Bu proje GM018568 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse edildi. Bu iletişim kuralı için Nano sistemleri (CNS), bir üye, ulusal nanoteknoloji koordine altyapı ağı (NSF Ödülü No 1541959 altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen NNCI), kısmen merkezinde gerçekleştirildi. CNS Harvard Üniversitesi bir parçasıdır. Çok teşekkürler Thomas Norman ve Nathan Lord nedeniyle hamile kalma ve burada ve orijinali cihazları binada gösterilen aygıtlar için kullanılan ana şablon imalatı işlerini içindir. Biz de Johan Paulsson onun değerli ortak tavsiyeler için teşekkür ederiz ve üyeleri laboratuarına onların tavsiye ve bakteriyel mikrosıvısal için aygıtlar için sürekli iyileştirmeler için teşekkür ederim.

1. PDMS aygıt döküm
<ol><li>Tozsuz bir ortamda mix PDMS polimer ve kür Ajan 10:1 oranında ve en az 10 dk için vakum altında degas.</li>
	<li>Kırılmamış alüminyum folyo parçası üzerinde bir silikon ana (veya bunların bir epoksi veya poliüretan yineleme) polistren bir Petri tabağına yerleştirin. Degassed PDMS karışımı bir derinlik, yaklaşık 5 mm. Degas Petri tabağı en az 10 dk. kullanım için asıl yüzey kabarcık kırmak için hava yumuşak akışı dökün. Not: Kullanılan iki katmanlı cihazın boyutları eşlik eden CAD5 dosya sağlanır (bkz. ek dosya 1). Bir plastik çoğaltma ana gaz giderme sırasında kısmen savrulabilir; Bu durumda, çoğaltma temiz plastik bir aplikatör ile itin.</li>
	<li>60 ° c fırında en az 1 h için PDMS tedavi ve oda sıcaklığında serin. Ana ve tedavi PDMS Petri plaka içeren alüminyum folyo kaldırın. Alüminyum folyo asıl arkasından dikkatle akasındaki sonra dikkatli bir şekilde ana PDMS soyma. Not: Alternatif olarak, PDMS gecede oda sıcaklığında giderildi. Bir silikon gofret ustanın göreli kırılganlık kalıcı olarak 1/16 inç gofret bağ için epoksi yapıştırıcı kullanarak aşmak-kalın alüminyum disk gofret olarak aynı boyutta.</li>
	<li>Bir gofret genellikle birkaç mikrosıvısal aygıt (bkz. ek dosya 1) biraz farklı boyutları ile içerir gibi temiz, keskin neşter kullanarak boyutlandırmak için tek bir aygıt kesti. Not: B. subtilis iş alışılmış çalışma yöntemi için C veya F eşlik eden CAD dosyası ile işaretlenmiş 1.0 µm çapında hücre siperleri ile cihazlar kullanın.</li>
</ol>2. aygıt Delme ve bağlama
<ol><li>Yer biteviye-in yarı saydam office desenli özellikleri görünürlüğünü artırmak için aygıt desenli yan tarafa teyp ( Tablo malzemelerigörmek). Giriş ve çıkış bağlantı noktaları görünür sıvı kanalları (şekil 1) ters ucunda dairesel alanları olarak tanımlanır. Ne zaman içinde belgili tanımlık aygıt giriş ve çıkış pins için delik delme onların görünürlüğünü artırmak için ince uçlu bir işaretleyici kullanarak nokta ile giriş ve çıkışları işaretleyin. Not: giriş ve çıkış sabitleyicileri kalabalık değildir emin olmak için her kanal, kanal hemen altında aygıtın alfabetik göstergesi ile başlayan yumruk.</li>
	<li>Böylece desenli yan aşağı PDMS aygıt flip ve aygıt için bir 0,75 mm biyopsi yumruk kullanarak işaretli nokta üzerinden yumruk; punchings atın. Not: biyopsi yumruk tarafından oluşturulan delik genellikle biraz nerede yumruk polimer girer alevlendi çünkü belgili tanımlık aygıt desenli tarafı yumrukladı. Cihazın bir ters yönde Delme desenli tarafında delik keskin bir kenarlığı vardır sağlar.</li>
	<li>Bir stereomicroscope kullanarak, delikli delik cihazın giriş ve çıkış alanları ile üst üste emin olun. İnce uçlu cımbız PDMS herhangi bir yabancı parçaları delikli delik kaldırmak için kullanın.</li>
	<li>Yapışkan bant toz yeri ve aygıt her iki tarafından bir temiz polistren Petri plaka kaldırmak için kullanın. 22 mm x 40 mm kapak cam % 100 izopropil alkol ile ıslatma ve temiz oda temizleme işlemi ile sürtünme hazırlayın; Kuru bir dere tozsuz hava veya azot ile.</li>
	<li>Delikli PDMS aygıt özelliği yan birlikte temizlenir cam bir oksijen plazma temizleyici yerleştirin.<ol>
<li>Plazma-aşağıdaki ayarları cihazla tedavi: vakum, 70 mTorr; O2 basınç, 200 mTorr; süresi, 15 s; Hemen plazma tedavi süresi sona erdikten sonra güç, 30 W. aygıt ve cam plazma temizleyici çıkarın.</li>
		<li>PDMS ters çevir ve desenli yan cam rehber kapak cam ortasına yerleştirin; (giriş ve çıkış alanları arasında çalışan) besleme kanalları kapak cam uzun ekseni ile hizalandığından emin olun. Çok yavaşça PDMS mühürler cama emin olmak için bastırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir fırın montajı aygıt için en az 1 h 60 ° C'de pişirin Pişirme sonra el ile PDMS cam cihazın bir köşede hafifçe iterek gümrüklü doğrulayın. Not: bir kez belgili tanımlık aygıt bağlı, polimer ile artan yaşam süresi plazma tedaviden sonra giderek hidrofobik hale olarak 24 saat içinde kullanılmalıdır.</li>
</ol>3. mikrosıvısal sıhhi tesisat hazırlık
<ol><li>Polimer (kullanılıyorsa) anahtarlama cihazları şırınga pompa ulaşmak için uygun uzunlukta ve mikroskobunun monte edildiğinde cihaz (iç çap (ID) 0,02 inç, dış çap (OD) 0,06 inç) boru uzunlukları kesti. Mikrosıvısal yolları gibi birçok uzunlukları kesti.</li>
	<li>Y kavşak çimdik vanalar için kesme ve esnek silikon üst barbs "G" ve "G" alt barb için silikon tüp uzunlukları 1 cm (0.03 inç kimliği, 0,065 inç OD) boru uzunlukları 2 cm ekleme tarafından (kullanılıyorsa) monte</li>
	<li>Polimer boru uzunlukları 10 cm (veya uygun) kesme; "G" alt barb 1 cm silikon tüp kesimlerinde içine ekleyerek anahtarı Kavşağı için bir ucunda bağlamak Bunları plastik şırınga adaptörleri ve bent yaklaşık 90 ° yaklaşık 9 mm iğne sonundan itibaren kaldırılmıştır 21 G iğneler için diğer ucunda bağlayın.</li>
	<li>21 G künt iğneler şırınga iğneleri boru içine ekleyerek anahtarı aparatı çalışır boru parçaları bir ucunu bağlayın. Y kavşak giriş barbs silikon tüp kesimlerinde her boru uzunluğu diğer ucunu takın. Not: bir tür cihazlar çimdik vanalar ve kavşak tutmak için kullanmak; Bu micropipette uç kutusu (şekil 2B) kolayca yapılabilir.</li>
	<li>Cihazın prizinden atık atık bir ölçek için yürütmek için polimer boru uzunlukları kesti. Onları yukarıda açıklandığı gibi hazırlanan bükülmüş 21 G iğneler için bir ucunda bağlayın. Tüpler diğer ucunu atık bir ölçek teyp.</li>
	<li>0.1 mg/mL sığır serum albumin (BSA) içeren ortama uygun miktarda hazırlamak ve şırınga sayısını ve istediğiniz boyuta doldurun. BSA yüklü şırınga giriş boru ve yük şırınga şırınga pompa bağlı hazırlanan 21 G iğneler bağlayın. Not: cihazın 5 kanalları kullanılır, tipik deneyler için her biri 20 mL şırınga. Hangi orta açık olduğundan bir deney 5 şırıngaların 2 bankalar gerektirir. Burada, içeren ilk banka pompa Faz-1 pompa olarak adlandırılır ve içeren sonrası anahtarı orta ile ikinci banka pompa Faz-2 pompa olarak adlandırılır.</li>
	<li>Hava giriş sıhhi tesisat üzerinden bir yüksek akış hızı enjektör pompaları çalıştırarak tasfiye (> 500 µL/dak), başlangıç şırınga pompalar dikey yönlendirme ve üst hava kabarcığı getirmeyi şırıngaları dokunarak. Bir kez hava şırınga temizlendi, şırınga pompa yatay konuma getirin ve aşamalı olarak dokunun veya şırıngaları polimer satırlarından çıkarmak ve hava kabarcıkları tasfiye anahtarı aparatı flick. Eğer (medya anahtarlama) şırınga ikinci banka için bu işlemi yineleyin.</li>
	<li>Hava kabarcıkları temizlenir sonra Faz-2 şırınga pompa ayarla (Yani, kullanılacak olan orta ile anahtarından sonra ikinci) 1,5 µL/dk, sonra akışını duraklatır. İkinci orta aşamasına karşılık gelen Y kavşak kolu küçük bağlayıcı klipleri esnek boru parçaları üzerine yerleştirin. İkinci orta giriş boru üzerinden temizlemek en az 30 dakika için bir mütevazı akış hızı (örneğin, 10 µL/dak), faz-1 enjektör pompa çalışmaya devam aşağı Y kavşak.</li>
</ol>4. hücre kültür hazırlama
<ol><li>Bir preculture büyük ilgi istenen orta yük gecede, durağan faz için büyümek. Bakteriyel zorlanma böylece hücreleri cihazın kanalları dışında yüzmem hücreleri hareketsiz, işler bir mutasyon içermelidir. Not: Bu protokol için bakteriyel yük B. subtilis 3610 olduğunu bir cadıA233V ikame, (Bu mutasyon neden düz Helisel, önleme hücre hareketliliği yerine olmak kamçı) içeren bir PrsbV- mNeonGreen muhabiri hücre stres ve bir kurucu Phyperspank- mNeptune (kırmızı) muhabir hücreleri vurgulamak için. LB Lennox orta örnek protokolü kullanılır. Tipik suşları havacilik deneyler için bir veya daha fazla floresan transkripsiyon gazetecilere ve yapısal üretilen, sitoplazmik floresan protein hücrelerinin otomatik algılama kolaylaştırmak için içerir. Büyüme kusurları LB Lennox zengin Orta kullanılmıştır, ancak en az medya B. subtilis büyüme mikrosıvısal koşullar altında salgılanan çünkü inhibe siderophores uzağa tarafından orta akış yıkanır tespit edildi değil. Bu durumda, büyüme sodyum sitrat ve orta ferrik klorid eklenmesiyle S750 orta11için rapor olarak geri yüklenebilir.</li>
	<li>Deneme, sabah B. subtilis hücreler büyüme ortamının 25 mL içeren bir şaşkın 250 mL şişe 1:50 oranında seyreltin. 1'den büyük bir optik yoğunluğunun 37 ° C'de kültür sallayarak içinde 5-6 h için hücreleri büyümek. Not: sabit faz B. subtilis vardır daha küçük ve daha az sık sık bulunan hücre hücreleri çünkü yoğun hücre kültürü tercih edilir zincirleri, aygıt yükleme kolaylaştırmak. Farklı bakteri türleri diğer Orta veya büyüme koşulları için en uygun yükleme gerektirebilir.</li>
	<li>5-µm gözenek boyutu filtre ile donatılmış bir şırınga kullanarak, hücre kültürü yaklaşık 15 mL ( E. coli için gereksizdir ve diğer türler ile gerekli olmayabilir) B. subtilis hücre zincirleri kaldırmak için bir 15 mL konik tüp içine filtre uygulama. Not: Görece az sayıda hücre kaldırılması gerektiğini; filtrate bulanık olmalıdır.</li>
	<li>Filtre uygulanmış kültür için 4.000 x g oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi. Eğer hücre süspansiyon pipetting kolaylaştırmak için gerekli taze orta yaklaşık 500 µL ekleme tüpte kalan kalan süpernatant sıvı hücre Pelet resuspend ve süpernatant dökün.</li>
</ol>5. aygıt yükleme
<ol><li>Yavaşça boş ince jel-yükleme micropipette koyun mikrosıvısal cihazın çıkış deliklere İpuçları ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>İnce jel-yükleme ipuçları P200 micropipette ile kullanarak, aygıt 1 mg/mL BSA giriş deliklere dolum mikrosıvısal kanal (şekil 2A) izlemek için çıkış delikleri ipuçlarında gözlemleyerek içeren orta enjekte edilerek passivate. Cihazın oda sıcaklığında yaklaşık 5 min için kuluçkaya. Not: BSA genellikle onun hydrophilicity artan ve diğer proteinlerin veya hücre (hücre yüzey molekülleri) üzerinden bağlama azaltarak PDMS polimer hidrofobik yüzeye bağlayan bir engelleme veya pasivasyon ajan olarak kullanılır.</li>
	<li>İnce jel-yükleme ipuçlarını kullanarak, aygıt (şekil 2B) hücreleri ilerlemesini izlemek için çıkış kanalda ipuçlarını kullanarak her kanal ile resuspended hücrelerden (Bölüm 4), yük. Not: Yükleme P200 micropipette en fazla 200-µL hacmi ayarlayıp sonra hücre küçük hacimli (yaklaşık yarım hacmi pipet ucu ince bölümünü) aspirating önce hava yastığı aspirating kolaylaştırılmıştır. PDMS aygıt hacmi micropipette göre küçük olduğu resuspended hücre hacmi kesin, olması gerekmez. Hücre süspansiyon cihazın içine pipetted sürece resuspended hücre yoğunluğu için üst sınır yoktur biliyoruz. Hücre kümeleri cihazın yapışmasına neden olabilir ve tam pipetting ve/veya girdap karıştırma tarafından kaçınılmalıdır.</li>
	<li>Yavaşça jel-yükleme ipuçları teker teker cihaza zarar önlemek için çalışma çıkış delikleri kaldırın.</li>
	<li>Santrifüj kapasitesi yaklaşık 6.000 x g de bir uygun rotor adaptör bir tezgah üstü microcentrifuge cihazda 10 dk (şekil 2C). Not: bir microcentrifuge rotor (şekil 2C) uyacak şekilde tasarlanmış bir özel işlenmiş alüminyum rotor adaptör kullanılan; farklı santrifüj modelleri uygun rotor adaptörler ile kullanılabilir. Önemli özelliğidir adaptörü, böylece hücreleri yan kanallarına zorlama hücre siperler, kapalı uçları yönünde yanal kuvvet sağlamasıdır.</li>
	<li>(Şekil 3) mikroskop altında başarılı yükleme doğrulayın ancak cihazın slayt tutucu/sahneye yapıştırılması olmadan eklemek. Not: Bu protokol için bir 60 X, 1.4 NA Ph3 petrol-daldırma amaç bu aşamada her iki doğrulama için sonraki görüntüleme için kullanılır.</li>
</ol>6. cihaz montaj, denge ve montaj
<ol><li>Dikkatle PDMS sahne Ekle alt tarafındaki kapak cam taping tarafından yüklenen aygıt sahne Ekle üzerine monte (Yani, aygıtı eklemeden önce sahne Ekle ters çevir). Böylece PDMS karşı karşıya olduğu sahne Ekle-aygıt montaj ters çevir ve tozsuz mendil (şekil 2B) gibi yumuşak bir yüzeye yerleştirin.</li>
	<li>35 µL/dak Faz-1 enjektör pompa akış hızı ayarlamak bir yol, bir anda çalışıyor, giriş iğne ve sonra çıkış iğne ekleyin (Yani, çalışan atık kabı için; Şekil 2E).</li>
	<li>Uzak aşırı herhangi bir ortamda temiz tozsuz mendil ile silin ve cihazın kaçakları kontrol edin. Aşırı hücreleri (genellikle bulanık bir çizgi görünür) ve yavaş yavaş atık kabı doğru hareket edecek orta Menisküs görünümünü çıkış boruları inceleyin.</li>
	<li>Cihazın 35 µL/dk için yaklaşık 15-30 dakika, tüm bağlı yolları atık kabı boşaltılmasına kadar çalıştırmak için izin verir.</li>
	<li>Faz-1 enjektör pompa 1,5 µL/dak için ayarla ve akışını duraklatır. Tüm pompa ve aygıt aparatı (Bu işlem destekli tüm çalışırken bir at arabası yerleştirerek) mikroskop getirmek ve Faz-1 1,5 µL/dak, Orta Akış dikkatle cihazın üzerine bir ters Floresans mikroskobu ile sahne Ekle mount yeniden kullanma giriş ve çıkış boru yönlendirmek için gereken bant.</li>
	<li>İstenilen pozisyonlar için düşsel aygıt bulun ve istediğiniz gibi görüntüleme başlar. Not hücreleri genellikle gerektirir kararlı durum üssel faz büyüme ulaşmak için birkaç saat (yaklaşık 10 nesil) ve resim alma başlangıcı olarak gecikebilir görüntüleme denge döneminden sonra başlamasını istediğiniz. Not: Kararlı durum büyüme üstel aşamasında düzenlenen hücre sonraki görüntü analizi sırasında hücre bölünmesi kez izleme ve sürekli en az değeri ulaştınız sağlanması doğrulanması gerekir.</li>
</ol>7. orta arasında geçiş yapma
<ol><li>Arasında art arda gelen mermi görüntüleme Faz-1 enjektör pompa akış duraklatın. Dikkatle boru, Y kavşak Faz-1 Şubesi her silikon tüp hareketli Faz-2 silikon üzerinden bağlayıcı klipleri çöz. BM-pause Faz-2 akışını (Bu adım 3.8 1,5 µL/min ayarlandı) pompa şırınga ve görüntüleme devam. Not: polimer aşağı boru, 10 cm uzunluğunda 1,5 µm/min, Y kavşak ikinci aşama orta cihazın yaklaşık 50 dakika içinde ulaşır. Cihazın vakti floresan izleyici parçacıkları içeren medyayı kullanarak ampirik olarak test edilebilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-cell+chemostat:+an+agarose-based,+microfluidic+device+for+high-throughput,+single-cell+studies+of+bacteria+and+bacterial+communities.">The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities.</a> Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).</li><li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy.">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).</li><li>Dusny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+bias+of+microcultivation+environments+on+single-cell+physiology.">Technical bias of microcultivation environments on single-cell physiology.</a> Lab Chip. 15 (8), 1822-1834 (2015).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+growth+of+Escherichia+coli.">Robust growth of Escherichia coli.</a> Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).</li><li>Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+and+modularity+in+cell-fate+decision+making.">Memory and modularity in cell-fate decision making.</a> Nature. 503 (7477), 481-486 (2013).</li><li>Perestrelo, A. R., Aguas, A. C., Rainer, A., Forte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Organ/Body-on-a-Chip+Devices+at+the+Convergence+of+Biology+and+Microengineering.">Microfluidic Organ/Body-on-a-Chip Devices at the Convergence of Biology and Microengineering.</a> Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).</li><li>Johari, S., Nock, V., Alkaisi, M. M., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+analysis+of+C.+elegans+muscular+forces+and+locomotion+patterns+in+microstructured+environments.">On-chip analysis of C. elegans muscular forces and locomotion patterns in microstructured environments.</a> Lab Chip. 13 (9), 1699-1707 (2013).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+distant+biofilms+and+emergence+of+nutrient+time-sharing.">Coupling between distant biofilms and emergence of nutrient time-sharing.</a> Science. 356 (6338), 638-642 (2017).</li><li>Choi, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+cell-laden+microgels+using+double+emulsion+drops+with+a+sacrificial+ultra-thin+oil+shell.">One-step generation of cell-laden microgels using double emulsion drops with a sacrificial ultra-thin oil shell.</a> Lab Chip. 16 (9), 1549-1555 (2016).</li><li>Weibel, D. B., Diluzio, W. R., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+meets+microbiology.">Microfabrication meets microbiology.</a> Nat Rev Microbiol. 5 (3), 209-218 (2007).</li><li>Taheri-Araghi, S., Brown, S. D., Sauls, J. T., McIntosh, D. B., Jun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Physiology.">Single-Cell Physiology.</a> Annu Rev Biophys. 44, 123-142 (2015).</li><li>Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+physical+mechanisms+and+biofilm+processes:+review+of+microfluidic+methods.">Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods.</a> Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).</li><li>Yu, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+microfluidic+tracking+of+coccoid+cyanobacterial+cells+reveals+robust+control+of+division+timing.">Long-term microfluidic tracking of coccoid cyanobacterial cells reveals robust control of division timing.</a> BMC Biol. 15 (1), 11 (2017).</li><li>Campos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+constant+size+extension+drives+bacterial+cell+size+homeostasis.">A constant size extension drives bacterial cell size homeostasis.</a> Cell. 159 (6), 1433-1446 (2014).</li><li>Taheri-Araghi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-size+control+and+homeostasis+in+bacteria.">Cell-size control and homeostasis in bacteria.</a> Curr Biol. 25 (3), 385-391 (2015).</li><li>Siryaporn, A., Kim, M. K., Shen, Y., Stone, H. A., Gitai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization,+competition,+and+dispersal+of+pathogens+in+fluid+flow+networks.">Colonization, competition, and dispersal of pathogens in fluid flow networks.</a> Curr Biol. 25 (9), 1201-1207 (2015).</li><li>Connell, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+prokaryotic+social+behaviors+with+bacterial+"lobster+traps".">Probing prokaryotic social behaviors with bacterial "lobster traps".</a> MBio. 1 (4), (2010).</li><li>Long, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+bacterial+adaptation+dynamics+at+the+single-cell+level+using+a+microfluidic+chemostat+and+time-lapse+fluorescence+microscopy.">Measuring bacterial adaptation dynamics at the single-cell level using a microfluidic chemostat and time-lapse fluorescence microscopy.</a> Analyst. 139 (20), 5254-5262 (2014).</li><li>Okumus, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+slowing-down+of+cytoplasmic+diffusion+allows+in+vivo+counting+of+proteins+in+individual+cells.">Mechanical slowing-down of cytoplasmic diffusion allows in vivo counting of proteins in individual cells.</a> Nat Commun. 7, 11641 (2016).</li><li>Teng, S. W., Mukherji, S., Moffitt, J. R., de Buyl, S., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+circadian+oscillations+in+growing+cyanobacteria+require+transcriptional+feedback.">Robust circadian oscillations in growing cyanobacteria require transcriptional feedback.</a> Science. 340 (6133), 737-740 (2013).</li><li>Baker, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable,+Pneumatically+Actuated+Microfluidic+Device+with+an+Integrated+Nanochannel+Array+To+Track+Development+of+Individual+Bacteria.">Programmable, Pneumatically Actuated Microfluidic Device with an Integrated Nanochannel Array To Track Development of Individual Bacteria.</a> Anal Chem. 88 (17), 8476-8483 (2016).</li><li>Russell, J. R., Cabeen, M. T., Wiggins, P. A., Paulsson, J., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+in+a+phosphorelay+drives+stochastic+entry+into+sporulation+in+Bacillus+subtilis.">Noise in a phosphorelay drives stochastic entry into sporulation in Bacillus subtilis.</a> EMBO J. 36 (19), 2856-2869 (2017).</li><li>Cabeen, M. T., Russell, J. R., Paulsson, J., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+microfluidic+platform+to+uncover+basic+features+of+energy+and+environmental+stress+responses+in+individual+cells+of+Bacillus+subtilis.">Use of a microfluidic platform to uncover basic features of energy and environmental stress responses in individual cells of Bacillus subtilis.</a> PLoS Genet. 13 (7), e1006901 (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Adımlardan kullanımı belirli türler veya zorlanma veya belirli bir amaç için en iyi duruma getirmek için değiştirilebilir bu havacilik Protokolü esnek olmamasıdır. Nitekim, bu protokol için kullanımı B. subtilisile optimize etmek için orijinal "ana makine" kavramı4 değişiklikler yapılmış. Çoğu zaman, bu protokol için hücreleri çevreleyen sığ bir kanal ile iki katlı hücre siperler, kullanın, ancak hangi hücrelerin sınırlı olan siperler bir tek katmanlı ...

Dünya'daki yaşam en çarpıcı özelliklerinden biri onun büyük esneklik ve çeşitlilik olduğunu. Moleküler Biyoloji merkezi amacı tarafından hücreleri genler ve proteinler onların büyüme ve fitness çok çeşitli çevresel koşullar altında en üst düzeye çıkarmak için kullanılan mantığı anlamaktır. Bu hedefe ulaşmak için bilim adamları güvenle gözlemlemek mümkün olmalıdır nasıl, tek tek hücreleri büyümek, bölmek ve onların genler belirli bir koşullar kümesi altında hızlı hücre kendi ortamlarında sonraki değişiklikler nasıl yanıt verdiklerini kaydetti. Ancak, Mikrobiyoloji geleneksel analitik yöntemleri ele alınabileceği soru türleri etkiler teknik kısıtlamalar bulunmaktadır. Örneğin, toplu kültür tabanlı analizler yıllar içinde çok yararlı olmuştur henüz anlamlı hücre hücre çeşitleri veya daha küçük alt nüfus toplam nüfusunun hücrelerinin davranışlarını maske yapabilirsiniz nüfus düzeyinde veri sundukları. Tek hücreli analizleri üzerinde ışık mikroskobu göre yaşayan bakterilerin tek hücreli davranışı ortaya ama aynı zamanda teknik olarak sınırlıdır. Bakteri genellikle büyüme orta, içeren özel yastıkları immobilize ama büyüme ve bölünme kalabalıklar mikroskobik görünümü hücre ve gözlem zaman1önemli ölçüde sınırlayan bir kaç hücre döngüsünden sonra kullanılabilir besin tüketir, 2. Ayrıca, besin yerel tükenmesi ve hücre büyümesi nedeniyle metabolik yan eşlik eden birikimini sürekli yerel hücre büyüme çevre değişiyor yollarla ölçmek ya da tahmin etmek zordur. Özel pedleri kullanarak bu tür çevresel değişiklikler için çalışmalar kararlı durum davranışları veya hücresel yanıt büyüme koşulları3belirli değişiklikler için bir sorun teşkil.
Bir sıvı orta sürekli microfabricated cihazlar aracılığıyla akıtılana mikrosıvısal, klasik deneysel sınırlamalar bir çözüm sunar. Büyüme orta akış sürekli hücreleri ile taze besin sağlar ve metabolik yan ve aşırı hücreleri, böylece son derece düzgün bir büyüme oluşturma uzak yıkar bir mikrosıvısal aygıt tek tek hücreler pozisyon için yaşamak-cep mikroskobu saklayabilirsiniz çevre. Sürekli büyüme koşullar altında çevresel faktörler, hücre iç mantık Engelsiz bir görünümünü izin etkisi düşük yalıtım modunda hücre davranışlar görülebilir. Hücrelerle kalabalık olma mikrosıvısal cihaz sıvı akışını engeller, tek hücre soy onlarca veya yüzlerce nesiller için gözlem olası4,5olur. Böyle uzun gözlem kez aksi takdirde belirlenemeyen uzun vadeli veya nadir cep davranışları tespiti izin. Son olarak, aygıt akıyor, değiştirilebilir orta bileşimi olacak, onlar bir stres başlangıcı veya giriş veya belirli bir bileşik kaldırılması için yanıt olarak uyması gereken hücreler izin.
Havacilik zaten önemli uygulamaları bir dizi kazanmıştır. Örneğin, doku, organ- veya vücut-on-a-chip aygıt, birden fazla insan hücre türü bir vivo içinde durumu6benzetimini yapmak için işbirliği kültürlü olduğu içinde kullanılmıştır; microstructured ortamlar7nematodunun hareketi incelenmesi için; Bakteriyel biyofilmler (örneğin, 8); arasındaki etkileşimler incelemek için ve için saklama ve işleme küçük hacimli hücreleri veya kimyasal maddeler (örneğin, 9). Mikrosıvısal cihazlar da özellikle onların fiziksel olarak (için mükemmel yorumları, bkz: 10 ve 11), Mikrobiyoloji alanında giderek daha popüler hale gelmiştir ve akış özellikleri doğal mikrobiyal nişler12' ye uyumlu. Örneğin, havacilik son zamanlarda microbiologists tarafından bu tür amaçlar için tam olarak patojen hareketi16analiz hücre büyüme ve bölüm13,14,15, ölçüm olarak istihdam edilmiştir, çekirdek algılama17 ve fizyolojik geçişler18izleme ve protein için sayma19, birçok diğer örnekler arasında. Burada sunulan yöntem suşları ya türü birleşimlerini yerine tek bakteri hücre soy analizi için özel olarak tasarlanmıştır. "Ana makine" tasarım4hangi hücreleri tek dosya büyüdü, bir varyasyon aşağıda gösterildiği mikrosıvısal aygıt kullanır içinde bir mikrosıvısal siper bir kapalı ucu ve bir açık uçlu; hücre büyümesi ve bölünme iter döl hücreleri yukarı ve dışarı açık ucu sıvı akışı. Bizim analizler genellikle yalnızca açmanın kapalı sonunda sınırlı "anne" hücre odaklanmak. Biz bu yöntemi önceki ışık mikroskobu tabanlı tek hücreli analitik teknikler, Hücre immobilizasyon üzerinde özel yastıkları gibi üzerinde bir gelişme düşünün. B. subtilis bir model olarak kullanılırken, yöntem aynı zamanda diğer bakteriyel türler için geçerlidir (Escherichia coli başka bir ortak modeli, farklı hücre boyutlarını veya türleri morfoloji ile bazı türler yeni cihazlar imalatı gerektirebilir farklı boyutları ile). Floresan gazetecilere hücreleri işaretlemek için ve gen ekspresyonu değişimler görselleştirmek için kullanımı genetik olarak uysal türlerin kullanımını gerektirir; Ancak, hücre büyümesi ve Morfoloji bile floresan işaretleri mümkün analizlerdir.
Mevcut iletişim kuralı fotolitografi, başka bir yerde yaygın olarak tanımlanmıştır5kullanarak silikon asıl imalatı işlemi hariç; ustalar da microfabrication tesislerinden kolayca dış kaynaklı olabilir. Güçlendirilmiş silikon ana PDMS aygıttan kalıplama içerir; kapak cam parçası aygıta bağlar; mikrosıvısal giriş ve çıkış sıhhi tesisat montaj, orta geçiş izin vermek için de dahil olmak üzere çimdik vanalar; Cihazın pasivasyon, bakteri hücreleri hazırlamak ve bakteri hücreleri ile aygıt yükleme; su tesisatı için aygıt ekleme ve hücreleri sıcaklığına; ve üzerine floresan mikroskop için düşsel aygıt yükleme. Çünkü birçok farklı resim alma ve işleme yazılımı araçları görselleştirmek ve faiz4,5farklı veri analiz etmek için kullanılabilir, örnek resimler gösterilir, ama görüntü yakalama yöntemleri bu protokol için dahil değildir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="580">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:71px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">(240)4019862</td>
			<td style="width:167px;">This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">0.75-mm biopsy punch</td>
			<td style="width:71px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">22 x 40 mm No. 1.5 cover glass</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48393 172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Plasma Etch PE-50</td>
			<td style="width:71px;">Plasma Etch Inc.</td>
			<td style="width:119px;">PE-50</td>
			<td>Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Tygon flexible tubing ID 0.02&#34;, OD 0.06&#34;</td>
			<td style="width:71px;">Saint-Gobain PPL Corp.</td>
			<td>AAD04103</td>
			<td>For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:223px;">Silicone Tubing, 0.04&#34; ID, 0.085&#34; OD</td>
			<td style="width:71px;">HelixMark Standard Silicone Tubing</td>
			<td style="width:119px;">60-795-05</td>
			<td>For pinch valves and Y-junction connection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7906-100G</td>
			<td>Used as passivation agent</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">ART Gel Pipet Tips (P200)</td>
			<td style="width:71px;">Molecular BioProducts</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2155</td>
			<td>For loading the device with medium and cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-&#956;m Supor membrane</td>
			<td style="width:71px;">Pall Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4560</td>
			<td>For filtering cultures before device loading</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">21-ga blunt needles, 1&#34;</td>
			<td style="width:71px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">75165A681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Y connector with 200-series barbs, 1/16&#34; ID tubing, polypropylene</td>
			<td style="width:71px;">Nordson Medical</td>
			<td style="width:119px;">Y210-6005</td>
			<td>The company is AKA Value Plastics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Eclipse Ti-E inverted microscope</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">LB Lennox</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Microfuge 18</td>
			<td style="width:71px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right">367160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">Bacillus subtilis strain NCIB3610</td>
			<td style="width:71px;">Bacillus Genetic Stock Center</td>
			<td style="width:119px;">3A1</td>
			<td>wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Gravity convection oven</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">414005-106</td>
			<td>for curing PDMS and baking assembled devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Scotch-Weld Epoxy Kit</td>
			<td style="width:71px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">2216 B/A</td>
			<td>may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Scotch Magic tape, 3/4&#34; width</td>
			<td style="width:71px;">3M</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted &#34;office tape&#34; or &#34;adhesive tape&#34; in protocol)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ800N</td>
			<td>listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W292907</td>
			<td>To clean cover glass</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">Syring pump, 6 channel</td>
			<td style="width:71px;">New Era Pump Systems Inc.</td>
			<td style="width:119px;">NE-1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:71px;">Kimberly-Clark</td>
			<td align="right" style="width:119px;">34120</td>
			<td>a brand of dust-free wipes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell microfluidic analysis of bacillus subtilis

Mikrosıvısal teknoloji birçok Mikrobiyoloji geleneksel analitik yöntemleri için kısıtlamaları üstesinden gelir. Toplu-kültür yöntemlerinden farklı olarak, tek hücreli çözünürlük ve nesiller yüzlerce spanning kez uzun gözlem sunar; Özel yastık tabanlı mikroskobu sıkı kontrol Tekdüzen büyüme koşullarına sahiptir. Çünkü bir mikrosıvısal aygıt neden olduğu hücre büyümesi ve metabolizma, otantik değişiklikler gen ekspresyonu ve hücre büyümesini yanıt olarak yerel kimyasal ortamdaki öngörülemeyen varyasyonlarından hücrelerde büyüme ortamının sürekli akışı ayırır belirli uyaranlara daha güvenle görülebilmektedir. Bacillus subtilis kullanılır burada bir "ana makine" göstermek için bir model bakteriyel türler olarak-yazın için hücresel analiz yöntemi. Biz oluşturmak ve bir mikrosıvısal aygıt çekül, hücrelerle yüklemek, mikroskobik görüntüleme başlatmak ve bir büyüme ortamından diğerine geçiş yaparak bir uyarana yapan hücreleri göstermek nasıl göstereceğim. Stres-duyarlı bir muhabir bu yöntemle elde edilen veri türü ortaya çıkarmak için bir örnek olarak kullanılır. Da kısaca uygulamaları deneyler, bakteriyel sporulation analizi gibi diğer türleri için bu yöntemin daha fazla tartışmak.

Yükleme, faz kontrast mikroskopi tarafından aygıta mikrosıvısal sıhhi tesisat eklemeden önce değerlendirildi gibi başarılı ilk hücre veya neredeyse tümünü içeren bir veya daha fazla bakteri hücreleri ( mikrosıvısal yan Kanallar sahip olarak düşünülebilir Şekil 3A). En uygun yükleme her kanalda birkaç hücreyi gösterir ama kanalları yine de hücreleri hücre büyüme denge döneminde (şekil 3B) nedeniy...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis at JoVE.com

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Bacillus subtilis tek hücreli mikrosıvısal analizi

Biz örnek olarak Bacillus subtilis kullanarak bireysel bakteri hücre soy mikrosıvısal çözümlenmesi için bir yöntem mevcut. Yöntemi gözlem, hücre nesiller sıkı bir şekilde kontrol edilebilir ve düzgün büyüme koşullar altında yüzlerce izin vererek Mikrobiyoloji geleneksel analitik yöntemleri eksikliklerin üstesinden gelir.

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

single-cell-microfluidic-analysis-of-bacillus-subtilis

Research

JoVE Journal

Biology

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

11.9K Görüntüleme.  Oklahoma State University. Biz örnek olarak Bacillus subtilis kullanarak bireysel bakteri hücre soy mikrosıvısal çözümlenmesi için bir yöntem mevcut. Yöntemi gözlem, hücre nesiller sıkı bir şekilde kontrol edilebilir ve düzgün büyüme koşullar altında yüzlerce izin vererek Mikrobiyoloji geleneksel analitik yöntemleri eksikliklerin üstesinden gelir.

Video: Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

Görüntüleme Uyuşmazlığı DNA Hasar Onarım ve Hücresel Yanıtları Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Biyoloji

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a thorough analysis of the fates of single cells under normal and experimental conditions. To this end, transfection methods that target single progenitors are a prerequisite. We describe here a technically straightforward method for transfecting single cells in chicken tissues in-ovo, allowing reliable lineage tracing as well as genetic manipulation. Specific tissue domains are targeted within the somite or neural tube, and DNA is injected directly into the epithelium of interest, resulting in sporadic transfection of single cells. Using reporters, clonal populations may consequently be traced for up to three days, and behavior of genetically manipulated clonal populations can be compared with that of controls. This method takes advantage of the accessibility of the chick embryo along with emerging tools for genetic manipulation. We compare and discuss its advantages over the widely-used electroporation method, and possible applications and use in additional in-vivo models are also suggested. We advocate the use of this method as a significant addition and complement for existing lineage tracing and genetic interference tools.

Using fine tip micropipettes we inject plasmid DNA into subdomains of chicken somites or neural tubes. The concentration of the plasmid is adjusted to generate single transfected cells. We then allow the cells to develop into clonal populations.

Civciv Embriyolar Tek Hücreli Transfeksiyon

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Zebra balığı Tek Hücre Kader Haritalama

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

RNA Floresan tarafından Tek hücreli Gen Transkripsiyon Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

Hücre Haberleşme Analizi İçin Tek hücreli Mikroenjeksiyon

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 &#181;m) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (&lt; 10 &#181;m), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.

Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.

Tek prob Uygulamalar: Ortam Koşullarında Kütle Spektrometre Görüntüleme ve Tek Hücre Analizi

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

Zararlı etkileri, düşük basınç plazma sterilizasyon Bacillus subtilis sporlar kullanarak canlı cep mikroskobu sağkalıma soruşturma

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Zebra balığı adacıkları tek hücreli çözünürlük kalsiyum Imaging'i kullanma Beta hücre fonksiyonu Analizi

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic bacteria of special relevance for a wide number of hosts. P. syringae enters the plant from the leaf surface and multiplies rapidly within the apoplast, forming microcolonies that occupy the intercellular space. The constitutive expression of fluorescent proteins by the bacteria allows for visualization of the microcolonies and monitoring of the development of the infection at the microscopic level. Recent advances in single-cell analysis have revealed the large complexity reached by clonal isogenic bacterial populations. This complexity, referred to as phenotypic heterogeneity, is the consequence of cell-to-cell differences in gene expression (not linked to genetic differences) among the bacterial community. To analyze the expression of individual loci at the single-cell level, transcriptional fusions to fluorescent proteins have been widely used. Under stress conditions, such as those occurring during colonization of the plant apoplast, P. syringae differentiates into distinct subpopulations based on the heterogeneous expression of key virulence genes (i.e., the Hrp type III secretion system). However, single-cell analysis of any given P. syringae population recovered from plant tissue is challenging due to the cellular debris released during the mechanical disruption intrinsic to the inoculation and bacterial extraction processes. The present report details a method developed to monitor the expression of P. syringae genes of interest at the single-cell level during the colonization of Arabidopsis and bean plants. The preparation of the plants and the bacterial suspensions used for inoculation using a vacuum chamber are described. The recovery of endophytic bacteria from infected leaves by apoplastic fluid extraction is also explained here. Both the bacterial inoculation and bacterial extraction methods are empirically optimized to minimize plant and bacterial cell damage, resulting in bacterial preparations optimal for microscopy and flow cytometry analysis.

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

The present protocol describes a method that allows single-cell gene expression analysis on Pseudomonas syringae populations grown within the plant apoplast.

Bitki Dokusu İçindeki Pseudomonas syringae Genlerinin Ekspresyonunun Tek Hücreli Analizi

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...