Estamos gratos pelo apoio financeiro da Fundação Nacional de ciências naturais (21675112), projeto chave do plano de ciência e tecnologia da Comissão de educação de Beijing (KZ201710028027) e programa Yanjing jovem estudioso da Capital Normal University.

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Os autores não declaram nenhum interesse financeiro concorrente.

Um excelente benefício de aptamers é que são identificados por meio do método em vitro SELEX, enquanto os anticorpos são gerados através de immunoreactions na vivo . Portanto, aptamers pode ser selecionado com a especificidade do alvo desejado sob condições experimentais bem projetadas, Considerando que os anticorpos estão limitados às condições fisiológicas.
Para facilitar a separação de sequências de limite de sequências gratuito, vários SELEX modificados recentemente foram relatados, no qual eletroforese capilar30, microfluídica31, grânulos magnéticos / acrílicos / agarose beads14, etc., substituíram os filtros de nitrocelulose ou colunas de afinidade para conseguir uma separação mais eficiente. Entre essas técnicas, os métodos baseados em grânulo foram mais amplamente utilizados para a seleção de aptamer de alvos de pequenas moléculas devido a sua simples instalação, fácil operação e sendo passível de análises de pequenas moléculas.
Existem dois grupos de métodos que são comumente usados para a seleção de aptamer de alvos de pequena molécula: os alvo13 e biblioteca14 imobilização métodos baseados. No antigo grupo de métodos, os alvos de pequenas moléculas são imobilizados na fase sólida como grânulos magnéticos funcionalizados ou grânulos de agarose via reações de acoplamento covalente. Bibliotecas são incubadas com grânulos revestidos pequeno-molécula, e as sequências que não vincular ou associar-se fracamente ao alvo na fase sólida são removidas simplesmente através da realização de lavagem e centrifugação ou etapas de separação magnética. As sequências de limite são posteriormente eluídas e amplificadas por PCR. Os alvos de pequena molécula devem ter pelo menos um grupo funcional disponível para a reação de acoplamento. Para aqueles sem adequado de grupos funcionais, o grupo funcional tem que ser incorporada o alvo original através da síntese orgânica. A síntese do alvo cuidadosamente concebido pode envolver várias etapas e às vezes é bastante desafiador também. A modificação estrutural dos alvos fortemente também pode afetar os locais obrigatórios e afinidade com seus aptamers. Para evitar estes problemas, biblioteca baseada em imobilização métodos têm sido desenvolvidos, onde a biblioteca é hibridizada a complementar sondas de captura de DNA em grânulos magnéticos, e as sequências de ligação caiam os grânulos em ligação com os alvos. Neste grupo de métodos, os alvos são adicionados no buffer de vinculação e não grupos funcionais são necessários. PAEs são os derivados de ésteres de ftalato ácido, e um PAE típico consiste de um grupo de ácido éster ftalato e uma ou duas cadeias de alquil (figura 1A-D). PAEs não tem nenhum grupos funcionais disponíveis para a imobilização de fase sólida. Assim, os métodos de imobilização-baseado biblioteca parecem mais atraentes para a seleção de aptamer de PAEs.
Um status de dispersão bem controlados é fundamental para garantir o desejado enriquecimento da biblioteca através de SELEX. No entanto, PAEs são extremamente hidrofóbicos e facilmente formam agregados em soluções aquosas numa concentração superior a vários µM, mesmo na presença de surfactantes múltiplos para facilitar a dispersão. Assim, o status de dispersão de PAEs é difícil de controlar, e seria difícil selecionar aptamers que se ligam especificamente a moléculas individuais do PAE. Para resolver o problema da solubilidade, métodos de imobilização-alvo foram escolhidos, na quais PAEs foram imobilizados sobre os grânulos hidrofílicos através de covalente. Usando essa estratégia de imobilização, os alvos devem ser predominantemente presentes na superfície do grânulo num único Estado molecular, ao invés de agregados.
O projeto estrutural do destino âncora também é bastante crítico para a seleção bem sucedida de específicas do grupo aptamers. Três fatores precisam ser considerados para o projeto estrutural. O primeiro fator é o propósito da seleção aptamer. Considerando a finalidade de selecionar aptamers específicas do grupo, é essencial para expor o grupo comum de PAEs para ligação de aptamer e evitar o resto das peças que participam na ligação aptamer. Assim, o grupo funcional deve ser introduzido no terminal da cadeia lateral. No início, projetamos OH-acrescida de DEHP (4-OH−DEHP) (Figura 1E) como o destino de âncora e imobilizado-lo em ácido carboxílico grânulos magnético16. Assim, as cadeias alquila foram expostas na superfície da matriz. Nós tentamos escolher grânulos magnéticos com grupos carboxila como a matriz sólida. Nenhuma melhoria óbvia afinidade foi observada após cinco rodadas de seleção, e a absorção inespecífica na matriz da desencapado manteve-se forte.
Portanto, DBP-NH2 mais tarde foi projetada com base nos seguintes pensamentos: (1) o grupo phthalate é mais provável que interagem especificamente com o aptamer através da pilha de π-π e a ligação de hidrogênio do que a cadeia; (2) NHS mediada carbodiimida reação é suave e tem uma eficiência de acoplamento muito eficiente, assim -NH2 é introduzida no final de uma cadeia de DBP; (3) é fácil de operar com os grânulos magnéticos como uma partição de fase sólida, mas a adsorção não específica da biblioteca é forte. Embora a perda dos grânulos do agarose durante a separação é maior do que os grânulos magnéticos, a adsorção não específica da biblioteca é muito menor. Assim, DBP-NH2 foi imobilizada nos grânulos de agarose epóxi-ativado, e o grupo acidester anidridos ftálico foi exposto na superfície da matriz.
A escolha do buffer de seleção é importante, especialmente para alvos de pequenas moléculas com solubilidade diversa. O buffer de ligação deve ser cuidadosamente preparado para evitar a agregação e garantir um estado de boa dispersão de POPs durante o processo de seleção e caracterização de aptamer toda. Em nosso estudo, encontramos que o DEHP não pode dissolver em buffers normais sem surfactantes, mostrando duas camadas distintas. A camada desaparece após a adição de surfactantes múltiplas na quantidade otimizada. As soluções claras precisam ser armazenadas em temperaturas superiores a 20 ° C, para manter seu status. Detalhes são fornecidos na etapa de protocolo 3.1.
Geração de single-stranded DNA de dupla-hélice produtos PCR é um passo crítico no processo de SELEX. Vários métodos diferentes, atualmente, têm sido descritos na literatura32,33, incluindo PCR assimétrico, digestão do exonuclease λ, separação magnética com grânulos streptavidin-revestido e separação de tamanho por desnaturação gel de poliacrilamida-ureia.
Diferentes métodos têm seus próprios pontos fortes e fracos. Atualmente, o método mais comumente usado para a geração de ssDNA é separação magnética com grânulos streptavidin-revestido. A excepcional vantagem deste método é sua economia de tempo e de simples operação. A desvantagem é seu alto custo em comparação com outros métodos. Em contraste, o método baseado em separação tamanho, usando as primeiras demão reversos com estrutura de tronco – loop rico em GC, é um dos métodos mais baratos, enquanto o rendimento do ADN é o mais baixo entre estes métodos32. Neste protocolo, descrevemos a utilização da digestão do exonuclease λ para gerar single-stranded DNA, que é um dos métodos mais baratos. Nós achamos que o rendimento do ADN single-stranded é comparável com os dois métodos de separação magnética e grânulos streptavidin-revestido. Além disso, descobrimos que a reação do exonuclease foi inibida pela alta concentração de sal. A digestão incompleta do produto do PCR relatada na literatura33 foi provavelmente devido a demasiada sal existentes no produto da PCR. Além disso, a exonuclease λ é altamente ativo e barato (Figura 4).
A caracterização e validação de aptamers é trabalhoso, demorado e incorpora um grande gargalo no aptamer descoberta gasoduto33. A maioria das técnicas são sensíveis à massa métodos que funcionam bem para os maiores parceiros de ligação aptamer (> 10.000 amu), mas não são suficientemente sensíveis para medir as interações com alvos de baixo peso molecular (< 1.000 amu)15. A caracterização e validação de aptamers de moléculas pequenas hidrofóbicas como PAEs é ainda mais difícil. Sua solubilidade em água pobre resulta na insaturação da curva de titulação, o que impede o Kda determinação em solução ou imobiliza aptamers na superfície. Portanto, determinamos o Kds do aptamers identificadas por sequenciamento de alta taxa de transferência por DBP-NH2 sobre os grânulos magnéticos hidrofílicos para evitar o problema da solubilidade de imobilização. O relativas afinidades e seletividade da aptamers a outros PAEs foram então determinada por ensaios competitivos, onde os candidatos aptamer foram previamente delimitados ao DBP-NH2 anexado grânulos magnéticos e lançado para o sobrenadante após incubação com os PAEs testados ou outras substâncias potencialmente interferentes. O ensaio do competidor foi aplicado porque permitia uma comparação facile afinidade entre PAEs que não tinha nenhum grupos funcionais para a imobilização de superfície. Além disso, ensaios fluorescentes do grânulo-based magnéticos são adequados para o estudo de afinidade da pequena molécula-aptamer interações34. No entanto, achamos que os grânulos magnéticos às vezes causam fluorescência têmpera por razões desconhecidas. Assim, os ensaios de qPCR foram usados para as medições de afinidade.
Uma dica técnica crítica para o biosensor eletroquímico descrito neste estudo é a superfície passivação do eletrodo35. Devido a alta hidrofobicidade de DEHP, tem uma forte tendência para ser nonspecifically absorvida para o eletrodo de ouro, levando ao fracasso da detecção. Mais comumente usado de agente de superfície do passivation, 6-mercapto-1-hexanol (MCH)36,37, não é suficiente para prevenir a absorção inespecífica de DEHP, enquanto encontramos aquele HS-(CH2)2-[OCH2CH2 ]6- OCH3 foi eficaz o suficiente para permitir a detecção sensível de DEHP38.
Este procedimento descreve um protocolo para a seleção de aptamers de DNA específicas do grupo de moléculas pequenas altamente hidrofóbicas e uma aplicação da aptamer selecionado em um biossensor electroquímico. O protocolo de ajuda com a seleção de outras pequenas moléculas hidrofóbicas e fornece insights sobre desenvolvimento de sensor de altamente hidrofóbicas moléculas pequenas também. O processo de seleção de aptamer pertence à categoria de métodos baseados em imobilização do alvo. As limitações deste tipo de método também existem para este protocolo, por exemplo, a necessidade de síntese complicada de alvos de âncora e os impactos da fase sólida na ligação aptamer. As vantagens atraentes os biossensores eletroquímicos descritos neste protocolo incluem seu design simples e alta sensibilidade. A principal desvantagem é sua precisão limitada devido ao seu extremamente ampla faixa dinâmica. Portanto, os biosensores descritos aqui são mais adequados para testes, em vez de medidas quantitativas das metas de seleção.

Juntamente com o rápido desenvolvimento econômico, a aceleração da industrialização e a construção urbana, poluição ambiental é mais grave do que nunca. Poluentes ambientais típicos incluem íons de metais pesados, toxinas, antibióticos, pesticidas, Disruptores endócrinos e poluentes orgânicos persistentes (POPs). Íons metálicos e toxinas, além de outros poluentes são pequenas moléculas que muito frequentemente consistem em uma variedade de congêneres. Por exemplo, os POPs mais tóxicos incluem bifenilos policlorados (PCBs), hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAP), éteres de bifenil polibromados (PBDEs), polychlorinated dibenzo-p-dioxina (PCDD), Dibenzofurano policlorados (PCDF) e anidridos ftálico ésteres do ácido (PAEs)1,2, compostas de muitos congéneres. Principalmente a detecção de pequena molécula tem sido executada por técnicas baseadas em espectrometria de cromatografia de massa devido a sua diversidade de aplicações3,4,5,6. Para a detecção no local, métodos baseados em anticorpos foram recentemente desenvolvidos7,8,9. No entanto, uma vez que esses métodos são altamente específicos para um determinado congénere, vários testes devem ser executados. O mais grave é que o romance congêneres crescerem tão rápido que seus anticorpos não podem ser gerados em tempo. Portanto, o desenvolvimento de biossensores de grupo específicas para monitorar os níveis totais de todos os congêneres em um teste pode fornecer uma métrica inestimável para avaliação do estado de poluição ambiental.
Recentemente, aptamers de ácido nucleico foram aplicados extensamente como elementos de reconhecimento em várias plataformas biosensing devido à sua capacidade de reconhecer uma grande variedade de destinos, de íons e pequenas moléculas de proteínas e células10,11 ,12. Aptamers são identificados através de um método em vitro chamado evolução sistemática de ligantes pelo enriquecimento exponencial (SELEX)13,14. SELEX começa com biblioteca aleatória sintético único fio do oligonucleotide, que contém aproximadamente 10 sequências15 14-10. O tamanho da biblioteca aleatória assegura a diversidade das estruturas de candidato de RNA ou DNA. Processo SELEX típico consiste de várias rodadas de enriquecimento até a biblioteca é enriquecida em sequências com alta afinidade e especificidade para o alvo. A piscina enriquecida final então é sequenciada, e as constantes de dissociação (Kd) e seletividade contra potencial substâncias interferentes são determinadas por diferentes técnicas tais como filtram binding, cromatografia de afinidade, superfície Plasmon ressonância (SPR), etc. 15
Devido a solubilidade em água extremamente pobre e falta de grupos funcionais para a imobilização de superfície, a seleção de aptamer de POPs é teoricamente difícil. Avanços significativos para SELEX aceleraram a descoberta de aptamers. No entanto, a seleção do grupo específico aptamers de POPs não ainda foi relatada. Até agora, apenas PCB-ligação DNA aptamers com elevada especificidade para um determinado congénere foram identificados16. PAEs são usados principalmente em materiais de policloreto de vinila, mudando de cloreto de polivinila de um plástico duro para um plástico elástico, agindo assim como um plastificante. Alguns PAEs foram identificados como desreguladores endócrinos, pode causar graves danos ao fígado e rins, reduzir a motilidade do esperma masculina e pode resultar em morfologia do esperma anormal e câncer testicular17. O composto - nem aptamers de PAE-obrigatórias específicas do grupo têm sido relatados.
O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo representativo para a seleção de aptamers de DNA específicas do grupo de altamente hidrofóbicas moléculas pequenas tais como PAEs, um grupo representativo de POPs. Podemos também demonstrar a aplicação do aptamer selecionado para a deteção de poluição ambiental. Este protocolo fornece orientação e insights para a descoberta de aptamer de outras pequenas moléculas hidrofóbicas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>UV-2550</td>
			<td>Shimadzu,Japan</td>
			<td></td>
			<td>protocol, section 3.8.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>section 3.5.1.2 and 3.5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>section 5.3.6 and 6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VMP3 multichannel potentiostat</td>
			<td>Bio-Logic Science, Claix, France</td>
			<td></td>
			<td>section 7.4,7.8 and 7.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy-activated Sepharose 6B</td>
			<td>GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)</td>
			<td>10220020</td>
			<td>argarose beads, section 2.3 and 3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beads</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>420420</td>
			<td>magnetic beads,section 5.2. and 5.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premix Taq Hot Start Version</td>
			<td>Takara,Dalian,China</td>
			<td>R028A</td>
			<td>polymerase, section 3.5.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PARAFILM Sealing Membrane</td>
			<td>Bemis, USA</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>section 3.6.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda Exonuclease</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>EN0561</td>
			<td>section3.7.1.2.The 10 &#215; reaction buffer is provided along with &#955; exonuclease by the provider.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dr. GenTLE 
			Precipitation Carrier</td>
			<td>Takara,Dalian,China</td>
			<td>9094</td>
			<td>section 3.6.2 and 3.8.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai)</td>
			<td>B511135</td>
			<td>section 4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>1811838</td>
			<td>nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Premix Ex Taq II</td>
			<td>Takara,Dalian,China</td>
			<td>RR820A</td>
			<td>polymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS: 1132-61-2</td>
			<td>section 5.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>CAS: 25952-53-8</td>
			<td>section 5.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6066-82-6</td>
			<td>section 5.2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mercaptohexanol (MCH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS: 1633-78-9</td>
			<td>section 7.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold electrode</td>
			<td>Shanghai Chenhua</td>
			<td>CHI101</td>
			<td>section 7.4. - 7.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS: 51805-45-9</td>
			<td>section 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-(2-Mercaptoethyl)-O&#39;-methyl-hexa-(ethylene glycol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS: 651042-82-9</td>
			<td>section 7.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethylhexyl phthalate (DEHP)</td>
			<td>National Institute of Metrology, China</td>
			<td>CAS: 117-81-7</td>
			<td>section 7.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS: 9005-64-5</td>
			<td>polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS: 9002-93-1</td>
			<td>non-ionic surface active agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368</td>
			<td>10 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phthalic acid ester-binding dna aptamer selection, characterization, and application to an electrochemical aptasensor

Ácido ftálico ésteres (PAEs) é um dos principais grupos de poluentes orgânicos persistentes. A detecção de grupo específico de PAEs é altamente desejada devido ao rápido crescimento de congêneres. Aptamers de DNA foram cada vez mais aplicadas como elementos de reconhecimento em plataformas biosensor, mas selecionando aptamers em direção a alvos altamente hidrofóbicos pequena molécula, como PAEs, é raramente relatada. Este trabalho descreve um método baseado em talão projetado para selecionar aptamers de DNA específicas do grupo de PAEs. O grupo amino acrescida Dibutilftalato (DBP-NH2) como o alvo de âncora foi sintetizado e imobilizado sobre os grânulos de agarose epóxi-ativado, permitindo que a exibição do grupo éster anidridos ftálico na superfície da matriz de imobilização, e por conseguinte, a seleção dos fichários do grupo específico. Determinamos as constantes de dissociação dos candidatos aptamer pela reacção em cadeia quantitativa polimerização juntamente com separação magnética. O relativas afinidades e seletividade da aptamers a outros PAEs foram determinadas por ensaios competitivos, onde os candidatos aptamer foram previamente delimitados ao DBP-NH2 anexado grânulos magnéticos e lançado para o sobrenadante após incubação com os PAEs testados ou outras substâncias interferentes potenciais. O ensaio do competidor foi aplicado porque permitia uma comparação facile afinidade entre PAEs que não tinha nenhum grupos funcionais para a imobilização de superfície. Finalmente, demonstrou a fabricação de um aptasensor eletroquímico e usou para detecção ultra-sensível e seletiva de ftalato de bis(2-ethylhexyl). Este protocolo fornece insights para a descoberta de aptamer de outras pequenas moléculas hidrofóbicas.

Projetamos e sintetizado o grupo amino acrescido Dibutilftalato (DBP-NH2) como o destino de âncora (Figura 1F). Em seguida, realizamos a seleção de aptamer do DNA de PAEs usando DBP-NH2 como o destino de âncora e seguindo o método baseado em imobilização clássica do alvo (Figura 2). Em cada rodada, um piloto PCR foi realizada usando a página desnaturada para otimizar o número de ciclo de PCR (Figura 3). A página desnaturada, em vez de página nativa, é fortemente sugerida porque nós e os outras colegas descobriram que os subprodutos de suspeita de alto peso molecular mostrados os géis nativos para os maiores números de ciclo são na verdade de reticulação complexos formados por sequências do tamanho certo. Assim, a intensidade da banda da página desnaturada pode realmente refletem a quantidade do produto certo. A única geração de DNA encalhada é outro passo crítico, e muitos métodos para esta etapa foram relatados28. O método de digestão do exonuclease λ é o método mais barato. O sucesso da geração single-stranded DNA pode convenientemente ser verificado por página nativa, onde o produto do PCR é mostrado como único (primeiras várias rodadas de SELEX) ou múltiplas bandas, enquanto apenas uma banda é mostrada após a digestão (Figura 4).
A SELEX foi interrompido após a quinta rodada da seleção por causa da quantidade significativa de DNA acumulado na parte superior da página, mesmo após o tratamento de desnaturação (onde DNAs são aquecidos a 95 ° C por 10 min em 2 × TBE – contendo ureia de 8,3 M) , que sugeriu o cross-linking grave entre DNAs e também indicou que as sequências foram enriquecidas. Portanto, a piscina4 foi enviado para o sequenciamento de alta produtividade. O resultado do elevado-throughput mostrou que o top 100 mais frequentemente ocorrem sequências foram altamente conservada e eram de uma família. A sequência superior DBP-1 exibido afinidade nanomolar (Figura 5) e grupo boa especificidade para congêneres PAE (DBP, BBP, DEHP) (Figura 6) através de ensaios os qPCR conveniente, conforme descrito na seção de protocolo.
DBP-1 tem sido usada para construir uma vertente baseada no deslocamento aptasenor eletroquímico conformemente para nosso relatado anteriormente trabalho29. O sensor DEHP pode responder com sensibilidade e seletivamente para DEHP (Figura 7). Os poluentes ambientais comuns como íons de metais pesados, antibióticos e pequenas moléculas com grupos funcionais similares mostraram muito fraca resposta à DBP-1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56814/56814fig1.jpg"> Figura 1: Estruturas químicas do (A) PAEs, (B) BBP, DBP (C), (D) DEHP, (E) 4-OH-DEHP, (F) DBP−NH2. Esta figura foi reimpresso com permissão de Han Y. et al . 22 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56814/56814fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56814/56814fig2.jpg"> Figura 2: Processo de selecção de aptamer grupo específico DNA para PAEs usando DBP-NH2 como um alvo de âncora. Esta figura foi reimpresso com permissão de Han Y. et al . 22 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56814/56814fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56814/56814fig3.jpg"> Figura 3: representante resulta da otimização do ciclo de PCR usando página desnaturada. Da esquerda para a direita, representam as vias: 20 bp DNA escada padrão, 15 ciclos (nenhum modelo de DNA), 20 ciclos (nenhum modelo de DNA), 25 ciclos (nenhum modelo de DNA), 30 ciclos (nenhum modelo de DNA), 15 ciclos, 20 ciclos, 25 ciclos e 30 ciclos. Condições ideais foram observadas em 25 ciclos, onde a banda único produto estava em alta intensidade sem subprodutos indesejáveis, além disso, nenhuma banda foi observada no controle correspondente em branco. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56814/56814fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56814/56814fig4.jpg"> Figura 4: A otimização da reação de exonuclease λ para digerir a vertente fosforilada usando página nativa. Da esquerda para a direita, representam as vias: 20 bp DNA escada padrão, negativo (nenhum exonuclease λ), 2U, 5U, 8U e 10U. A quantidade mínima de enzima foi observada em 2U, onde o duplo produto PCR torna-se single-stranded DNAs. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56814/56814fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56814/56814fig5.jpg"> Figura 5: medições de afinidade de DBP-1 por ensaios baseados em qPCR. O erro (desvio padrão, SD) do Kd do foi calculado de três medições da mesma amostra. Esta figura foi reimpresso com permissão de Han Y. et al . 22
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56814/56814fig6.jpg"> Figura 6: medições de afinidade relativa do DBP-1 para livres DBP-NH2 (10 µM), DBP (10 µM), DEHP (10 µM), BBP (10 µM), acetato de etila (10 µM), ácido benzoico (10 µM), ácido ftálico (10 µM) e outros através de ensaios de competição. Outros: uma mistura de potenciais interferências (glicose, canamicina, ampicilina e etanol), tudo a 10 µM. A relação (a afinidade relativa) foi calculada dividindo o número de aptamers libertado os grânulos na presença da amostra pelo número de aptamers libertado os grânulos no buffer de vinculação de PAE. As barras representam a média ± SD O SDs foram calculadas a partir de três medições individuais. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56814/56814fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56814/56814fig7.jpg"> Figura 7: biosensor eletroquímico de DEHP para detecção ultra-sensível e ultraselective de DEHP: mecanismo (A), SWV curvas b, C, da curva de calibração e testes de seletividade (D). Os erros (SDs) foram calculados a partir de três medições individuais. Esta figura foi reimpresso com permissão de Han Y. et al . 22 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56814/56814fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

É apresentado um protocolo para a seleção em vitro e caracterização de aptamers de DNA de ligação éster ácido ftálico de grupo específico. A aplicação do aptamer selecionado em um aptasensor eletroquímico também está incluída.

Seleção de Aptamer de DNA de ligação éster de ácido ftálico, caracterização e aplicação de um Aptasensor eletroquímica

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the ...

phthalic-acid-ester-binding-dna-aptamer-selection-characterization

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.7K visualizações.  Capital Normal University. É apresentado um protocolo para a seleção em vitro e caracterização de aptamers de DNA de ligação éster ácido ftálico de grupo específico. A aplicação do aptamer selecionado em um aptasensor eletroquímico também está incluída.

Vídeo: Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

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DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

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Dinâmica eletroquímico Medição de íons cloreto

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Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). ...

Time-resolved Photophysical Characterization of Triplet-harvesting Organic Compounds at an Oxygen-free Environment Using an iCCD Camera

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables the acquisition of photoluminescence spectra covering the time regime from nanoseconds up to 0.1 s. This enables us to follow the changes in the intensity (decay) and emission of the spectra over time. Using this method, it is possible to study diverse photophysical phenomena, such as the emission of phosphorescence, and the contributions of prompt and delayed fluorescence in molecules showing thermally activated delayed fluorescence (TADF). Remarkably, all spectra and decays are obtained in a single experiment. This can be done for solids (thin film, powder, crystal) and liquid samples, where the only limitations are the spectral sensitivity of the camera and the excitation wavelength (532 nm, 355 nm, 337 nm, and 266 nm). This technique is, thus, very important when investigating the excited state dynamics in organic emitters for their application in organic light-emitting diodes and other areas where triplet harvesting is of paramount importance. Since triplet states are strongly quenched by oxygen, emitters with efficient TADF luminescence, or those showing room temperature phosphorescence (RTP), must be correctly prepared in order to remove any dissolved oxygen from solutions and films. Otherwise, no long-lived emission will be observed. The method of degassing solid samples as presented in this work is basic and simple, but the degassing of liquid samples creates additional difficulties and is particularly interesting. A method of minimizing solvent loss and changing the sample concentration, while still enabling to remove oxygen in a very efficient and a repeatable manner, is presented in this work.

Here, we present a method of the spectroscopic characterization of organic molecules by means of time-resolved photoluminescence spectroscopy on the nanosecond-to-millisecond timescale in oxygen-free conditions. Methods to efficiently remove oxygen from the samples and, thus, limit luminescence quenching are also described.

Tempo-resolvido compostos orgânicos de Photophysical caracterização dos Triplet-colheita em um livre de oxigênio ambiente usando uma câmera de iCCD

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables ...

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control cellular functions. The reversal of DNA methylation, or DNA demethylation, is mediated by the ten-eleven translocation (TET) protein family of dioxygenases. Although it has been widely reported that aberrant DNA methylation and demethylation are associated with developmental defects and cancer, how these epigenetic changes directly contribute to the subsequent alteration in gene expression or disease progression remains unclear, largely owing to the lack of reliable tools to accurately add or remove DNA modifications in the genome at defined temporal and spatial resolution. To overcome this hurdle, we designed a split-TET2 enzyme to enable temporal control of 5-methylcytosine (5mC) oxidation and subsequent remodeling of epigenetic states in mammalian cells by simply adding chemicals. Here, we describe methods for introducing a chemical-inducible epigenome remodeling tool (CiDER), based on an engineered split-TET2 enzyme, into mammalian cells and quantifying the chemical inducible production of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) with immunostaining, flow cytometry or a dot-blot assay. This chemical-inducible epigenome remodeling tool will find broad use in interrogating cellular systems without altering the genetic code, as well as in probing the epigenotype&#8722;phenotype relations in various biological systems.

Detailed protocols for introducing an engineered split-TET2 enzyme (CiDER) into mammalian cells for chemical inducible DNA hydroxymethylation and epigenetic remodeling are presented.

Uma enzima de Split-TET2 projetado para Hydroxymethylation de DNA químico-inducible e remodelação epigenéticas

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...

An Electrochemical Cholesteric Liquid Crystalline Device for Quick and Low-Voltage Color Modulation

We demonstrate a method for fabricating a prototype reflective display device that contains cholesteric liquid crystal (LC) as an active component. The cholesteric LC is composed of a nematic LC 4&#39;-pentyloxy-4-cyanobiphenyl (5OCB), redox-responsive chiral dopant (FcD), and a supporting electrolyte 1-ethyl-3-methylimidazolium trifluoromethanesulfonate (EMIm-OTf). The most important component is FcD. This molecule changes its helical twisting power (HTP) value in response to redox reactions. Therefore, in situ electrochemical redox reactions in the LC mixture allow for the device to change its reflection color in response to electrical stimuli. The LC mixture was introduced, by a capillary action, into a sandwich-type ITO glass cell comprising two glass slides with patterned indium tin oxide (ITO) electrodes, one of which was coated with poly(3,4-ethylenedioxythiophene)-co-poly(ethylene glycol) doped with perchlorate (PEDOT+). Upon application of +1.5 V, the reflection color of the device changed from blue (467 nm) to green (485 nm) in 0.4 s. Subsequent application of 0 V made the device recover the original blue color in 2.7 s. This device is characterized by its fastest electrical response and lowest operating voltage among any previously reported cholesteric LC device. This device could pave the way for the development of next generation reflective displays with low energy consumption rates.

A protocol for the fabrication of a reflective cholesteric liquid crystalline display device containing a redox-responsive chiral dopant allowing quick and low-voltage operation is presented.

Um dispositivo cristalino líquido colestéricos eletroquímico para modulação de cor rápida e baixa tensão

We demonstrate a method for fabricating a prototype reflective display device that contains cholesteric liquid crystal (LC) as an active component. The ...

Electrochemical Roughening of Thin-Film Platinum Macro and Microelectrodes

This protocol demonstrates a method for electrochemical roughening of thin-film platinum electrodes without preferential dissolution at grain boundaries of the metal. Using this method, a crack free, thin-film macroelectrode surface with up to 40 times increase in active surface area was obtained. The roughening is easy to do in a standard electrochemical characterization laboratory and incudes the application of voltage pulses followed by extended application of a reductive voltage in a perchloric acid solution. The protocol includes the chemical and electrochemical preparation of both a macroscale (1.2 mm diameter) and microscale (20 &#181;m diameter) platinum disc electrode surface, roughening the electrode surface and characterizing the effects of surface roughening on electrode active surface area. This electrochemical characterization includes cyclic voltammetry and impedance spectroscopy and is demonstrated for both the macroelectrodes and the microelectrodes. Roughening increases electrode active surface area, decreases electrode impedance, increases platinum charge injection limits to those of titanium nitride electrodes of same geometry and improves substrates for adhesion of electrochemically deposited films.

This protocol demonstrates a method for electrochemical roughening of thin-film platinum electrodes without preferential dissolution at grain boundaries. The electrochemical techniques of cyclic voltammetry and impedance spectroscopy are demonstrated to characterize these electrode surfaces.

Desbaste eletroquímico de macro e microeletrodos de platina de película fina

This protocol demonstrates a method for electrochemical roughening of thin-film platinum electrodes without preferential dissolution at grain boundaries ...