この研究は、ドイツの研究財団（WE 3548 / 4-1）とローランド・エルンスト・シュタップゥン・ファール・ジェシードハイツェン（Roland-Ernst-StiftungfürGesundheitswesen）（1/14）によって支持された。

ここに提示された動物実験は、機関および政府の動物保護および使用委員会によって独立して審査され、許可され、 実験動物連合連盟 （FELASA）のガイドラインに従って実施された。すべての可能な措置は、麻酔および鎮痛、または必要な場合には早期安楽死を含む苦痛を最小限にするためにとられた。 1.細胞およびオルガノイドの調製注：1回の注入につき100,000細胞で20μLの容量を使用してください。漏出を防止し、標準化された注射を確実にするために、基底膜マトリックス（BMM）を使用する。再現可能な結果を確保するために、一定の間隔で（STRプロファイリングを介して 、 例えば ）細胞株認証アッセイを行います。 <ol><li> 新鮮な組織からの一次細胞懸濁液の調製 注：常に無菌条件下で作業してください。新鮮なものの即時転送手術室から氷上で実験室に切除された組織は、細胞の高い生存性を確実にするために必要とされる。 患者の健康と最適な治療が常に最優先事項でなければなりません。したがって、研究のための組織試料は、切除された腫瘍のその後の病理学的検査および病期診断を妨害しない方法で得なければならない。従って、ほとんどの場合、病理学的診断との非干渉を確実にするために、訓練された病理学者によって得られた研究のためのサンプルを有することは合理的である。 <ol><li>切除標本（理想的には1cm 3 ）から滅菌除去した直後に、20〜30mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を予め充填した50mLチューブに組織サンプルを入れる。チューブを氷上に保管し、すぐに検査室に移す。 </li><li>ペトリ皿に組織を入れ、十分なPBSで2回洗浄して残りの血液を除去する。 </li><li>組織をscaで小片（〜2〜4 mm）に切断するlpel（ 例えば 、＃20または＃36ブレード）。 </li><li>腫瘍組織を単細胞懸濁液にさらに解離させるために、解離剤を製造者の指示に従って使用する。あるいは、酵素消化の他のプロトコールを使用する。 </li><li>得られた単一細胞懸濁液の細胞を計数する（ 例えば 、コールターカウンターまたは血球計で）。 </li><li>遠心分離（1,500 xgで5分間）し、細胞懸濁液をPBSで2回洗浄する。 </li><li> BMMに5×10 6細胞/ mLの濃度で細胞を再懸濁し、氷上に保ちます。 </li></ol></li><li> 注射用細胞株の調製 <ol><li>標準的な培養条件（37℃、5％CO 2 ）下ですべての結腸直腸癌細胞株を増殖させ、手術の日に調製する。 </li><li>標準的な細胞培養プロトコールに従って細胞を採取し、細胞を計数し（ 例えば 、コールターカウンターまたは血球計算盤で）、reqを計算する注射される動物の数に依存して、すべての注射のための尿量。 </li><li>実際に必要とされる量の3-5倍を準備して、ピペッティングロスと注入シリンジのデッドボリュームを考慮してください。 </li><li>遠心分離（1,500gで5分間）し、細胞懸濁液をPBSで2回洗浄する。 </li><li> BMMに5×10 6細胞/ mLの濃度で細胞を再懸濁し、氷上に保ちます。 </li></ol></li><li> オルガノイドの調製 注：すべての3Dオルガノイド培養物は、標準的な培養条件（37℃、5％CO 2 ）下で増殖させる。オルガノイド培養の詳細なプロトコールはこれまでに公開されている。従来の細胞株と同様に18、19、20、我々 は注射当たり100,000細胞で20μLBMMのボリュームをお勧めします。オルガノイドは、手術の日に次のように調製される： <ol><li>以下の培地を調製する（以下、（DMEM）/ F12 + 1％HEPES（1M）+ 1％グルタミン（200mM）+ 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）を含むDMEM / F12 + </li><li> 15 mLチューブに1 mLのDMEM / F12 +++をあらかじめ充填する。 </li><li>注意深くオルガノイドを培養プレートの表面から吸引し、3〜5ウェルの内容物を1つの15mLチューブに移す。 </li><li>細長いガラスピペットで上下にピペッティングすることにより、有機体を慎重に小さな断片に砕きます。 </li><li>管に5mLのDMEM / F12 +++を添加し、続いて1000xgで5分間遠心分離する。 </li><li>遠心分離後、上清を除去し、ペレットを600μL酵素解離緩衝液に再懸濁し、懸濁液を6ウェルプレートの1つのウェルに移す。 </li><li> 37℃で1〜5分間インキュベートし、オルガノイドを溶解するために懸濁液を上下に慎重にピペッティングする。 注：消化は顕微鏡で確認してください。すべての細胞クラスターが解離したときに完了する単一細胞へのd。 </li><li>うまく消化し​​たら、消化を停止するために1.4mLのDMEM / F12 +++を加える。その後、消化されたオルガノイドのすべてのウェルを50mLチューブに移す。 </li><li>細胞を数え、すべての注射に必要な量を計算する。 </li><li>分注ロスと注入シリンジのデッドボリュームを考慮に入れて実際に必要とされる量の3〜5倍を準備する</li><li>遠心分離（1,500 xgで5分間）し、細胞懸濁液をPBSで2回洗浄する。 </li><li> BMM中の細胞を5×10 6細胞/ mLの濃度に再懸濁し、それらを氷上に保つ。 </li></ol></li></ol> 2.正射マウスモデル<ol><li> 手術のためのレシピエント動物の調製 注：6-8週齢のNOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wj1 / SzJ（NOD scidガンマ、NSG）マウスをレシピエントとして使用する。 21 NSGは、最も免疫不全のマウスのうち、成熟したB、TおよびNK細胞を欠いており、他の複数の免疫性のdeフェクト。 21彼らは確実に低い細胞数が注入されている場合でも、腫瘍を成長させ、遠隔転移に非常になりやすいです。 NSGマウスは優れた育種家であり、従来の特定病原体不使用（SPF）単位で維持することができます。 <ol><li>最初の切開の前に、0.05mg / kgのブプレノルフィンを皮下注射する。 </li><li>全身麻酔の場合、セボフルランを3-3.5容量％で使用する。つま先ピンチ反射の喪失は、十分な麻酔を示す。 </li><li>角膜の乾燥を避けるために、眼科用軟膏で麻酔したマウスの眼を覆う。 </li><li>小さなテーブルの上で仰向けにマウスを拘束します。 </li><li>腹部を電気シェーバー（脱毛クリームを代わりに使用することができる）で剃り、少なくとも3回クロルヘキシジン/ヨウ素と70％アルコールで消毒する。 </li><li>手術野を滅菌ドレープで覆う。 注：周術期抗生物質の使用はオプションであり、制度上のガイドラインの対象となります。 </li></ol></li><li> 中線開腹術および盲腸曝露 <ol><li>はさみ（メスを交互に使用することができます）を使用して、下腹部の皮膚の小さな正中線切開（3〜5 mm）を行います。鉗子で腹部の筋肉組織を拾い、慎重にはさみで切開して、腹腔を開きます。 </li><li>盲腸を特定し、慎重に外傷性鉗子で外形化する。盲腸のブラインドエンドパウチを腹部に配置し、頭蓋骨を指します。 </li><li>体外に出すと、常に温かい生理食塩水綿棒を使って盲腸を湿らせてください。 </li></ol></li><li> 眼内注射、腹部閉鎖および術後回復 <ol><li>内腔内注射のためには、30Gカニューレを備えた標準的な1mL注射器を使用する。このシリンジをマイクロインジェクションポンプに取り付け、マイクロインジェクションポンプをマイクロマニピュレーターに取り付けます。 </li><li>慎重に非鉗子鉗子で盲腸の先端をつかみ、それを穏やかに滑らかにする温かい生理食塩水で湿らせた鉗子の第2のセットでd。 </li><li>カニューレを盲腸の真上に配置する。 </li><li>双眼の外科用顕微鏡で視覚制御下で次の手順を実行します。 </li><li>盲腸の外郭部分の両端にある2つの非外傷性鉗子で盲腸を慎重に把握し、わずかに引き伸ばし、ゆっくりとそれを平行にかつ真上に位置するカニューレ上にゆっくりと引き寄せる。漏出および腹膜播種につながる可能性があるので、腸壁全体を穿孔しない（したがって、細胞を管腔に注入する）ことは重要であり、穿孔の初期点を超えて漿膜を穿孔しないことも重要である。 <ol><li>腸をカニューレの方に移動し、カニューレを腸の方へ移動させないでください。ホックと2つの鉗子の間に腸を伸ばします。外科医の手は、振戦を軽減するために表面上に静止していなければならない。 </li></ol></li><li>漿膜の間に細胞を注入する（上の非常に薄い、半透明の裏地eの壁内の血管）および筋肉痛。したがって、カニューレは、血管の上および薄い半透明膜の下に視覚的に配置されなければならない。 </li><li>カニューレが腸壁の内側にある間に振戦を軽減するために、注射を開始するためにフットスイッチを使用してください。 </li><li>カニューレが所定の位置に来たら、注射を開始する。 20秒間を使用すると、ポンプのコントロールユニットに1μL/ sが設定されます。 注：損傷した血管の中または近くへの注射は、直接的な血管内伝播および遠隔転移を招き、したがって避けるべきである。 </li><li>注射が完了した後、カニューレを慎重に後方に引っ張って外す。 </li><li>乾燥した綿棒を盲腸の下に置き、漏出した細胞を溶解して人工腹膜の播種を防ぐために盲腸を蒸留水で十分にすすいでください。 </li></ol></li><li> 腹部の閉鎖および術後の回復 <ol><li> rの後盲腸を静かに腹腔に戻してください。 </li><li>急速吸収性の6 - 0の縫合糸で腹壁を閉鎖する。 </li><li>外科用創傷クリップで皮膚を閉じます。 </li><li>麻酔から完全に回復するまで38℃に設定されたヒーティングマップ上にマウスを置きます。 </li><li> 48時間後のマウスの術後状態を密接に観察する。苦痛の場合は、ブプレノルフィン0.05 mg / kgを12時間毎に投与する。 </li><li>腫瘍の成長による苦痛の徴候について少なくとも1日1回、マウスをモニターする。 </li></ol></li></ol>全血試料からの循環腫瘍細胞の単離注：麻酔したマウスの経皮的心臓穿刺により血液を採取し、その後安楽死させる。理想的には、100μLの抗凝固剤（エチレンジアミン四酢酸（EDTA）またはヘパリン）をあらかじめ充填したシリンジに、1,000μLの血液を採取します。抗ヒトEpCAM（上皮細胞接着分子）抗体を用いてCTCを同定した。ヒト上皮細胞株がマウスモデルで使用される場合、これは非常にうまく機能します。他の器具については、異なる抗体が必要とされ得る。 <ol><li> CTC濃縮： <ol><li> 15mLのチューブに5mLの密度勾配培地をあらかじめ充填し、注意深く血液を15mLのチューブに移す。 </li><li>遠心分離（ブレーキなしで300xgで30分間）し、慎重に上清を除去する。 </li><li>残りを新しい15 mLチューブに入れ、遠心分離機にかけます（15分間、ブレーキで300 xg）。 </li><li>単核細胞を含む中間相を回収し（残りを捨てる）、細胞をPBSで2回洗浄する。 </li><li>ペレットを200μLPBS / 1％EDTAに再懸濁し、4μLのEpCAM抗体を加える。暗所で氷上で20分間インキュベートする。 </li></ol></li><li> スクリーニングとピッキング <ol><li>以下の緩衝液（以下、ピッキング緩衝液と称する）を調製する：PBS + 10％ウシ胎児血清（FCS）+ 1％ペニシリン/ Sトレプトマイシン（1％）+ 0.8％EDTA。 </li><li> PAPペンを使用して、6cmの滅菌ペトリ皿（液体が皿に分散するのを防ぐ）に約1cmの円を描き、この円の中にピペットバッファー700μLをピペットで入れる。 </li><li>円内の700μLのピッキングバッファーに50μLの細胞懸濁液を添加する。顕微鏡で細胞の密度をチェックする。濃すぎる場合は、サンプルを別の料理に分割します。 </li><li>細胞が沈降するのを待ちます（約5分）。 </li><li>染色された（= EpCAM陽性）細胞の細胞懸濁液の滴をスクリーニングする。 </li><li>セルが発見されると、マイクロマニピュレータを用いて細胞を選択し、意図下流分析（ 例えば 、RNA抽出緩衝液または培養培地）に応じて、50μLのバッファに入れ。 </li><li>目的とする下流分析に応じて、陰性対照としてEpCAM陰性細胞および/または培地を単離する。 </li><li>下流の分析（ 例えば 、細胞培養、PCR）を続ける。 </li></ol></li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+transgenic+mouse+for+colorectal+cancer+research+with+intestinal+cre+expression+limited+to+the+large+intestine.">Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine.</a> Mol Cancer Res. 8 (8), 1095-1104 (2010).</li><li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+inducible+colon-specific+Cre+enzyme+mouse+line+for+colon+cancer+research.">Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).</li></ol>

著者は何も開示することはない。

皮下マウスモデルでのその前臨床的に証明された活性にもかかわらず、新規化合物の大部分は臨床試験に失敗し、決して診療所に到達しない。 11皮下マウスモデルのこの明らかな不足を正確に腫瘍の生物学および増殖パターンは、直接元の臓器への腫瘍細胞の注射に基づく同所性マウスモデルの開発につながっているシミュレートします。 オルソトープマウスモデルは、皮下モデルよりもはるかに正確に固形腫瘍の生物学および普及をシミュレートすることができる。 15しかし 、主な欠点は、特に、中空の器官だけでなく、腫瘍の成長の技術的要求の厳しい監視などの技術的要求の厳しい臓器に再現性が低いです。我々のモデルでは、我々は、反復撮像法ではなく、あらかじめ定義された時点で腫瘍サイズに焦点を当てており、技術的な数精巧で動物のストレステストのために。ここで説明したモデルは、腫瘍細胞株の特徴づけ、腫瘍生物学と普及ならびに治療試験の15の調査のような様々な用途に使用することができます。 17明らかなエンドポイントは、原発腫瘍の大きさおよび遠隔転移の数であるが、そのようなCTC番号17または撮像モダリティとしてより複雑なエンドポイントを使用することもできます。 我々のプロトコールの最も重要なステップは、漿膜下腫瘍細胞注入である。それは練習を必要とし、直接的な視覚的制御下で常に実行されなければならない。寄託物が漿膜下の他の場所で粘膜上にある場合、腫瘍の増殖はまったく起こらず、予測できない増殖と拡散が起こり、その結果は比類のないものになる。腫瘍発生の欠如の他の考えられる理由には、生存不能細胞（ 例えば、/ em&gt;、細胞の収穫と注入の間の長い時間間隔のため）、または完全に同系のマウスではない。これは、C57Bl / 6マウスを使用する場合に可能である。また、料金がかかる腫瘍に反映される別個の遺伝的および表現型の相違点22を示すC57BL / 6（ 例えば 、C57BL / 6JおよびC57BL / 6N）の複数substrainsがあるとして。 23 ここに記載された高度に制御された注入技術は、再現性の高い腫瘍増殖および播種をもたらし、このモデルを以前に記載された同所性モデルと区別する。また24、腫瘍細胞注入が劇的人工腹膜播種の速度を低減した後、蒸留水で盲腸をすすぎます。したがって、我々のモデルにおいて腹膜癌腫症が発生する場合、医原性腫瘍細胞漏出よりもむしろ細胞株の生物学的結果の可能性が最も高い。 このmの制限オデルは、ヒト細胞株が使用される場合に免疫不全でなければならないレシピエントマウスである。これは、免疫学的研究におけるモデルの適用を厳しく制限する。しかし、この制限は、同系ネズミ細胞株またはオルガノイド（未発表データ）の使用によって克服することができる。別の制限は、細胞系自体の使用である。腫瘍細胞株はしばしば高度な退形成であり、元の腫瘍の生物学の代表性について疑問を残す。この制限は、組織特異的腫瘍形成突然変異の導入によって新たな腫瘍を発生させる遺伝子改変マウスモデル（GEMM）には存在しない。 12このようなGEMMsは通常条件生殖細胞系突然変異に基づいて（ 例えば、flox化APC遺伝子）で局所感染のいずれかにより、変異の活性化のCre媒介されるアデノCRE 28、27、25、または組織特異的プロモーター駆動CRE表現。 29、30、31は、しかしながら、そのようなモデルは、しばしば大規模な交差を必要とし、高度に可変生物学を有します。本明細書中に提示されたモデルにおいて一次細胞株が使用される場合、再現性および相対的コスト効率のような本発明者らのモデルの他の利点を失うことなく、低い代表性の限界を克服することができる。 ここで提案する手法のもう1つの制限は、表面マーカーとしてのEpCAMへの依存です。 EMT中にEpCAMが失われ、EpCAM陰性であるCTCの一部が存在することは周知である。 10は 、15したがって 、実験の目的と注射に使用される細胞株に依存して、特定の他の手段（ 例えば 、注射の前に細胞のGFP標識）を用いることができます。 結論として、ここに提示されたモデルc結腸内の腫瘍の元の微小環境との関連で腫瘍の発達および播種を研究するための柔軟なツールを装備している。転移性細胞株が使用される場合、それは、血流中のCTCを含むCRCに関する全ての関連部位における腫瘍細胞の播種を忠実にシミュレートする。したがって、腫瘍増殖および播種の間の表現型変化を研究する有用なツールであり、CRCにおけるCTCの繰り返しの単離および特徴付けが可能である。 15

結腸直腸癌（CRC）は、西欧諸国における癌の死の最も一般的な原因の1つである。 1原発腫瘍はしばしば切除することができるが、遠隔転移の発生は劇的に予後を悪化させ、しばしば死に至る。腫瘍から切り離し2、3転移の生物学的相関循環している腫瘍細胞（CTCのは）、、、標的臓器に上皮に取り付け、循環の中で生き残る臓器に侵入し、最終的に新たな病変への脱却します。 4のCTCが予後関連性、5、6、7、8であることが知られているが、それらの生物学9は、部分的にのみCRCにおけるそれらの極端な希少性の結果として理解されます。 10 マウスモデルは強力なtです癌生物学のさまざまな側面を研究する古典的な皮下腫瘍モデルは、免疫担当者（同系マウス腫瘍細胞が使用される場合）または免疫不全のいずれかであり得るレシピエントマウスへの腫瘍細胞の皮下注射によって産生される。皮下腫瘍モデルは安価であり、データを迅速に生成する。それらのエンドポイント腫瘍増殖は容易かつ非侵襲的に測定することができる。しかしながら、そのようなモデルにおいて抗腫瘍活性を示した新規化合物の88％が臨床試験に失敗している。 11これは人間とマウスの種間の違いに一部原因があります。しかし、この失敗の大部分は皮下マウスモデルの予測値が低いためです。 したがって、腫瘍細胞が起源の器官に注入され、したがって元の微小環境で増殖する正所性のマウスモデルは、がん研究においてますます使用されている。 図11 、図 12 、 </sアップ&gt; 13、14の同所モデルは、局所的な腫瘍の成長条件をシミュレートしないだけでなく、腫瘍増殖の解剖学的に正しいサイトの結果として、同所マウスモデルはまた、転移の現実的なシミュレーションを可能にし、したがって、CTCの生物学8、15、16またはCRCの異なる治療への応答を研究するために使用されています。 13、17 同所性マウスモデルの主な欠点は、その技術的な複雑さです。細胞が注入される臓器に応じて、実験者が再現性のある腫瘍を誘導するまでの学習曲線はかなり長い。これは、腫瘍細胞を腸壁に注入する必要があるため、結腸直腸癌モデルに特に適用され、穿孔、腫瘍細胞漏出、または腔内腫瘍細胞の損失をもたらすことが多い。これは、原型組織サンプル、2D細胞株および3Dオルガノイド培養からの細胞調製方法およびマウスの盲腸へのそれらの注入を記載することを意図している。ここに記載されている技術は、高度に均一な腫瘍をもたらし、そして注射に使用される細胞系の腫瘍生物学に応じて、レシピエントマウスにおける遠隔転移およびCTCの再現性のある形成をもたらす。 15

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1294">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:421px;">Cell culture Media and Components</td>
			<td style="width:297px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:457px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Advanced DMEM F12</td>
			<td style="width:297px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12634010</td>
			<td style="width:457px;">DMEM/ F12 +++ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">HEPES (1 M)</td>
			<td style="width:297px;">Life Technologies GmbH</td>
			<td style="width:119px;">15630056</td>
			<td style="width:457px;">DMEM/ F12 +++ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Glutamax-I Supplement (200 mM)</td>
			<td style="width:297px;">Life Technologies GmbH</td>
			<td style="width:119px;">35050038</td>
			<td style="width:457px;">DMEM/ F12 +++ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Penicillin/Streptomycin (PenStrep)</td>
			<td style="width:297px;">Life Technologies GmbH</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td style="width:457px;">DMEM/ F12 +++ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">DMEM</td>
			<td style="width:297px;">Life Technologies GmbH</td>
			<td style="width:119px;">61965026</td>
			<td>basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:297px;">BIOCHROM AG</td>
			<td style="width:119px;">S 0115</td>
			<td>basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">TrypLE Express enzymatic dissociation buffer</td>
			<td style="width:297px;">Life Technologies GmbH</td>
			<td style="width:119px;">12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free)</td>
			<td style="width:297px;">CORNING B.V. Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:297px;">Life Technologies GmbH</td>
			<td style="width:119px;">14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Trypsin-EDTA (0,25%, Phenol-Red)</td>
			<td style="width:297px;">Life Technologies GmbH</td>
			<td style="width:119px;">25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">6-/48-well plates with lid</td>
			<td style="width:297px;">CORNING</td>
			<td style="width:119px;">3516/3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">cell culture flask 75cm&#178;, 250 mL</td>
			<td style="width:297px;">VWR International GmbH</td>
			<td style="width:119px;">734-2066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">cell culture flask 150cm&#178;, 600 mL</td>
			<td style="width:297px;">Corning B.V. Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">355001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:421px;">Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL</td>
			<td style="width:297px;">Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td style="width:119px;">72.706.400/ 72.695.400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">15 ml, 50 ml centrifuge tubes</td>
			<td style="width:297px;">Greiner-Bio-One GmbH</td>
			<td style="width:119px;">188271/227270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine)</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad Laboratories GmbH</td>
			<td style="width:119px;">1450016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:421px;">Pasteur pipettes (glass, 150 mm)</td>
			<td style="width:297px;">Fisher Scientific GmbH</td>
			<td style="width:119px;">11546963/ FB50251</td>
			<td>thinly pulled by using a bunsen burner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gentleMACS Dissociator</td>
			<td style="width:297px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>for primary tumor tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACSmix Tube Rotator</td>
			<td style="width:297px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td>for primary tumor tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gentleMACS C Tubes</td>
			<td style="width:297px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>for primary tumor tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Tumor Dissociation Kit</td>
			<td style="width:297px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-929</td>
			<td>for primary tumor tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 70&#181;m Cell Strainer</td>
			<td style="width:297px;">Corning B.V. Life Sciences</td>
			<td>352350</td>
			<td>for primary tumor tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Name</td>
			<td style="width:297px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:421px;">Surgical Equipment</td>
			<td style="width:297px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Sevoflurane</td>
			<td style="width:297px;">AbbVie Germany GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Medical oxygen</td>
			<td style="width:297px;">Air Liquide Medical GmbH</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:297px;">Temgesic</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Bepanthen - opthalmic ointment</td>
			<td style="width:297px;">Bayer Vital GmbH</td>
			<td style="width:119px;">10047757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Normal saline 0.9% (E154)</td>
			<td style="width:297px;">Serumwerk Bernburg AG</td>
			<td style="width:119px;">10013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Aqua ad injectabilia</td>
			<td style="width:297px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">235144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO</td>
			<td style="width:297px;">Braun/neoLab</td>
			<td style="width:119px;">194291661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">30G injection needle</td>
			<td style="width:297px;">BECTON DICKINSON</td>
			<td style="width:119px;">304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">cellulose swabs</td>
			<td style="width:297px;">Lohmann &#38; Rauscher Deutschland</td>
			<td style="width:119px;">13356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Micro-Adson Forceps</td>
			<td style="width:297px;">FST - Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Iris Scissor - ToughCut</td>
			<td style="width:297px;">FST - Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Olsen-Hegar Needle Holder</td>
			<td style="width:297px;">FST - Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">12002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">AutoClip Kit</td>
			<td style="width:297px;">FST - Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">12020-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture)</td>
			<td style="width:297px;">Johnson &#38; Johnson Medical GmbH</td>
			<td style="width:119px;">Z1012H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:421px;">Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer</td>
			<td style="width:297px;">Parkland Scientific</td>
			<td style="width:119px;">V3000PS/PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">UltraMicro Pump with Micro4 Controller</td>
			<td style="width:297px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">UMP3-4</td>
			<td>equipment for highly controlled orthotopic injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Footswitch for SYS-Micro4 Controller</td>
			<td style="width:297px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">15867</td>
			<td>equipment for highly controlled orthotopic injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Three-axis Manual Micromanipulator</td>
			<td style="width:297px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">M325</td>
			<td>equipment for highly controlled orthotopic injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Magnetic Stand for Micromanipulator</td>
			<td style="width:297px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">M10</td>
			<td>equipment for highly controlled orthotopic injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand</td>
			<td style="width:297px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">5479</td>
			<td>equipment for highly controlled orthotopic injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Hot Plate 062</td>
			<td style="width:297px;">Labotect</td>
			<td style="width:119px;">13854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Isis - Hair shaver</td>
			<td style="width:297px;">AESCULAP - Braun</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Binocular Surgical Microscope</td>
			<td style="width:297px;">Parkland Scientific</td>
			<td style="width:119px;">VS-2Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Name</td>
			<td style="width:297px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:421px;">CTC isolation</td>
			<td style="width:297px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">EDTA</td>
			<td style="width:297px;">Roth</td>
			<td>8040.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Density gradient medium &#8211; Ficoll</td>
			<td>StemCell - Lymphoprep</td>
			<td>7801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:421px;">Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>324210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:421px;">Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">118210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Dish, &#248; 60 x 15 mm, 21 cm&#178;, Vent</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence Cell Culture Microscope</td>
			<td style="width:297px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transferman 4r Micromanipulator</td>
			<td style="width:297px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTram Air</td>
			<td style="width:297px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:457px;">aspiration pump connected to the micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dmz Universal Microelectrode Puller</td>
			<td style="width:297px;">Dagan Corporation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism Glass Capillaries</td>
			<td style="width:297px;">Dagan Corporation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">PAP pen</td>
			<td style="width:297px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:297px;">Life Technologies GmbH</td>
			<td style="width:119px;">14190169</td>
			<td>picking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:297px;">BIOCHROM AG</td>
			<td style="width:119px;">S 0115</td>
			<td>picking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Penicillin/Streptomycin (PenStrep)</td>
			<td style="width:297px;">Life Technologies GmbH</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td>picking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">EDTA</td>
			<td style="width:297px;">Roth</td>
			<td>8040.1</td>
			<td>picking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Name</td>
			<td style="width:297px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:421px;">Immunohistochemistry</td>
			<td style="width:297px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">324201</td>
			<td>EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">HRP rabbit anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:297px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97046</td>
			<td>EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of circulating tumor cells in an orthotopic mouse model of colorectal cancer

容易な適用性および費用対効果の利点にもかかわらず、皮下マウスモデルには重大な制限があり、腫瘍生物学および腫瘍細胞の播種を正確にシミュレートしない。これらの限界を克服するために、正三角形のマウスモデルが導入されている。しかしながら、そのようなモデルは、特に大腸のような中空器官において、技術的に要求されている。確実に増殖し転移する均一な腫瘍を作製するためには、腫瘍細胞の調製および注射の標準化技術が不可欠である。 我々は、非常に均一な腫瘍を発達させ、腫瘍の生物学的研究および治療的試験に使用できる結腸直腸癌（CR）の同所性マウスモデルを開発した。原発腫瘍、二次元（2D）細胞系または三次元（3D）オルガノイドのいずれかからの腫瘍細胞が盲腸内に注入され、注入された腫瘍細胞の転移能に応じて、高度に転移性の腫瘍を形成する。加えて、CTCsは定期的に見つけることができます。ここでは、2D細胞株および3Dオルガノイドならびに原発腫瘍組織、腫瘍移植マウスからの外科および注入技術ならびにCTCの単離ならびにトラブルシューティングのためのヒントを提供する。

このモデルにおける結腸直腸腫瘍の成功し、再現性のある世代は、漏出または漏出のない細胞の正確な注入に決定的に依存する。これが達成されれば、このモデルは非常に信頼性が高く、人工腹膜播種の結果は非常にまれです。腫瘍の成長動力学ならびにそれらの拡散様式は、使用されるオルガノイドおよび細胞の生物学に依存する。 15 HCT116細胞は確実に、このモデルでは肝臓に転移SW620細胞の形同所腫瘍が、転移していませんが。 15 このモデルにおけるHCT116細胞の使用は、腫瘍細胞注射の35日以内に瀕死のマウスを確実にもたらす。原発腫瘍のサイズは約10mm（ 図1Aおよび図2A ）、肝臓転移（ 図1B </str<html> ong&gt;および図2B ）、肺転移（ 図1Cおよび図2C ）および循環腫瘍細胞（ 図3 ）はほぼ常に存在する。腫瘍細胞注入の35日後にHCT116腫瘍を有するマウスでは、CTCは高頻度および量で存在し、下流分析のために容易に単離することができる（ 図3 ）。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55357/55357fig1.jpg" /> 図1： 解剖後の肉眼写真NSGマウスへのHCT116ヒトCRC細胞の同所性注射後35日。 （ A ）盲腸における原発腫瘍（破線）。 （ B ）複数の転移を伴う肝臓。 （ C ）肺転移（矢印）。1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt;この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55357/55357fig2.jpg" /> 図2： 図1に示す臓器の組織学的画像。 （ A ）原発腫瘍（H＆E）。 （ B ）肝転移（H＆E）。 （ C ）肺転移（抗EpCAM免疫組織化学）。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55357/55357fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55357/55357fig3.jpg" /> 図3： 循環腫瘍細胞（NSGマウスのHCT116細胞、腫瘍細胞注入の35日後）。明視野（ A </末梢血単核細胞（PBMC）画分中のCTCの免疫蛍光（抗hEpCAM-Alexa488（ B ））画像を示す。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55357/55357fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

本発明者らは、腫瘍細胞またはオルガノイドをマウスの盲腸に注入することによる同所性結腸直腸腫瘍の確立およびこのモデルからの循環腫瘍細胞（CTC）のその後の単離について記載する。

結腸直腸癌モデルマウスにおける循環腫瘍細胞の単離

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

isolation-circulating-tumor-cells-an-orthotopic-mouse-model

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.9K ビュー.  Technische Universität Dresden. 本発明者らは、腫瘍細胞またはオルガノイドをマウスの盲腸に注入することによる同所性結腸直腸腫瘍の確立およびこのモデルからの循環腫瘍細胞（CTC）のその後の単離について記載する。 

ビデオ: Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will survive longer than five years. In order to understand and mimic the microenvironment of pancreatic tumors, we utilized a murine orthotopic model of pancreatic cancer that allows non-invasive imaging of tumor progression in real time. Pancreatic cancer cells expressing green fluorescent protein (PANC-1 GFP) were suspended in basement membrane matrix, high concentration, (e.g., Matrigel HC) with serum-free media and then injected into the tail of the pancreas via laparotomy. The cell suspension in the high concentration basement membrane matrix becomes a gel-like substance once it reaches room temperature; therefore, it gels when it comes in contact with the pancreas, creating a seal at the injection site and preventing any cell leakage. Tumor growth and metastasis to other organs are monitored in live animals by using fluorescence. It is critical to use the appropriate filters for excitation and emission of GFP. The steps for the orthotopic implantation are detailed in this article so researchers can easily replicate the procedure in nude mice. The main steps of this protocol are preparation of the cell suspension, surgical implantation, and whole body fluorescent in vivo imaging. This orthotopic model is designed to investigate the efficacy of novel therapeutics on primary and metastatic tumors.

A procedure to implant green fluorescent protein-expressing pancreatic cancer cells (PANC-1 GFP) orthotopically into the pancreas of Balb-c Ola Hsd-Fox1nu mice to assess tumor progression and metastasis is presented here.

膵臓がんの蛍光同所性マウスモデル

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

がん研究

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is important to control peritoneal dissemination. However, it is still unclear how tumor cells detach from primary lesions and attach to the mesothelium. The establishment of an appropriate animal model is needed to gain an understanding of the mechanism of peritoneal dissemination in vivo. In the current study, we introduce the process from the local injection of EOC cells into the murine ovarian surface to the development of metastasis, including the peritoneum and distant organs. Female nude mice (BALB/c nu/nu) at 8 weeks of age were used. Under a microscopic field of view, EOC cells (1 x 105 cells/&#181;l of medium-extracellular matrix (ECM)-based hydrogel/unilateral ovary/mouse) were injected into murine ovaries through a retroperitoneal approach from the dorsal flank. This proposed method is a less invasive procedure for the mouse and minimizes damage to the ovary. Here, we describe the methodological steps in the development of the original and metastatic tumor formation of EOC.

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

To clarify the multistep process of peritoneal dissemination of ovarian carcinoma, the current study presents a murine experimental model of original tumor development and peritoneal metastasis via orthotopic inoculation with these tumor cells.

オリジナル腫瘍の開発のマウス実験モデルと腹膜転移<em&gt;経由で</em卵巣癌細胞で&gt;同所接種

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip for downstream analysis and/or culture. The strategy employs the use of a novel Parylene C membrane slot pore microfilter to capture CTC and a coating of poly (N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) for thermoresponsive viable release of the captured CTC. The capture of live cells is enabled by leveraging the design of a slot pore geometry with specific dimensions to reduce the shear stress typically associated with the filtration process. While the microfilter exhibits a high capture efficiency, the release of these cells is non-trivial. Typically, only a small percentage of cells are released when techniques such as reverse flow or cell scraping are used. The strong adhesion of these epithelial cancer cells to the Parylene C membrane is attributable to non-specific electrostatic interaction. To counteract this effect, we employed the use of PIPAAm coating and exploited its thermal responsive interfacial properties to release the cells from the filter. Blood is first filtered at room temperature. Below 32 &#176;C, PIPAAm is hydrophilic. Thereafter, the filter is placed in either culture media or a buffer maintained at 37 &#176;C, which results in the PIPAAm turning hydrophobic, and subsequently releasing the electrostatically bound cells.

A protocol to utilize a poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) coated microfilter for effective capture and thermoresponsive release of viable circulating tumor cells (CTC) is presented. This method allows capture of CTC from patients&#39; blood and subsequent release of viable CTC for downstream off-chip culture, analyses and characterization.

キャプチャと血液から生存循環腫瘍細胞のリリース

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified to secrete human Prostate Specific Antigen (PSA), and the procedure for the confirmation of tumor implantation. In brief, mice are anesthetized using injectable drugs and are made to lay in the dorsal position. Urine is vacated from the bladder and 50 &#181;L of poly-L-lysine (PLL) is slowly instilled at a rate of 10 &#181;L/20 s using a 24 G IV catheter. It is left in the bladder for 20 min by stoppering the catheter. The catheter is removed and PLL is vacated by gentle pressure on the bladder. This is followed by instillation of the murine bladder cancer cell line (1 x 105 cells/50 &#181;L) at a rate of 10 &#181;L/20 s. The catheter is stoppered to prevent premature evacuation. After 1 h, the mice are revived with a reversal drug, and the bladder is vacated. The slow instillation rate is important, as it reduces vesico-ureteral reflux, which can cause tumors to occur in the upper urinary tract and in the kidneys. The cell line should be well re-suspended to reduce clumping of cells, as this can lead to uneven tumor sizes after implantation.
This technique induces tumors with high efficiency. Tumor growth is monitored by urinary PSA secretion. PSA marker monitoring is more reliable than ultrasound or fluorescence imaging for the detection of the presence of tumors in the bladder. Tumors in mice generally reach a maximum size that negatively impacts health by about 3 - 4 weeks if left untreated. By monitoring tumor growth, it is possible to differentiate mice that were cured from those that were not successfully implanted with tumors. With only end-point analysis, the latter may be mistakenly assumed to have been cured by therapy.

This protocol describes the generation of murine orthotopic bladder tumors in female C57BL/6J mice and the monitoring of tumor growth.

マウス同所性膀胱腫瘍モデルおよび腫瘍検出システム

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations and do not accurately simulate tumor biology and tumor cell dissemination. Genetically engineered mouse models have been introduced to overcome these limitations; however, such models are technically demanding, especially in large organs such as the colon in which only a single tumor is desired.
As a result, an immunocompetent, genetically engineered mouse model of colorectal cancer was developed which develops highly uniform tumors and can be used for tumor biology studies as well as therapeutic trials. Tumor development is initiated by surgical, segmental infection of the distal colon with adeno-cre virus in compound conditionally mutant mice. The tumors can be easily detected and monitored via colonoscopy. We here describe the surgical technique of segmental adeno-cre infection of the colon, the surveillance of the tumor via high-resolution colonoscopy and present the resulting colorectal tumors.

A protocol for the establishment of a genetically engineered mouse model of colorectal cancer by segmental adeno-cre infection and its surveillance via high-resolution colonoscopy is presented.

散発性結腸直腸癌の遺伝子操作マウスモデル

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In particular, endothelial cells (EC) constituting the inner surface of vessels, directly participate in oxygen delivery, nutrient supply, and removal of waste products to and from tumors, and are thereby prominently involved in the constitution of the tumor microenvironment (TME). Tumor endothelial cells (TECs) can be used as cellular biosensors of the intratumoral microenvironment established by communication between tumor and stromal cells. TECs also serve as targets of therapy. Accordingly, in culture these cells allow studies on mechanisms of response or resistance to anti-angiogenic treatment. Recently, it was found that TECs isolated from human colorectal carcinoma (CRC) exhibit memory-like effects based on the specific TME they were derived from. Moreover, these TECs actively contribute to the establishment of a specific TME by the secretion of different factors. For example, TECs in a prognostically favorable Th1-TME secrete the anti-angiogenic tumor-suppressive factor secreted protein, acidic and rich in cysteine-like 1 (SPARCL1). SPARCL1 regulates vessel homeostasis and inhibits tumor cell proliferation and migration. Hence, cultures of pure, viable TECs isolated from human solid tumors are a valuable tool for functional studies on the role of the vascular system in tumorigenesis. Here, a new up-to-date protocol for the isolation of primary EC from the normal colon as well as CRC is described. The technique is based on mechanical and enzymatic tissue digestion, immunolabeling, and fluorescence activated cell sorting (FACS)-sorting of triple-positive cells (CD31, VE-cadherin, CD105). With this protocol, viable TEC or normal endothelial cell (NEC) cultures could be isolated from colon tissues with a success rate of 62.12% when subjected to FACS-sorting (41 pure EC cultures from 66 tissue samples). Accordingly, this protocol provides a robust approach to isolate human EC cultures from normal colon and CRC.

Tumor endothelial cells are important determinants of the tumor microenvironment and the course of the disease. Here, a protocol for the isolation of pure and viable endothelial cells from human colorectal carcinoma and normal colon to be used in drug testing and pathogenesis research is described.

通常のコロンと大腸癌 - 改良されたプロトコルから人間の血管内皮細胞の分離

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful biomarkers for clinical practice. Here, we present a protocol to extract, reverse transcribe and evaluate the expression levels of circulating miRNAs from plasma samples of patients with colorectal cancer (CRC). microRNAs (miRNAs) are a class of non-coding RNAs of 18-25 nucleotides in length that regulate the expression of target genes at the translational level and play an important role, including that of pro- and anti-angiogenic function, in the physiopathology of various organs. miRNAs are stable in biological fluids such as serum and plasma, which renders them ideal circulating biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and treatment decision-making and monitoring. Circulating miRNA extraction was performed using a rapid and effective method that involves both organic and column-based methodologies. For miRNA retrotranscription, we used a multi-step procedure that considers polyadenylation at 3&#39; and the ligation of an adapter at 5&#39; of the mature miRNAs, followed by random miRNA pre-amplification. We selected a 24-miRNA custom panel to be tested by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and spotted the miRNA probes on array custom plates. We performed qRT-PCR plate runs on a real-time PCR System. Housekeeping miRNAs for normalization were selected using GeNorm software (v. 3.2). Data were analyzed using Expression suite software (v 1.1) and statistical analyses were performed. The method proved to be reliable and technically robust and could be useful to evaluate biomarker levels in liquid samples such as plasma and/or serum.

We present a protocol to evaluate the expression levels of circulating microRNA (miRNAs) in plasma samples from cancer patients. In particular, we used a commercially available kit for circulating miRNA extraction and reverse transcription. Finally, we analyzed a panel of 24 selected miRNAs using real-time pre-spotted probe custom plates.

転移性大腸癌患者における循環マイクロ Rna カスタム パネルの検出

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new tumors at distant sites. CTCs are found in the bloodstream of patients as single cells (single CTCs) or as multicellular aggregates (CTC clusters and CTC-white blood cell clusters), with the latter displaying a higher metastatic ability. Beyond enumeration, phenotypic and molecular analysis is extraordinarily important to dissect CTC biology and to identify actionable vulnerabilities. Here, we provide a detailed description of a workflow that includes CTC immunostaining and micromanipulation, ex vivo culture to assess&#160;proliferative and survival capabilities of individual cells, and in vivo metastasis-formation assays. Additionally, we provide a protocol to achieve the dissociation of CTC clusters into individual cells and the investigation of intra-cluster heterogeneity. With these approaches, for instance, we precisely quantify survival and proliferative potential of single CTCs and individual cells within CTC clusters, leading us to the observation that cells within clusters display better survival and proliferation in ex vivo cultures compared to single CTCs. Overall, our workflow offers a platform to dissect the characteristics of CTCs at the single cell level, aiming towards the identification of metastasis-relevant pathways and a better understanding of CTC biology.

Here, we present an integrated workflow to identify phenotypic and molecular features that characterize circulating tumor cells (CTCs). We combine live immunostaining and robotic micromanipulation of single and clustered CTCs with single cell-based techniques for downstream analysis and assessment of metastasis-seeding ability.

下流の分子分析と転移性電位評価のための循環腫瘍細胞のマイクロマニピュレーション

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional (3D) tumor architecture and low relevance to human cancer. Researchers have recently developed a 3D in vitro cancer model referred to as tumor organoids that can mimic the characteristics of a native tumor in a culture dish. Here, experimental procedures are described in detail for the establishment of bladder tumor organoids from a carcinogen-induced murine bladder tumor, including culture, passage, and maintenance of the resulting 3D tumor organoids in vitro. In addition, protocols to manipulate the established bladder tumor organoid lines for genetic engineering using lentivirus-mediated transduction are described, including optimized conditions for the efficient introduction of new genetic elements into tumor organoids. Finally, the procedure for orthotopic transplantation of bladder tumor organoids into the wall of the murine bladder for further analysis is laid out. The methods described in this article can facilitate the establishment of an in vitro model for bladder cancer for the development of better therapeutic options.

This protocol provides detailed experimental steps to establish a three-dimensional in vitro culture of bladder tumor organoids derived from carcinogen-induced murine bladder cancer. Culture methods including passaging, genetic engineering, and orthotopic transplantation of tumor organoids are described.

マウス膀胱腫瘍オルガノイドの培養、操作、および正体移植

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the limitations of current treatments, as the majority of patients do not respond to immunotherapy. Development of accurate preclinical models to quickly identify novel and effective therapeutic combinations are critical to address this unmet clinical need. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) is a canonical example of an immune checkpoint blockade resistant tumor with only 2% of patients responding to immunotherapy. The genetically engineered KrasG12D+/-;Trp53R172H+/-;Pdx-1 Cre (KPC) mouse model of PDA recapitulates human disease and is a valuable tool for assessing therapies for immunotherapy resistant in the preclinical setting, but time to tumor onset is highly variable. Surgical orthotopic tumor implantation models of PDA maintain the immunobiological hallmarks of the KPC tissue-specific tumor microenvironment (TME) but require a time-intensive procedure and introduce aberrant inflammation. Here, we use an ultrasound-guided orthotopic tumor implantation model (UG-OTIM) to non-invasively inject KPC-derived PDA cell lines directly into the mouse pancreas. UG-OTIM tumors grow in the endogenous tissue site, faithfully recapitulate histological features of the PDA TME, and reach enrollment-sized tumors for preclinical studies by four weeks after injection with minimal seeding on the peritoneal wall. The UG-OTIM system described here is a rapid and reproducible tumor model that may allow for high throughput analysis of novel therapeutic combinations in the murine PDA TME.

We describe a protocol for the ultrasound guided implantation of murine-derived pancreatic ductal adenocarcinoma cell lines directly into the native tumor site. This approach resulted in pancreatic tumors detectable by ultrasound scanning within 2-4 weeks of injection, and significantly reduced the proportion tumor cell seeding on the peritoneal wall as compared to surgical orthotopic implantation.

マウス膵管腺癌の超音波誘導矯正着移植

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...