We would like to gratefully acknowledge Dr. Milan N Stojanovic from Columbia University, New York, NY for valuable scientific input. This work is supported by funding from the California State University East Bay (CSUEB) and the CSUEB Faculty Support Grant-Individual Researcher. O.E., T.C., and A.L. were supported by the CSUEB Center for Student Research (CSR) Fellowship.

注：分子生物学グレードの水は、すべての緩衝液および溶液製剤で使用されます。すべて使い捨てチューブ（微量とPCR）およびピペットチップはDNase-とRNaseフリーです。使用前に、すべての化学物質のための材料安全データシート（MSDS）を参照してください。適切な個人保護具（PPE）の使用を強くお勧めします。 アプタマーストック溶液の調製<ol><li>商業的にポリデオキシヌクレオチドの2本鎖を購入します。高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による精製との両方の鎖を注文します。 ストランド1（GD-アプタマー）： 5 &#39; - / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3&#39; ストランド2（QS）： 5&#39;-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 &#39; </li><li> Gd-アプタマーとQSの100μMの個々の原液を作るために水の中に各鎖を溶かします。 </li><li> -20℃でこれらのソリューションを保管してください。ソリューションはこれまで、3年間安定です。 </li><li> freezを最小限に抑えるために、電子融解サイクル、10μLのアリコートで原液を格納します。 </li></ol> 2倍のGd-センサーソリューションの調製<ol><li>アッセイ緩衝液を調製し（20mMのHEPES、2mMのMgCl 2を、150mMのNaCl、5mMのKClを）。 NaOHおよびHClでpHに〜7.4に調整し、0.2μmのPES膜で滅菌使い捨てボトルトップフィルターでろ過します。滅菌瓶に保管してください。濾過し、（室温で）適切に保存されている場合、バッファはこれまで、2年間安定です。 </li><li> （ステップ1.2から）のGd-アプタマー原液の1μLおよびアッセイ緩​​衝液497μL（ステップ1.2から）QS原液の2μLに希釈します。ボルテックスを用いてよく混ぜます。 2XのGdセンサ液中の濃度は、それぞれ、200 nmおよび400 nMです。 注： -検量線造影剤溶液のためのGd 3+の7様々な濃度のこの工程で調製したGd 2×センサー溶液の体積は、6をテストするのに十分である500μL、あります（ステップ3）。各サンプルは、384ウェルプレートに二連のウェルを与えます。 <ol><li>テストする必要のGd 3+ソリューションの数に応じて2倍のGd-センサーソリューションの音量を調整します。 </li></ol></li><li>各チューブに50μLで、9 PCRチューブに2倍のGd-センサー・ソリューションを転送します。サーマルサイクラーにチューブを入れます。 </li><li> 95°Cまでのチューブ内の溶液を加熱するサーマルサイクラーにプログラムを設定し、5分間保持し、その後、ゆっくりの速度で（15分〜かけて25℃にソリューションを冷却〜0.05から0.1℃/秒）。加熱と冷却のサイクルは、GdのアプタマーとQS間の最適なハイブリダイゼーションを確実にすることです。不完全焼入れとセンサーの高いバックグラウンド蛍光の部分的なハイブリダイゼーションの結果。サーマルサイクラーを使用できない場合は、代わりに、湯浴を用いてこの処理を行います。 </li><li>一度25℃に冷却し、直ちに解決策を使用するか、またはこと準備ができるまで（約2時間まで）サーマルサイクラーに保ちます中古。水浴を加熱するために使用される場合、水がゆっくりと室温まで冷却するように、浴中でチューブを残します。 </li></ol> 3.蛍光検量線の構築及びGd造影剤の溶液に非キレート化のGd 3+の存在を検出します<ol><li>アッセイ緩衝液中の固体のGdCl 3（ステップ2.1と同じバッファ）を溶解します。 </li><li>連続希釈によって、検量線（2回ソリューション）の最終的な所望の濃度の二重で100μLマイクロ遠心チューブ内の6異なるのGd 3+の溶液のそれぞれを準備します。 <ol><li>たとえば、0の校正（NOのGdCl 3と緩衝液のみ）、50、100、200、400、及びGd 3+の800 nMのを構築0、100、200、400、800を含有する溶液を調製し、1,600 nmのイオンの。常にネガティブコントロールとして0 nMでのGd 3+との「空白」を必ず含めてください。 </li></ol></li><li>試験であることが造影剤を溶解アッセイ緩​​衝液中で編。連続希釈を介して造影剤溶液の2または3種の異なる濃度を準備します。 注：造影剤溶液の3種の異なる濃度のテストをお勧めします。これは、これらの濃度は線形の範囲内にあることを保証することです。試験した試料は直線関係が表示されない場合は、使用する造影剤の濃度を低下させます。 </li><li>サーマルサイクラーのうちステップ2.5から2倍のGd-センサー溶液を含むPCRチューブを取ります。 </li><li> 2倍のGd-センサー・ソリューションを含む9 PCRチューブの6にステップ3.2からそれぞれのGd 3+溶液50μLを追加します。ピペッティングにより混和します。各PCRチューブは今のGd 3+テストされる、100 nMのGdの-アプタマー、および200 nMのQSの所望の濃度が含まれています。 </li><li> 2倍のGd-センサー・ソリューションを含む残りのPCRチューブに、ステップ3.3からの造影剤溶液の50μLを追加します。ピペッティングにより、数回上下よく混ぜます。 </li><li>秒をインキュベート室温で約5分間のPCRチューブ内olutions。彼らは、最大30分間放置してもよいです。 </li><li> 384ウェルプレートに各チューブの45μLを転送します。各PCRチューブは、二連のウェルが得られます。 </li><li>プレートリーダーで各ウェルの蛍光を記録します。供給業者のウェブサイトに掲載されているとしてのGd-センサ設計で使用されるフルオロフォア（FAM）は、それぞれ495および520 nmでの励起および発光極大を有しています。プレートリーダーはmonochromator-またはフィルタベースであるかどうかに応じて、適切な励起波長および発光波長やフィルタを選択してください。 </li><li> Gd 3+の濃度に対する任意の蛍光単位（AFU）における蛍光のグラフをプロットします。 </li><li> Gd 3+の濃度に対する蛍光倍率変化としてグラフをプロットします。 （GD 3+の0 nMので）「ブランク」ソリューションのAFUにより各濃度のAFUを分割することにより、蛍光倍率変化を計算します。蛍光倍数変化は、nが可能になります結果のormalization、AFU表示いくつかの定期的な（異なる日、 等 ） が変動する必要があります。 </li><li> 0 nMでのGdCl 3（緩衝液のみ）を含む溶液で造影剤を含む溶液と、「ブランク」の蛍光発光を比較します。 注：GBCA溶液の高い蛍光は、造影剤の更なる精製を必要とすることができる非キレート化のGd 3+の存在を意味します。非キレート化のGd 3+の量は、工程3.10または3.11で作成した検量線を用いて推定することができます。 </li></ol>

<ol>
	<li>Shen, C., New, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promising+strategies+for+Gd-based+responsive+magnetic+resonance+imaging+contrast+agents.">Promising strategies for Gd-based responsive magnetic resonance imaging contrast agents.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 158-166 (2013).</li><li>Cheong, B. Y. C., Muthupillai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephrogenic+systemic+fibrosis:+a+concise+review+for+cardiologists.">Nephrogenic systemic fibrosis: a concise review for cardiologists.</a> Tex. Heart Inst. J. 37 (5), 508-515 (2010).</li><li>Hao, D., Ai, T., Goerner, F., Hu, X., Runge, V. 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Chem. 379 (7), 1050-1054 (2004).</li><li>Telgmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speciation+and+isotope+dilution+analysis+of+gadolinium-based+contrast+agents+in+wastewater.">Speciation and isotope dilution analysis of gadolinium-based contrast agents in wastewater.</a> Environ. Sci. Technol. 46 (21), 11929-11936 (2012).</li><li>Cleveland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic+methods+for+the+quantification+of+free+and+chelated+gadolinium+species+in+MRI+contrast+agent+formulations.">Chromatographic methods for the quantification of free and chelated gadolinium species in MRI contrast agent formulations.</a> Anal. Bioanal. Chem. 398 (7), 2987-2995 (2010).</li><li>Edogun, O., Nguyen, N. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+reporter-quencher+pairs+for+efficient+quenching+through+formation+of+intramolecular+dimers.">Choosing reporter-quencher pairs for efficient quenching through formation of intramolecular dimers.</a> Methods Mol. Biol. 335, 17-29 (2006).</li><li>Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+gadolinium+chemistry.">A primer on gadolinium chemistry.</a> J. Magn. Reson. Imaging. 30 (6), 1240-1248 (2009).</li><li>Shakhverdov, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cross-relaxation+mechanism+of+fluorescence+quenching+in+complexes+of+lanthanide+ions+with+organic+ligands.">A cross-relaxation mechanism of fluorescence quenching in complexes of lanthanide ions with organic ligands.</a> Opt. Spectrosc. 95 (4), 571-580 (2003).</li><li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submicrogram+determination+of+lanthanides+through+quenching+of+calcein+blue+fluorescence.">Submicrogram determination of lanthanides through quenching of calcein blue fluorescence.</a> Anal. Chem. 59 (8), 1122-1125 (1987).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

アプタマーベースのGd-センサを用いて、非キレート化のGd 3+の濃度に比例する蛍光発光の増加が観察されます。使用されるサンプルの量を最小にするために、アッセイは、ウェル当たり45μLの全試料体積で384ウェルマイクロプレートで実行されてもよいです。この設計では、フルオレセイン（FAM）およびダブシル（DAB）の選択は、主に、試薬のコストに基づいていました。発光波長、蛍光体の異なるペアを変更すると消光剤11を使用することができます。 重要なステップの一つは、GdのアプタマーとQS間の最適なハイブリダイゼーションを達成するために、アッセイ緩​​衝液中で95℃、徐冷（ステップ2.4）に加熱され、センサーで最良の結果を得るために、それを注意することが重要ですストランド。以前のプロトコルで述べたようにサーマルサイクラーを使用できない場合は、95℃でのインキュベーションは、水浴中で行ってもよいです。制御するためのもう一つの重要なパラメータはtです彼は、緩衝液の組成物。造影剤を溶解するために、ステップ2.1に記載されているアッセイ緩​​衝液の使用が推奨され、または脱イオン水を使用してもよいです。しかし、潜在的な干渉を含む溶液は避けるべきです。そのような緩衝剤の例としては、不溶性リン酸ガドリニウム12を形成するために非キレート化のGd 3+に配位することができ、リン酸アニオンを、含有するものです。沈殿物は、偽陰性の結果が得られ、センサーに反応しません。 実験のいくつかのステップは、結果に影響を与えずに修正することができます。まず、分析及び計算を単純化するために、2倍の濃度の検量線用のGdセンサ水溶液とのGdCl 3の両方を準備します。所望であれば、他の希釈係数は、Gdを、アプタマーの最終アッセイ濃度とQSは、それぞれ、100 nmおよび200 nmで維持されていれば、（例えば、10倍溶液）を使用してもよいです。第二に、アッセイバッファーDOES正確にpHが7.4である必要はありません。 7の間の任意の値 - 7.4であれば同一の緩衝液を、実験の全体にわたって使用されるように、所望の蛍光増加を生じます。蛍光発光の読み取りが得られると第三に、データ点は、任意の単位での生の蛍光（AFU）として、または蛍光倍数変化のいずれかをプロットすることができます。蛍光の倍率変化を計算するために、各濃度の未加工の蛍光読み取りは、陰性対照（0 nMでのGd 3+）の読み取り（分周）に正規化されます。 図2AおよびBに示すように、両方のグラフにおいて蛍光発光の傾向はほぼ同じです。倍数変化を、プレートリーダーは、異なる時間に記録された生の読みでいくつかのバリエーションが表示されている場合、データを分析するためのより便利な方法であり得ます。実験室は蛍光ではなく、プレートリーダーが装備されている場合、最終的に、各データポイントではなく、マイクロプレート、キュベットを用いて測定することができます。サイズOに応じて、利用可能なキュベットfは、アッセイで調製した溶液のボリュームを調整する必要があります。 本明細書で報告された方法は、chromatographic-する代替手段を提供し、および/または水性のGd 3+を検出するための分析に基づく技術。後者に比べて、Gdのセンサーアッセイは、複数種の同時検出のための感度、精度、および能力の点で、より制限されています。一方、分光ベースのセンサは、おそらくより容易に入手できる、より短い時間内に行ってもよいとすることができる機器を必要とし、試料調製は最小です。造影剤は、単にのGdセンサー溶液と混合し、緩衝液に溶解してもよいし、蛍光発光を直接測定します。さらに、センサは、キシレノールオレンジ指示薬（2つの方法の間の大きさの差の約2オーダー）より非キレート化のGd 3+の非常に低い濃度を検出することができるとありいくつかの他の生物学的に重要と遷移金属イオン9オーバーのGd 3+のためのより高い選択。 いくつかの実験条件の下でその使用が制限される可能性があり、このアッセイの2つの欠点があります。 1つの制限は、センサーが3+のGdに特異的ではないということです。それは、9（などのEu 3+とTbの3+などの ）他のランタニドイオンに対する応答が表示されます。しかし、これらは、一般に造影剤または生物学的システムに見出されるイオンはなく、従って、それらの干渉は最小です。注意すべき第二の点はのGd 3+、Gdのセンサー蛍光発光の漸減の（〜10μM以上の）高濃度で観察されることです。ランタニドイオンによる消光の効果も検出し、それらに14を定量化するための技術として使用されてきた十分に立証された現象で13です。これは、Gdの高濃度を測定するためのセンサの有用性を制限しながら、3+ </s&gt;まで、この設計の目的は、造影剤の高純度を保証するために、溶液中の遊離イオンの少量を検出することです。 この研究では、水溶液中で毒性非キレート化のGd 3+を検出するための便利な蛍光ベースの技術の使用が記載されています。このアッセイは、特にin vitro実験のための合成および製剤中に、ガドリニウムベースの造影剤純度の初期段階の評価のために意図されています。診断、磁気共鳴イメージングの現在の成長と、新規の造影剤の増加は、継続的に設計され、試験されています。アプタマーベースのGdセンサは、急速に、未反応のまたは周囲のpHの水溶液中でのGd 3+を解離のサブマイクロモル濃度の存在を検出するための手段を提供することによって、この開発を促進します。センサーは、他の三価のランタニドイオンとの交差反応性を表示するため、また、そのアプリケーションであってもよいです研究のこれらの領域に拡張。

技術固有の感度によって制限され、臨床診断、磁気共鳴イメージング（MRI）の重要性の高まりは、新規ガドリニウムベースの造影剤（GBCAs）1の開発の研究の急速な成長をもたらしました。 GBCAsは、画像品質を改善するために投与される分子であり、それらは、典型的には、多座配位子に配位価のガドリニウムイオン（Gdの3+）の化学構造を有します。非キレートのGd 3+は有毒であるように、この複合体形成は極めて重要です。それは、腎疾患または障害2と一部の患者における腎性全身性線維症の発症に関与しています。その結果、水性の遊離イオンを検出することがGBCAsの安全性を確保することに尽力しています。 GBCAソリューションの非キレート化のGd 3+の存在は、多くの場合、リガンドとイオン、複合体の解離、またはdisplacemen間の不完全な反応の結果であります他の生物学的金属カチオン3によってトン。 現在のGd 3+、汎用性および適用4の観点で最も高いクロマトグラフィーおよび/または分析のランクに依存するそれらの存在を決定するために使用されるいくつかの技術のうち。それらの長所の中でも、高感度および精度、（リストを、複数のGd 3+複合体の同時定量（ヒト血清5、尿及び毛髪6、廃水7、及び造影剤配合物8を含む） は 、種々のサンプルマトリックスを分析する能力であります研究の2013年前にはTelgmann ら ）4により包括的なレビューに記載されています。唯一の欠点は、これらの方法のいくつかは、いくつかの研究室がアクセス権を持っていないかもしれません（そのような誘導結合プラズマ質量分析など）計測器4を必要とすることです。研究や概念実証レベルでの新たなGBCA発見の文脈の中で、ARelativelyより、便利で迅速、かつ費用対効果の高い分光ベースの方法は、（例えば、UV-可視吸収または蛍光のような）価値のある代替物として機能することができます。心の中でこれらのアプリケーションでは、水のGd 3+のための蛍光アプタマーベースのセンサは9を開発しました。 アプタマー（GD-アプタマー）が指数関数的濃縮（SELEX）9によるリガンドの系統的進化の過程を経て単離した塩基の特定の配列を有する44塩基長の一本鎖DNA分子です。蛍光センサーにアプタマーを適応させるために、フルオロフォアは、その後13相補的塩基（ 図1）を介して急冷ストランド（QS）とハイブリダイズされた鎖の5 &#39;末端に結合しています。 QSは、3 &#39;末端ダーククエンチャー分子でタグ付けされています。 Gd 3+の非存在下では、1からなるセンサ（GD-センサー）：それぞれのGd-アプタマーとQSの2モル比は、最小の蛍光発光によるTを有していますクエンチャーへのフルオロフォアからOエネルギー移動。水性のGd 3+を添加すると、蛍光発光の増加をもたらす、のGd-アプタマーからQSを置換します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55216/55216fig1.jpg" /> フルオレセイン（蛍光団）とダブシルでタグ付けされた13塩基長の消光ストランド（QS）でタグ付けされた44塩基長のアプタマー（GD-アプタマー）（ダーククエンチャー）で構成され 、図1 のセンサ（GD-センサー） 。非キレート化のGd 3+の非存在下では、センサの蛍光は最小です。 Gd 3+を添加し、QSの変位が発生し、蛍光発光の増加が観察されます。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55216/55216fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 検出のための1つの一般的に使用される分光ベースの方法は、現在ではあり水性のGd 3+をる。このアッセイは、イオン10にキレート化時に433から573 nmの最大吸収波長のシフトを起こす分子キシレノールオレンジを使用しています。これら二つの吸光度最大値の比率は、非キレート化のGd 3+の量を定量するために使用することができます。 2つの方法は、標的選択性、定量の線形範囲は、検出様式（例えば、pH及び使用する緩衝液の組成など）は、異なる反応条件を有するようにアプタマーセンサーは、キシレノールオレンジアッセイに代わるもの（これも相補的であってもよい）であります9。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2018">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Gd-aptamer</td>
			<td style="width:187px;">IDTDNA</td>
			<td style="width:439px;">Input sequence and fluorophore modification in the order form</td>
			<td style="width:943px;">A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quenching strand</td>
			<td>IDTDNA</td>
			<td>Input sequence and quencher modification in the order form</td>
			<td>A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molecular biology grade water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gadolinium(III) chloride anhydrous</td>
			<td>Strem</td>
			<td>936416</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride anhydrous</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>0520984480 - 100 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327300025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P333-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide, pellets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP359</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA49</td>
			<td>Toxic and corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3575</td>
			<td>Plates which are suitable for fluorescence reading are required.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>5680020</td>
			<td>The bottle top is fitted with&#160; 0.2 micron PES membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable sterile bottles 250 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430281</td>
			<td>A larger or smaller bottle may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 mL PCR tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No specific manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipet tips (non filter) of appropriate sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name of Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate reader</td>
			<td>Biotek Synergy H1</td>
			<td></td>
			<td>Plate readers from other manufacturers would work equally well</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an aptamer-based sensor for unchelated gadolinium(iii)

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd3+) in aqueous solution is demonstrated. Gd3+ is often present in samples of gadolinium-based contrast agents as a result of incomplete reactions between the ligand and the ion, or as a dissociation product. Since the ion is toxic, its detection is of critical importance. Herein, the design and usage of an aptamer-based sensor (Gd-sensor) for Gd3+ are described. The sensor produces a fluorescence change in response to increasing concentrations of the ion, and has a limit of detection in the nanomolar range (~100 nM with a signal-to-noise ratio of 3). The assay may be run in an aqueous buffer at ambient pH (~7 - 7.4) in a 384-well microplate. The sensor is relatively unreactive toward other physiologically relevant metal ions such as sodium, potassium, and calcium ions, although it is not specific for Gd3+ over other trivalent lanthanides such as europium(III) and terbium(III). Nevertheless, the lanthanides are not commonly found in contrast agents or the biological systems, and the sensor may therefore be used to selectively determine unchelated Gd3+ in aqueous conditions.

非キレート化のGd 3+の存在下でのGdセンサ液の典型的な蛍光変化を、 図2に示されています。発光は、任意の単位（AFU）における蛍光倍数変化（ 図2A）又は読み出しの生の蛍光（ 図2B）としてプロットすることができます。両方のプロットは、1μMおよび&gt; 3μMでの信号の飽和以下のGd 3+の濃度について線形範囲で非常に類似した検量線が得られます。検出限界は、3つの信号対雑音比を有する〜100nmです。 関心のGBCAを含有する溶液において、非キレート化のGd 3+の存在は、「ブランク」溶液と比較して、センサの蛍光増加に変換されます。 Gd-DOTA複合体の2つの異なるバッチ、他よりも高い純度の1の溶液中の蛍光変化は、ショーです代表的な結果（ 図3）の例としては、N。 GD-DOTA（ガドテル酸）のGdガドリニウム錯体3+商業造影剤に見られる有機リガンドDOTAで囲まれています。より高純度のバッチのGd-DOTAの20 mmの放出までの有意な増加を表示しません。非キレート化のGd 3+が存在する場合、さらには5 mMの以下のGd-DOTA濃度で顕著に変化が観察されます。データ点は、センサの蛍光の倍率変化としてプロットされているこの例では、非キレート化のGd 3+の量の定量化は、 図2Aの較正曲線を用いて推定することができます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55216/55216fig2.jpg" /> 図2 の代表のGdセンサ蛍光較正曲線プロット。すべてのデータポイントは重複し、少なくとも行い、平均値をプロット値エラーバーとして標準偏差テッド。 （A）校正曲線は100nmでのGd-アプタマー200 nMのQSを用いて得られました。グラフはy軸として蛍光倍数変化でプロットされています。 （B）y軸として任意の単位（AFU）で生の蛍光を有する（A）と同一の検量線。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55216/55216fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55216/55216fig3.jpg" /> 図3. 代表のGd-センサーの蛍光変化 のGd-DOTA分子のサンプル中の 非キレート化のGd 3+ の存在をテストします 。 Gd-DOTA複雑なソリューションの二つの異なるバッチがこのプロットに示されているが、より高純度（円マーカー）およびその他を含む非キレート化のGd 3+の1（青trianglEマーカー）。各データ点は、エラーバーとしての標準偏差を有する2つの測定値の平均です。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55216/55216fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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An Aptamer-based Sensor for Unchelated GadoliniumIII

The use of polydeoxynucleotide (44-mer aptamer) molecules for sensing unchelated gadolinium(III) ion in an aqueous solution is described. The presence of the ion is detected via an increase in the fluorescence emission of the sensor.

非キレート化ガドリニウム（III）のためのアプタマーベースのセンサー

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd3+) in aqueous solution is demonstrated. Gd3+ is often present in samples ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

An Aptamer-based Sensor for Unchelated Gadolinium(III)

7.2K ビュー.  California State University, East Bay. The use of polydeoxynucleotide (44-mer aptamer) molecules for sensing unchelated gadolinium(III) ion in an aqueous solution is described. The presence of the ion is detected via an increase in the fluorescence emission of the sensor. 

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Polymalic Acid-based Nano Biopolymers for Targeting of Multiple Tumor Markers: An Opportunity for Personalized Medicine?

Tumors with similar grade and morphology often respond differently to the same treatment because of variations in molecular profiling. To account for this diversity, personalized medicine is developed for silencing malignancy associated genes. Nano drugs fit these needs by targeting tumor and delivering antisense oligonucleotides for silencing of genes. As drugs for the treatment are often administered repeatedly, absence of toxicity and negligible immune response are desirable. In the example presented here, a nano medicine is synthesized from the biodegradable, non-toxic and non-immunogenic platform polymalic acid by controlled chemical ligation of antisense oligonucleotides and tumor targeting molecules. The synthesis and treatment is exemplified for human Her2-positive breast cancer using an experimental mouse model. The case can be translated towards synthesis and treatment of other tumors.

An example of a nano drug based on polymalic acid is presented towards the rational design of personalized medicine that is applicable to cancer. It describes the synthesis of a nano drug to treat Her2-positive human breast cancer in a nude mouse.

複数の腫瘍マーカーのターゲットとするためのポリリンゴ酸ベースのナノバイオポリマー：個別化医療の機会？

Tumors with similar grade and morphology often respond differently to the same treatment because of variations in molecular profiling. To account for this ...

化学

An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and reliable point-by-point protocols of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the investigation of ligand-receptor interactions: the direct ligand-receptor interaction assay (LRA) and the competition LRA. As a case study, the ELISA based analysis of the interaction between different lambda interferons (IFNLs) and the alpha subunit of their receptor (IL28RA) is presented: the direct LRA is used for the determination of dissociation constants (KD values) between receptor and IFN ligands, and the competition LRA for the determination of the inhibitory capacity of an oligopeptide, which was designed to compete with the IFNLs at their receptor binding site. Analytical steps to estimate KD and half maximal inhibitory concentration (IC50) values are described. Finally, the discussion highlights advantages and disadvantages of the presented method and how the results enable a better molecular understanding of ligand-receptor interactions.

The presented protocols describe two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based techniques for the rapid investigation of ligand-receptor interactions: The first assay allows the determination of dissociation constant between ligand and receptor. The second assay enables a rapid screening of blocking peptides for ligand-receptor interactions.

ELISAベースの結合と競争法は急速にリガンド - 受容体相互作用を決定するために、

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and ...

Anionic Polymerization of an Amphiphilic Copolymer for Preparation of Block Copolymer Micelles Stabilized by &#960;-&#960; Stacking Interactions

In this study, an amphiphilic copolymer that includes a core-forming block with phenyl groups was synthesized by living anionic polymerization of phenyl glycidyl ether (PheGE) on methoxy-polyethylene glycol (mPEG-b-PPheGE). Characterization of the copolymer revealed a narrow molecular distribution (PDI &#60; 1.03) and confirmed the degree of polymerization of mPEG122-b-(PheGE)15. The critical micelle concentration of the copolymer was evaluated using an established fluorescence method with the aggregation behavior evaluated by dynamic light scattering and transmission electronic microscopy. The potential of the copolymer for use in drug delivery applications was evaluated in a preliminary manner including in vitro biocompatibility, loading and release of the hydrophobic anti-cancer drug doxorubicin (DOX). A stable micelle formulation of DOX was prepared with drug loading levels up to 14% (wt%), drug loading efficiencies &#62; 60% (w/w) and sustained release of drug over 4 days under physiologically relevant conditions (acidic and neutral pH, presence of albumin). The high drug loading level and sustained release is attributed to stabilizing &#960;-&#960; interactions between DOX and the core-forming block of the micelles.

The key steps of living anionic polymerization of phenyl glycidyl ether (PheGE) on methoxy-polyethylene glycol (mPEG-b-PPheGE) are described. The resulting block copolymer micelles (BCMs) were loaded with doxorubicin 14% (wt%) and sustained release of drug over 4 days under physiologically relevant conditions was obtained.

π-πスタッキング相互作用によって安定化されたブロック共重合体ミセルの調製のための両親媒性共重合体のアニオン重合

In this study, an amphiphilic copolymer that includes a core-forming block with phenyl groups was synthesized by living anionic polymerization of phenyl ...

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient radiolabeling of DBCO-group-functionalized gold nanoparticles using a copper-free click reaction. Radioiodination of the stannylated precursor (2) was carried out by using [125I]NaI and chloramine T as an oxidant at room temperature for 15 min. After HPLC purification of the crude product, the purified 125I-labeled azide (1) was obtained with high radiochemical yield (75 &plusmn; 10%, n = 8) and excellent radiochemical purity (&gt;99%). For the synthesis of radiolabeled 13-nm-sized gold nanoparticles, the DBCO-functionalized gold nanoparticles (3) were prepared by using a thiolated polyethylene glycol polymer. A copper-free click reaction between 1 and 3 gave the 125I-labeled gold nanoparticles (4) with more than 95% of radiochemical yield as determined by radio-thin-layer chromatography (radio-TLC). These results clearly indicate that the present radiolabeling method using a strain-promoted copper-free click reaction will be useful for the efficient and convenient radiolabeling of DBCO-group-containing nanomaterials.

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

A detailed procedure for the synthesis of a 125I-labeled azide and the radiolabeling of dibenzocyclooctyne (DBCO)-group-conjugated, 13-nm-sized gold nanoparticles using a copper-free click reaction is described.

使用した金ナノ粒子の効率的な放射性標識のために最適化されたプロトコル<sup&gt; 125</sup&gt; I標識アジド補綴グループ

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient ...

Time-resolved Photophysical Characterization of Triplet-harvesting Organic Compounds at an Oxygen-free Environment Using an iCCD Camera

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables the acquisition of photoluminescence spectra covering the time regime from nanoseconds up to 0.1 s. This enables us to follow the changes in the intensity (decay) and emission of the spectra over time. Using this method, it is possible to study diverse photophysical phenomena, such as the emission of phosphorescence, and the contributions of prompt and delayed fluorescence in molecules showing thermally activated delayed fluorescence (TADF). Remarkably, all spectra and decays are obtained in a single experiment. This can be done for solids (thin film, powder, crystal) and liquid samples, where the only limitations are the spectral sensitivity of the camera and the excitation wavelength (532 nm, 355 nm, 337 nm, and 266 nm). This technique is, thus, very important when investigating the excited state dynamics in organic emitters for their application in organic light-emitting diodes and other areas where triplet harvesting is of paramount importance. Since triplet states are strongly quenched by oxygen, emitters with efficient TADF luminescence, or those showing room temperature phosphorescence (RTP), must be correctly prepared in order to remove any dissolved oxygen from solutions and films. Otherwise, no long-lived emission will be observed. The method of degassing solid samples as presented in this work is basic and simple, but the degassing of liquid samples creates additional difficulties and is particularly interesting. A method of minimizing solvent loss and changing the sample concentration, while still enabling to remove oxygen in a very efficient and a repeatable manner, is presented in this work.

Here, we present a method of the spectroscopic characterization of organic molecules by means of time-resolved photoluminescence spectroscopy on the nanosecond-to-millisecond timescale in oxygen-free conditions. Methods to efficiently remove oxygen from the samples and, thus, limit luminescence quenching are also described.

時間分解光物性評価のトリプレット収穫有機化合物無酸素環境使用、iCCD カメラ

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables ...

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control cellular functions. The reversal of DNA methylation, or DNA demethylation, is mediated by the ten-eleven translocation (TET) protein family of dioxygenases. Although it has been widely reported that aberrant DNA methylation and demethylation are associated with developmental defects and cancer, how these epigenetic changes directly contribute to the subsequent alteration in gene expression or disease progression remains unclear, largely owing to the lack of reliable tools to accurately add or remove DNA modifications in the genome at defined temporal and spatial resolution. To overcome this hurdle, we designed a split-TET2 enzyme to enable temporal control of 5-methylcytosine (5mC) oxidation and subsequent remodeling of epigenetic states in mammalian cells by simply adding chemicals. Here, we describe methods for introducing a chemical-inducible epigenome remodeling tool (CiDER), based on an engineered split-TET2 enzyme, into mammalian cells and quantifying the chemical inducible production of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) with immunostaining, flow cytometry or a dot-blot assay. This chemical-inducible epigenome remodeling tool will find broad use in interrogating cellular systems without altering the genetic code, as well as in probing the epigenotype&#8722;phenotype relations in various biological systems.

Detailed protocols for introducing an engineered split-TET2 enzyme (CiDER) into mammalian cells for chemical inducible DNA hydroxymethylation and epigenetic remodeling are presented.

化学誘導型 DNA Hydroxymethylation およびエピジェネティックな改造のために設計された分割型 TET2 酵素

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...

An Experimental Protocol for Femtosecond NIR/UV - XUV Pump-Probe Experiments with Free-Electron Lasers

This protocol describes key steps in performing and analyzing femtosecond pump-probe experiments that combine a femtosecond optical laser with a free-electron laser. This includes methods to establish the spatial and temporal overlap between the optical and free-electron laser pulses during the experiment, as well as important aspects of the data analysis, such as corrections for arrival time jitter, which are necessary to obtain high-quality pump-probe data sets with the best possible temporal resolution. These methods are demonstrated for an exemplary experiment performed at the FLASH (Free-electron LASer Hamburg) free-electron laser in order to study ultrafast photochemistry in gas-phase molecules by means of velocity map ion imaging. However, most of the strategies are also applicable to similar pump-probe experiments using other targets or other experimental techniques.

This protocol describes the key steps for performing and analyzing pump-probe experiments combining a femtosecond optical laser with a free-electron laser in order to study ultrafast photochemical reactions in gas-phase molecules.

実験的プロトコル フェムト秒近赤外/紫外-自由電子レーザーによる XUV ポンプ ・ プローブ実験

This protocol describes key steps in performing and analyzing femtosecond pump-probe experiments that combine a femtosecond optical laser with a ...

Synthesis of Substrate-Bound Au Nanowires Via an Active Surface Growth Mechanism

Advancing synthetic capabilities is important for the development of nanoscience and nanotechnology. The synthesis of nanowires has always been a challenge, as it requires asymmetric growth of symmetric crystals. Here, we report a distinctive synthesis of substrate-bound Au nanowires. This template-free synthesis employs thiolated ligands and substrate adsorption to achieve the continuous asymmetric deposition of Au in solution at ambient conditions. The thiolated ligand prevented the Au deposition on the exposed surface of the seeds, so the Au deposition only occurs at the interface between the Au seeds and the substrate. The side of the newly deposited Au nanowires is immediately covered with the thiolated ligand, while the bottom facing the substrate remains ligand-free and active for the next round of Au deposition. We further demonstrate that this Au nanowire growth can be induced on various substrates, and different thiolated ligands can be used to regulate the surface chemistry of the nanowires. The diameter of the nanowires can also be controlled with mixed ligands, in which another &#34;bad&#34; ligand could turn on the lateral growth. With the understanding of the mechanism, Au nanowire-based nanostructures can be designed and synthesized.

We report a solution-based method to synthesize substrate-bound Au nanowires. By tuning the molecular ligands used during the synthesis, the Au nanowires can be grown from various substrates with different surface properties. Au nanowire-based nanostructures can also be synthesized by adjusting the reaction parameters.

アクティブな表面の成長メカニズムを介して基質結合 Au ナノワイヤの作製

Advancing synthetic capabilities is important for the development of nanoscience and nanotechnology. The synthesis of nanowires has always been a ...

Key Factors Affecting the Performance of Sb2S3-sensitized Solar Cells During an Sb2S3 Deposition via SbCl3-thiourea Complex Solution-processing

Sb2S3 is considered as one of the emerging light absorbers that can be applied to next-generation solar cells because of its unique optical and electrical properties. Recently, we demonstrated its potential as next-generation solar cells by achieving a high photovoltaic efficiency of &#62; 6% in Sb2S3-sensitized solar cells using a simple thiourea (TU)-based complex solution method. Here, we describe the key experimental procedures for the deposition of Sb2S3 on a mesoporous TiO2 (mp-TiO2) layer using a SbCl3-TU complex solution in the fabrication of solar cells. First, the SbCl3-TU solution is synthesized by dissolving SbCl3 and TU in N,N-dimethylformamide at different molar ratios of SbCl3:TU. Then, the solution is deposited on as-prepared substrates consisting of mp-TiO2/TiO2-blocking layer/F-doped SnO2 glass by spin coating. Finally, to form crystalline Sb2S3, the samples are annealed in an N2-filled glove box at 300 &#176;C. The effects of the experimental parameters on the photovoltaic device performance are also discussed.

Key Factors Affecting the Performance of Sb2S3-sensitized Solar Cells During an Sb2S3 Deposition via SbCl3-thiourea Complex Solution-processing

This work provides a detailed experimental procedure for the deposition of Sb2S3 on a mesoporous TiO2 layer using a SbCl3-thiourea complex solution for applications in Sb2S3-sensitized solar cells. This article also determines key factors governing the deposition process.

主要な Sb2S3の性能に影響を与える要因-太陽電池を増感の間に、Sb2S3成膜を介してSbCl3-チオ尿素複合ソリューション処理

Sb2S3 is considered as one of the emerging light absorbers that can be applied to next-generation solar cells because of its unique optical and electrical ...

An Electrochemical Cholesteric Liquid Crystalline Device for Quick and Low-Voltage Color Modulation

We demonstrate a method for fabricating a prototype reflective display device that contains cholesteric liquid crystal (LC) as an active component. The cholesteric LC is composed of a nematic LC 4&#39;-pentyloxy-4-cyanobiphenyl (5OCB), redox-responsive chiral dopant (FcD), and a supporting electrolyte 1-ethyl-3-methylimidazolium trifluoromethanesulfonate (EMIm-OTf). The most important component is FcD. This molecule changes its helical twisting power (HTP) value in response to redox reactions. Therefore, in situ electrochemical redox reactions in the LC mixture allow for the device to change its reflection color in response to electrical stimuli. The LC mixture was introduced, by a capillary action, into a sandwich-type ITO glass cell comprising two glass slides with patterned indium tin oxide (ITO) electrodes, one of which was coated with poly(3,4-ethylenedioxythiophene)-co-poly(ethylene glycol) doped with perchlorate (PEDOT+). Upon application of +1.5 V, the reflection color of the device changed from blue (467 nm) to green (485 nm) in 0.4 s. Subsequent application of 0 V made the device recover the original blue color in 2.7 s. This device is characterized by its fastest electrical response and lowest operating voltage among any previously reported cholesteric LC device. This device could pave the way for the development of next generation reflective displays with low energy consumption rates.

A protocol for the fabrication of a reflective cholesteric liquid crystalline display device containing a redox-responsive chiral dopant allowing quick and low-voltage operation is presented.

迅速かつ低電圧の色変調のため電気化学コレステリック液晶結晶デバイス

We demonstrate a method for fabricating a prototype reflective display device that contains cholesteric liquid crystal (LC) as an active component. The ...