Wir sind dankbar für die finanzielle Unterstützung von der National Natural Science Foundation (21675112), Key-Projekt von Wissenschaft und Technik Plan von Peking Education Commission (KZ201710028027) und Yanjing Young Scholar Program der Capital Normal University.

<ol>
	<li>Vorkamp, K., Riget, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+new+and+current-use+contaminants+in+the+Arctic+environment:+Evidence+of+long-range+transport+and+indications+of+bioaccumulation.">A review of new and current-use contaminants in the Arctic environment: Evidence of long-range transport and indications of bioaccumulation.</a> Chemosphere. 111, 379-395 (2014).</li><li>Net, S., Sempere, R., Delmont, A., Paluselli, A., Ouddane, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence,+fate,+behavior+and+ecotoxicological+state+of+phthalates+in+different+environmental+matrices.">Occurrence, fate, behavior and ecotoxicological state of phthalates in different environmental matrices.</a> Environ Sci Technol. 49 (7), 4019-4035 (2015).</li><li>Xie, Q. L., Liu, S. H., Fan, Y. Y., Sun, J. Z., Zhang, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+phthalate+esters+in+edible+oils+by+use+of+QuEChERS+coupled+with+ionic-liquid-based+dispersive+liquid-liquid+microextraction+before+high-performance+liquid+chromatography.">Determination of phthalate esters in edible oils by use of QuEChERS coupled with ionic-liquid-based dispersive liquid-liquid microextraction before high-performance liquid chromatography.</a> Anal BioanalChem. 406 (18), 4563-4569 (2014).</li><li>Ierapetritis, I., Lioupis, A., Lampi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+phthalates+into+vegetable+oils+by+isotopic+dilution+gas+chromatography+mass+spectrometry.">Determination of phthalates into vegetable oils by isotopic dilution gas chromatography mass spectrometry.</a> Food Anal Methods. 7 (7), 1451-1457 (2014).</li><li>Sun, J. Z., He, H., Liu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+phthalic+acid+esters+in+Chinese+white+spirit+using+dispersive+liquid-liquid+microextraction+coupled+with+sweeping+beta-cyclodextrin-modified+micellar+electrokinetic+chromatography.">Determination of phthalic acid esters in Chinese white spirit using dispersive liquid-liquid microextraction coupled with sweeping beta-cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography.</a> J Sep Sci. 37 (13), 1679-1686 (2014).</li><li>Yilmaz, P. K., Ertas, A., Kolak, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+seven+phthalic+acid+esters+in+beverages+using+ultrasound+and+vortex-assisted+dispersive+liquid-liquid+microextraction+followed+by+high-performance+liquid+chromatography.">Simultaneous determination of seven phthalic acid esters in beverages using ultrasound and vortex-assisted dispersive liquid-liquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography.</a> J Sep Sci. 37 (16), 2111-2117 (2014).</li><li>Sun, R., Zhuang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+gold+nanoparticles+improved+real-time+immuno-PCR+assay+for+detecting+diethyl+phthalate+in+foodstuff+samples.">An ultrasensitive gold nanoparticles improved real-time immuno-PCR assay for detecting diethyl phthalate in foodstuff samples.</a> Anal Biochem. 480, 49-57 (2015).</li><li>Sun, R. Y., Zhuang, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+heterogeneous+biotin-streptavidin+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+the+determination+of+di-(2-ethylhexyl)phthalate+(DEHP)+in+beverages+using+a+specific+polyclonal+antibody.">A sensitive heterogeneous biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of di-(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP) in beverages using a specific polyclonal antibody.</a> Anal Methods. 6 (24), 9807-9815 (2014).</li><li>Zhou, L., Lei, Y., Zhang, D., Ahmed, S., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-sensitive+monoclonal+antibody-based+enzyme-linked+immunosobent+assay+for+dibutyl+phthalate+in+human+urinary.">An ultra-sensitive monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosobent assay for dibutyl phthalate in human urinary.</a> Sci Total Environ. 541, 570-578 (2016).</li><li>Shen, J., Li, Y., Gu, H., Xia, F., Zuo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+development+of+sandwich+assay+based+on+the+nanobiotechnologies+for+proteins,+nucleic+Acids,+small+Molecules,+and+ions.">Recent development of sandwich assay based on the nanobiotechnologies for proteins, nucleic Acids, small Molecules, and ions.</a> Chem Rev. 114 (15), 7631-7677 (2014).</li><li>Yin, X. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+nucleic+acids+for+electrochemical+and+electrochemiluminescent+sensing+applications.">Functional nucleic acids for electrochemical and electrochemiluminescent sensing applications.</a> TrAC, Trends Anal Chem. 33, 81-94 (2012).</li><li>Nguyen, V. -. T., Kwon, Y. S., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-based+environmental+biosensors+for+small+molecule+contaminants.">Aptamer-based environmental biosensors for small molecule contaminants.</a> Curr Opin Biotechnol. 45, 15-23 (2017).</li><li>Groher, F., Suess, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+antibiotic-binding+aptamers.">In vitro selection of antibiotic-binding aptamers.</a> Methods. 106, 42-50 (2016).</li><li>Yang, K. -. A., Pei, R., Stojanovic, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+and+amplification+protocols+for+isolation+of+aptameric+sensors+for+small+molecules.">In vitro selection and amplification protocols for isolation of aptameric sensors for small molecules.</a> Methods. 106, 58-65 (2016).</li><li>Jing, M., Bowser, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+measuring+aptamer-protein+equilibria:+a+review.">Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review.</a> Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).</li><li>Mehta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+characterization+of+PCB-binding+DNA+aptamers.">Selection and characterization of PCB-binding DNA aptamers.</a> Anal Chem. 84 (3), 1669-1676 (2012).</li><li>Matsumoto, M., Hirata-Koizumi, M., Ema, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+adverse+effects+of+phthalic+acid+esters+on+human+health:+A+review+of+recent+studies+on+reproduction.">Potential adverse effects of phthalic acid esters on human health: A review of recent studies on reproduction.</a> Regul Toxicol Pharm. 50 (1), 37-49 (2008).</li><li>Goodchild, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugates+of+oligonucleotides+and+modified+oligonucleotides:+a+review+of+their+synthesis+and+properties.">Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: a review of their synthesis and properties.</a> Bioconjug Chem. 1 (3), 165-187 (1990).</li><li>Brown, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+oligonucleotide+synthesis.">A brief history of oligonucleotide synthesis.</a> Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties. , 1-17 (1993).</li><li>Reese, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligo-and+poly-nucleotides:+50+years+of+chemical+synthesis.">Oligo-and poly-nucleotides: 50 years of chemical synthesis.</a> Org Biomol Chem. 3 (21), 3851-3868 (2005).</li><li>Sproat, B., Colonna, F., Mullah, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+the+isolation+and+purification+of+oligoribonucleotides.">An efficient method for the isolation and purification of oligoribonucleotides.</a> Nucleos Nucleot Nucl. 14 (1-2), 255-273 (1995).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+group-specific+phthalic+acid+esters+binding+DNA+aptamers+via+rationally+designed+target+immobilization+and+applications+for+ultrasensitive+and+highly+selective+detection+of+phthalic+acid+esters.">Selection of group-specific phthalic acid esters binding DNA aptamers via rationally designed target immobilization and applications for ultrasensitive and highly selective detection of phthalic acid esters.</a> Anal Chem. 89 (10), 5270-5277 (2017).</li><li>Bartlett, J. M. S., Stirling, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short+history+of+the+polymerase+chain+reaction.">A short history of the polymerase chain reaction.</a> PCR protocols. , 3-6 (2003).</li><li>Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+amplification+of+beta-globin+genomic+sequences+and+restriction+site+analysis+for+diagnosis+of+sickle+cell+anemia.">Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.</a> Science. 230, 1350-1354 (1985).</li><li>Albright, L. M., Slatko, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Denaturing+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , A. 3B 1-A. 3B 5 (2001).</li><li>Summer, H., Gr&#228;mer, R., Dr&#246;ge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Denaturing+urea+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(Urea+PAGE).">Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE).</a> JoVE. (32), e1485 (2009).</li><li>Jing, M., Bowser, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+measuring+aptamer-protein+equilibria:+a+review.">Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review.</a> Anal Chim Acta. 686 (1), 9-18 (2011).</li><li>Sharma, T. K., Bruno, J. G., Dhiman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCs+of+DNA+aptamer+and+related+assay+development.">ABCs of DNA aptamer and related assay development.</a> Biotechnol Adv. 35 (2), 275-301 (2017).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling-probe+displacement+electrochemical+aptamer-based+sensor+(SD-EAB)+for+detection+of+nanomolar+kanamycin+A.">Signaling-probe displacement electrochemical aptamer-based sensor (SD-EAB) for detection of nanomolar kanamycin A.</a> Electrochim Acta. 182, 516-523 (2015).</li><li>Mendonsa, S. D., Bowser, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evolution+of+functional+DNA+using+capillary+electrophoresis.">In vitro evolution of functional DNA using capillary electrophoresis.</a> J Am Chem Soc. 126, 20-21 (2004).</li><li>Lou, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromagnetic+selection+of+aptamers+in+microfluidic+channels.">Micromagnetic selection of aptamers in microfluidic channels.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 2989-2994 (2009).</li><li>Cho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+selection+of+DNA+aptamers+through+microfluidic+selection+and+high-throughput+sequencing.">Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15373-15378 (2010).</li><li>Cho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+selection+and+parallel+characterization+of+aptamers.">Quantitative selection and parallel characterization of aptamers.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110 (46), 18460-18465 (2013).</li><li>Song, K. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticle-based+colorimetric+detection+of+kanamycin+using+a+DNA+aptamer.">Gold nanoparticle-based colorimetric detection of kanamycin using a DNA aptamer.</a> Anal Biochem. 415 (2), 175-181 (2011).</li><li>Yang, Z., Ding, X., Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+generation+of+signaling-probe+displacement+electrochemical+aptasensor+for+detection+of+picomolar+ampicillin+and+sulfadimethoxine.">Second generation of signaling-probe displacement electrochemical aptasensor for detection of picomolar ampicillin and sulfadimethoxine.</a> Sens Actuators B. 253 (2017), 1129-1136 (2017).</li><li>Lou, X., Zhao, T., Liu, R., Ma, J., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+DNA+monolayer+buffered+dynamic+ranges+of+mercuric+electrochemical+sensor.">Self-assembled DNA monolayer buffered dynamic ranges of mercuric electrochemical sensor.</a> Anal Chem. 85 (15), 7574-7580 (2013).</li><li>Zhao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoprobe-enhanced,+split+aptamer-based+electrochemical+sandwich+assay+for+ultrasensitive+detection+of+small+molecules.">Nanoprobe-enhanced, split aptamer-based electrochemical sandwich assay for ultrasensitive detection of small molecules.</a> Anal Chem. 87 (15), 7712-7719 (2015).</li><li>Lou, X., He, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+using+oligo(ethylene+glycol)+in+ATRP-assisted+DNA+detection.">Surface passivation using oligo(ethylene glycol) in ATRP-assisted DNA detection.</a> Sens Actuators,B. 129 (1), 225-230 (2008).</li></ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Ein herausragender Vorteil von Aptameren ist, dass sie erkannt werden, durch die in-Vitro -Methode SELEX, während Antikörper über in Vivo Immunoreactions generiert werden. Daher können Aptamere mit gewünschten Spezifität durchdachte experimentellen Bedingungen ausgewählt werden, während Antikörper auf physiologischen Bedingungen beschränkt sind.
Um die Trennung der gebundenen Sequenzen von freien Sequenzen zu erleichtern, mehrere modifizierten SELEX vor kurzem berichtet wurde, in welche Kapillarelektrophorese30, Mikrofluidik31, magnetisch / Acryl Perlen / Agarose Perlen14, usw., ersetzt Nitrozellulosefilter oder Affinität Spalten um eine effizientere Trennung zu erzielen. Unter diesen Techniken, die Wulst-basierten Methoden am häufigsten werden seit der Aptamer-Auswahl der niedermolekularer Ziele durch ihre einfache Einrichtung, einfache Bedienung und sein kleines Molekül Analysen zugänglich.
Es gibt zwei Gruppen von Methoden, die üblicherweise für Aptamer Auswahl der niedermolekularer Ziele verwendet werden: das Ziel13 und Bibliothek14 Immobilisierung-basierten Methoden. In der ehemaligen Gruppe von Methoden sind die kleinen Molekül-Ziele auf der Festphase wie funktionalisierten magnetische Beads oder Agarose Perlen über kovalente Kupplungsreaktionen immobilisiert. Bibliotheken sind mit kleinen Molekül beschichtete Perlen inkubiert und die Sequenzen, die nicht binden oder binden Sie schwach an das Ziel an der festen Phase werden einfach durch Waschen und Zentrifugation oder magnetische Trennung Schritte entfernt. Die gebundenen Sequenzen sind anschliessend eluiert und durch PCR verstärkt. Das kleine Molekül-Ziele müssen mindestens eine funktionelle Gruppe für die Kupplung Reaktion zur Verfügung. Für diejenigen ohne geeignete funktionelle Gruppen hat die funktionelle Gruppe in das ursprüngliche Ziel durch organische Synthese eingearbeitet werden. Die Synthese aus den sorgfältig gestalteten Ziel könnte mehrere Schritte und manchmal auch recht anspruchsvoll ist. Die bauliche Veränderung der Ziele könnte auch stark die Bindungsstellen und Affinität zu ihren Aptamere beeinflussen. Zur Vermeidung dieser Probleme Bibliothek Immobilisierung-basierte Methoden entwickelt wurden, wo die Bibliothek zu ergänzenden hybridisiert ist DNA-Erfassung, Sonden auf magnetische Beads und Bindung Sequenzen Abfallen der Perlen auf Bindung mit den Zielen. In dieser Gruppe von Methoden die Ziele sind in der Bindung Puffer hinzugefügt und keine funktionellen Gruppen erforderlich sind. PAEs sind die Ester-Derivate von Phthalat-Säure, und eine typische PAE besteht aus einer Phthalat-Acid Ester-Gruppe und ein oder zwei Alkyl-Ketten (Abbildung 1A-D). PAEs haben keine funktionellen Gruppen für feste Phase Ruhigstellung zur Verfügung. So scheinen die Bibliothek Immobilisierung-basierte Methoden noch attraktiver für die Aptamer-Auswahl der PAEs.
Ein gut kontrolliertes Abstrahlverhalten-Status ist wichtig, um die gewünschte Bereicherung der Bibliothek per SELEX sicherzustellen. Allerdings sind extrem hydrophoben PAEs und leicht bilden Aggregate in wässrigen Lösungen mit einer Konzentration höher als einige µM, sogar in Anwesenheit von mehreren Tensiden Dispersion zu erleichtern. So, der Dispersion Status PAEs ist schwer zu kontrollieren, und es wäre schwierig, Aptamere auszuwählen, die speziell auf einzelne PAE-Moleküle binden. Um die Löslichkeit-Problem zu lösen, wurden Ziel-Immobilisierung Methoden ausgewählt, in denen PAEs auf der hydrophilen Perlen über kovalente Bindung immobilisiert wurden. Mithilfe dieser Immobilisierung Strategie sollte die Ziele auf der Oberfläche der Perle in einem molekularen begeben, anstatt Aggregate dominant vorhanden sein.
Der konstruktive Aufbau des Ziels Anker ist auch ganz entscheidend für die erfolgreiche Selektion von gruppenspezifischen Aptamere. Drei Faktoren für die Konstruktion berücksichtigt werden müssen. Der erste Faktor ist der Zweck der Aptamer-Auswahl. In Anbetracht der Zweck der Auswahl gruppenspezifische Aptamere unbedingt zu entlarven die gemeinsame Gruppe von PAEs für Aptamer Bindung und verhindern, dass der Rest der Teile an die Aptamer-Bindung. Daher sollte der funktionellen Gruppe am Terminal der Seitenkette eingeführt werden. Am Anfang, wir OH funktionalisiert DEHP (4-OH−DEHP) (Abbildung 1E) als Anker Ziel entwickelt und auf die Carbonsäure magnetische Beads16immobilisiert. So wurden die Alkyl-Ketten auf der Oberfläche der Matrix ausgesetzt. Wir haben versucht, magnetische Beads mit Carboxylgruppen als festen Matrix wählen. Keine offensichtlichen Affinität Verbesserung wurde nach fünf Runden der Auswahl beobachtet, und die unspezifische Absorption auf der nackten Matrix blieb stark.
Daher, DBP-NH2 wurde später entwickelt, basierend auf folgenden Gedanken: (1) die Phthalat-Gruppe ist eher zu interagieren, speziell mit dem Aptamer durch die π-π-Stapel und die Wasserstoff-Bindung als Alkyl Kette; (2) NHS-vermittelten Carbodiimide Reaktion ist mild und hat einen sehr effizienten Kupplung Wirkungsgrad, so dass am Ende ein Alkyl Kette von DBP -NH2 eingeführt wird; (3) Es ist einfach zu bedienen mit magnetischen Beads als Festphase Partition, aber die unspezifische Adsorption der Bibliothek ist stark. Obwohl der Verlust der Agarose Korne während Trennung höher ist als die magnetische Beads ist, ist die unspezifische Adsorption der Bibliothek wesentlich geringer. So, DBP-NH2 wurde auf den Epoxy-aktivierte Agarose-Perlen immobilisiert und phthalic Acidester Gruppe auf der Oberfläche der Matrix ausgesetzt war.
Die Wahl der Auswahlpuffer ist wichtig, besonders für kleine Molekül Ziele mit unterschiedlichen Löslichkeit. Die Bindung Puffer muss sorgfältig vorbereitet zu vermeiden Aggregation und gewährleisten einen gute Dispersion Zustand von POPs während des gesamten Aptamer Auswahl und Charakterisierung. In unserer Studie fanden wir, dass DEHP in reguläre Puffer ohne Tenside, auflösen kann nicht mit zwei unterschiedlichen Schichten. Die Schicht verschwindet bei Zugabe von mehreren Tenside in der optimalen Menge. Die klare Lösungen bei Temperaturen über 20 ° C auf ihren Status gespeichert werden müssen. Angaben im Protokoll Schritt 3.1.
Einzelsträngigen DNA-Generation von doppelsträngigen PCR-Produkte ist ein wichtiger Schritt in die SELEX-Verfahren. Verschiedene Methoden sind derzeit in der Literatur32,33, einschließlich asymmetrische PCR, λ Exonuclease Verdauung und magnetische Trennung mit Streptavidin beschichteten Perlen Größe Trennung durch Denaturierung beschrieben worden Harnstoff-Polyacrylamid-Gel.
Verschiedene Methoden haben ihre eigenen Stärken und Schwächen. Derzeit ist die am häufigsten verwendete Methode zur Erzeugung von SsDNA magnetische Trennung mit Streptavidin beschichteten Perlen. Der herausragende Vorteil dieser Methode ist die zeitsparende und einfache Bedienung. Der Nachteil ist sein hoher Preis im Vergleich zu anderen Methoden. Im Gegensatz dazu gehört die Größe Trennung-basierte Methode, bei der reverse Primer mit GC-reichen Stem-Loop-Struktur, die billigsten Methoden während der Ertrag von einzelsträngiger DNA die niedrigste unter diesen Methoden32ist. In diesem Protokoll beschrieben wir die Verwendung von λ Exonuclease Verdauung, einzelsträngigen DNA zu generieren ist eine der billigsten Methoden. Wir fanden, dass die Ausbeute von einzelsträngiger DNA vergleichbar mit den zwei Methoden der magnetische Trennung und Streptavidin beschichteten Perlen. Darüber hinaus fanden wir, dass die Exonuclease Reaktion durch die hohe Konzentration des Salzes gehemmt wurde. Die unvollständige Verdauung des PCR Produktes berichtet in der Literatur33 war wahrscheinlich wegen zu viel Salz in das PCR-Produkt vorhanden. Darüber hinaus ist der λ-Exonuclease sehr aktiv und kostengünstig (Abbildung 4).
Die Charakterisierung und Validierung von Aptameren ist aufwändig, zeitraubend und verkörpert einen größeren Engpass in der Aptamer-Entdeckung-Pipeline-33. Die meisten Techniken sind Masse-Sensitive Methoden, die auch für die größeren Aptamer Bindungspartner arbeiten (> 10.000 amu), aber sind nicht ausreichend empfindlich auf die Interaktionen mit niedrigem Molekulargewicht Ziele messen (< 1.000 amu)15. Die Charakterisierung und Validierung von Aptameren hydrophobe kleiner Moleküle wie PAEs ist sogar noch schwieriger. Ihre schlechte Wasserlöslichkeit ergibt die Doppelbindungen der Titration Kurve, die verhindert, dass die K-d-Bestimmung in Lösung oder Aptamere auf Oberfläche immobilisiert. Deshalb entschlossen wir Kds der identifizierten Aptamere von Hochdurchsatz-Sequenzierung von Immobilisierung DBP-NH2 auf der hydrophilen magnetische Beads um die Löslichkeit zu vermeiden. Die relativen Affinitäten und Selektivität der Aptamere für andere PAEs wurden dann durch die wettbewerbsfähige Assays bestimmt, wo die Aptamer-Kandidaten der DBP-NH2 Pre begrenzt waren angeschlossen magnetische Beads und veröffentlicht, um den Überstand nach Inkubation mit den getesteten PAEs oder anderen potentiell störenden Substanzen. Die wettbewerbsfähigere Assay wurde angewendet, weil sie einen einfache Affinität Vergleich zwischen PAEs bereitgestellt, die keine funktionellen Gruppen für Oberfläche Immobilisierung hatte. Darüber hinaus eignen sich magnetische Wulst-basierte fluoreszierende Assays für die Affinität Studie von kleinen Molekül-Aptamer Interaktionen34. Allerdings haben wir festgestellt, dass die magnetische Beads manchmal verursachen Fluoreszenzlöschung aus unbekannten Gründen. So wurden die qPCR-Assays für die Affinität Messungen verwendet.
Eine kritische Technik-Tipp für die elektrochemische Biosensor beschrieben in dieser Studie ist die Oberfläche Passivierung der Elektrode35. Aufgrund der hohen Hydrophobie von DEHP hat es eine starke Tendenz zur nonspecifically auf die gold Elektrode, führt zum Ausfall des Fundes aufgenommen werden. Am meisten allgemein verwendeten Oberflächen-Passivierung Agent, 6-Mercapto-1-Hexanol (MCH)36,37, ist nicht ausreichend, um zu verhindern, dass die unspezifische Absorption von DEHP, während wir, dass HS-(CH2)2-[OCH2CH2 fanden ]6- OCH3 war wirksam genug, um die empfindliche Detektion von DEHP38zu ermöglichen.
Dieses Verfahren beschreibt ein Protokoll für die Auswahl von gruppenspezifischen DNA Aptameren stark hydrophobe kleiner Moleküle und eine Anwendung von der ausgewählten Aptamer in eine elektrochemische Biosensor. Das Protokoll hilft bei der Auswahl der anderen hydrophoben kleine Moleküle und bietet Einblicke in Sensorentwicklung stark hydrophobe kleiner Moleküle sowie. Das Aptamer-Auswahlverfahren gehört zur Kategorie Ziel Immobilisierung-basierter Methoden. Die Grenzen dieser Art von Methode gibt es auch für dieses Protokoll, z. B. die Notwendigkeit für komplizierte Synthese von Anker-Ziele und die Auswirkungen der Festphase Aptamer-Bindung. Die attraktive elektrochemischen Biosensoren, die in diesem Protokoll beschriebenen Vorteile ihr schlichtes Design und hohe Empfindlichkeit. Der größte Nachteil ist die begrenzte Präzision durch ihre extrem breiten Dynamikbereich. Daher eignen sich die hier beschriebenen Biosensoren mehr für screening-Tests statt quantitative Messungen der Ziele.

Zusammen mit der rasanten wirtschaftlichen Entwicklung ist die Beschleunigung der Industrialisierung und Städtebau, Umweltbelastungen strenger als je zuvor. Typischen Umweltschadstoffen gehören Schwermetall-Ionen, Toxine, Antibiotika, Pestizide, endokrine Disruptoren und persistente organische Schadstoffe (POPs). Neben der Metall-Ionen und Giftstoffe, andere Schadstoffe sind kleine Moleküle, dass ganz oft bestehen aus einer Vielzahl von Artgenossen. Die giftigsten POPs zählen beispielsweise polychlorierte Biphenyle (PCB), polychlorierten Dibenzofuran (PCDFs), polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK), polybromierten APEO Ether (PBDE), polychlorierten Dibenzo-p-Dioxin (PCDDs) und phthalic saure Ester (PAEs)1,2, die alle viele Artgenossen aus. Kleines Molekül Erkennung wurde vor allem durch Chromatographie/Mass Spectrometry-basierten Techniken wegen ihrer Vielfalt von Anwendungen3,4,5,6durchgeführt. Für vor-Ort-Erkennungen wurden Antikörper-basierten Methoden kürzlich entwickelten7,8,9. Da diese Methoden sehr spezifisch für eine bestimmte gleichartig sind, müssen mehrere Tests durchgeführt werden. Gravierender ist, dass die neuartige Kongenere wachsen so schnell, dass ihre Antikörper in der Zeit erzeugt werden können. Daher kann die Entwicklung von zielgruppenspezifischen Biosensoren, die insgesamt Level alle Artgenossen in einem Test zu überwachen eine unschätzbare Metrik zur Bewertung von Umweltbelastungen Status bereitstellen.
Vor kurzem wurden Nukleinsäure-Aptamere weithin als Erkennungselemente in verschiedenen Biosensoren Plattformen durch ihre Fähigkeit, eine Vielzahl von Zielen, von Ionen und kleinen Molekülen an Proteine und Zellen10,11 erkennen angewendet ,12. Aptamere werden durch eine in-vitro- Methode namens systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX)13,14identifiziert. SELEX beginnt mit der zufällige synthetische Einzelstrang Oligonukleotid-Bibliothek, die ca. 1014-1015 Sequenzen enthält. Die Größe der zufälligen Bibliothek sorgt für die Vielfalt der RNA oder DNA-Kandidat Strukturen. Der typische SELEX-Prozess besteht aus mehrere Runden der Bereicherung bis die Bibliothek in Sequenzen mit hoher Affinität und Spezifität zum Ziel angereichert ist. Der endgültige angereicherte Pool dann sequenziert und die Dissoziation konstanten (K-d) und Selektivität gegen mögliche Störsubstanzen durch verschiedene Techniken wie z. B. bestimmt werden Filtern verbindlich, Affinitätschromatographie, Oberfläche Plasmon-Resonanz (SPR), etc. 15
Aufgrund der extrem schlechten Wasserlöslichkeit und Mangel an funktionellen Gruppen für Oberfläche Immobilisierung ist die Aptamer-Auswahl des POPs theoretisch schwierig. Die Entdeckung der Aptamere haben bedeutende Fortschritte für SELEX beschleunigt. Die Auswahl der gruppenspezifischen Aptamere für POPs wurde jedoch noch nicht gemeldet. Bisher wurden nur PCB-Bindung DNA Aptameren mit hoher Spezifität für eine bestimmte Artgenossen identifizierte16. PAEs werden hauptsächlich in Polyvinylchlorid Materialien, Wechsel Polyvinylchlorid aus einem harten Kunststoff zu einem elastischen Kunststoff, fungiert somit als Weichmacher eingesetzt. Einige PAEs als endokrine Disruptoren eingestuft wurden, können schwere Schäden verursachen, Leber- und Nierenfunktion, reduzieren die Beweglichkeit der männlichen Spermien und abnormen Spermien Morphologie und Hodenkrebs17führen kann. Verbindung- weder die gruppenspezifischen PAE-Bindung Aptamere sind berichtet worden.
Das Ziel dieser Arbeit ist es, eine repräsentative Protokoll bieten für die Auswahl von gruppenspezifischen DNA Aptameren, stark hydrophobe kleine Moleküle wie PAEs, eine repräsentative Gruppe von POPs. Wir zeigen auch die Anwendung von der ausgewählten Aptamer für Umweltverschmutzung Erkennung. Dieses Protokoll bietet Beratung und Einblicke für die Aptamer-Entdeckung des anderen hydrophoben kleine Moleküle.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>UV-2550</td>
			<td>Shimadzu,Japan</td>
			<td></td>
			<td>protocol, section 3.8.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>section 3.5.1.2 and 3.5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>section 5.3.6 and 6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VMP3 multichannel potentiostat</td>
			<td>Bio-Logic Science, Claix, France</td>
			<td></td>
			<td>section 7.4,7.8 and 7.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy-activated Sepharose 6B</td>
			<td>GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)</td>
			<td>10220020</td>
			<td>argarose beads, section 2.3 and 3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beads</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>420420</td>
			<td>magnetic beads,section 5.2. and 5.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premix Taq Hot Start Version</td>
			<td>Takara,Dalian,China</td>
			<td>R028A</td>
			<td>polymerase, section 3.5.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PARAFILM Sealing Membrane</td>
			<td>Bemis, USA</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>section 3.6.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda Exonuclease</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>EN0561</td>
			<td>section3.7.1.2.The 10 &#215; reaction buffer is provided along with &#955; exonuclease by the provider.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dr. GenTLE 
			Precipitation Carrier</td>
			<td>Takara,Dalian,China</td>
			<td>9094</td>
			<td>section 3.6.2 and 3.8.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai)</td>
			<td>B511135</td>
			<td>section 4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>1811838</td>
			<td>nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Premix Ex Taq II</td>
			<td>Takara,Dalian,China</td>
			<td>RR820A</td>
			<td>polymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS: 1132-61-2</td>
			<td>section 5.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>CAS: 25952-53-8</td>
			<td>section 5.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6066-82-6</td>
			<td>section 5.2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mercaptohexanol (MCH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS: 1633-78-9</td>
			<td>section 7.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold electrode</td>
			<td>Shanghai Chenhua</td>
			<td>CHI101</td>
			<td>section 7.4. - 7.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS: 51805-45-9</td>
			<td>section 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-(2-Mercaptoethyl)-O&#39;-methyl-hexa-(ethylene glycol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS: 651042-82-9</td>
			<td>section 7.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethylhexyl phthalate (DEHP)</td>
			<td>National Institute of Metrology, China</td>
			<td>CAS: 117-81-7</td>
			<td>section 7.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS: 9005-64-5</td>
			<td>polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS: 9002-93-1</td>
			<td>non-ionic surface active agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368</td>
			<td>10 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phthalic acid ester-binding dna aptamer selection, characterization, and application to an electrochemical aptasensor

Phthalsäure Acid Ester (PAEs) einer der wichtigsten Gruppen von persistenten organischen Schadstoffen. Die gruppenspezifische Erkennung von PAEs ist sehr erwünscht, aufgrund der schnellen Anbau von Artgenossen. DNA-Aptameren zunehmend als Erkennungselemente auf Biosensor Plattformen angewendet wurden, aber Auswahl Aptamere auf stark hydrophobe niedermolekularer Ziele, wie z. B. PAEs, wird selten berichtet. Diese Arbeit beschreibt eine Perle basierende Methode entwickelt, um gruppenspezifische DNA Aptameren, PAEs auswählen. Die Aminogruppe funktionalisiert Dibutyl Phthalat (DBP-NH2) wie das Anker-Ziel wurde synthetisiert und an den Epoxy-aktivierte Agarose-Perlen immobilisiert ermöglicht die Anzeige der phthalic Estergruppe an der Oberfläche der Immobilisierung Matrix und Daher ist die Auswahl der gruppenspezifischen Bindemittel. Wir entschlossen die Dissoziation Konstanten der Aptamer Kandidaten durch quantitative Polymerisation Kettenreaktion gepaart mit magnetische Trennung. Die relativen Affinitäten und Selektivität der Aptamere für andere PAEs wurden durch die wettbewerbsfähige Assays bestimmt, wo die Aptamer-Kandidaten der DBP-NH2 Pre begrenzt waren magnetische Beads angebracht und veröffentlicht, um den Überstand nach Inkubation mit die getesteten PAEs oder andere potenziellen störenden Substanzen. Die wettbewerbsfähigere Assay wurde angewendet, weil sie einen einfache Affinität Vergleich zwischen PAEs bereitgestellt, die keine funktionellen Gruppen für Oberfläche Immobilisierung hatte. Schließlich demonstriert die Herstellung eines elektrochemischen Aptasensor und benutzte es für Gromer und selektive Detektion von bis(2-ethylhexyl) Phthalat. Dieses Protokoll bietet Einblicke für die Aptamer-Entdeckung des anderen hydrophoben kleine Moleküle.

Wir entwickelt und synthetisiert die Aminogruppe funktionalisiert Dibutyl Phthalat (DBP-NH2) als Anker Ziel (Abb. 1F). Wir spielten dann die DNA-Aptamer-Auswahl der PAEs mit DBP-NH2 als Anker Ziel und im Anschluss an das klassische Ziel Immobilisierung basierende Methode (Abbildung 2). In jeder Runde war eine pilot PCR durchgeführt mit der denaturierten Seite optimieren die Zykluszahl PCR (Abbildung 3). Die denaturierte Seite statt native Seite, wird dringend empfohlen, weil wir und andere Kollegen gefunden zu haben, dass die vermuteten hochmolekularen Nebenprodukte gezeigt auf die native Gele bei höheren Taktzahlen tatsächlich Vernetzung komplexe gebildet durch Sequenzen der richtigen Größe. Somit kann die Band Intensität der denaturierten Seite wirklich die Menge an das richtige Produkt reflektieren. Die einzige stranded DNA-Generation ist ein weiterer wichtiger Schritt, und viele Methoden für diesen Schritt gewesen gemeldeten28. Die λ Exonuclease Verdauung ist die billigste Methode. Der Erfolg der einzelsträngigen DNA-Generation kann bequem vom native Seite, wo das PCR-Produkt als angezeigt wird kontrolliert werden (erste mehrere Runden von SELEX) einzelne oder mehrere bands, während nur eine Band nach der Verdauung (Abb. 4) dargestellt ist.
Die SELEX wurde gestoppt, nachdem die fünfte Runde der Auswahl wegen der bedeutenden Menge von DNA gesammelt am oberen Rand der Seite, auch nach der Denaturierung Behandlung (wobei DNAs bei 95 ° C für 10 min in 2 × TBE – enthält 8,3 M Harnstoff erhitzt werden) , die ernsthafte Vernetzung zwischen DNAs vorgeschlagen und auch darauf hingewiesen, dass die Sequenzen angereichert wurden. Daher wurde der Pool4 für den Hochdurchsatz-Sequenzierung verschickt. Das Hochdurchsatz-Ergebnis zeigte, dass die Top 100, die am häufigsten auftretenden Sequenzen hoch konserviert wurden und von einer Familie waren. Die obere Sequenz DBP-1 nanomolaren Affinität (Abbildung 5) und gute Gruppe-Spezifität für PAE Kongenere (DBP, BBP, DEHP) angezeigt (Abbildung 6) über die bequeme qPCR-Assays, wie im Abschnitt Protokoll beschrieben.
DBP-1 wurde verwendet, um einen Strang Verschiebung-basierte elektrochemischen Aptasenor entsprechend konstruieren, unsere bereits berichtet arbeiten29. Die DEHP-Sensor kann empfindlich und selektiv auf DEHP (Abbildung 7) reagieren. Die gemeinsame Umweltschadstoffe wie Schwermetall-Ionen, Antibiotika und kleine Moleküle mit ähnlichen funktionellen Gruppen zeigten sehr schwachen Reaktion auf DBP-1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56814/56814fig1.jpg"> Abbildung 1: Chemische Strukturen von (A) PAEs, (B) BBP, DBP (C), (D) DEHP, (E) 4-OH-DEHP, (F) DBP−NH2. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von Y. Han Et Al. nachgedruckt 22 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56814/56814fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56814/56814fig2.jpg"> Abbildung 2: Gruppe-spezifische DNA-Aptamer Auswahlverfahren für PAEs mit DBP-NH2 als Anker Ziel. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von Y. Han Et Al. nachgedruckt 22 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56814/56814fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56814/56814fig3.jpg"> Abbildung 3: Vertreter ergibt sich aus PCR-Zyklus-Optimierung mittels denaturierten Seite. Von links nach rechts, die Gassen vertreten: 20 bp DNA-Leiter Standard 15 Zyklen (keine DNA-Vorlage), 20 Zyklen (keine DNA-Vorlage), 25 Zyklen (keine DNA-Vorlage), 30 Zyklen (keine DNA-Vorlage), 15 Zyklen, 20 Zyklen, 25 Zyklen und 30 Zyklen. Optimale Bedingungen wurden beobachtet bei 25 Zyklen, wo war die Einzelprodukt Band mit hoher Intensität ohne unerwünschte Nebenprodukte, darüber hinaus keine Band in der entsprechenden Blindkontrolle beobachtet wurde. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56814/56814fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56814/56814fig4.jpg"> Abbildung 4: die Optimierung der λ Exonuclease Reaktion den phosphorylierten Strang mit native Seite verdauen. Von links nach rechts, die Gassen vertreten: 20 bp DNA-Leiter Standard, negativ (keine λ Exonuclease), 2U, 5U, 8U und 10U. Der Mindestbetrag des Enzyms wurde bei 2U, beobachtet wo wird das doppelte PCR-Produkt einzelsträngiger DNA. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56814/56814fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56814/56814fig5.jpg"> Abbildung 5: Affinität Messungen der DBP-1 von qPCR basierende Assays. Der Fehler (Standardabweichung, SD) von der K-d wurde aus drei Messungen der gleichen Probe berechnet. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von Y. Han Et Al. nachgedruckt 22
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56814/56814fig6.jpg"> Abbildung 6: Relative Affinität Messungen der DBP-1 gratis DBP-NH2 (10 µM), DBP (10 µM), DEHP (10 µM), BBP (10 µM), Ethylacetat (10 µM), Benzoesäure (10 µM), Phthalsäure Säure (10 µM) und anderen über Wettbewerb Assays. Sonstiges: eine Mischung aus potenziellen Störungen (Glukose, Kanamycin, Ampicillin und Ethanol) jeweils 10 µM. Das Verhältnis (die relative Affinität) wurde berechnet, indem die Anzahl der Aptamere befreit die Perlen im Beisein der Probe durch die Anzahl der Aptamere aus Perlen im PAE Bindung Puffer freigegeben. Die Balken repräsentieren Mittelwert ± SD Die SDs wurden aus drei Einzelmessungen berechnet. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56814/56814fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56814/56814fig7.jpg"> Abbildung 7: DEHP elektrochemische Biosensor Gromer und ultraselective Nachweis von DEHP: Mechanismus (A), SWV Kurven (B), Eichkurve (C) und Selektivität testet (D). Die Fehler (SDs) wurden aus drei Einzelmessungen berechnet. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von Y. Han Et Al. nachgedruckt 22 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56814/56814fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

Ein Protokoll für die in-vitro- Selektion und Charakterisierung von gruppenspezifischen Phthalsäure Acid Ester-Bindung DNA Aptameren wird vorgestellt. Die Anwendung von der ausgewählten Aptamer in einem elektrochemischen Aptasensor ist ebenfalls enthalten.

Phthalsäure Acid Ester-Bindung DNA-Aptamer Auswahl, Charakterisierung und Anwendung eines elektrochemischen Aptasensor

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the ...

phthalic-acid-ester-binding-dna-aptamer-selection-characterization

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

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Serie: Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both stimuli and cargo can be tailored according to specific needs. Here we describe the DNA nanorobot fabrication protocol, with the use of the DNA origami technique. The procedure initiates by mixing short single-strand DNA staples into a stock mixture which is then added to a long, circular, single-strand DNA scaffold in presence of a folding buffer. A standard thermo cycler is programmed to gradually lower the mixing reaction temperature to facilitate the staples-to-scaffold annealing, which is the guiding force behind the folding of the nanorobot. Once the 60 hr folding reaction is complete, excess staples are discarded using a centrifugal filter, followed by visualization via agarose-gel electrophoresis (AGE). Finally, successful fabrication of the nanorobot is verified by transmission electron microscopy (TEM), with the use of uranyl-formate as negative stain.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

Falten und Charakterisierung eines Bio-responsive Robot von DNA-Origami

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Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

The traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the use of solid-phase synthesis by appending suitably modified phosphoramidite precursors to the nascent chain. However, the conditions used during the synthesis and the restriction to rather short sequences hamper the applicability of this methodology. On the other hand, modified nucleoside triphosphates are activated building blocks that have been employed for the mild introduction of numerous functional groups into nucleic acids, a strategy that paves the way for the use of modified nucleic acids in a wide-ranging palette of practical applications such as functional tagging and generation of ribozymes and DNAzymes. One of the major challenges resides in the intricacy of the methodology leading to the isolation and characterization of these nucleoside analogues.
	
	In this video article, we present a detailed protocol for the synthesis of these modified analogues using phosphorous(III)-based reagents. In addition, the procedure for their biochemical characterization is divulged, with a special emphasis on primer extension reactions and TdT tailing polymerization. This detailed protocol will be of use for the crafting of modified dNTPs and their further use in chemical biology.

The protocol described herein aims to explain and abridge the numerous obstacles in the way of the intricate route leading to modified nucleoside triphosphates. Consequently, this protocol facilitates both the synthesis of these activated building-blocks and their availability for practical applications.

Nucleosidtriphosphaten - von der Synthese zur biochemischen Charakterisierung

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

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In this paper, a procedure for quantifying the mass transport parameters of chemicals in various materials is presented. This process involves employing an inverse-analysis based diffusion model to vapor emission profiles recorded by real-time, mass spectrometry in high vacuum.

Eine inverse Analyse Ansatz zur Charakterisierung von chemischen Transport in Farben

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

Dynamic Electrochemical Measurement of Chloride Ions

This protocol describes the dynamic measurement of chloride ions using the transition time of a silver silver chloride (Ag/AgCl) electrode. Silver silver chloride electrode is used extensively for potentiometric measurement of chloride ions concentration in electrolyte. In this measurement, long-term and continuous monitoring is limited due to the inherent drift and the requirement of a stable reference electrode. We utilized the chronopotentiometric approach to minimize drift and avoid the use of a conventional reference electrode. A galvanostatic pulse is applied to an Ag/AgCl electrode which initiates a faradic reaction depleting the Cl&#713; ions near the electrode surface. The transition time, which is the time to completely deplete the ions near the electrode surface, is a function of the ion concentration, given by the Nernst equation. The square root of the transition time is in linear relation to the chloride ion concentration. Drift of the response over two weeks is negligible (59 &#181;M/day) when measuring 1 mM [Cl&#713;]using a current pulse of 10 Am-2. This is a dynamic measurement where the moment of transition time determines the response and thus is independent of the absolute potential. Any metal wire can be used as a pseudo-reference electrode, making this approach feasible for long-term measurement inside concrete structures.

Dynamic measurement of chloride ions is presented. Transition time of an Ag/AgCl electrode, during a chronopotentiometric technique, can give the concentration of chloride ions in electrolyte. This method does not require a stable conventional reference electrode.

Dynamische elektrochemischen Messung von Chlorid-Ionen

This protocol describes the dynamic measurement of chloride ions using the transition time of a silver silver chloride (Ag/AgCl) electrode. Silver silver ...

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A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd3+) in aqueous solution is demonstrated. Gd3+ is often present in samples of gadolinium-based contrast agents as a result of incomplete reactions between the ligand and the ion, or as a dissociation product. Since the ion is toxic, its detection is of critical importance. Herein, the design and usage of an aptamer-based sensor (Gd-sensor) for Gd3+ are described. The sensor produces a fluorescence change in response to increasing concentrations of the ion, and has a limit of detection in the nanomolar range (~100 nM with a signal-to-noise ratio of 3). The assay may be run in an aqueous buffer at ambient pH (~7 - 7.4) in a 384-well microplate. The sensor is relatively unreactive toward other physiologically relevant metal ions such as sodium, potassium, and calcium ions, although it is not specific for Gd3+ over other trivalent lanthanides such as europium(III) and terbium(III). Nevertheless, the lanthanides are not commonly found in contrast agents or the biological systems, and the sensor may therefore be used to selectively determine unchelated Gd3+ in aqueous conditions.

An Aptamer-based Sensor for Unchelated GadoliniumIII

The use of polydeoxynucleotide (44-mer aptamer) molecules for sensing unchelated gadolinium(III) ion in an aqueous solution is described. The presence of the ion is detected via an increase in the fluorescence emission of the sensor.

Ein Aptamer-basierten Sensor für unchelatisierte Gadolinium (III)

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Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). ...

Time-resolved Photophysical Characterization of Triplet-harvesting Organic Compounds at an Oxygen-free Environment Using an iCCD Camera

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables the acquisition of photoluminescence spectra covering the time regime from nanoseconds up to 0.1 s. This enables us to follow the changes in the intensity (decay) and emission of the spectra over time. Using this method, it is possible to study diverse photophysical phenomena, such as the emission of phosphorescence, and the contributions of prompt and delayed fluorescence in molecules showing thermally activated delayed fluorescence (TADF). Remarkably, all spectra and decays are obtained in a single experiment. This can be done for solids (thin film, powder, crystal) and liquid samples, where the only limitations are the spectral sensitivity of the camera and the excitation wavelength (532 nm, 355 nm, 337 nm, and 266 nm). This technique is, thus, very important when investigating the excited state dynamics in organic emitters for their application in organic light-emitting diodes and other areas where triplet harvesting is of paramount importance. Since triplet states are strongly quenched by oxygen, emitters with efficient TADF luminescence, or those showing room temperature phosphorescence (RTP), must be correctly prepared in order to remove any dissolved oxygen from solutions and films. Otherwise, no long-lived emission will be observed. The method of degassing solid samples as presented in this work is basic and simple, but the degassing of liquid samples creates additional difficulties and is particularly interesting. A method of minimizing solvent loss and changing the sample concentration, while still enabling to remove oxygen in a very efficient and a repeatable manner, is presented in this work.

Here, we present a method of the spectroscopic characterization of organic molecules by means of time-resolved photoluminescence spectroscopy on the nanosecond-to-millisecond timescale in oxygen-free conditions. Methods to efficiently remove oxygen from the samples and, thus, limit luminescence quenching are also described.

Zeitaufgelöste photophysikalischen Charakterisierung der Triplett-Ernte organische Verbindungen in einer sauerstofffreien Umgebung verwenden eine iCCD Kamera

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables ...

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control cellular functions. The reversal of DNA methylation, or DNA demethylation, is mediated by the ten-eleven translocation (TET) protein family of dioxygenases. Although it has been widely reported that aberrant DNA methylation and demethylation are associated with developmental defects and cancer, how these epigenetic changes directly contribute to the subsequent alteration in gene expression or disease progression remains unclear, largely owing to the lack of reliable tools to accurately add or remove DNA modifications in the genome at defined temporal and spatial resolution. To overcome this hurdle, we designed a split-TET2 enzyme to enable temporal control of 5-methylcytosine (5mC) oxidation and subsequent remodeling of epigenetic states in mammalian cells by simply adding chemicals. Here, we describe methods for introducing a chemical-inducible epigenome remodeling tool (CiDER), based on an engineered split-TET2 enzyme, into mammalian cells and quantifying the chemical inducible production of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) with immunostaining, flow cytometry or a dot-blot assay. This chemical-inducible epigenome remodeling tool will find broad use in interrogating cellular systems without altering the genetic code, as well as in probing the epigenotype&#8722;phenotype relations in various biological systems.

Detailed protocols for introducing an engineered split-TET2 enzyme (CiDER) into mammalian cells for chemical inducible DNA hydroxymethylation and epigenetic remodeling are presented.

Ein veränderter Split-TET2 Enzym für chemische-induzierbaren DNA Hydroxymethylation und epigenetische Umbau

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...

An Electrochemical Cholesteric Liquid Crystalline Device for Quick and Low-Voltage Color Modulation

We demonstrate a method for fabricating a prototype reflective display device that contains cholesteric liquid crystal (LC) as an active component. The cholesteric LC is composed of a nematic LC 4&#39;-pentyloxy-4-cyanobiphenyl (5OCB), redox-responsive chiral dopant (FcD), and a supporting electrolyte 1-ethyl-3-methylimidazolium trifluoromethanesulfonate (EMIm-OTf). The most important component is FcD. This molecule changes its helical twisting power (HTP) value in response to redox reactions. Therefore, in situ electrochemical redox reactions in the LC mixture allow for the device to change its reflection color in response to electrical stimuli. The LC mixture was introduced, by a capillary action, into a sandwich-type ITO glass cell comprising two glass slides with patterned indium tin oxide (ITO) electrodes, one of which was coated with poly(3,4-ethylenedioxythiophene)-co-poly(ethylene glycol) doped with perchlorate (PEDOT+). Upon application of +1.5 V, the reflection color of the device changed from blue (467 nm) to green (485 nm) in 0.4 s. Subsequent application of 0 V made the device recover the original blue color in 2.7 s. This device is characterized by its fastest electrical response and lowest operating voltage among any previously reported cholesteric LC device. This device could pave the way for the development of next generation reflective displays with low energy consumption rates.

A protocol for the fabrication of a reflective cholesteric liquid crystalline display device containing a redox-responsive chiral dopant allowing quick and low-voltage operation is presented.

Eine elektrochemische cholesterischen flüssig kristallinen Gerät für schnelle und Niedervolt-Farbe Modulation

We demonstrate a method for fabricating a prototype reflective display device that contains cholesteric liquid crystal (LC) as an active component. The ...

Electrochemical Roughening of Thin-Film Platinum Macro and Microelectrodes

This protocol demonstrates a method for electrochemical roughening of thin-film platinum electrodes without preferential dissolution at grain boundaries of the metal. Using this method, a crack free, thin-film macroelectrode surface with up to 40 times increase in active surface area was obtained. The roughening is easy to do in a standard electrochemical characterization laboratory and incudes the application of voltage pulses followed by extended application of a reductive voltage in a perchloric acid solution. The protocol includes the chemical and electrochemical preparation of both a macroscale (1.2 mm diameter) and microscale (20 &#181;m diameter) platinum disc electrode surface, roughening the electrode surface and characterizing the effects of surface roughening on electrode active surface area. This electrochemical characterization includes cyclic voltammetry and impedance spectroscopy and is demonstrated for both the macroelectrodes and the microelectrodes. Roughening increases electrode active surface area, decreases electrode impedance, increases platinum charge injection limits to those of titanium nitride electrodes of same geometry and improves substrates for adhesion of electrochemically deposited films.

This protocol demonstrates a method for electrochemical roughening of thin-film platinum electrodes without preferential dissolution at grain boundaries. The electrochemical techniques of cyclic voltammetry and impedance spectroscopy are demonstrated to characterize these electrode surfaces.

ElektrochemischeS Schruppen von Dünnschicht-Platinmakro und Mikroelektroden

This protocol demonstrates a method for electrochemical roughening of thin-film platinum electrodes without preferential dissolution at grain boundaries ...