国家自然科学基金 (21675112)、北京教育委員会 (KZ201710028027) と燕若い学者プログラムの首都師範大学の科学技術計画のキー プロジェクトから財政支援に感謝しております。

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著者は競争の経済的利害関係を宣言しません。

アプタマーの顕著な利点の 1 つは抗体が生体内で免疫反応を介して生成された SELEX、体外法によって識別されます。したがって、アプタマーは抗体が生理的条件に限定しているに対し、適切に設計された実験条件下で目的のターゲット特異性と選択できます。
無料シーケンスからバインドされたシーケンスの分離を容易にするいくつかの変更された SELEX 最近報告されている、キャピラリー電気泳動30、31マイクロ流体、磁気/アクリル ビーズ/アガロース ビーズ14、 など、硝酸セルロース フィルターまたはより効率的な分離を達成するために親和性列に置き換えています。ビーズ法これらの技術の間で簡単なため小分子ターゲットのアプタマー選択のため最も広く使用されているセットアップ、簡単操作、および小分子の解析に適しています。
小さな分子のアプタマー選択の一般的に使用されるメソッドの 2 つのグループがある: ターゲット13と図書館14固定ベース メソッド。メソッドの元のグループの機能性磁気ビーズや共有結合の結合反応を介してアガロース ビーズなどの固相に小分子ターゲット固定されています。ライブラリに孵化する小分子コーティングを施したビーズを固相のターゲットに弱くバインドまたはバインドしないでくださいこれらのシーケンスは、洗濯と遠心分離または磁気分離のステップを実行することによって単に削除されます。連結シーケンスはその後溶出、PCR によって増幅されます。小分子ターゲット カップリング反応に使用できる、少なくとも 1 つの機能グループが必要です。適当な官能基を持たない、機能グループは、有機合成によって元のターゲットに組み込まれます。注意深く設計されたターゲットの合成は、複数のステップを含むことができるし、同様非常に困難があります。ターゲットの構造の変更を結合部位と、アプタマーとの親和性も強く影響します。これらの問題を避けるためにライブラリの固定ベースの方法を開発されている、ライブラリに相補的な交配磁気ビーズで DNA キャプチャ プローブしターゲットの間でバインド時にビード落ちるバインド シーケンス。メソッドのグループ、結合バッファーでターゲットを追加し、官能する必要はありません。パエスはフタル酸酸のエステル誘導体であり、典型的な PAE は、フタル酸エステルのグループと 1 つまたは 2 つのアルキル鎖 (図 1 a~ D) で構成されています。パエスは固相固定で利用できる機能グループをあります。したがって、ライブラリの固定ベースのメソッドはパエスのアプタマー選択のより魅力的に見えます。
よく管理された分散状態は、SELEX を経由してライブラリの目的の濃縮を確保するため重要です。ただし、パエスは非常に疎水性であり、分散を容易にするために複数の界面活性剤の存在下でも、数 μ M よりも高い濃度の水溶液中で容易に形成します。したがって、パエスの分散状態がコントロールするは難しい、それは個々 の PAE 分子に特異結合するアプタマーを選択することは困難でしょう。容解性の問題を解決するためにどのパエスの共有結合を介して親水性のビーズに固定化したターゲット固定方法は選ばれました。この固定化戦略を使用して、ターゲットは優性の集計ではなく、単一の分子状態でビーズ表面に存在する必要があります。
アンカー ターゲットの構造の設計もグループ固有のアプタマーの選択に失敗しないために非常に重要です。3 つの要因は、構造設計を考慮する必要があります。最初の要因は、アプタマー選択の目的です。グループ固有のアプタマーを選択する目的を考慮したアプタマー バインディングのパエスの共通のグループを公開し、アプタマーのバインディングに参加しているから残りの部品を防ぐため不可欠です。機能グループはこのように、側鎖のターミナルで導入してください。初めに、アンカー ターゲットとして DEHP ああ官能基化 (4-OH−DEHP) (図 1E) を設計し、カルボン酸磁気ビーズ16で固定.したがって、アルキル鎖マトリックスの表面に露出しています。我々 は、固体のマトリックスとしてカルボキシル磁気ビーズを選択ましょう。選択の 5 つのラウンド後明白な親和性改善みられなかったされ裸の行列に無指定の吸収は強かった。
したがって、DBP NH2はその後次の考えに基づいて設計された: (1) フタル酸のグループ、特に π-π スタックとアルキル鎖; よりも水素結合を介してアプタマーとやり取りする可能性が高く(2) NHS を介したカルボジイミド反応は軽度と -NH2は DBP; のアルキル鎖の終わりに導入された、非常に効率的な結合効率(3) 固相パーティションとして磁気ビーズで動作するように簡単ですが、ライブラリの無指定の吸着が強い。分離中にアガロース ビーズの損失は磁気ビーズよりも高いが、ライブラリの無指定の吸着ははるかに低い。したがって、DBP NH2だったエポキシ活性化アガロース ビーズに固定化した、フタル酸エステルのグループは、マトリックスの表面にさらされました。
選択バッファーの選択は重要、特に多様な容解性の小分子ターゲットです。結合バッファーは集計を回避し、全体のアプタマーの選抜とその特性のプロセス中に Pop の良好な分散状態に慎重に準備する必要があります。本研究では、DEHP が 2 つの明瞭な層を示す溶解できない界面活性剤なし標準バッファーを発見しました。レイヤーは最適化された量で複数の界面活性剤添加時に表示されなくなります。明確な解決策は、その状態を維持するために 20 ° C 以上の高温で保存する必要があります。詳細は、プロトコル手順 3.1 で提供されます。
二本鎖の PCR の製品からの単一座礁させた DNA 生成は、SELEX プロセスの 1 つの重要なステップです。いくつかの異なる方法は、文献32,33の変化によって非対称的な PCR、λ exonuclease 消化、ストレプトアビジン コーティング ビーズ、磁気分離およびサイズ分離を含む現在記載されています。尿素ポリアクリルアミドのゲル。
さまざまな方法、独自の長所と短所があります。現在、ssDNA の生成のための最も一般的に使用されるメソッドは、ストレプトアビジンをコートしたビーズと磁気分離です。この方法の顕著な利点は、その時間の節約と簡単な操作です。欠点は、他の方法と比較してコストが高いです。対照的に、GC リッチ幹-ループ構造を持つ逆プライマーを使用して、サイズ分離ベースのメソッドは、単一座礁させた DNA の収量がこれらのメソッドの32の間で最も低い最も安い方法の 1 つです。このプロトコルでは、最も安価な方法の 1 つである単一座礁させた DNA を生成する λ exonuclease 消化の使い方を説明しました。単一座礁させた DNA の収量が磁気分離とストレプトアビジン コーティング ビーズの 2 つの方法に匹敵することがわかった。さらに、exonuclease 反応が塩の高い濃度で阻害されたことがわかった。文学33で報告された PCR の製品の不完全な消化力は PCR の製品にあまりにも多くの塩存在可能性があります。さらに、λ exonuclease は非常にアクティブな安価な (図 4)。
特性とアプタマーの検証は骨の折れる、時間がかかり、アプタマー探索パイプライン33の主要なボトルネックを体現しています。ほとんどの技術はより大きいアプタマー結合パートナーに適している質量に依存するメソッド (> 10,000 amu)、低分子量のターゲットとの相互作用を測定に十分に敏感ではないが、(< 1,000 amu)15。特性評価および検証・ パエスのような疎水性分子のアプタマーはさらに困難です。貧しい水溶解性のソリューションでKdの定量を防ぐことができますまたは表面のアプタマーを固定化滴定曲線の不飽和の結果します。したがって、我々 は DBP NH2容解性の問題を避けるために親水性の磁気ビーズに固定化した高スループット シーケンスによって識別されたアプタマーのKds を決定しました。相対的な親和性と選択性他のパエスにアプタマーのいた競争の試金によって決まります、アプタマー候補あった DBP NH2限定事前どこ磁気ビーズを添付し、培養上清にリリーステスト ・ パエスまたは他の物質に干渉する可能性があります。競争の試金は、表面固定化のための機能グループがなかった・ パエスの安易な親和性の比較を提供されるために適用しました。さらに、磁気ビーズを用いた蛍光アッセイは、小さな分子アプタマー相互作用34の親和性研究に適しています。しかし、我々 は磁気ビーズは、未知の理由のため蛍光消光時々 原因と発見します。したがって、qPCR の試金は親和性測定に使用されました。
本研究で記述されている電気化学バイオ センサーの 1 つの重大な技術ヒントは電極35の表面不活性化です。DEHP の疎水性が高いためそれ特異的検出の障害につながる、金電極に吸収する強い傾向があります。ほとんどの一般的表面不活性化剤、6-メルカプト-1-ヘキサノール (MCH)36,37を使用、我々 が見つかりましたその HS-(2CH)2-[OCH2CH2 間、DEHP の無指定の吸収を防ぐために十分ではないです。]6- OCH3いた DEHP38の高感度の検出を有効にするのに十分効果的です。
この手順では、電気化学バイオ センサーで高い疎水性小分子のグループ特定 DNA アプタマーの探索と選択したアプタマーのアプリケーションを選択するためのプロトコルについて説明します。プロトコルは他の疎水性小分子の選択に役立ち、高い疎水性小分子同様のセンサーの開発に洞察力を提供します。アプタマーの選択プロセスは、ターゲット固定ベース メソッドのカテゴリに属しています。このタイプの方法の制限は、このプロトコルは、たとえばアンカー ターゲットの複雑な合成の必要性とアプタマー バインディングにおける固相の影響も存在します。このプロトコルで記述されている電気化学バイオ センサーの魅力的な利点は、そのシンプルなデザインと高感度に含まれます。主な欠点は、非常に広いダイナミック レンジのための限られた精密です。したがって、ここで説明したバイオ センサーは目標の定量的な測定ではなく、スクリーニングに適しています。

急速な経済発展に伴って、工業化と都市建設公害の加速は今までよりもより厳しいです。代表的な環境汚染物質は、重金属、毒素、抗生物質、農薬、内分泌攪乱物質、残留性有機汚染物質 (POPs) に含まれます。金属イオンおよび毒素のほか他の汚染物質が低分子化合物がかなり多くの場合は、同族の様々 な。たとえば、最も有毒なポップス、ポリ塩化ビフェニル (Pcb)、多環芳香族炭化水素 (PAHs)、ポリ臭化ビフェニル エーテル (PBDEs)、ポリ塩化ジベンゾ-p-ジオキシン (ダイオキシン類)、ポリ塩化ジベンゾ フラン (濃度)、フタル酸と酸エステル (パエス)1、2、すべて多くの同族体から成っています。小分子の検出は、アプリケーション3,4,5,6の多様性のためのクロマトグラフィー/質量分析法を用いたテクニックで主に行われています。オンサイト検出の抗体を用いた方法は最近開発された7,8,9をされています。ただし、これらのメソッドは特定の同族体に非常に特有なので、複数のテストを実行する必要があります。深刻なは新規の同族が非常に高速にその抗体を生成できないことを成長します。したがって、1 つのテストですべての同族体のレベルの合計を監視するグループ固有のバイオ センサーの開発は環境汚染状況を評価するため非常に貴重な指標を提供可能性があります。
最近、核酸アプタマーは広く様々 なイオンと蛋白質と細胞10,11 小分子化合物からのターゲットを認識の彼らの能力のための様々 なバイオセンシング プラットフォームの認識要素として適用されています。 ,12。アプタマーは、指数関数的濃縮 (SELEX)13,14によって配位子の系統進化と呼ばれる体外法によって識別されます。SELEX から始まるランダム合成一本鎖オリゴヌクレオチド ライブラリは、約 10 の14-1015シーケンスが含まれています。ランダムなライブラリのサイズは、RNA または DNA 候補構造の多様性を保証します。SELEX の典型的なプロセスは、ライブラリが高い親和性と特異性をターゲットのシーケンスで濃縮されてまで濃縮の複数のラウンドで構成されます。最終的な豊かなプールがシーケンスをサポートしと解離定数 (Kd) と妨害物質などさまざまな手法によって決定されます潜在的な選択性フィルター、アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー、表面のバインディングプラズモン共鳴 (SPR)、等。15
非常に貧しい人々 の水の溶解度と表面固定化機能群の不足、Pop のアプタマー選択は理論的に難しい。SELEX にとって重要な進歩がアプタマーの探索を高速化します。しかし、Pop のグループ固有のアプタマーの選択はまだ報告されていません。これまでのところ、特定の同族体の高度だけ基板結合 DNA アプタマーの探索は、識別された16をされています。パエスはポリ塩化ビニール材料、硬質プラスチックから、弾塑性解析、可塑剤として作用するポリ塩化ビニルを変更することで主に使用されます。いくつかのパエス内分泌かく乱物質として識別されている、深刻な損傷を引き起こすことができる肝臓と腎臓機能、男性の精子の運動性の軽減、精子形態の異常および精巣癌17があります。化合物 - もグループ固有 PAE バインディング アプタマーが報告されています。
この作業の目的は、ポップスの代表的なグループ ・ パエスといった高疎水性の小さな分子に DNA アプタマーの探索グループ特定を選択するための代表的なプロトコルを提供するためにです。また環境汚染検出のため選択したアプタマーのアプリケーションを示します。このプロトコルは、他の疎水性小分子のアプタマー探索の指導と洞察力を提供します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>UV-2550</td>
			<td>Shimadzu,Japan</td>
			<td></td>
			<td>protocol, section 3.8.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>section 3.5.1.2 and 3.5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>section 5.3.6 and 6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VMP3 multichannel potentiostat</td>
			<td>Bio-Logic Science, Claix, France</td>
			<td></td>
			<td>section 7.4,7.8 and 7.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy-activated Sepharose 6B</td>
			<td>GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)</td>
			<td>10220020</td>
			<td>argarose beads, section 2.3 and 3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beads</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>420420</td>
			<td>magnetic beads,section 5.2. and 5.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premix Taq Hot Start Version</td>
			<td>Takara,Dalian,China</td>
			<td>R028A</td>
			<td>polymerase, section 3.5.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PARAFILM Sealing Membrane</td>
			<td>Bemis, USA</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>section 3.6.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda Exonuclease</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>EN0561</td>
			<td>section3.7.1.2.The 10 &#215; reaction buffer is provided along with &#955; exonuclease by the provider.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dr. GenTLE 
			Precipitation Carrier</td>
			<td>Takara,Dalian,China</td>
			<td>9094</td>
			<td>section 3.6.2 and 3.8.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai)</td>
			<td>B511135</td>
			<td>section 4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>1811838</td>
			<td>nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Premix Ex Taq II</td>
			<td>Takara,Dalian,China</td>
			<td>RR820A</td>
			<td>polymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS: 1132-61-2</td>
			<td>section 5.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>CAS: 25952-53-8</td>
			<td>section 5.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6066-82-6</td>
			<td>section 5.2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mercaptohexanol (MCH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS: 1633-78-9</td>
			<td>section 7.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold electrode</td>
			<td>Shanghai Chenhua</td>
			<td>CHI101</td>
			<td>section 7.4. - 7.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS: 51805-45-9</td>
			<td>section 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-(2-Mercaptoethyl)-O&#39;-methyl-hexa-(ethylene glycol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS: 651042-82-9</td>
			<td>section 7.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethylhexyl phthalate (DEHP)</td>
			<td>National Institute of Metrology, China</td>
			<td>CAS: 117-81-7</td>
			<td>section 7.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS: 9005-64-5</td>
			<td>polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS: 9002-93-1</td>
			<td>non-ionic surface active agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368</td>
			<td>10 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phthalic acid ester-binding dna aptamer selection, characterization, and application to an electrochemical aptasensor

フタル酸エステル (パエス) は残留性有機汚染物質の主要なグループの一人。・ パエスのグループ固有の検出が同族体の急速な成長のために望ましい。DNA アプタマーは、ますますバイオ センサー プラットフォーム上の認識要素として適用されているが、パエスなどの高い疎水性小分子目標に向かって選択するアプタマーはほとんど報告します。この作業では、・ パエスに DNA アプタマーの探索グループ特定を選択するように設計ビーズ法について説明します。アミノ基修飾フタル酸ジブチル (DBP NH2) アンカー ターゲットを合成し、エポキシ活性化アガロース ビーズに固定化した、固定マトリックスの表面でフタル酸エステルのグループの表示を許可してしたがって、グループ固有のバインダーの選択。我々 は、磁気分離と結合の定量的重合連鎖反応によるアプタマー候補の解離定数を決定しました。相対的な親和性と選択性他のパエスにアプタマーの競争の試金によって定められた磁気ビーズを添付アプタマー候補あった DBP NH2限定事前どこと培養上清にリリーステスト ・ パエスまたは他の潜在的な妨害物質。競争の試金は、表面固定化のための機能グループがなかった・ パエスの安易な親和性の比較を提供されるために適用しました。最後に、我々 は電気化学 aptasensor の作製を実証し、bis(2-ethylhexyl) フタル酸の超高感度かつ選択的な検出のためにそれを使用します。このプロトコルは、他の疎水性小分子のアプタマー探索の洞察力を提供します。

私たちは設計・ アンカー ターゲット (図 1 階) として、アミノ基修飾フタル酸ジブチル (DBP NH2) を合成します。・ パエス DBP NH2を使用してアンカー ターゲットとして、次の古典的なターゲット固定ベース メソッド (図 2) の DNA アプタマーの選択を行った。各ラウンドでパイロットの PCR は PCR (図 3) のサイクル数を最適化する変性のページを用いて行った。高いサイクル数でネイティブのゲルに疑われる高分子量副産物が実際に架橋複合体である我々 と他の同僚を発見したので変性] ページで、ネイティブのページの代わりにお勧め適切なサイズのシーケンス。したがって、変性のページのバンドの強度は本当に適切な製品の量を反映できます。単一の孤立した DNA 生成は別の重要なステップと、このステップのための多くの方法が報告されている28をされています。Λ exonuclease 消化法は、最も安い方法です。単一座礁させた DNA の生成の成功はネイティブ] ページで、PCR の製品のようで便利にチェックできます (SELEX の最初のいくつかのラウンド) を単一または複数のバンド、のみ 1 つのバンドは (図 4) 消化後は表示します。
5 番目は (前記 Dna を 2 TBE-含む × 8.3 M 尿素 10 分 95 ° C で加熱します) 変性治療後も、ページの上部に蓄積された DNA のかなりの量のための選択のラウンド後、SELEX が停止しました。、Dna の間深刻な架橋を示唆し、指摘したシーケンスを濃縮しました。したがって、プール4は、高スループット シーケンスのために送られました。高スループットの結果を示した最も頻出シーケンスをするトップ 100 が高度に保存された、一つの家族からあった。トップ シーケンス DBP 1 ナノモル親和性 (図 5) と良いグループ特異性を PAE 同族 (DBP、BBP、DEHP) に表示されます (図 6) を介してプロトコル セクションの便利な qPCR の試金。
DBP 1 はそれに応じてストランド変位に基づく電気化学 aptasenor を構築に使用されている我々 の既報に働く29。DEHP センサーは、DEHP (図 7) に敏感、選択的に応答できます。似たような官能基を持つ小分子、抗生物質、重金属イオンなど一般的な環境汚染物質は、DBP 1 に非常に弱い反応を示した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56814/56814fig1.jpg"> 図 1: 化学構造 (A) ・ パエス、BBP (B)、(C) DBP、(D) (E) 4 OH DEHP、(F) DBP−NH2DEHP 。この図は、韓裕らの許可を得て転載されています22<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56814/56814fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56814/56814fig2.jpg"> 図 2: グループ固有の DNA アプタマー選択手順・ パエス DBP NH2アンカー ターゲットとして使用します。この図は、韓裕らの許可を得て転載されています22<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56814/56814fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56814/56814fig3.jpg"> 図 3: 代表に起因する変性のページを使用して PCR サイクル最適化します。左から右に、車線を表す: 20 bp DNA ラダー標準、15 サイクル (DNA テンプレートなし)、20 サイクル (DNA テンプレートなし)、25 サイクル (DNA テンプレートなし)、30 サイクル (DNA テンプレートなし)、15 サイクル、20 サイクル、25 サイクル、および 30 のサイクル。最適な条件は、単一の製品バンドところ不要な副産物がなければ高強度でさらに、空白の対応するコントロールにバンドが認められず 25 サイクルで観測しました。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56814/56814fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56814/56814fig4.jpg"> 図 4: ネイティブ] ページを使用してリン酸化繊維を消化する λ exonuclease 反応の最適化。左から右に、車線を表す: 20 bp DNA ラダー標準、負 (λ exonuclease ない)、2 u、5 u、8 u、および 10U。最低限酵素の 2 u、ダブルの PCR の製品が一本鎖 Dna になる観測されました。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56814/56814fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56814/56814fig5.jpg"> 図 5: qPCR ベースアッセイ DBP 1 のアフィニ ティー測定。Kdのエラー (標準偏差、SD) は、同じサンプルの 3 つの測定から計算しました。この図は、韓裕らの許可を得て転載されています22
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56814/56814fig6.jpg"> 図 6: 無料 DBP NH2 (10 μ M)、DBP の DBP 1 の相対的親和性測定 (10 μ M)、DEHP (10 μ M)、BBP (10 μ M)、酢酸エチル (10 μ M)、安息香酸 (10 μ M)、フタル酸 (10 μ M)、および他の競争の試金を経由します。その他: 10 μ M のすべての潜在的な干渉 (グルコース、カナマイシン、アンピシリン、エタノール) の混合。率 (相対的親和性) は、PAE 結合バッファーのビードからリリース アプタマーの数によってサンプルの存在下でビーズからリリース アプタマーの数で除して算出しました。バーを表す平均 ± SD.SDs は、3 つの個々 の測定値から算出しました。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56814/56814fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56814/56814fig7.jpg"> 図 7: DEHP の超高感度と ultraselective の検出用 DEHP 電気化学バイオ センサー: メカニズム (A)、SWV 曲線 (B)、(C)、校正曲線と選択性をテスト (D).エラー (SDs) は、3 つの個々 の測定値から算出しました。この図は、韓裕らの許可を得て転載されています22<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56814/56814fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

生体外の選択グループ特定フタル酸エステル結合 DNA アプタマーのキャラクタリゼーションのためのプロトコルが表示されます。電気化学 aptasensor で選択したアプタマーのアプリケーションが含まれています。

フタル酸エステル結合 DNA アプタマーの選択、評価、および電気化学 Aptasensor への応用

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the ...

phthalic-acid-ester-binding-dna-aptamer-selection-characterization

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.7K ビュー.  Capital Normal University. 生体外の選択グループ特定フタル酸エステル結合 DNA アプタマーのキャラクタリゼーションのためのプロトコルが表示されます。電気化学 aptasensor で選択したアプタマーのアプリケーションが含まれています。

ビデオ: Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both stimuli and cargo can be tailored according to specific needs. Here we describe the DNA nanorobot fabrication protocol, with the use of the DNA origami technique. The procedure initiates by mixing short single-strand DNA staples into a stock mixture which is then added to a long, circular, single-strand DNA scaffold in presence of a folding buffer. A standard thermo cycler is programmed to gradually lower the mixing reaction temperature to facilitate the staples-to-scaffold annealing, which is the guiding force behind the folding of the nanorobot. Once the 60 hr folding reaction is complete, excess staples are discarded using a centrifugal filter, followed by visualization via agarose-gel electrophoresis (AGE). Finally, successful fabrication of the nanorobot is verified by transmission electron microscopy (TEM), with the use of uranyl-formate as negative stain.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

DNA折り紙からバイオ応答ロボットの折りたたみとキャラクタリゼーション

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

化学

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

The traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the use of solid-phase synthesis by appending suitably modified phosphoramidite precursors to the nascent chain. However, the conditions used during the synthesis and the restriction to rather short sequences hamper the applicability of this methodology. On the other hand, modified nucleoside triphosphates are activated building blocks that have been employed for the mild introduction of numerous functional groups into nucleic acids, a strategy that paves the way for the use of modified nucleic acids in a wide-ranging palette of practical applications such as functional tagging and generation of ribozymes and DNAzymes. One of the major challenges resides in the intricacy of the methodology leading to the isolation and characterization of these nucleoside analogues.
	
	In this video article, we present a detailed protocol for the synthesis of these modified analogues using phosphorous(III)-based reagents. In addition, the procedure for their biochemical characterization is divulged, with a special emphasis on primer extension reactions and TdT tailing polymerization. This detailed protocol will be of use for the crafting of modified dNTPs and their further use in chemical biology.

The protocol described herein aims to explain and abridge the numerous obstacles in the way of the intricate route leading to modified nucleoside triphosphates. Consequently, this protocol facilitates both the synthesis of these activated building-blocks and their availability for practical applications.

ヌクレオシド三リン酸 - 合成からの生化学的特徴付けへ

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in understanding contaminant mass transport and the ability to decontaminate materials. If a material is contaminated, over time, the transport of highly toxic chemicals (such as chemical warfare agent species) out of the material can result in vapor exposure or transfer to the skin, which can result in percutaneous exposure to personnel who interact with the material. Due to the high toxicity of chemical warfare agents, the release of trace chemical quantities is of significant concern. Mapping subsurface concentration distribution and transport characteristics of absorbed agents enables exposure hazards to be assessed in untested conditions. Furthermore, these tools can be used to characterize subsurface reaction dynamics to ultimately design improved decontaminants or decontamination procedures. To achieve this goal, an inverse analysis mass transport modeling approach was developed that utilizes time-resolved mass spectroscopy measurements of vapor emission from contaminated paint coatings as the input parameter for calculation of subsurface concentration profiles. Details are provided on sample preparation, including contaminant and material handling, the application of mass spectrometry for the measurement of emitted contaminant vapor, and the implementation of inverse analysis using a physics-based diffusion model to determine transport properties of live chemical warfare agents including distilled mustard (HD) and the nerve agent VX.

In this paper, a procedure for quantifying the mass transport parameters of chemicals in various materials is presented. This process involves employing an inverse-analysis based diffusion model to vapor emission profiles recorded by real-time, mass spectrometry in high vacuum.

塗料中の化学輸送のキャラに逆解析アプローチ

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

Dynamic Electrochemical Measurement of Chloride Ions

This protocol describes the dynamic measurement of chloride ions using the transition time of a silver silver chloride (Ag/AgCl) electrode. Silver silver chloride electrode is used extensively for potentiometric measurement of chloride ions concentration in electrolyte. In this measurement, long-term and continuous monitoring is limited due to the inherent drift and the requirement of a stable reference electrode. We utilized the chronopotentiometric approach to minimize drift and avoid the use of a conventional reference electrode. A galvanostatic pulse is applied to an Ag/AgCl electrode which initiates a faradic reaction depleting the Cl&#713; ions near the electrode surface. The transition time, which is the time to completely deplete the ions near the electrode surface, is a function of the ion concentration, given by the Nernst equation. The square root of the transition time is in linear relation to the chloride ion concentration. Drift of the response over two weeks is negligible (59 &#181;M/day) when measuring 1 mM [Cl&#713;]using a current pulse of 10 Am-2. This is a dynamic measurement where the moment of transition time determines the response and thus is independent of the absolute potential. Any metal wire can be used as a pseudo-reference electrode, making this approach feasible for long-term measurement inside concrete structures.

Dynamic measurement of chloride ions is presented. Transition time of an Ag/AgCl electrode, during a chronopotentiometric technique, can give the concentration of chloride ions in electrolyte. This method does not require a stable conventional reference electrode.

塩化物イオンの動的電気化学測定

This protocol describes the dynamic measurement of chloride ions using the transition time of a silver silver chloride (Ag/AgCl) electrode. Silver silver ...

An Aptamer-based Sensor for Unchelated Gadolinium(III)

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd3+) in aqueous solution is demonstrated. Gd3+ is often present in samples of gadolinium-based contrast agents as a result of incomplete reactions between the ligand and the ion, or as a dissociation product. Since the ion is toxic, its detection is of critical importance. Herein, the design and usage of an aptamer-based sensor (Gd-sensor) for Gd3+ are described. The sensor produces a fluorescence change in response to increasing concentrations of the ion, and has a limit of detection in the nanomolar range (~100 nM with a signal-to-noise ratio of 3). The assay may be run in an aqueous buffer at ambient pH (~7 - 7.4) in a 384-well microplate. The sensor is relatively unreactive toward other physiologically relevant metal ions such as sodium, potassium, and calcium ions, although it is not specific for Gd3+ over other trivalent lanthanides such as europium(III) and terbium(III). Nevertheless, the lanthanides are not commonly found in contrast agents or the biological systems, and the sensor may therefore be used to selectively determine unchelated Gd3+ in aqueous conditions.

An Aptamer-based Sensor for Unchelated GadoliniumIII

The use of polydeoxynucleotide (44-mer aptamer) molecules for sensing unchelated gadolinium(III) ion in an aqueous solution is described. The presence of the ion is detected via an increase in the fluorescence emission of the sensor.

非キレート化ガドリニウム（III）のためのアプタマーベースのセンサー

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd3+) in aqueous solution is demonstrated. Gd3+ is often present in samples ...

Electrochemical Impedance Spectroscopy as a Tool for Electrochemical Rate Constant Estimation

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). In the case of fast reversible electrochemical processes, current is predominantly affected by the rate of diffusion, which is the slowest and limiting stage. EIS is a powerful technique that allows separate analysis of stages of charge transfer that have different AC frequency response. The capability of the method was used to extract the value of charge transfer resistance, which characterizes the rate of charge exchange on the electrode-solution interface. The application of this technique is broad, from biochemistry up to organic electronics. In this work, we are presenting the method of analysis of organic compounds for optoelectronic applications.

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) of species that undergo reversible oxidation or reduction in solution was used for determination of rate constants of oxidation or reduction.

電気化学インピー ダンス分光電気化学定数推定法のためのツールとして

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). ...

Time-resolved Photophysical Characterization of Triplet-harvesting Organic Compounds at an Oxygen-free Environment Using an iCCD Camera

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables the acquisition of photoluminescence spectra covering the time regime from nanoseconds up to 0.1 s. This enables us to follow the changes in the intensity (decay) and emission of the spectra over time. Using this method, it is possible to study diverse photophysical phenomena, such as the emission of phosphorescence, and the contributions of prompt and delayed fluorescence in molecules showing thermally activated delayed fluorescence (TADF). Remarkably, all spectra and decays are obtained in a single experiment. This can be done for solids (thin film, powder, crystal) and liquid samples, where the only limitations are the spectral sensitivity of the camera and the excitation wavelength (532 nm, 355 nm, 337 nm, and 266 nm). This technique is, thus, very important when investigating the excited state dynamics in organic emitters for their application in organic light-emitting diodes and other areas where triplet harvesting is of paramount importance. Since triplet states are strongly quenched by oxygen, emitters with efficient TADF luminescence, or those showing room temperature phosphorescence (RTP), must be correctly prepared in order to remove any dissolved oxygen from solutions and films. Otherwise, no long-lived emission will be observed. The method of degassing solid samples as presented in this work is basic and simple, but the degassing of liquid samples creates additional difficulties and is particularly interesting. A method of minimizing solvent loss and changing the sample concentration, while still enabling to remove oxygen in a very efficient and a repeatable manner, is presented in this work.

Here, we present a method of the spectroscopic characterization of organic molecules by means of time-resolved photoluminescence spectroscopy on the nanosecond-to-millisecond timescale in oxygen-free conditions. Methods to efficiently remove oxygen from the samples and, thus, limit luminescence quenching are also described.

時間分解光物性評価のトリプレット収穫有機化合物無酸素環境使用、iCCD カメラ

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables ...

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control cellular functions. The reversal of DNA methylation, or DNA demethylation, is mediated by the ten-eleven translocation (TET) protein family of dioxygenases. Although it has been widely reported that aberrant DNA methylation and demethylation are associated with developmental defects and cancer, how these epigenetic changes directly contribute to the subsequent alteration in gene expression or disease progression remains unclear, largely owing to the lack of reliable tools to accurately add or remove DNA modifications in the genome at defined temporal and spatial resolution. To overcome this hurdle, we designed a split-TET2 enzyme to enable temporal control of 5-methylcytosine (5mC) oxidation and subsequent remodeling of epigenetic states in mammalian cells by simply adding chemicals. Here, we describe methods for introducing a chemical-inducible epigenome remodeling tool (CiDER), based on an engineered split-TET2 enzyme, into mammalian cells and quantifying the chemical inducible production of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) with immunostaining, flow cytometry or a dot-blot assay. This chemical-inducible epigenome remodeling tool will find broad use in interrogating cellular systems without altering the genetic code, as well as in probing the epigenotype&#8722;phenotype relations in various biological systems.

Detailed protocols for introducing an engineered split-TET2 enzyme (CiDER) into mammalian cells for chemical inducible DNA hydroxymethylation and epigenetic remodeling are presented.

化学誘導型 DNA Hydroxymethylation およびエピジェネティックな改造のために設計された分割型 TET2 酵素

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...

An Electrochemical Cholesteric Liquid Crystalline Device for Quick and Low-Voltage Color Modulation

We demonstrate a method for fabricating a prototype reflective display device that contains cholesteric liquid crystal (LC) as an active component. The cholesteric LC is composed of a nematic LC 4&#39;-pentyloxy-4-cyanobiphenyl (5OCB), redox-responsive chiral dopant (FcD), and a supporting electrolyte 1-ethyl-3-methylimidazolium trifluoromethanesulfonate (EMIm-OTf). The most important component is FcD. This molecule changes its helical twisting power (HTP) value in response to redox reactions. Therefore, in situ electrochemical redox reactions in the LC mixture allow for the device to change its reflection color in response to electrical stimuli. The LC mixture was introduced, by a capillary action, into a sandwich-type ITO glass cell comprising two glass slides with patterned indium tin oxide (ITO) electrodes, one of which was coated with poly(3,4-ethylenedioxythiophene)-co-poly(ethylene glycol) doped with perchlorate (PEDOT+). Upon application of +1.5 V, the reflection color of the device changed from blue (467 nm) to green (485 nm) in 0.4 s. Subsequent application of 0 V made the device recover the original blue color in 2.7 s. This device is characterized by its fastest electrical response and lowest operating voltage among any previously reported cholesteric LC device. This device could pave the way for the development of next generation reflective displays with low energy consumption rates.

A protocol for the fabrication of a reflective cholesteric liquid crystalline display device containing a redox-responsive chiral dopant allowing quick and low-voltage operation is presented.

迅速かつ低電圧の色変調のため電気化学コレステリック液晶結晶デバイス

We demonstrate a method for fabricating a prototype reflective display device that contains cholesteric liquid crystal (LC) as an active component. The ...

Electrochemical Roughening of Thin-Film Platinum Macro and Microelectrodes

This protocol demonstrates a method for electrochemical roughening of thin-film platinum electrodes without preferential dissolution at grain boundaries of the metal. Using this method, a crack free, thin-film macroelectrode surface with up to 40 times increase in active surface area was obtained. The roughening is easy to do in a standard electrochemical characterization laboratory and incudes the application of voltage pulses followed by extended application of a reductive voltage in a perchloric acid solution. The protocol includes the chemical and electrochemical preparation of both a macroscale (1.2 mm diameter) and microscale (20 &#181;m diameter) platinum disc electrode surface, roughening the electrode surface and characterizing the effects of surface roughening on electrode active surface area. This electrochemical characterization includes cyclic voltammetry and impedance spectroscopy and is demonstrated for both the macroelectrodes and the microelectrodes. Roughening increases electrode active surface area, decreases electrode impedance, increases platinum charge injection limits to those of titanium nitride electrodes of same geometry and improves substrates for adhesion of electrochemically deposited films.

This protocol demonstrates a method for electrochemical roughening of thin-film platinum electrodes without preferential dissolution at grain boundaries. The electrochemical techniques of cyclic voltammetry and impedance spectroscopy are demonstrated to characterize these electrode surfaces.

薄膜白金マクロ及びマイクロ電極の電気化学粗化

This protocol demonstrates a method for electrochemical roughening of thin-film platinum electrodes without preferential dissolution at grain boundaries ...