによって洗い流されます。このような状況下では、S750中11の報告として成長をクエン酸ナトリウムと、中に塩化第二鉄添加による復元があります。</li>
	<li>実験の朝は、成長培地を 25 mL を含む困惑して 250 mL フラスコに 1:50枯草細胞を希釈します。1 より大きい光学密度 37 ° C で文化を振動で 5-6 時間細胞を成長します。 注: 定常相菌細胞は小さく、頻繁に見られるセルを少なくするため高密度細胞培養が望ましいチェーン、デバイス読み込みを促進します。細菌種は、最適なローディングのための他の媒体または成長条件を必要があります。</li>
	<li>枯草セル チェーン (エシェリヒア属大腸菌の必要はありません、他の種と必要ない場合があります) を削除する 15 mL コニカル チューブに細胞培養の約 15 mL をフィルター 5 μ m の孔径フィルターが装備する注射器を使用して。 注: 比較的少数の細胞を削除する必要があります。濾液は混濁する必要があります。</li>
	<li>室温で 4,000 x g で 10 分間のフィルター処理された文化を遠心します。上清を注ぎ、残りの細胞懸濁液をピペッティングを容易にする必要がある場合、新鮮な媒体の約 500 μ L を追加する管内残留液の上澄みで細胞ペレットを再懸濁します。</li>
</ol>5. デバイス読み込み
<ol><li>ゆっくりと空の薄いゲル読み込みマイクロ ピペットを置きます (材料の表を参照) をマイクロ流体デバイスのコンセント穴にヒントします。</li>
	<li>マイクロ チャンネル (図 2 a) の充填を監視するコンセントの穴に先端を観察入口穴に 1 mg/mL BSA を添加した培地を注入することによってデバイスをパッシベーション P200 ピペットで薄いゲル ロード ヒントを使用して、します。約 5 分間室温でデバイスを孵化させなさい。 注意: BSA はブロックまたは不活性化剤としては、PDMS 高分子の疎水性表面にバインドその親水性を増加し、他の蛋白質または細胞 (細胞表面分子) を経由してのバインドに使用されます。</li>
	<li>薄いゲル ロード ヒントを使用して、(セクション 4) から再懸濁細胞 (図 2 b) デバイスを介して細胞の進行状況を監視するアウトレット チャネルでヒントを使用して各チャネルを読み込みます。 注: 読み込みは最大 200 μ L のボリュームに P200 ピペットを設定し、セルの少量 (約ピペット チップの薄いセクションの半分の量) を吸引する前に空気のクッションを吸引によって促進されます。PDMS デバイスのボリュームが、マイクロ ピペットのそれと比較して小さい、再懸濁細胞量が正確には、する必要ではありません。細胞懸濁液はデバイスに戻ことができます限り、再懸濁細胞の密度に限度額なしのわかってください。細胞塊はデバイスを詰まらせることができ、徹底的なピペッティングおよび/または渦混合によって避けるべきであります。</li>
	<li>ゆっくり 1 つずつデバイスに損傷を防ぐための作業、コンセント穴からゲルの読み込みヒントを削除します。</li>
	<li>10 分 (図 2) の約 6,000 x g で適切なローター アダプターでベンチトップ遠心機でデバイスを遠心します。 注: 遠心ローター (図 2) に収まるように設計されたカスタム加工アルミニウム ローター アダプターは使用された;異なる遠心モデルを使用して、適切なローター アダプターで可能性があります。アダプターの重要な特徴は、サイド チャンネルにさせ細胞細胞トレンチのクローズド エンドの方向の水平力を提供することです。</li>
	<li>顕微鏡 (図 3) の下でロードの成功を確認、挿入なしでスライド ホルダー ・ ステージにデバイスを送れます。 注: このプロトコルは、60 X で 1.4 NA Ph3 油浸対物レンズがこの段階で両方の検証とその後のイメージングのために使用されます。</li>
</ol>6. デバイス アセンブリ、平衡、および取り付け
<ol><li>慎重にステージの挿入の下に PDMS の両側にカバーガラスをテーピングによってステージの挿入に読み込まれるデバイスをマウント (すなわちデバイスを取り付ける前にステージの挿入を反転)。PDMS を向いているので、ステージ挿入デバイス アセンブリを反転し、埃のないワイプ (図 2 D) などのソフト面に配置。</li>
	<li>フェーズ 1 シリンジ ポンプ 35 μ L/分の流量を調整する入口針し、口針を挿入、時に 1 つの車線を操作、(すなわち、廃棄物ビーカー; を実行して図 2 e)。</li>
	<li>クリーン無塵ワイパーで任意の過剰の中を拭いて、リークのためのデバイスを目視で確認します。余分なセル (通常濁ったストライプとして表示される) および廃棄物ビーカーに向かってゆっくりと移動中のメニスカスの外観のアウトレット チューブを調べます。</li>
	<li>廃棄物ビーカーに接続されているすべてのレーンを排出しているまで 35 μ L/分約 15-30 分で実行するデバイスを許可します。</li>
	<li>フェーズ 1 シリンジ ポンプを 1.5 μ L/分に設定し、流れを停止します。(このプロセスはローリング カートにすべて配置することによって助け) 顕微鏡に全体のポンプと装置の器具を持参し、1.5 μ L/分で中型の流れは慎重に倒立蛍光顕微鏡にデバイスとステージの挿入をマウント フェーズ 1 を再起動を使用してインレットとアウトレット チューブをルートに必要なテープ。</li>
	<li>イメージング デバイス上の目的の位置を検索し、必要に応じて画像を開始します。細胞は通常数時間 (約 10 世代) 定常状態指数段階成長に到達するを必要とは、画像集録の開始が遅れる、イメージングの平衡期間後開始を希望します。 注: 指数段階で開催された細胞の定常成長は、細胞分裂時間を追跡し、彼らが最小値は定数に達していることを確認それに続く画像解析時に確認する必要があります。</li>
</ol>7 媒体の切り替え
<ol><li>イメージングの連続ラウンドの間には、フェーズ 1 シリンジ ポンプの流れを一時停止します。フェーズ 2 シリコーン チューブ、シリコン チューブにそれぞれの Y ジャンクションのフェーズ 1 の分岐に移動からバインダー クリップを慎重に外します。国連-休止フェーズ 2 の流れはシリンジ ポンプ (これは 3.8 の手順で 1.5 μ L/分に設定された) とイメージングを続けます。 注: ポリマー チューブ下流の 10 cm の長さで 1.5 μ m/分で第 2 フェーズ中 Y ジャンクションの約 50 分のデバイスに到達します。デバイスには、蛍光トレーサー粒子を含むメディアを使用して経験的テストことができます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-cell+chemostat:+an+agarose-based,+microfluidic+device+for+high-throughput,+single-cell+studies+of+bacteria+and+bacterial+communities.">The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities.</a> Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).</li><li>Young, J. 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このマイクロ プロトコルは柔軟性手順の多くは、特定の種やひずみ、あるいは特定の目的のための使用を最適化するために変更する場合があります。確かに、このプロトコルでは我々 は枯草と使用を最適化するために元の「マザーマシン」コンセプト4に変更を加えました。多くの場合、セルの限定トレンチはこのプロトコルでセルを囲む浅いチャネルと 2 層セル ト...

地球上の生命の最も顕著な特徴の 1 つは、偉大な回復力と様々 な。分子生物学の中心的な目標は、細胞の遺伝子そして蛋白質を最大限に使用彼らの成長とさまざまな環境条件下でフィットネス ロジックを理解します。この目標を達成するために科学者が、自信を持ってを確認できる必要がありますどのように個々 の細胞は、成長、分類し、特定の条件セットの下で彼らの遺伝子を表現、細胞がその後の環境の変化に反応する方法注意すること。しかし、微生物学の従来の分析方法は対処できる質問の種類に影響を与える技術的な限界にあります。たとえば、一括文化に基づく分析は長年にわたって非常に有用されているまだ意味のある細胞に変化または総人口の細胞の小さいサブ集団の行動を隠すことができる人口レベルのデータのみを提供します。光顕的観察に基づく生きた細菌の単一細胞解析は単一細胞の挙動を明らかにするも技術的に限られています。細菌成長培地を含む agarose パッドに固定されている通常細胞の成長と分裂の群衆ミクロな視点、、観測時刻1を実質的に制限するちょうど少数の細胞周期後利用できる栄養素を使い果たす 2。さらに、ローカル栄養素の枯渇と細胞増殖による代謝副産物の併用の蓄積は常に測定や予測が難しい方法でローカル セル成長環境を変化します。アガロースのパッドを使用してこのような環境変化の定常状態の動作または成長条件3の特定の変化に対する細胞応答の研究に課題があります。
マイクロ流体技術、微細加工素子を液体培地が継続的に受け渡される古典的な実験的限界への解決策を提供しています。マイクロ流体デバイスを成長媒体の流れは常に新鮮な栄養素と細胞を提供する、均一な成長を作成することにより、余分な細胞と代謝副産物を洗い流しながら、生細胞の顕微鏡検査のための位置に個々 の細胞を保つことができます。環境。一定の成長条件の下で細胞の挙動は細胞の内部ロジックの妨げられていないビューを許可する環境要因の影響から分離して観察できます。流体の流れは、マイクロ流体デバイスを防止細胞と混雑になっているから、数十または数百の世代のための単一細胞系譜の観察可能な4,5になります。このような長い観測時間は、そうでなければ検出できない長期的またはまれな細胞挙動の検出を許可します。最後に、デバイスを流れることができます変更する培地の組成は、細胞ストレスの発症に、導入、または特定の化合物の除去に対応する、観察することができます。
マイクロは、重要なアプリケーションの数をすでに楽しんでいます。例えば、それは組織、器官、または種類の人間の細胞は、生体内での条件6をシミュレートするために共培養体オンチップ デバイスで使用されています微細環境7の線虫の動きの研究のため細菌バイオ フィルム (例えば、 8); 間の相互作用を調べるしてカプセル化と細胞や化学物質 (例えば、 9) の小さなボリュームの操作。マイクロ流体デバイスが物理として特に (優秀なレビューを参照してください10および11) の微生物学の分野でますます人気のあるもになるし、流動性が自然微生物ニッチ12に似合い。例えば、マイクロ流体最近として採用されている微生物によってそのような目的の細胞成長と分裂13,14,15、病原体の動き16の分析を正確に測定監視クォーラム センシング17および生理学的転移18とタンパク質19、他の多くの例の中で数をカウントします。ここで紹介した方法の系統や種の組み合わせではなく、単一の細菌細胞系譜の解析設計されます。ここに示すマイクロ流体デバイスを利用して「マザーマシン」デザインの4細胞が単一ファイルを栽培されて 1 つのバリエーション 1 つクローズド エンドと 1 つのオープン エンド; マイクロ トレンチ内オープン エンドのうち上下にプッシュ子孫細胞成長と分裂をセル流体の流れにします。私たちの分析は、通常、海溝のクローズド エンドに限られている「母」のセルだけに集中します。我々 は以前光顕微鏡ベース単一細胞解析技術、アガロース パッドの細胞固定化などで進歩としてこのメソッドを考慮します。メソッドは他の細菌種に適用もここでモデルとして使用されますが、枯草(大腸菌は別の共通モデル; 異なるセルのサイズや形態のいくつかの種は、新しいデバイスの作製を必要があります異なる寸法)。細胞をマークし、遺伝子発現の変化を可視化する蛍光レポーターの使用遺伝子扱いやすい種の使用が必要です。しかし、細胞の増殖と形態の解析に蛍光マーカーがなくても対応可能です。
現在のプロトコルを除く5; 写真平版は、他の場所で広範囲にわたって記載されているを使用してシリコン マスターを製造する工程マスターズは、微細加工設備から簡単に外部委託も可能です。強化シリコン マスターから PDMS デバイスの成形が含まれていますカバー ガラスの部分にデバイスのボンディングマイクロ流体の入口と出口の配管の組み立て、含むピンチ弁中程度の切り替えを許可するにはデバイスを不動態化、細菌のセルの準備および細菌細胞とデバイスの読み込み配管をデバイスに接続して, 細胞;蛍光顕微鏡イメージングのためにデバイスを読み込みます。多くの別の画像集録および処理ソフトウェア ツールを使用して視覚化および金利4、5のさまざまなデータを分析することができます、例の画像を表示し、画像キャプチャ方法はこのプロトコルには含まれません。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="580">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:71px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">(240)4019862</td>
			<td style="width:167px;">This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">0.75-mm biopsy punch</td>
			<td style="width:71px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">22 x 40 mm No. 1.5 cover glass</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48393 172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Plasma Etch PE-50</td>
			<td style="width:71px;">Plasma Etch Inc.</td>
			<td style="width:119px;">PE-50</td>
			<td>Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Tygon flexible tubing ID 0.02&#34;, OD 0.06&#34;</td>
			<td style="width:71px;">Saint-Gobain PPL Corp.</td>
			<td>AAD04103</td>
			<td>For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:223px;">Silicone Tubing, 0.04&#34; ID, 0.085&#34; OD</td>
			<td style="width:71px;">HelixMark Standard Silicone Tubing</td>
			<td style="width:119px;">60-795-05</td>
			<td>For pinch valves and Y-junction connection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7906-100G</td>
			<td>Used as passivation agent</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">ART Gel Pipet Tips (P200)</td>
			<td style="width:71px;">Molecular BioProducts</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2155</td>
			<td>For loading the device with medium and cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-&#956;m Supor membrane</td>
			<td style="width:71px;">Pall Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4560</td>
			<td>For filtering cultures before device loading</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">21-ga blunt needles, 1&#34;</td>
			<td style="width:71px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">75165A681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Y connector with 200-series barbs, 1/16&#34; ID tubing, polypropylene</td>
			<td style="width:71px;">Nordson Medical</td>
			<td style="width:119px;">Y210-6005</td>
			<td>The company is AKA Value Plastics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Eclipse Ti-E inverted microscope</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">LB Lennox</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Microfuge 18</td>
			<td style="width:71px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right">367160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">Bacillus subtilis strain NCIB3610</td>
			<td style="width:71px;">Bacillus Genetic Stock Center</td>
			<td style="width:119px;">3A1</td>
			<td>wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Gravity convection oven</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">414005-106</td>
			<td>for curing PDMS and baking assembled devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Scotch-Weld Epoxy Kit</td>
			<td style="width:71px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">2216 B/A</td>
			<td>may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Scotch Magic tape, 3/4&#34; width</td>
			<td style="width:71px;">3M</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted &#34;office tape&#34; or &#34;adhesive tape&#34; in protocol)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ800N</td>
			<td>listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W292907</td>
			<td>To clean cover glass</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">Syring pump, 6 channel</td>
			<td style="width:71px;">New Era Pump Systems Inc.</td>
			<td style="width:119px;">NE-1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:71px;">Kimberly-Clark</td>
			<td align="right" style="width:119px;">34120</td>
			<td>a brand of dust-free wipes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell microfluidic analysis of bacillus subtilis

マイクロ流体技術は、微生物学の伝統的な分析手法を制限の多くを克服します。単一セルの解像度との世代の数百に及ぶ時間長い観察併設して大量培養方法とは異なりアガロース パッドを用いた顕微鏡とは異なり厳密に管理することができる均一な生育条件があります。成長媒体の連続的な流れを分離細胞の増殖と代謝、増殖への応答と遺伝子発現の本格的な変化によって引き起こされるローカル化学環境で予測不可能な変化からマイクロ流体デバイスの細胞をから特定の刺激より自信を持って観察できます。枯草を使用ここでは「マザーマシン」を示すモデルの菌種として-細胞解析法を入力します。構築しマイクロ流体デバイスを垂直、細胞でそれをロード、顕微鏡イメージングを開始、1 つの成長媒体から別に切り替えることによって刺激する細胞を公開する方法を示します。ストレス応答の記者は、このメソッドによって得られるデータの種類を明らかにするための例として使用されます。我々 も簡単にさらに実験、細菌の胞子形成の分析などの他の種類のこのメソッドのアプリケーションを議論します。

すべてまたはほぼすべてを含む 1 つまたは複数の細菌細胞 (マイクロ流体側チャンネルの読み込み、デバイス、マイクロ流体配管を取り付ける前に位相差顕微鏡により評価した成功の最初のセルと見なされる3 a を図)。各チャンネル内の複数のセルを表示する最適な読み込みが、チャンネルはそれにもかかわらず平衡期間 (図 3 b</s...

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Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

枯草菌の単一細胞マイクロ流体解析

例として枯草菌を使用して個々 の細菌細胞系譜のマイクロ流体解析手法を提案します。メソッドは、しっかりと制御し、均一な生育条件下で細胞世代の何百もの観察を許可することで微生物学の伝統的な分析手法の欠点を克服します。

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

single-cell-microfluidic-analysis-of-bacillus-subtilis

Research

JoVE Journal

Biology

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

11.9K ビュー.  Oklahoma State University. 例として枯草菌を使用して個々 の細菌細胞系譜のマイクロ流体解析手法を提案します。メソッドは、しっかりと制御し、均一な生育条件下で細胞世代の何百もの観察を許可することで微生物学の伝統的な分析手法の欠点を克服します。

ビデオ: Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

イメージングのミスマッチ修復とのDNA損傷に対する細胞応答枯草菌</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

生物学

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a thorough analysis of the fates of single cells under normal and experimental conditions. To this end, transfection methods that target single progenitors are a prerequisite. We describe here a technically straightforward method for transfecting single cells in chicken tissues in-ovo, allowing reliable lineage tracing as well as genetic manipulation. Specific tissue domains are targeted within the somite or neural tube, and DNA is injected directly into the epithelium of interest, resulting in sporadic transfection of single cells. Using reporters, clonal populations may consequently be traced for up to three days, and behavior of genetically manipulated clonal populations can be compared with that of controls. This method takes advantage of the accessibility of the chick embryo along with emerging tools for genetic manipulation. We compare and discuss its advantages over the widely-used electroporation method, and possible applications and use in additional in-vivo models are also suggested. We advocate the use of this method as a significant addition and complement for existing lineage tracing and genetic interference tools.

Using fine tip micropipettes we inject plasmid DNA into subdomains of chicken somites or neural tubes. The concentration of the plasmid is adjusted to generate single transfected cells. We then allow the cells to develop into clonal populations.

鶏胚における単一細胞のトランスフェクション

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

ゼブラフィッシュにおける単一の細胞運命のマッピング

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

RNAの蛍光による単一細胞遺伝子転写の解析<em&gt; in situで</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

セル通信解析のための単一細胞のマイクロインジェクション

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

低酸素症後単一細胞レベルでのグローバルのRNA合成の分析

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 &#181;m) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (&lt; 10 &#181;m), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.

Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.

シングルプローブの応用：周囲条件下での質量分析イメージングと単一細胞解析

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

有害な効果の低圧プラズマ滅菌を使用して住んでいる携帯顕微鏡枯草菌胞子の生存に調査

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

ゼブラフィッシュ ランゲルハンス島における単一セルの解像度カルシウム イメージングを用いた β-細胞機能の解析

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic bacteria of special relevance for a wide number of hosts. P. syringae enters the plant from the leaf surface and multiplies rapidly within the apoplast, forming microcolonies that occupy the intercellular space. The constitutive expression of fluorescent proteins by the bacteria allows for visualization of the microcolonies and monitoring of the development of the infection at the microscopic level. Recent advances in single-cell analysis have revealed the large complexity reached by clonal isogenic bacterial populations. This complexity, referred to as phenotypic heterogeneity, is the consequence of cell-to-cell differences in gene expression (not linked to genetic differences) among the bacterial community. To analyze the expression of individual loci at the single-cell level, transcriptional fusions to fluorescent proteins have been widely used. Under stress conditions, such as those occurring during colonization of the plant apoplast, P. syringae differentiates into distinct subpopulations based on the heterogeneous expression of key virulence genes (i.e., the Hrp type III secretion system). However, single-cell analysis of any given P. syringae population recovered from plant tissue is challenging due to the cellular debris released during the mechanical disruption intrinsic to the inoculation and bacterial extraction processes. The present report details a method developed to monitor the expression of P. syringae genes of interest at the single-cell level during the colonization of Arabidopsis and bean plants. The preparation of the plants and the bacterial suspensions used for inoculation using a vacuum chamber are described. The recovery of endophytic bacteria from infected leaves by apoplastic fluid extraction is also explained here. Both the bacterial inoculation and bacterial extraction methods are empirically optimized to minimize plant and bacterial cell damage, resulting in bacterial preparations optimal for microscopy and flow cytometry analysis.

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

The present protocol describes a method that allows single-cell gene expression analysis on Pseudomonas syringae populations grown within the plant apoplast.

植物組織における シュードモナス・シリンガエ 遺伝子発現の単一細胞解析

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...