我々 は腫瘍グループ AAML1531 子どもと看護師の保健研究患者サンプルの形で彼らの貢献のために参加者に感謝します。この仕事、国立衛生研究所 (UM1 CA186107、RO1 CA49449 RO1 CA149445)、子供の発見研究所のワシントン大学とセントルイス子供病院 (MC-II-2015-461) とイーライ セス ・ マシューズ白血病財団によって資金を供給されました。

<ol>
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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+ultra-rare+pre-leukemic+clones+via+targeted+error-corrected+sequencing.">Quantifying ultra-rare pre-leukemic clones via targeted error-corrected sequencing.</a> Leukemia. 29 (7), 1608-1611 (2015).</li><li>Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+harbouring+AML-associated+mutations+is+ubiquitous+in+healthy+adults.">Clonal hematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults.</a> NatureCommunications. 7, 12484 (2016).</li><li>Patel, J. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+profiling+of+immune+repertoires+for+minor+lymphocyte+counts+using+unique+molecular+identifiers.">Quantitative profiling of immune repertoires for minor lymphocyte counts using unique molecular identifiers.</a> The Journal of Immunology. 194 (12), 6155-6163 (2015).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

ここでは、さまざまな病気で低 VAFs と突然変異を研究する簡単に実装することができますシーケンスのエラー修正プロトコルのスイートを紹介します。最も重要な彼らは raw 読み取りのエラー訂正を有効にすると各分子シーケンスの前に行政の混入であります。ここで説明する方法は、市販遺伝子パネルおよび自己設計されていた遺伝子特定 oligos の両方にカスタマイズされた行政を組み込む研究者を許可します。
NGS の標準プロトコル シーケンス エラー率 2% 以下エンと遺伝子変異の検出を排除する、これは稀な変形の検出は重要な研究の NGS のアプリケーションを制限します。標準の NGS 誤り率を回避、ECS これら生の変異体の高感度検出できます。例えば、これらの突然変異は最初 (したがって、低エン) 起こるとき病原性の変異の検出は病気14,15の早期介入を通知することが不可欠。白血病研究、最小残差の検出の病 (治療後残存白血病細胞) がリスク層別化を通知し、バイナリ流れフローサイトメトリー評価できない方法で治療の選択肢が通知される可能性があります。さらに、ECS は循環腫瘍核酸を検出し、プライマリの特性は、特定の突然変異のバリアントの負担と同様に有無を評価することによって固形腫瘍患者における転移能を評価する適切です腫瘍16。
表 1に示されているように、バリアントを呼び出す位置固有のエラーの二項分布に基づくモデルを使用しての力はエラー モデルの構築に使用されるシーケンスの深さと同様に、シーケンスされたライブラリの数に大きく依存します。エラー モデルのロバスト性のサンプルと詳細シーケンス数の増加とともに増加します。各サンプルのエラー プロファイルを構築するサンプルあたり 3000 x のエラー修正リード カバレッジの平均で少なくとも 10 シーケンスされたサンプルを使用することをお勧めします。位置特定方法と同じです、MAGERI がすべての六つの異なる置換タイプの集計エラー率を使用しての代わり (A > C/T > G、A > G/T > C、A > T/T >、C > A/G > T、C > G > C、C > T/G > A)13, 我々 はすべての位置で独立して各置換モデルします。例えば、C のエラー発生率 > 所定ゲノムの位置に T は別の位置から異なる。我々 のアプローチも考慮シーケンス バッチ効果シーケンス実行の 1 つにみられる塩基置換率は別の実行から異なる場合があります。したがって異なるシーケンスの実行からのサンプルはモデルの構築にプールされる場合は特にすべての置換型のそれぞれの位置をモデル化することが重要です。
ECS 実験を設計するときの重要な考慮事項は、所望の検出のしきい値です。NGS 研究の美しさは遺伝子/ターゲットの興味、(配列の深さによって決定)、検出しきい値および照会個体数の面で、簡単に縮小できます。たとえば、研究者が 0.0001 の検出閾値を持つ 2 つの産物のまれな突然変異を見つけるに興味があるなら、MiSeq V2 化学まで 1500 万読み取りを出力を使用して実行、単一シーケンスで最大限に 75 検体をプールできる (2 amplicons * 10,000分子 * 10 読み取りエラー補正 * 75 検体 = 1500 万配列読み取り)。研究者は分子シーケンスまたは検出しきい値を調整するために実行する単一シーケンスでプールされたサンプルの数に入るの数を変更できます。私たちの研究で検出しきい値を持つ 0.0001 エン (1:10, 000) の突然変異を見つけることを目指しましたイルミナ遺伝子パネルを使用します。我々 は日常的に 250 を使用して十分な分子が前述の検出閾値を達成するためにキャプチャされるように DNA の開始の ng。研究者は、DNA の低量の開始する選ぶことができます (50 ng をお勧めします) 目的の検出限界がある場合 > 0.001 エン。
行政は、i5 のインデックスに追加されます、シーケンス設定はそれに応じて改正されるあります。たとえば、16 の N 行政を使いました、シーケンス設定された 2 x 144 対最後の読み取り、インデックス 1 の 8 サイクル、インデックス 2 の通常 8 サイクルではなくインデックス 2 の 16 のサイクル。インデックス 2 サイクルの増加は、読み取りに割り当てられた合計回数の減少によって補償されています。研究者は 12 n Umi10,17を使用することを選ぶ、設定はインデックス 2 の 12 のサイクルを変更する必要があります。
この海ベースのシーケンスのメソッドは、シーケンス エラーの修正に最適です。すべて増幅方式のための問題である PCR 表示をあつかう上で最適ではないままです。ポスト シーケンスと ddPCR を使用してポスト バイオインフォマティクス検証のラウンドを行い、我々 はほとんど PCR 表示による任意の偽陽性を検出します。それにもかかわらず、研究者が低増幅エラー高忠実度ポリメラーゼを用いた実験を行うことをお勧めします。

我々 として年齢、変異原性物質と細胞分裂結果、ゲノム、これで身体異常の蓄積で中確率のエラーへの暴露の基となる悪性転化の根本的な病因神経疾患、小児障害と正常な老化1,2。病気運転可能性と体細胞突然変異は、早期発見とリスク管理3,4、5の重要な診断と予後バイオ マーカーです。生理学的な clonogenesis が理解するために臨床通知し、意思決定、定量の正確さおよびこれらの突然変異の特性を研究する重要です。次世代シーケンス (NGS) は、異種の DNA サンプルにクローン変異の研究に現在使用されてただし、NGS は突然変異を識別する制限 > 0.02 バリアント アレル分数 (エン)-0.5-2.0 の固有の誤り率のためシーケンス プラットフォーム6,7,8%。その結果、診断と予後追跡低いエンで重要な体の亜種では得られない標準 NGS。
近年、様々 なメソッドは、NGS8,9,10,11のエラー率を回避するために開発されています。これらのメソッドは、シーケンス処理の後のエラー訂正を可能分子タギングを利用します。各分子やゲノム断片配列ライブラリでは付くと、ランダムなユニークな分子識別子 (UMI) その分子に固有です。行政は、無作為化ヌクレオチド (8-16 N) の文字列の順列を構築されています。2 番目サンプル固有のバーコードも、ワークフロー実行同じ NGS シーケンスに複数のサンプルを多重伝送が可能に統合されます。Pcr は分子タグ ライブラリで実行され、シーケンス処理用ライブラリを送信するその後。ライブラリの準備中、エラーでがゲノム フラグメントを pcr とシーケンス8中にランダムに導入されることが期待されます。ランダムなシーケンス エラーを削除するには、生配列読み取りが UMI に従ってグループ化されます。シーケンスからの人工物は真のバリアントが忠実に増幅し、同じ海を共有すべての読み取りでシーケンスに対し導入の確率論的性質同じゲノムの位置に同じ海ですべての読み取りに存在することは行われません。成果物が削除されます bioinformatically です。ここでは、3 つのメソッドのエラー修正のシーケンス (ECS) 研究所単一のヌクレオチドの亜種 (SNVs) と小さな挿入削除 (オクターリピート) を識別するために DNA および RNA 遺伝子発現下の定量化を容易にするための最適化について述べる、NGS のエラーのしきい値。
最初の方法では、研究者によって設計された遺伝子特異的プライマーを用いた珍しい体イベントを探す方法について説明します。ライブラリの準備の前に研究者は興味のかけらをターゲットにプライマーを設計する必要があります。Web アプリ Primer3 を使いました (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)。200-250 bp の産物は、これらは、行政が組み込まれて一度ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) に最適、ペアエンド リード 150 bp ペアエンド リードでの重複を生成します。使用する最適なプライマー設計条件: 最小プライマー サイズ = 19;最適なプライマー サイズ = 25;最大プライマー サイズ = 30;最小 Tm = 64 ° C;最適な Tm = 70 ° C;最大 Tm = 74 ° C;Tm 差の最大値 = 5 ° C;GC の最小の内容 = 45;最大 GC コンテンツ = 80。返される数 = 20;最大 3' 端安定性 = 100。
方法 2 のクローン SNVs と小さなオクターリピート 0.0001 エン amplicons の数百を含む市販遺伝子パネルを使用してのようにまれにイルミナ化学と ECS DNA のプロトコルを組み合わせる手法について述べる.TruSight 骨髄性シーケンス パネル (イルミナ) を実験に使用し、小児の骨髄性疾患のための興味の遺伝子を含むように拡張されたパネルを設計しました。これらのパネルがこれらのパネルに独自のアダプターの戦略を追加しましたので、エラー訂正を促進するようなユニークな分子識別子 (Umi) を提供していません。ECS が動作するはずです同様に他のさまざまな病気と関連付けられる遺伝子の豊かに設計のパネルのいずれかで。次の DNA の隔離および組織または目的の標本から後続の定量化、それは少なくとも 500 に勧め株 DNA 試料当りの ng。我々 は日常的に 250 を使用して単一配列ライブラリを作る ng の下流をできるだけ多くユニークなゲノム フラグメントとしてキャプチャするために DNA の重複とエン計算を読み取ります。残りの 250 とオプションの複製シーケンス ライブラリを作ることができる DNA の ng。標本あたり 2 つのライブラリのレプリケートを常に確認、真陽性として両方の複製で独立して検出されたイベントのみを考えます。4,13を呼び出すバリエーションの精度を高めるためのゲノム位置特異的二項エラー モデルを実施します。
最後に、ECS を市販の QIAseq ターゲット RNA パネル (Qiagen) を使用して転写定量化のための RNA シーケンスに結合手法について述べる。重複除外に必要な行政とエラー訂正は、キットに盛り込まれているし、研究者は、ライブラリの製造元の推奨事項に従います。Bioinformatically、研究者は、ECS-DNA のプロトコル セクションで詳細に説明するために概説パイプラインを従うことができます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Q5 High Fidelity Hot Start Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truseq Custom Amplicon Index Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-130-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMI i5 adapter sequences</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7442S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II Ligation Module</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7595S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Digital PCR System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Genomics</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent Genomics</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSight Myeloid Sequencing Panel</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-130-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie 2</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Customized QIAseq Targeted RNA Panel</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Plus Mini Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rare event detection using error-corrected dna and rna sequencing

従来の次世代シーケンシング技術 (NGS) は、10 年以上の巨大なゲノム解析を許可しています。具体的には、NGS は悪性腫瘍にクローン変異のスペクトルを分析するために使用されています。従来サンガー、NGS 闘争その高い誤り率 ~0.5–2.0% によるまれなクローンと subclonal 突然変異を識別するよりもはるかに効率的です。したがってがある突然変異の検出限界を持つ標準的な NGS > 0.02 バリアント アレル分数 (エン)。患者のまれな突然変異の臨床的意義、知られている病気は、明白でなく残ることがなく白血病の治療を受けた患者が大幅に向上成果残存病変が < フローサイトメトリーによる 0.0001。NGS のこの artefactual 背景を軽減するために多くの方法が開発されています。ここでエラー修正 DNA および RNA シーケンス (ECS)、エラー訂正のため 16 bp ランダム インデックスと多重化のための 8 bp 患者固有のインデックスの個々 の分子のタグ付けを含むため手法について述べる。本手法は検出し、バリアント アレル分数 (VAFs) 2 桁の NGS の検出限界よりも低く、0.0001 エンのようにまれにクローン変異を追跡できます。

Targeted Error-Corrected は、DNA の配列に突然変異患者商業の genomic DNA の DNA を希釈原理検証実験の証拠を行った。患者は、GATA1 突然変異 (chrX:48650264、C > G) 0.19 の元エンと。図 1に ECS が単一のヌクレオチドのバリアントのため 1: 10,000 レベルを定量的であることを示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig1.jpg"> 図 1: GATA1 SNV が ECS が 1: 10,000 レベルを定量的であることを示す希釈系列。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57509/57509fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
また、ECS DNA は確実に高齢健常者4成人急性骨髄性白血病 (AML) における反復的遺伝子のまれなクローン変異を検出.バンク約離れて 〜 10 年ナースの健康における 20 健常者からバフィー コートのサンプルを入手しました。我々 はこれらのサンプルに ECS DNA パネル プロトコルを適用されます。この実験は、我々 イルミナ TruSight 骨髄性シーケンス パネル 568 amplicons (詳細 https://www.illumina.com/products/by-type/clinical-research-products/trusight-myeloid.html の遺伝子リスト) で構成される適応し、シーケンス20 人から 80 ライブラリ (異なる時点での 2 コレクションは、時間ごとに個別あたり 2 複製ポイント) 4770 万ペアエンド読み取りの平均と 340 万エラー修正の平均を生成するイルミナ NextSeq プラットフォームを使用してライブラリ4ごとコンセンサス配列。ライブラリあたり平均ヌクレオチド報道約 6,000 (3.4 百万 568 で割った値) x だった。各サンプルでは、同じサンプルからはシーケンスのライブラリを使用して位置固有のエラー プロファイルを構築しました。我々 は、少なくとも 1 つのコレクションの時間ポイントの両方のレプリケートに存在していた 109 のクローン体細胞の突然変異を見つけた。これらの突然変異があるエン 0.0003-0.1451 に至る。既知の宇宙の表現と 21 の突然変異を選択し、ddPCR を使用して 1 つまたは 2 つのコレクションの時間ポイントのすべての 21 の変異を検証 (n = 34、図 2、若いら20164から適応)。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig2.jpg"> 図 2: ECS によって識別される突然変異が高い一致 VAFs と ddPCR を介して確認した。(n = 34、若いら20164から変更)。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57509/57509fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
(QIAseq 人間癌トランスクリプトーム パネルから適応)、種々 の癌と関連付けられる知られていた 416 の遺伝子で構成される QIAseq 化学を用いた遺伝子パネルをカスタマイズしました ECS RNA のプロトコルを使用して表現のエラー訂正レベルに関してある特定の遺伝子 (遺伝子リスト補足資料1) の最も一般に表されたエクソンを増幅します。我々 はライブラリあたり 830 万読み取りの平均を与えたペアエンド形式でイルミナ MiSeq プラットフォームを使用してライブラリを塩基配列し、41 万 7000 エラー修正コンセンサス シーケンスの平均値を取り込むことができた。低豊富な転写産物の発現レベルを示した (< 1,000 トラン スクリプト数 50 ng のトータル RNA の) 複製間再現性の高い、(データ ポイント n = 300、図 3)。DdPCR (表現の度合いの六つの選択した遺伝子) を使用した検証は、遺伝子の発現レベルが正しく正規化を必要とせず ECS プロトコルによって捕獲されていたことを示した。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig3.jpg"> 図 3: 同じサンプルの複製の間 ECS RNA によって上部には、トラン スクリプトの相関をカウント (n = 300).下、ECS で識別されるカウントは ddPCR によって立証されたトラン スクリプト (n = 6)。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57509/57509fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

次世代シーケンス (NGS)、プラットフォーム (~0.5–2.0%) の高い誤り率によって制限されるゲノム解析の強力なツールです。NGS のエラーレートを未然に防ぐし、バリアント アレル分 0.0001 のようにまれに突然変異を検出するエラー修正のシーケンスの我々 の方法をについて説明します。

エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

rare-event-detection-using-error-corrected-dna-and-rna-sequencing

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

11.9K ビュー.  Washington University School of Medicine. 次世代シーケンス (NGS)、プラットフォーム (~0.5–2.0%) の高い誤り率によって制限されるゲノム解析の強力なツールです。NGS のエラーレートを未然に防ぐし、バリアント アレル分 0.0001 のようにまれに突然変異を検出するエラー修正のシーケンスの我々 の方法をについて説明します。

ビデオ: Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable development and differentiation of different tissue types. Dysregulation of this process is often the hallmark of various diseases like cancer. Here, we outline one of the recent sequencing techniques, Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq), used to quantify methylation in various normal and disease tissues for large patient cohorts. We describe a detailed protocol of this affinity enrichment approach along with a bioinformatics pipeline to achieve optimal quantification. This technique has been used to sequence hundreds of patients across various cancer types as a part of the 1,000 methylome project (Cancer Methylome System).

Here we present a protocol to investigate genome wide DNA methylation in large scale clinical patient screening studies using the Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq or MBD-seq) technology and the subsequent bioinformatics analysis pipeline.

患者の組織のためのメチル結合DNA捕捉シーケンシング

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

遺伝学

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

ビオチン化ソラレンを用いたRNA-RNA相互作用のマッピング

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR). It provides accurate, sensitive, reliable, and reproducible results. Several factors can affect the sensitivity and specificity of RT-qPCR. Residual genomic DNA (gDNA) contaminating RNA samples is one of them. In gene expression analysis, non-specific amplification due to gDNA contamination will overestimate the abundance of transcript levels and can affect the RT-qPCR results. Generally, gDNA is detected by qRT-PCR using primer pairs annealing to intergenic regions or an intron of the gene of interest. Unfortunately, intron/exon annotations are not yet known for all genes from vertebrate, bacteria, protist, fungi, plant, and invertebrate metazoan species.
Here we present a protocol for detection of gDNA contamination in RNA samples by using ribosomal DNA (rDNA)-based primers. The method is based on the unique features of rDNA: their multigene nature, highly conserved sequences, and high frequency in the genome. Also as a case study, a unique set of primers were designed based on the conserved region of ribosomal DNA (rDNA) in the Poaceae family. The universality of these primer pairs was tested by melt curve analysis and agarose gel electrophoresis. Although our method explains how rDNA-based primers can be applied for the gDNA contamination assay in the Poaceae family,&#160;it could be easily used to other prokaryote and eukaryote species

Here, we present a protocol for tracing genomic DNA (gDNA) contamination in RNA samples. The presented method utilizes primers specific for the internal transcribed spacer region (ITS) of ribosomal DNA (rDNA) genes. The method is suited for reliable and sensitive detection of DNA contamination in most eukaryotes and prokaryotes.

リボソーム DNA に基づいて RNA サンプルの DNA 汚染の評価

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics of these pathogens, in part due to a lack of well-developed genetic and genomic resources. These organisms have large, repetitive genomes, which have made genome sequencing and assembly prohibitively difficult. Here, we describe methods for the collection, extraction, purification and quality control assessment of high molecular weight genomic DNA from one powdery mildew species, Golovinomyces cichoracearum. The protocol described includes mechanical disruption of spores followed by an optimized phenol/chloroform genomic DNA extraction. A typical yield was 7 &#181;g DNA per 150 mg conidia. The genomic DNA that is isolated using this procedure is suitable for long-read sequencing (i.e., &#62; 48.5 kbp). Quality control measures to ensure the size, yield, and purity of the genomic DNA are also described in this method. Sequencing of the genomic DNA of the quality described here will allow for the assembly and comparison of multiple powdery mildew genomes, which in turn will lead to a better understanding and improved control of this agricultural pathogen.

Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.

ロングリード配列決定のためのうどんこ病から高分子量のゲノムDNAの精製

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループット シーケンス ライブラリーの構築

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of cancer development. By using non-invasive or pre-malignant lesions from patients who later develop invasive disease, gene expression analyses may help identify early molecular alterations that predispose to cancer risk. It has been well described that nucleic acids recovered from FFPE tissues have undergone severe physical damage and chemical modifications, which make their analysis difficult and generally requires adapted assays. MicroRNAs (miRNAs), however, which represent a small class of RNA molecules spanning only up to ~18&#8211;24 nucleotides, have been shown to withstand long-term storage and have been successfully analyzed in FFPE samples. Here we present a 3&#39; barcoded complementary DNA (cDNA) library preparation protocol specifically optimized for the analysis of small RNAs extracted from archived tissues, which was recently demonstrated to be robust and highly reproducible when using archived clinical specimens stored for up to 35 years. This library preparation is well adapted to the multiplex analysis of compromised/degraded material where RNA samples (up to 18) are ligated with individual 3&#39; barcoded adapters and then pooled together for subsequent enzymatic and biochemical preparations prior to analysis. All purifications are performed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), which allows size-specific selections and enrichments of barcoded small RNA species. This cDNA library preparation is well adapted to minute RNA inputs, as a pilot polymerase chain reaction (PCR) allows determination of a specific amplification cycle to produce optimal amounts of material for next-generation sequencing (NGS). This approach was optimized for the use of degraded FFPE RNA from specimens archived for up to 35 years and provides highly reproducible NGS data.

Formalin-fixed paraffin-embedded specimens represent a valuable source of molecular biomarkers of human diseases. Here we present a laboratory-based cDNA library preparation protocol, initially designed with fresh frozen RNA, and optimized for the analysis of archived microRNAs from tissues stored up to 35 years.

ホルマリン固定パラフィン包埋 RNA 試料を用いた回顧マイクロ Rna シーケンス: 相補的な DNA ライブラリの準備のプロトコル

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

ミトコンドリア DNA のメチル化の正確な検出のための方法論

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

ナノポアシーケンシングを用いた全血からの mRNA の配列決定

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human genetics research. Although a number of in silico algorithms have been developed to predict the pathogenicity of variants identified in these datasets, functional studies are critical to determining how specific genomic variants affect protein function, especially for missense variants. In the Undiagnosed Diseases Network (UDN) and other rare disease research consortia, model organisms (MO) including Drosophila, C. elegans, zebrafish, and mice are actively used to assess the function of putative human disease-causing variants. This protocol describes a method for the functional assessment of rare human variants used in the Model Organisms Screening Center Drosophila Core of the UDN. The workflow begins with gathering human and MO information from multiple public databases, using the MARRVEL web resource to assess whether the variant is likely to contribute to a patient&#39;s condition as well as design effective experiments based on available knowledge and resources. Next, genetic tools (e.g., T2A-GAL4 and UAS-human cDNA lines) are generated to assess the functions of variants of interest in Drosophila. Upon development of these reagents, two-pronged functional assays based on rescue and overexpression experiments can be performed to assess variant function. In the rescue branch, the endogenous fly genes are &#34;humanized&#34;&#160;by replacing the orthologous Drosophila gene with reference or variant human transgenes. In the overexpression branch, the reference and variant human proteins are exogenously driven in a variety of tissues. In both cases, any scorable phenotype (e.g., lethality, eye morphology, electrophysiology) can be used as a read-out, irrespective of the disease of interest. Differences observed between reference and variant alleles suggest a variant-specific effect, and thus likely pathogenicity. This protocol allows rapid, in vivo assessments of putative human disease-causing variants of genes with known and unknown functions.

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

The goal of this protocol is to outline the design and performance of in vivo experiments in Drosophila melanogaster to assess the functional consequences of rare gene variants associated with human diseases.

ショウジョウバエを用した疾患関連希少ヒト変異体の生体内機能的研究

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...