Name: single-cell microfluidic analysis of bacillus subtilis
Uploaded: 2018-01-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis at JoVE.com

הפרויקט מומן על ידי מכוני הבריאות הלאומיים תחת GM018568. פרוטוקול זה בוצעה באופן חלקי במרכז עבור ננו מערכות (CNS), חבר של נבחרת ננוטכנולוגיה מתואמת תשתית רשת (NNCI), אשר נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע תחת ה-NSF פרס 1541959 מס. CNS מהווה חלק מאוניברסיטת הרווארד. תודה רבה הן בשל תומאס נורמן ואדון נתן לעבודתם להריון, בדיית בתבנית האב המשמש עבור ההתקנים המוצגים כאן, בבניין את הגירסה המקורית של המנגנון. אנחנו גם תודה פאולסון יוהן על עצתו שיתופי יקר ותודה חברי המעבדה שלו עצה, שיפורים המשך מנגנוני microfluidic חיידקי.

<ol>
	<li>Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-cell+chemostat:+an+agarose-based,+microfluidic+device+for+high-throughput,+single-cell+studies+of+bacteria+and+bacterial+communities.">The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities.</a> Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).</li><li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy.">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).</li><li>Dusny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+bias+of+microcultivation+environments+on+single-cell+physiology.">Technical bias of microcultivation environments on single-cell physiology.</a> Lab Chip. 15 (8), 1822-1834 (2015).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+growth+of+Escherichia+coli.">Robust growth of Escherichia coli.</a> Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).</li><li>Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+and+modularity+in+cell-fate+decision+making.">Memory and modularity in cell-fate decision making.</a> Nature. 503 (7477), 481-486 (2013).</li><li>Perestrelo, A. R., Aguas, A. C., Rainer, A., Forte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Organ/Body-on-a-Chip+Devices+at+the+Convergence+of+Biology+and+Microengineering.">Microfluidic Organ/Body-on-a-Chip Devices at the Convergence of Biology and Microengineering.</a> Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).</li><li>Johari, S., Nock, V., Alkaisi, M. M., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+analysis+of+C.+elegans+muscular+forces+and+locomotion+patterns+in+microstructured+environments.">On-chip analysis of C. elegans muscular forces and locomotion patterns in microstructured environments.</a> Lab Chip. 13 (9), 1699-1707 (2013).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+distant+biofilms+and+emergence+of+nutrient+time-sharing.">Coupling between distant biofilms and emergence of nutrient time-sharing.</a> Science. 356 (6338), 638-642 (2017).</li><li>Choi, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+cell-laden+microgels+using+double+emulsion+drops+with+a+sacrificial+ultra-thin+oil+shell.">One-step generation of cell-laden microgels using double emulsion drops with a sacrificial ultra-thin oil shell.</a> Lab Chip. 16 (9), 1549-1555 (2016).</li><li>Weibel, D. B., Diluzio, W. R., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+meets+microbiology.">Microfabrication meets microbiology.</a> Nat Rev Microbiol. 5 (3), 209-218 (2007).</li><li>Taheri-Araghi, S., Brown, S. D., Sauls, J. T., McIntosh, D. B., Jun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Physiology.">Single-Cell Physiology.</a> Annu Rev Biophys. 44, 123-142 (2015).</li><li>Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+physical+mechanisms+and+biofilm+processes:+review+of+microfluidic+methods.">Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods.</a> Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).</li><li>Yu, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+microfluidic+tracking+of+coccoid+cyanobacterial+cells+reveals+robust+control+of+division+timing.">Long-term microfluidic tracking of coccoid cyanobacterial cells reveals robust control of division timing.</a> BMC Biol. 15 (1), 11 (2017).</li><li>Campos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+constant+size+extension+drives+bacterial+cell+size+homeostasis.">A constant size extension drives bacterial cell size homeostasis.</a> Cell. 159 (6), 1433-1446 (2014).</li><li>Taheri-Araghi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-size+control+and+homeostasis+in+bacteria.">Cell-size control and homeostasis in bacteria.</a> Curr Biol. 25 (3), 385-391 (2015).</li><li>Siryaporn, A., Kim, M. K., Shen, Y., Stone, H. A., Gitai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization,+competition,+and+dispersal+of+pathogens+in+fluid+flow+networks.">Colonization, competition, and dispersal of pathogens in fluid flow networks.</a> Curr Biol. 25 (9), 1201-1207 (2015).</li><li>Connell, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+prokaryotic+social+behaviors+with+bacterial+"lobster+traps".">Probing prokaryotic social behaviors with bacterial "lobster traps".</a> MBio. 1 (4), (2010).</li><li>Long, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+bacterial+adaptation+dynamics+at+the+single-cell+level+using+a+microfluidic+chemostat+and+time-lapse+fluorescence+microscopy.">Measuring bacterial adaptation dynamics at the single-cell level using a microfluidic chemostat and time-lapse fluorescence microscopy.</a> Analyst. 139 (20), 5254-5262 (2014).</li><li>Okumus, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+slowing-down+of+cytoplasmic+diffusion+allows+in+vivo+counting+of+proteins+in+individual+cells.">Mechanical slowing-down of cytoplasmic diffusion allows in vivo counting of proteins in individual cells.</a> Nat Commun. 7, 11641 (2016).</li><li>Teng, S. W., Mukherji, S., Moffitt, J. R., de Buyl, S., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+circadian+oscillations+in+growing+cyanobacteria+require+transcriptional+feedback.">Robust circadian oscillations in growing cyanobacteria require transcriptional feedback.</a> Science. 340 (6133), 737-740 (2013).</li><li>Baker, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable,+Pneumatically+Actuated+Microfluidic+Device+with+an+Integrated+Nanochannel+Array+To+Track+Development+of+Individual+Bacteria.">Programmable, Pneumatically Actuated Microfluidic Device with an Integrated Nanochannel Array To Track Development of Individual Bacteria.</a> Anal Chem. 88 (17), 8476-8483 (2016).</li><li>Russell, J. R., Cabeen, M. T., Wiggins, P. A., Paulsson, J., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+in+a+phosphorelay+drives+stochastic+entry+into+sporulation+in+Bacillus+subtilis.">Noise in a phosphorelay drives stochastic entry into sporulation in Bacillus subtilis.</a> EMBO J. 36 (19), 2856-2869 (2017).</li><li>Cabeen, M. T., Russell, J. R., Paulsson, J., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+microfluidic+platform+to+uncover+basic+features+of+energy+and+environmental+stress+responses+in+individual+cells+of+Bacillus+subtilis.">Use of a microfluidic platform to uncover basic features of energy and environmental stress responses in individual cells of Bacillus subtilis.</a> PLoS Genet. 13 (7), e1006901 (2017).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מיקרופלואידיקה הוא גמיש כי רבים מן השלבים ניתן לשנות כדי למטב את השימוש עם מינים מסוימים או זן או למטרה מסוימת. ואכן, ב פרוטוקול זה עשינו שינויים המקורי "האם מכונה" קונספט4 כדי למטב את השימוש עם B. subtilis. לעתים קרובות, התעלות שבו מרותקים התאים מהווה תכונה שכבה אחת, ואילו בפרוטוקול זה נשתמש תעלות תא דו שכבתי, עם ערוץ רדוד המקיפים את התאים. העיצוב דו שכבתי הוצג כדרך להגדיל את השטף של חומרי הזנה של מטבוליטים מתאי B. subtilis , במיוחד ב לונג (> 75 מיקרומטר) תעלות5; אולם, תכונות שכבה אחת לעתים קרובות מספיק לצמיחה אופטימלית בתא, משמשים בדרך כלל עבור e. coli, בייחוד כאשר הם קצרים יותר (~ 25 מיקרומטר)4. אנו משתמשים בדרך כלל יותר תעלות, כפי הם להפחית את התדירות שבה שרשראות תא B. subtilis , אשר מתעוררות stochastically, יוצאו מהמארז תעלות שלהם על ידי הזרם בינוני הראשי האכלה ערוץ5.
עוד שינויים, כגון השימוש של מכשירים עם מידות שונות תכונה (למשל, רוחב הערוץ) או מאפיינים (למשל, צורה, מספר הקצוות פתוחים) יכול להיות מוחלף בהתאמה. למשל, השימוש תא תעלות כי הם לפתוח בשני הקצוות (ולא בקצה אחד בלבד, כמו בפרוטוקול הנוכחי) שימש אחרים מחקרים1,20,21. תעלות פתוחות בשני הקצוות למנוע הזדקנות התא כי הם כל הזמן ממלאים עם תאים היילוד (לעומת אמא מכונות, שבו התא העתיקים מתבצע מעקב אחר, תאים חדשים יידחפו התעלה), למרות העובדה כי תאים בוגרים יידחפו את שני הקצוות בדרך כלל מגביל חלון תצפיתיים שלהם פחות מ 10 דורות1,21. אנחנו בדרך כלל מבקשים עוד תצפיתיים החלונות (מאות דורות) המוצעים על ידי מכונת אמא, אשר מאפשרים לתהליכים memoryless אפילו מידה אשר זמני ההמתנה הם עשרות או מאות דורות ארוכים5. השתמשנו גם העיצוב מכונת אמו להתבונן בתאים לא גדל באופן אקספוננציאלי, כמו שלנו ניתוחים של הנבגה22. במקרים כאלה, תאים נוספים לאורך הגידול תעלות יכול להיות והכוונה ניתח22.
רבים מן השלבים בפרוטוקול הם יחסית לסלוח כי ניתן לשנות אותם מבלי להשפיע באופן משמעותי על תוצאות פרוטוקול. למשל, גירסה מוקדמת יותר של הפרוטוקול שנקרא לניקוי הזכוכית המכסה על-ידי רציפים 10 דקות אמבט sonication שלבים ב- 10 מ' KOH ומים אז טהור, אבל מצאנו כי המכשיר טוב מליטה ותפעול הושג באמצעות השיטה הפשוטה יותר מבוססי אלכוהול איזופרופיל ניקוי שלב המתוארים כאן. אם בעיית מליטה התעורר החשד יצוקה על הניקיון של הזכוכית המכסה, החזרה פרוטוקול ניקוי יותר מחמירים מומלץ. באופן דומה, בעוד אנו משתמשים צעד צנטריפוגה כדי למקסם את התא loading בתעלות תא, טעינה מלאה סבירה יכולה להיות מושגת גם ללא שלב זה, ובלבד מרוכז מאוד תאים משמשים עבור השלב טעינה. אסטרטגיה חלופית זו יכולה להיות שימושית במיוחד עבור חוקרים אשר אין מתאם צנטריפוגה זמינים כדי לסובב את המכשיר. ניתן להשתמש שוב, ריכוזים שונים של סוכן passivating/שימון (BSA ב פרוטוקול זה); אנו משתמשים באופן שגרתי ריכוז גבוה ככל 1 מ"ג/מ"ל. במקרים שבו זן עשוי להיות רגיש BSA, תוצאות מתקבלות על הדעת עשויה להיות מושגת גם בהיעדר של סוכן passivating. ואכן, כאשר השתמשנו במכשיר microfluidic לבחון הנבגה, הדורש תא הרעבה, היינו מודאגים כי BSA עשוי לשמש מקור מזין פוטנציאליים עבור התאים, אז אנחנו מושמט מן הזרם בינונית מבלי התבוננות משמעותי כלשהו תופעות לוואי22.
ראוי לציין, זרימה רציפה של מדיום דרך המכשיר יכול להפיק פנוטיפים שונים במקצת לעומת צמיחת תאים במערכת סגורה, כגון בקבוקון. לדוגמה, המחסור התזונתי או מורכבים עשויה להיות מאתגרת, כמו תאים יכולים לעיתים קרובות ניקוי תרכובות של זרימה בינונית. אכן, הבחנו כי גרימת תא הנבגה באמצעות הרעבה דורשת זמן רב יותר במכשיר microfluidic מאשר בבקבוקון. באופן דומה, הבחנו כי אינדוקציה של מתח אנרגיה באמצעות את זרחון חמצוני decoupler קרבוניל ציאניד m-chlorophenyl hydrazone (CCCP) דורש ריכוז גבוה several-fold במכשיר microfluidic מאשר דיווח בתרבות הבקבוק. 23. לכן, קצת אופטימיזציה עשויים להידרש כדי להשיג תוצאות משביעות רצון עם תוספים שונים בינוני.

אחד המאפיינים הבולטים ביותר של החיים על פני כדור הארץ הוא שלה חוסן נפשי גדול ומגוון. מטרה מרכזית של הביולוגיה המולקולרית היא להבין את ההיגיון שבו תאים להשתמש גנים, חלבונים כדי להגדיל את הצמיחה ואת כושר תחת מגוון רחב של תנאים סביבתיים. כדי להשיג מטרה זו, מדענים להיות מסוגל להתבונן בביטחון כמה תאים בודדים לגדול, לחלק ולבטא את הגנים שלהם תחת מערכת נתונה של תנאים, וציין כיצד התאים מגיבים לשינויים הבאים בסביבתם. עם זאת, מסורתיים שיטות אנליטיות במיקרוביולוגיה יש מגבלות טכניות המשפיעות על סוגי שאלות שיכול הליות ממוען. לדוגמה, בצובר מבוססת תרבות הניתוחים היה שימושי מאוד במשך השנים, אך הם מציעים רק הנתונים ברמת האוכלוסייה מטשטשים את משמעות וריאציות לתא או ההתנהגויות של אוכלוסיות משנה קטנים יותר של תאים במכלל האוכלוסייה. תא בודד ניתוחים של חיידקים החיים מבוסס על מיקרוסקופ אור לחשוף התנהגות תא בודד אבל גם מוגבלים מבחינה טכנית. חיידקים הם בדרך כלל ותשמרו על רפידות agarose שמכיל מדיום הגידול, אבל התא גדילה וחלוקה קהל התצוגה מיקרוסקופיים, מכלה את החומרים המזינים זמין לאחר כמה מחזורים תא, משמעותית להגביל את התצפית זמן1, 2. יתר על כן, דלדול המקומי של חומרים מזינים, הצטברות בו-זמני של תוצרי לוואי מטבוליים עקב צמיחת תאים משתנים ללא הרף הסביבה הצמיחה המקומית תא בדרכים שקשה למדוד או לנבא. שינויים סביבתיים כאלה באמצעות רפידות agarose להוות אתגר ללימודים של מצב יציב התנהגויות או הסלולר התגובות שינויים ספציפיים צמיחה תנאי3.
טכנולוגיית Microfluidic, שבו מדיום נוזלי מוזרם באופן רציף באמצעות התקנים microfabricated, מציעה פתרון מגבלות הניסוי הקלאסי. מכשיר microfluidic יכול לשמור תאים בודדים במצב מתאים לחיות תאים במיקרוסקופ בזמן הזרימה של מדיום הגידול באופן קבוע מספק תאים עם חומרים מזינים טריים, ייעלם תוצרי לוואי מטבוליים ותאים עודף, ובכך יוצר גידול מאוד אחידה סביבה. בתנאים צמיחה מתמדת, התנהגויות התא יכול להיות שנצפו במנותק מן ההשפעה של גורמים סביבתיים, המתיר נוף ללא הפרעה של ההיגיון הפנימי של תאים. זרימת נוזל מונע מההתקן microfluidic הופך צפוף עם תאים, התבוננות שושלות תא בודד עבור עשרות או מאות דורות הופך להיות אפשרי4,5. בזמנים כאלה התבוננות ארוכה היתר זיהוי התנהגויות אחרת לגילוי תאים לטווח ארוך או נדירים. לבסוף, ההרכב של המדיום זה הזורם דרך המכשיר יכול להשתנות בכל וויל, ומאפשר תאים שחלים באיזו תחילתה של הלחץ או מבוא או הסרה של תרכובת מסוימת.
מיקרופלואידיקה נהנתה כבר מספר יישומים חשובים. למשל, זה נעשה שימוש ברקמות, איברים או התקנים הגוף-על-שבב, שבה מספר סוגי תאים אנושיים הם תרבותי משותף כדי לדמות של ויוו תנאי6; לצורך המחקר של נמטודות בתנועת סביבות microstructured7; לבדוק אינטראקציות בין biofilms חיידקי (למשל, 8); כדי להפוך את עטיפת מניפולציה של כרכים קטנים של תאים או כימיקלים (למשל, 9). Microfluidic התקנים הפכו יותר ויותר פופולרי גם בתחום מיקרוביולוגיה (עבור ביקורות מצוינות, ראה 10 ו -11), במיוחד כמו הפיזי שלהם, תכונות הזרימה גם בהתאמה לנישות מיקרוביאלית טבעית12. למשל, מיקרופלואידיקה לאחרונה ננקטה על ידי מיקרוביולוגים למטרות כאלה כמו דיוק מדידה תא גדילה וחלוקה13,14,15, ניתוח תנועה הפתוגן16, ניטור quorum חישה17 ו מעברים פיזיולוגיים18, וספירת החלבונים19, בין דוגמאות רבות אחרות. השיטה המוצגת כאן היא תוכננה במיוחד עבור הניתוח של שושלות תא החיידק בודד יותר מאשר שילובים של זנים או מינים. המכשיר microfluidic המודגמות כאן מנצל וריאציה אחת של "אמא המכונה" עיצוב4, שבו תאים גדלים קובץ יחיד בתוך תעלה microfluidic עם קצה אחד סגור, קצה פתוח אחד; צמיחת תאים וחלוקה דוחף תאים רומא יוצא את הקצה הפתוח לתוך זרימת נוזלים. הבדיקות שלנו בדרך כלל מתמקדים רק התא "אמא" מוגבל בקצה הסגור של התעלה. אנו רואים בשיטה זו כמו קידום מעל הקודם אור מבוסס מיקרוסקופיה תא בודד בשיטות אנליטיות, כגון תא הנייח על רפידות agarose. בעוד B. subtilis משמש כמודל כאן, השיטה ישימה גם למינים אחרים חיידקי (Escherichia coli הוא מודל נפוץ נוסף; מינים מסוימים עם תאים שונים הגדלים או מורפולוגיות עשויים לדרוש הזיוף של מכשירים חדשים עם ממדים שונים). השימוש של כתבים פלורסנט כדי לסמן את התאים וכדי להמחיש שינויים בביטוי הגנים מחייב שימוש המינים גנטית צייתן; עם זאת, ניתוח של צמיחת תאים, מורפולוגיה אפשריים גם ללא סמנים פלורסנט.
בפרוטוקול הנוכחי אינו כולל התהליך של בדיית המאסטר סיליקון באמצעות פוטוליתוגרפיה, אשר כבר מתואר בהרחבה במקום אחר5; ניתן בקלות מיקור חוץ של מתקני מיקרו-מלאכותית גם מאסטרים. היא כוללת המכייר של מכשיר PDMS מהמאסטר סיליקון מוקשח; מליטה להתקן חתיכת זכוכית מכסה; הרכבת microfluidic כניסת ואינסטלציה outlet, קמצוץ כולל שסתומים להתיר מיתוג בינונית; passivating המכשיר, הכנת תאים חיידקיים, טעינת המכשיר עם תאים חיידקיים; חיבור הצנרת להתקן, equilibrating התאים; טעינת המכשיר על גבי מיקרוסקופ פלורסצנטיות עבור הדמיה. כי ייבוא תמונות שונות רבות ועיבוד תוכנה ניתן להשתמש בכלים כדי להמחיש ולנתח נתונים שונים של עניין4,5, תמונות לדוגמה מוצגים, אך שיטות לכידת התמונה לא נכללות פרוטוקול זה.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>(240)4019862</td><td>This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio</td></tr><tr><td>0.75-mm biopsy punch</td><td>World Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 mm No. 1.5 cover glass</td><td>VWR</td><td>48393 172</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Etch PE-50</td><td>Plasma Etch Inc.</td><td>PE-50</td><td>Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment</td></tr><tr><td>Tygon flexible tubing ID 0.02&quot;, OD 0.06&quot;</td><td>Saint-Gobain PPL Corp.</td><td>AAD04103</td><td>For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles</td></tr><tr><td>Silicone Tubing, 0.04&quot; ID, 0.085&quot; OD</td><td>HelixMark Standard Silicone Tubing</td><td>60-795-05</td><td>For pinch valves and Y-junction connection</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td>Used as passivation agent</td></tr><tr><td>ART Gel Pipet Tips (P200)</td><td>Molecular BioProducts</td><td>2155</td><td>For loading the device with medium and cells</td></tr><tr><td>Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-&amp;mu;m Supor membrane</td><td>Pall Life Sciences</td><td>4560</td><td>For filtering cultures before device loading</td></tr><tr><td>21-ga blunt needles, 1&quot;</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A681</td><td></td></tr><tr><td>Y connector with 200-series barbs, 1/16&quot; ID tubing, polypropylene</td><td>Nordson Medical</td><td>Y210-6005</td><td>The company is AKA Value Plastics</td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E inverted microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td>This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E.</td></tr><tr><td>LB Lennox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 18</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Bacillus subtilis&lt;/em&gt; strain NCIB3610</td><td>Bacillus Genetic Stock Center</td><td>3A1</td><td>wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol</td></tr><tr><td>Gravity convection oven</td><td>VWR</td><td>414005-106</td><td>for curing PDMS and baking assembled devices</td></tr><tr><td>Scotch-Weld Epoxy Kit</td><td>3M</td><td>2216 B/A</td><td>may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate</td></tr><tr><td>Scotch Magic tape, 3/4&quot; width</td><td>3M</td><td></td><td>to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted &quot;office tape&quot; or &quot;adhesive tape&quot; in protocol)</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td>listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do</td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td>To clean cover glass</td></tr><tr><td>Syring pump, 6 channel</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>NE-1600</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>a brand of dust-free wipes</td></tr></tbody></table>

single-cell microfluidic analysis of bacillus subtilis

Microfluidic טכנולוגיה מתגבר על רבים מן המגבלות לשיטות אנליטיות מסורתי במיקרוביולוגיה. שלא כמו שיטות בצובר-תרבות, הוא מציע רזולוציית תא בודד והתבוננות ארוכה פעמים המתפרסות על-פני מאות דורות; בניגוד agarose המבוסס על דירת מיקרוסקופ, יש תנאי הגידול אחיד זה יכול להיות נשלט בחוזקה. כי זרימה רצופה של מדיום הגידול מבודד התאים במכשיר microfluidic של וריאציות לא צפוי בסביבה כימית מקומיות הנגרמת על ידי צמיחת תאים, חילוף החומרים, אותנטי שינויים בביטוי הגנים צמיחת תאים בתגובה גירויים מסוימים יכול להיות שנצפו בביטחון רב יותר. Bacillus subtilis משמש כאן כמו זן חיידקי דגם להפגין מכונה"אמא"-הקלד שיטה לניתוח הסלולר. אנו מראים כיצד לבנות לשרברב מכשיר microfluidic, לטעון אותו עם תאים, ליזום הדמיה מיקרוסקופיים ואני לחשוף תאים לגירוי על ידי מיתוג של מדיום הגידול אחד למשנהו. כתבת תגובה ללחץ משמש כדוגמה כדי לחשוף את סוג הנתונים שניתן להשיג על ידי שיטה זו. בקצרה גם נדון בהמשך יישומים של שיטה זו עבור סוגים אחרים של ניסויים, כגון ניתוח במחקרים על הנבגה חיידקי.

תא הראשונית מוצלחת טעינה, כפי מוערך על ידי מיקרוסקופ ניגודיות שלב לפני שתצרף את הצנרת microfluidic למכשיר, ייחשב כבעל כל או כמעט כל ערוצי הצד microfluidic המכיל תאים חיידקיים, אחד או יותר ( איור 3 א). טעינה אופטימלית יראה תאים אחדים בכל אחד מהערוצים, אך ערוצי ימלא בכל זאת עם תאים עקב צמיחת תאים במהלך תקופת equilibration (איור 3B). הסמטאות המסכן טעינה, שבו יחסית מעטים (< 50%) לצד ערוצי נטענים עם תאים, עשוי לשמש, אך הצפיפות הנתונים וכתוצאה מכך יהיו נמוכים עקב שושלות תאים פחות להיות עם תמונה-לכל תפקיד ההדמיה.
פעם אחת המכשיר בתחילה נטען, זה הוא equilibrated על ידי הצמדת הצנרת microfluidic זורם בינוני דרך המכשיר בספיקה גבוהה יחסית של µL 35/min. הצעד equilibration מגישה להסיר בועות אוויר ותאים עודף בערוץ האכלה מהמכשיר, לעודד את התאים ערוצי הצד להתחיל לגדול. התאים יוסרו מן המכשיר על זרימה בינונית לעתים קרובות ניתן לראות בעין בלתי מזוינת כלהקה בהיר עוברים דרך הצנרת שקע לכיוון פח אשפה; תנועת להקות משמש חיווי חזותי הנוזלים הזורמים בדרך כלל דרך הצנרת ואת ההתקן. בדיקה מיקרוסקופית של המכשיר equilibrated לחשוף כמה תאים כלוא בתוך קובץ יחיד ברוב הערוצים צד (איור 3B, 0 דקות).
ברגע מכשיר equilibrated מושם על המיקרוסקופ תחת זרימה ב- 1.5 µL/דקה ב 37 מעלות צלזיוס, התאים יחדש צמיחה אקספוננציאלית-פאזי אחיד וקבוע במשך כ 2 h (איור 3B). הגידול האקספוננציאלי קבוע צריך להיות ישירות אומתו לאחר ניתוח תמונות המראה של מישור הזמן הדור של התאים. בשלב זה, התאים הם מוכנים פלורסצנטיות ו/או brightfield הדמיה כרצונכם. מכשיר נטען בהצלחה ו equilibrated יכולים בדרך כלל בצורה אמינה לדימות לתקופה של פחות 24 שעות (איור 4A, ג). היכרות עם מתג בינונית (איור 4A–C) מרחיבה את מגוון ניסויים יכול להתבצע אך גם מגדיל את התדירות של אירועים קטסטרופליים מוות של תאים (איור 4D), ככל הנראה דרך המבוא של אוויר בועות זה לא נמחקו בהצלחה של הצנרת. עוד אירוע שעלולות לגרום מוות תאי קטסטרופלי הוא אשכולות של תאים ממוקם על הים עשוי להיות רופף, עוברים דרך תעלת הזנה, כפי שמוצג באיור 4D. אנחנו לא כיום מבינים למה זה גורם מוות תאי קטסטרופלי במכשיר, אנחנו עדיין לא תכנן שיטה כדי למנוע התרחשות אירועים כאלה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56901/56901fig1.jpg"> איור 1: סכימטי של המכשיר microfluidic. מכשיר סכמטית מוצג כ לשנות את קנה המידה. מציין האלף-ביתי נקראת יחד עם אזורי כניסת ולשקע זה מנוקבים כדי לחבר את המחטים הסתיימה בלאנט. בדרך כלל, מחצית הערוצים בדוגמת משמשות (מוצללים אפור). בתעלות תא הם שכיוונו כלפי מציין. קובץ ה-CAD הנלוות (ראה 1 קובץ משלים) מציג כל התכונות על המכשיר. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56901/56901fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56901/56901fig2.jpg"> איור 2: Microfluidic התקן פסיבציה תא הטעינה, equilibration. (א) A התקן מאוחד לאחר פסיבציה המכילות BSA בינונית. טיפים ג'ל העמסה נשמרים את החורים לשקע כדי לנטר את המעבר של בינוני ותאים דרך המכשיר. אלך להביא את האלונקה בינוני מוצגת בחלק הדק של העצות העמסה ג'ל (חץ). (B) המכשיר לאחר ההעמסה בתא. התאים גלויים כשכבה לבנה שקופה טיפים העמסה ג'ל (חץ). (ג) הג'ל-טעינת טיפים יוסרו לפני צנטריפוגה במתאם צנטריפוגה מפוברק-מותאם אישית. הקלטת רפואי (כחול) מושם על החלקים אלומיניום לרכך את המכשיר. (ד) בעקבות צנטריפוגה ואימות של העמסה, המכשיר הוא מודבק על הוסף שלב מיקרוסקופ, המצורפת כניסת ולשקע הפינים. בתמונה המוצגת, מיתוג בינוני התאפשר על ידי צביטה שסתומים ומחברים Y-שמסודרים ב מכשירים זני תיבה עצה micropipette. (E) הצג סכימתי של התקן שהורכב כולו, ממשאבות מזרק לגורם פסולת. לאורך צינור עודפים נוסע פסולת חבית קטנה. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56901/56901fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56901/56901fig3.jpg"> איור 3: תא וטעינה של הצמיחה את ההתקן microfluidic. (א) משמאל micrographs צודק, שלב-ניגודיות של התקן המכיל בינוני בלבד לפני טעינת תא באותו התקן לאחר תאים נוספו ויה pipetting, אבל לפני צנטריפוגה, באותו ההתקן לאחר טעינה צנטריפוגלי. (B) כמובן זמן של הסתגלות תא וצמיחה במכשיר (LB, 37 ° C, זרימה µL 1.5/min). בתחילת שנת הסתגלות, התאים נייחים-שלב הם וקצר יחסית. התאים להסתגל, לחזור צמיחה אקספוננציאלית-פאזי (60-120 דקות), הם מאמצים מורפולוגיה ארוך ורחב. לאחר 120 דקות, כל התאים במכשיר הם חידוש צמיחה אקספוננציאלית-פאזי אחיד, ההתקן אינו מוכן עבור הדמיה. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56901/56901fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56901/56901fig4.jpg"> איור 4: התא צמיחה בינוני מחליף את ההתקן microfluidic. Kymographs (א) מציג 550 מינימום של צמיחה לפני, 1,000 דקות של צמיחה לאחר מתג בינונית (קו מקווקו אפור) לתוך 2% אתנול כמו יותר מלחיץ. תמונות נלכדו במרווחים של 10 דקות. הפאנל העליון מציג כתב תעתיק mNeonGreen (ערוץ ירוק) של גן מפגינות. החלונית התחתונה מציגה כתב קונסטיטוטיביות mNeptune (ערוץ אדום) המשמשת במקרה זה עבור פילוח תא אוטומטית. צילום מקרוב (B) הצג את חלקיו של kymographs בתיבת מקווקו פאנל A, מציג תשובה ארעית בערוץ ירוק שלאחר הבורר בינוני. שימו לב כי הצמיחה ממשיכה באמצעות הבורר, למרות נוכחותם של האתנול גורם התאים נעשים קצרים יותר ולגדול בקצב מעט איטי יותר. סרגל זמן מוצג על ידי הקו האופקי, מרחק מוצג על ידי הסרגל האנכי. (ג) דוגמה עקבות של קרינה פלואורסצנטית שנותחה נתונים של שושלת תא בודד מן הניסוי המוצג בחלונית א קווים מקווקווים אנכי מצביעים על המתג בינוני לתוך 2% אתנול כמו יותר מלחיץ. (ד) דוגמה מתג בינוני שנכשלו. כשאחוז התאים המדיום השני, התאים הערוצים הם lysed. הבורר מלווה מספר גדול של תאים שחולפים בתעלה הראשית, גורם אות ניאון בהיר (תמונה מחדש שקנה המידה שלה השתנה המתאים לאזור סחף מוצג רק שמעליו). לאחר הבורר, אין תאים נוספים שנצפו, למרות שאריות תאים במעומעם פלורסנט נשאר הערוצים. סרגל זמן מוצג על ידי הקו האופקי, מרחק מוצג על ידי הסרגל האנכי. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56901/56901fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis at JoVE.com

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

ניתוח Microfluidic תא בודד של Bacillus subtilis

אנו מציגים שיטה לניתוח microfluidic של שושלות בודדים תא החיידק Bacillus subtilis כדוגמא. השיטה מתגבר על החסרונות של שיטות אנליטיות מסורתי במיקרוביולוגיה בכך שהוא מאפשר התבוננות של מאות דורות תא תחת תנאי הגידול בחוזקה לשליטה ואחידה.

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

single-cell-microfluidic-analysis-of-bacillus-subtilis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

11.9K Views.  Oklahoma State University. אנו מציגים שיטה לניתוח microfluidic של שושלות בודדים תא החיידק Bacillus subtilis כדוגמא. השיטה מתגבר על החסרונות של שיטות אנליטיות מסורתי במיקרוביולוגיה בכך שהוא מאפשר התבוננות של מאות דורות תא תחת תנאי הגידול בחוזקה לשליטה ואחידה.

Video: Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

תא הדמיה חיה של Bacillus subtilis ו Streptococcus pneumoniae באמצעות מיקרוסקופית אוטומטי זמן לשגות

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Immunology and Infection

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Bioengineering

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

שבב microfluidic לניתוח הכימי תכליתי של תאים בודדים

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as hydrodynamics, ecology and environmental engineering. Modeling bacterial transport in porous environments at different spatial scales is critical to better predict the consequences of bacterial transport, yet current models often fail to up-scale from laboratory to field conditions. Here, we introduce experimental tools to study bacterial transport in porous media at two spatial scales. The aim of these tools is to obtain macroscopic observables (such as breakthrough curves or deposition profiles) of bacteria injected into transparent porous matrices. At the small scale (10-1000 &#181;m), microfluidic devices are combined with optical video-microscopy and image processing to obtain breakthrough curves and, at the same time, to track individual bacterial cells at the pore scale. At larger scale, flow cytometry is combined with a self-made robotic dispenser to obtain breakthrough curves. We illustrate the utility of these tools to better understand how bacteria are transported in complex porous media such as the hyporheic zone of streams. As these tools provide simultaneous measurements across scales, they pave the way for mechanism-based models, critically important for upscaling. Application of these tools may not only contribute to the development of novel bioremediation applications but also shed new light on the ecological strategies of microorganisms colonizing porous substrates.

Breakthrough curves (BTCs) are efficient tools to study the transport of bacteria in porous media. Here we introduce tools based on fluidic devices in combination with microscopy and flow cytometric counting to obtain BTCs.

שילוב התקנים נוזליים עם מיקרוסקופיה וציתום זרימה לחקר תחבורה מיקרוביאלית במדיה נקבובית על פני קשקשים מרחביים

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...

Environment

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

מכשיר microfluidic לכימות Chemotaxis חיידקים Gradients ריכוז אורווה

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

מתודולוגיות לימוד<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilms כמודל לאפיון מולקולה קטנה Biofilm מעכבי

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing need for the development of methodologies that improve the detection of antigens immobilized on the surface of spores together with their quantification. Flow cytometry-based analyses have been previously proposed as fast, reliable, and specific approaches for detecting labeled cells of B. subtilis. Herein, we propose the use of flow cytometry to evaluate the display efficiency of a fluorescent antibody (FA) on the surface of the spore and quantify the number of spores using counting beads. 
For this, we used ethidium bromide as a DNA marker and an allophycocyanin (APC)-labeled antibody, which was coupled to the spores, as a surface marker. The quantification of spores was performed using counting beads since this technique demonstrates high accuracy in the detection of cells. The labeled spores were analyzed using a flow cytometer, which confirmed the coupling. As a result, it was demonstrated that DNA labeling improved the accuracy of quantification by flow cytometry, for the detection of germinated spores. It was observed that ethidium bromide was not able to label dormant spores; however, this technique provides a more precise determination of the number of spores with fluorescent protein coupled to their surface, thus helping in the development of studies that focus on the use of spores as a biotechnological platform in different applications.

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

This protocol focuses on the use of flow cytometry and counting beads to quantify bacterial spores labeled with ethidium bromide. The method is also efficient for analyzing the covalent coupling of proteins on the surface of intact spores.

שיפור של Bacillus subtilis ספירת נבגים וניתוח תוויות בציטומטריית זרימה

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing ...

Biochemistry

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

פלטפורמת Microfluidic על קוליים בתפוקה של רצף הגנום בתא יחיד

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

שימוש Coculture לזהות אינטראקציות interspecies המתווכת כימית

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...