この作品はMoritz Koch教授の記憶に捧げられています。

ここに提示された動物実験は、機関および政府の動物用ケアおよび使用委員会によって独立してレビューおよび承認され、実験動物連合連盟（FELASA）のガイドラインに従って実施された。すべての可能な措置は、麻酔および鎮痛、または必要な場合には早期安楽死を含む苦痛を最小限にするためにとられた。 1.外科的アデノ・クリード感染による局所腫瘍誘導<ol><li> 手術用動物の準備 注意：事実上、条件付き（「floxed」）突然変異は、本明細書に記載の方法によって誘導することができる。結腸直腸癌に関連する遺伝子、例えばApc、KrasまたはTp53における突然変異の使用が推奨される。創傷再結合の効率は、切除すべき構築物の大きさに依存する。大きなfloxed配列はあまり効率的に切除されません。全ての対立遺伝子の組換えは、PCによって腫瘍において確認されるべきであるR. <ol><li>結腸直腸腫瘍の発生のためには、CRCの基本モデル（括弧内のMGIデータベース番号）に以下の条件付き対立遺伝子のクロスを使用する： Apc tm2Rak （MGI：3688435） 16 Kras tm4Tyj （MGI：2429948） 17 Tp53 tm2Tyj （MGI：3039263） 18 </li><li>蛍光レポーターアレルが必要な場合（ 例えば 、微小転移巣を検出するために）、次のアレルを使用します： Gt（ROSA）26Sor tm6（CAG-ZsGreen1）Hze （MGI：3809522） 19 注：上記の株はすべて、NCI Mouse RepositoryまたはJackson Laboratoryから入手できます。絶食は、アデノウイルス感染の前に残っている全ての糞便を洗い流すことができるので、必要とされない。術前の絶食はより高い周術期の死亡率をもたらし、小型のげっ歯類にとっては非常に大きなストレスとなる。 </li><li>全身麻酔の場合、セボフルランを3〜3.5vol％で使用する。 tの損失彼はつま先反射が十分な麻酔を示しています。 </li><li>最初の切開の前に、0.05mg / kgのブプレノルフィンを皮下注射する。 </li><li>眼の軟膏で麻酔したマウスの目を覆い、角膜の乾燥を避ける。 </li><li>小さなテーブルの上に仰臥位にマウスを置きます。マウスを拘束するために非外傷性接着テープを使用してください。 </li><li>電気シェーバー（脱毛クリームを代わりに使用することができます）で腹部を剃り、アルコールスワブやヨウ素で消毒します。製造元が推奨する接触時間を使用してください。 </li><li>手術野を滅菌ドレープで覆う。 注：周術期抗生物質の使用はオプションであり、制度上のガイドラインの対象となります。 </li><li>すべての外科手術には、滅菌した一回使用または滅菌済みの器具を使用してください。 </li></ol></li><li> ミッドライン開腹術と結腸暴露 <ol><li>正中線を切開するためにハサミを使用する（メスを使用する）。（〜15mm）の下腹部にある皮膚を覆う。 </li><li>鉗子で腹部の筋肉組織を拾い、慎重にはさみで切開して、腹腔を開きます。 </li><li>遠位結腸を特定し、傷つきにくい鉗子でしか触れない。肛門の近位から約15mmの繊細なクランプ（ 例えば 、マイクロセリピン血管クランプ）で結腸をクランプする。 注：常にコロンの脆弱性に注意してください。穿孔は、必然的に腹膜炎および敗血症をもたらし、動物の安楽死を必要とする。 </li></ol></li><li> Adeno-creウイルスによる分節結腸感染 <ol><li>柔軟なテフロン（登録商標）チューブを経肛門的に挿入し、先に肛門縁から15mmのところに配置されたクランプによって達成される内腔閉塞に達するまで注意深く前進させる。過度の力を加えないでください。穿孔につながる可能性があります。 </li><li> 30Gカニューレでチューブをカニューレにし、標準的な1mLシリンジを接続し、コロを洗浄する残りの便を避けるために通常の生理食塩水で洗浄する。これには数mLの生理食塩水が必要な場合があります。 </li><li>遠位結腸が空になったら、チューブを取り出してそれを新鮮なテフロン（登録商標）チューブと交換し、再び上記のようにクランプの遠位に直接配置する。 </li><li>近位のクランプの遠位3mm〜2mmのクランプで結腸を閉塞する（挿入されたチューブの上、肛門から12mmのところまで）。その結果、3mmの分離された部分が感染する。 注：セグメントの遠位閉塞のために、Fogarty冠状動脈クリップは、クランプの枝間の管腔内管にもかかわらず、結腸の緊密な閉塞をもたらすゴム化されているので最も適していることが判明している。 </li><li>第2のシリンジ（30Gカニューレで標準1mL）を使用して、クランプされた結腸セグメントに0.25％トリプシン-EDTA50μLを注意深く注入し、10分間インキュベートする。液体が漏れるのを防ぐために、カニューレとシリンジをテフロンチューブに取り付けたままにしておきます。 <li>最初に、遠位のクランプを、次にトリプシンチューブを取り外す。 </li><li>約500μLの生理食塩水で遠位結腸を洗浄し、残りのトリプシンを除去する。 </li><li>新しいテフロンチューブを挿入し、遠位クランプを所定の位置に戻し、50〜80μLのアデノウイルス溶液（リン酸緩衝生理食塩水中の10 11プラーク形成単位（PFU）/ mL）で結腸セグメントを膨張させ、30分間インキュベートする図2A ）。 注：アデノクイレとの接触が条件付き突然変異マウスの組織のいずれかで腫瘍発生を引き起こす可能性があるため、ウイルス溶液をこぼさないでください。 </li><li>クランプとチューブを取り外します。 </li></ol></li><li> 腹部の閉鎖と術後の回復 <ol><li>急速に吸収される6-0で腹壁を閉じる（ 例えば 、ポリジオキサノン（PDS））。 </li><li>外科用創傷クリップで皮膚を閉じます。 </li><li>麻酔から完全に回復するまで、38℃に設定された加熱パッド上にマウスを置く。 </li><li>手術の12時間後にブプレノルフィン0.05mg / kgの別のボーラスを投与し、必要であればさらに12時間毎に追加のブプレノルフィンボーラスを投与する。 </li><li>腫瘍の成長による苦痛の徴候について少なくとも1日1回、マウスをモニターする。 </li></ol></li></ol> 2.結腸鏡検査注：使用された条件付き突然変異に応じて、アデノウイルス感染は2〜4週間以内に内視鏡的に見える腫瘍を引き起こす。したがって、アデノウィルス誘導の2週間後に最初の術後大腸内視鏡検査を行い、2週間ごとに繰り返す。ネズミ大腸内視鏡検査には市販のシステムを推奨します。 20 <ol><li> 大腸内視鏡検査用動物の調製 注：断食は必要ありませんed。残りの糞便は、通常、遠位結腸内で良好に形成され、大腸内視鏡検査中に腫瘍を越えて押し出すことができ、従って、絶食の繰り返しのストレスプロセスを不要にする。 <ol><li>全身麻酔の場合、セボフルランを3〜3.5vol％で使用する。つま先ピンチ反射の喪失は、十分な麻酔を示す。 </li><li>眼の軟膏で麻酔したマウスの眼を覆い、角膜の乾燥を避ける。 </li><li>小さなテーブルの上で仰向けにマウスを拘束します。 </li></ol></li><li> 大腸内視鏡検査 <ol><li>スコープ（直径1.9 mm、長さ10 cm）を肛門を通して腸管に挿入し、空気を注意深く吹き付けて結腸を拡張させます。検査に必要以上に空気を吹き込まないでください。 注：空気吹き込みの場合、大腸内視鏡検査システムの防曇エアポンプを使用することができます。防曇エアーポンプが利用できない場合は、非常に低い圧力設定の他のエアーポンプを使用することができます。デリケートな減圧弁で空気を吸い込みます。二酸化炭素（CO 2 ）は、小さなげっ歯類では容易にアシドーシスにつながるので避ける必要があります。 </li><li>遠位結腸内の粘膜病変が同定されるまで、慎重にスコープを前方に押します（ 図1A〜1D ）。 </li><li>後で評価するために内視鏡画像を保存します。管腔内腫瘍のための内視鏡的採点システムは以前に記載されている。 20 </li><li>慎重にスコープを取り外し、麻酔から完全に回復するまで38℃に設定された加熱パッド上にマウスを置きます。 </li></ol></li></ol>

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著者は何も開示することはない。

それらは一般に生成および維持が容易であるが、細胞系注入に基づく古典的なCRCマウスモデルは人為的であり、ヒト疾患を完全に再現することはできない。結果として、GEMMが開発された。最初のCRC GEMMは、Apc遺伝子のヘテロ接合ヌル変異を有するApc Minマウスであり、したがって、ヒト遺伝性疾患の家族性腺腫様ポリポーシス（FAP）を模倣した。しかし、Apc Minマウスは、結腸に限定されずに常に複数の腸管腺腫を発症する。また、腺腫形成の時間および正確な位置はランダムであり、腺腫が進行する前に良性腫瘍負荷のマウスが死ぬと、腫瘍は悪性病変になることはまれである。したがって、Apc Minマウスは、散発性CRCではなく、FAPのモデルである。他のモデルは、DNAミスマッチ修復遺伝子に突然変異を提示する。 22,23これらのうちのいくつかマウスは遺伝性胃腸癌の優れたモデルであり、散発性結腸直腸癌を代表するものではない。 根底にある遺伝的改変とは別に、散発性および症候性結腸直腸癌のモデルを別個に設定するのは遺伝的病変の位置である。上記モデルの全ては、腸内全体または胃腸管全体に恒常的に活性または誘導される突然変異を特徴とする。これは、ヒトの散発性CRCを代表するものではない多発性腺腫の形成をもたらし、大腸内視鏡検査ではほとんど評価できず、また、通常、腫瘍が広範囲の腫瘍負荷に晒される前に腫瘍を発達させるのに十分な時間を残さない。したがって、散発性結腸直腸癌のマウスモデルは、結腸直腸腫瘍形成の局所活性化を組み込む必要がある。 ここに提示されたGEMMで生じる腫瘍は、外科的にクランプされ、アデノイドに感染した部分に厳密に限定される結腸のこの結果、大腸内視鏡検査による検出および監視に容易にアクセスできる単一の腫瘍が形成される。加えて、遠位の位置は、腸閉塞を腫瘍増殖の遅い合併症とし、腫瘍が侵襲的になり、遺伝子型に依存して、動物が安楽死を必要とする前の転移性癌腫を生じる。分節型クリープ感染の別の利点は、影響を受けない環境である。 Apc Minおよび他の遺伝性マウスモデルでは、周囲の粘膜および間質細胞でさえ、腫瘍と同じ遺伝的異常を患っているが、ここに提案されたモデルの腫瘍は正常な結腸上皮および間質内に発生する。これにより、制限なく、より現実的な腫瘍 - 宿主相互作用および分子研究が可能になる。さらに、このモデルでは、腫瘍誘導の時点が明確に定義されています。 Apc Minマウスにおいて、第2のApc対立遺伝子が確率的である「第2のヒット」後に腫瘍が発生する任意の時点で喪失すると、本明細書に記載のモデルでは全ての所望の突然変異が同時に活性化され、非常に早期の病変または連続生検の研究が非常に明確に認められる。 しかし、このモデルにも限界があります。複数の対立遺伝子を1つのモデルに渡すには、膨大な時間とリソースが必要です。さらに、不適切な遺伝子型のために、しばしば全ての子孫が実験に使用されるわけではない。手順自体は練習を必要とし、時間がかかる。十分に高い力価および大量のアデノ - クリーウイルス懸濁液の製造は、費用がかかる。したがって、このモデルは他のすべてのCRCマウスモデルを置き換えるのには適しておらず、GEMモデルに重点を置いた研究室に限定されます。 プロトコルそのものは技術的に要求されていますが、一部の訓練では非外科医が適切に手順を実行することができます。アデノ - クリスの間の重要なステップnfectionはクランプされた腸セグメントの膨張です - 過剰な管腔内圧は穿孔につながり、不十分な圧力は感染の成功率を低下させます。このステップではトレーニングが必要です。 遠位結腸のアデノウイルス感染のためのプロトコールは、Hung et al。前。 13ここで提示されたプロトコルは、いくつかの重要な点で前述のプロトコルとは異なります。未熟な手の中で頻繁に腸管穿孔を引き起こすので、アデノイドインキュベーション前の粘膜の機械的擦過傷は本プロトコールでは省略される。これは腫瘍形成の速度を低下させるが、ウイルス力価の増加によって中和され得る。このようにして、粘膜擦過を伴わないと、腸壁内の間葉細胞が少ないことがアデノクリスに曝露されるため、間葉性腫瘍の割合も低下させることができる。 また、上記のプロトコル13とは対照的に、ここでは手術または大腸内視鏡検査の前に一晩の絶食を推奨していない。その代わりに、腸の洗浄、または大腸内視鏡検査の場合、簡単な機械的操作を用いて残りの糞便物質を除去する。プロトコールのこの改良は、動物の福祉を劇的に改善する。一晩絶食は、小さなげっ歯類にとって非常にストレスの多い手順であり、実験結果にも影響を及ぼす、マウスの代謝に強く影響することが知られている。 24,25この一晩絶食のこれらの望ましくない影響は、ここに提示された原稿で避けることができます。 ここに提示されたプロトコルと、Hungらのプロトコルとの間の別の重要な相違点は、クランプされた（したがって感染した）セグメントの長さです。ここに記載されたプロトコルは短い長さ（約3mm）を推奨しているが、Hungら遠位結腸の20mmを感染させることを推奨する。より短いセグメント長が選択されて番号が減少する再結合した陰窩および結果として生じる腫瘍の減少をもたらす。散発性CRCを有する患者の大多数は、複数の腫瘍よりむしろ単一の腫瘍を発症するので、この方法はモデルの臨床的関連性を高める。腫瘍形成の速度は、感染した結腸の表面の減少によって影響されないようである。 この技術の将来的な応用には、結腸粘膜内で局所的な再結合を必要とする全てのプロトコルが含まれる。がん研究のほとんどのアプリケーションには、結腸直腸腫瘍の形成をもたらす条件付き癌遺伝子が含まれます。しかしながら、結腸粘膜内のレポーター構築物を誘導するような他の全ての適用は、ここに提示されたプロトコールによっても達成され得る。 結論として、非常に洗練された遺伝子操作された結腸直腸癌マウスモデルと、進行中の腫瘍の検出およびサーベイランスのための高解像度大腸内視鏡検査の選択肢CRCの生物学と治療法を研究する優れた環境です。

結腸直腸癌（CRC）は、西洋諸国における癌関連死の主要な原因の1つであり続けている。 1早期の病気の患者の予後は良好であるが、後の段階で多くの腫瘍が診断され、多くの治療法にもかかわらず、予後は限られている。 2,3,4,5 CRCの現在のマウスモデルの大部分は、細胞株または患者腫瘍由来の腫瘍細胞の免疫不全マウスへの移植に基づいている。これは、注射部位および注射のために使用される腫瘍細胞に応じて、局所的に、そして時には転移性腫瘍に至る。しかしながら、得られた異種移植片モデルは、r制限。それらは免疫不全マウスに確立されなければならず、したがって腫瘍と宿主免疫系との間の複雑な相互作用が排除されなければならない。さらに、腫瘍間質は宿主細胞に由来するので、ヒト腫瘍実質とマウス間質との間の相互作用は欠陥があり、したがって疾患を代表するものではない。これらの欠点は、注射のためのネズミ細胞株の使用によって回避することができる。しかしながら、ごくわずかなマウスCRC細胞株しか入手できず、ほとんどの利用可能なヒトCRC細胞株と同様に、モノクローナルであり、非常に未分化である。要約すると、現在利用可能なほとんどのCRCマウスモデルは、高度に人工的であり、ヒト疾患を完全には代表していない。 CRCの遺伝子操作マウスモデル（GEMM）は、結腸内のCRCの主要な突然変異の誘導を介して生成される本物のマウス腫瘍を特徴とするので、これらの欠点を回避することができる。 図12 、図 13 、これは、結腸直腸粘膜内のcreリコンビナーゼによる条件付き（floxed）生殖系列突然変異の活性化によって達成することができる。多くの他の腫瘍実体のGEMMにおいて、組織特異的プロモーターによって駆動される生殖系列（誘導性）cre発現が使用されるが、生殖系列クリスは大腸内で多数の腺腫を導き、良性腫瘍負荷による死を引き起こすので、非常に若い年齢。したがって、本明細書に記載のモデルでは、creを発現するアデノウイルスベクターを用いて、短い結腸セグメントを感染させる。これは、研究者によって定義された時点で粘膜のこの部分内で腫瘍形成の誘導をもたらし、最終的に浸潤性および転移性の癌腫に進行する腺腫をもたらす。腫瘍は本物のマウス腫瘍であり、無傷の微小環境で増殖し、したがって、腫瘍 - 宿主相互作用および転移性カスケードを含む結腸直腸発癌の全体をシミュレートすることができる。このモデルはしたがって、癌の生物学および前臨床的治験の研究のための魅力的なプラットフォームです。 遺伝的に操作されたマウスモデルのCRCの主な欠点は、その技術的な複雑さです。 floxed Apc対立遺伝子を保有するマウスの直腸アデノ - クリード敵を用いた局所クリ - ク送達は以前に記載されている;しかし、腸腫瘍の発生率、多重度および位置は、この技術によって非常に変化し得る。したがって、誘発されるべき部分の外科的締め付けによるアデノ - クリー感染を制限する技術が開発されている。 13動物の福祉を改善し、死亡率と結果として生じる腫瘍の数を減らすために、この手順を変更しました。このプロトコールにより、小型げっ歯類手術の経験を有する全てのラボは、モデルを再現し、再現性が高く、大腸内視鏡に容易にアクセス可能な腫瘍を生成することができなければならない。条件付きのm腫瘍形成に使用される胎盤、腺腫、浸潤性癌および転移の全スペクトルが観察され得る。腫瘍は遠位結腸に位置するため、このモデルでは容易にシリアル内視鏡検査が可能です。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents / consumables&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Normal saline 0.9% (E154)</td><td>Serumwerk Bernburg AG</td><td>10013</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad injectabilia</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>235144</td><td></td></tr><tr><td>Ad5CMV-Cre (adenovirus, c = 2E+11 PFU/mL)</td><td>Gene Transfer Vector Core&lt;br/&gt; University of Iowa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL, 50 mL centrifuge tubes</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>188271/227270</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes 1.5 mL/ 2 mL</td><td>Sarstedt AG &amp;amp; Co.</td><td>72,695,400</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish PS 100/15 mm (sterile, Nuclon)</td><td>Fisher Scientific GmbH</td><td>10508921/ NUNC150350</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO</td><td>Braun/neoLab</td><td>194291661</td><td></td></tr><tr><td>30G injection needle</td><td>BECTON DICKINSON</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Analgesia / anesthesia&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie)</td><td>AbbVie Germany GmbH &amp;amp; Co. KG</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Medical oxygen</td><td>Air Liquide Medical GmbH</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine (Temgesic)</td><td>Indivior Eu Ltd.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen - ophthalmic ointment</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>10047757</td><td></td></tr><tr><td>Table Top Research Anesthesia Machine x/O2 Flush w/ Sevoflurane Vaporizer</td><td>Parkland Scientific</td><td>V3000PS/PK</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Surgical Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellulose swabs</td><td>Lohmann &amp;amp; Rauscher Deutschland</td><td>13356</td><td></td></tr><tr><td>Insulin syringe EMG 1 mL (with 30G cannula)</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>9161627S</td><td></td></tr><tr><td>Fine Bore Tubing (bore: 0.28 mm/ diameter: 0.61mm)</td><td>Smiths Medical Deutschland</td><td>800/100/100</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Adson Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissor - ToughCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Olsen-Hegar Needle Holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip Kit</td><td>Fine Science Tools</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture)</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson Medical GmbH</td><td>Z1012H</td><td></td></tr><tr><td>Curved Micro Serrefine Vascular Clamp</td><td>Fine Science Tools</td><td>18055-05</td><td></td></tr><tr><td>Fogarty Spring Clips</td><td>Edwards</td><td>CDSAFE 6</td><td></td></tr><tr><td>Hot Plate 062</td><td>Labotect</td><td>13854</td><td></td></tr><tr><td>Isis - Hair shaver</td><td>Aesculap - Braun</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Colonoscopy&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cold Light Fountain XENON 175 SCB</td><td>Karl Storz</td><td>20132101-1</td><td>Karl Storz Coloview System Mainz</td></tr><tr><td>Fiber Optic Light Cable</td><td>Karl Storz</td><td>69495NL</td><td>Karl Storz Coloview System Mainz</td></tr><tr><td>TRICAM Three-Chip Camera Head</td><td>Karl Storz</td><td>20221030</td><td>Karl Storz Coloview System Mainz</td></tr><tr><td>TRICAM SLII Camera Control Unit</td><td>Karl Storz</td><td>20223011-1</td><td>Karl Storz Coloview System Mainz</td></tr><tr><td>15&quot; Flat Screen Monitor EndoVue</td><td>Karl Storz</td><td>9415NN</td><td>Karl Storz Coloview System Mainz</td></tr><tr><td>HOPKINS Straight Forward Telescope&lt;br/&gt; diameter 1.9 mm; length 10 cm&lt;br/&gt; autoclavable&lt;br/&gt; fiber optic light transmission incorporated</td><td>Karl Storz</td><td>64301AA</td><td></td></tr><tr><td>Protection and Examination Sheath</td><td>Karl Storz</td><td>61029C</td><td></td></tr></tbody></table>

a genetically engineered mouse model of sporadic colorectal cancer

腫瘍細胞注入に基づく結腸直腸癌マウスモデルは、容易な適用性および費用対効果の利点があるにもかかわらず、厳しい制限があり、腫瘍生物学および腫瘍細胞の播種を正確にシミュレートしない。これらの制限を克服するために、遺伝子操作されたマウスモデルが導入された。しかしながら、そのようなモデルは、特に単一の腫瘍のみが望ましい大腸のような大きな器官において、技術的に要求されている。 その結果、非常に均一な腫瘍を発達させ、腫瘍生物学的研究および治療的試験に使用することができる、免疫担当者で遺伝子操作された結腸直腸癌のマウスモデルが開発された。腫瘍発達は、化合物の条件付き突然変異マウスにおいて、遠位結腸のアデノ - クリーウイルスによる外科的、部分的感染によって開始される。腫瘍は、大腸内視鏡検査によって容易に検出および監視することができる。我々はここで、結腸、高解像度大腸内視鏡検査による腫瘍の監視、および結果として得られる結腸直腸腫瘍の提示。

適切に実施すると、&gt; 85％の動物が腫瘍を発症する。ここに提示された外科手術の死亡率は&lt;5％であり、大腸内視鏡検査の死亡率は事実上存在しない。大部分のマウスでは、単一の病変が検出される。腫瘍誘導後2〜3週間以内に単一の腫瘍に通常融合する2〜3個の小さな腺腫を約30％で検出することができる。 得られる腫瘍の表現型および生物学的挙動は、動物の条件的変異に大きく依存する。 Apcの局所的な仲介型ノックアウトは、腫瘍形成を誘導するのに十分であり、最初はアデノーマに導き、アデノウイルス感染の2〜4週間後に検出され、12〜16週間以内に侵襲性腺癌に進行する。このプロセスは、条件付発癌性Kras突然変異（Kras G12D）を加えることによって加速され得、結果として生じる腫瘍は、迅速に侵襲性腺癌。発癌性のTp53 R172Hを添加すると、腫瘍は浸潤性および転移性の癌腫に迅速に進行する。生存は腫瘍の遺伝子型に強く依存する。通常、腫瘍誘導後約80〜200日である。大多数の症例における死因は、腫瘍増殖に続発する大腸閉塞である。 腫瘍は、動物に大きなストレスを与えることなく、大腸内視鏡検査（ 図1 ）によって容易かつ繰り返しモニターすることができる。 疾患症状はヒトCRCと非常によく似ている。動物は遠位結腸の腺腫および最終的に腺癌を発症する（ 図2B、2C、2F ）。マウスの条件的な遺伝子型に依存して、腫瘍はまた、肝臓（ 図 2D ）、肝臓（ 図2E ）および稀に<html>肺（図示せず）。 creレポーター対立遺伝子（ 例えば 、ZSGreen 19 ）を使用すると、すべての腫瘍症状を容易に同定することができる。 ZSGreenレポーター対立遺伝子は、昼間に見えるほど明るい蛍光タンパク質発現を特徴とする（ 図1B 、 図2C ）。 組織学的には、発生する腫瘍の95％が腺癌である。腫瘍の約5％は間葉起源であり、 例えば 、線維肉腫または平滑筋肉腫であり、恐らくアデノクリスに感染した間質細胞から発生すると考えられる。腺癌の組織形態学は、非侵襲性腺腫から周辺構造に侵入する腺癌までの全スペクトルを特徴とするヒトCRCと非常に類似している（ 図3A〜3C ）。 <html> files / ftp_upload / 55952 / 55952fig1.jpg &quot;/&gt; 図1.結腸直腸腫瘍のコロノスコピー画像（括弧内の動物の条件付きアレル）。 A.正常な遠位結腸。 B.アデノクリーシス2週間後の早期腺腫。このマウスのGFPレポーターアレルによる緑色に注意してください。 （Apc tm2Rak 、Kras tm4Tyj 、Gt（ROSA）26Sor tm6（CAG-ZsGreen1）Hze ）。 C.後期腺腫（Apc tm2Rak 、Kras tm4Tyj ）。 D.結腸直腸腺癌（大腸内視鏡画像が得られた後の病理により診断された; Apc tm2Rak 、Kras tm4Tyj 、Tp53 tm2Tyj ）。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55952/55952fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> 2.jpg &quot;/&gt; 図2. A.術中サイトラ。ラージサイズのゴム付Fogartyクリップが下部にあり、経肛門的に挿入されたチューブはアデノイド注入用です（赤い矢印）。結腸直腸腫瘍（白矢印）は、アデノ - クレ感染の8週間後に連続して大腸が閉塞する（Apc tm2Rak 、Kras tm4Tyj 、Tp53 tm2Tyj ）。結腸直腸腫瘍（白矢印）アデノ - クレブス感染の10週間後（Apc tm2Rak 、Kras tm4Tyj 、Gt（ROSA）26Sor tm6（CAG-ZsGreen1）Hze ）。このマウスの緑色蛍光タンパク質（GFP）レポーター対立遺伝子に起因する緑色に注意してください。 D. GEMM（Apc tm2Rak 、Kras tm4Tyj 、Tp53 tm2Tyj ）における腹膜発癌（黒矢印）。肝臓と腸が除去され、腎臓と横隔膜が暴露された。 E.アデノイドの12週間後のGEMMにおける総肝臓転移（Apc tm2Rak 、Kras tm4Tyj ）。 F. 図2Cに示す動物から取り出した後の腫瘍を有する結腸。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55952/55952fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55952/55952fig3.jpg" /> 図3. GEMMからの結腸直腸腫瘍のヘマトキシリン/エオシン（H / E）染色切片。 A.粘膜、粘膜下粘膜および筋肉粘膜の浸潤を伴う正常粘膜から腺癌への移行領域（Apc tm2Rak 、Kras tm4Tyj ）。 B.正常結腸粘膜から浸潤性腺癌への移行領域（Apc tm2Rak 、Kras tm4Tyj ）。周囲組織の浸潤を伴う高悪性度腺癌（Apc tm2Rak、Kras tm4Tyj 、Tp53 tm2Tyj ）。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55952/55952fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

散発性結腸直腸癌の遺伝子操作マウスモデル

分節型アデノクロス感染による結腸直腸癌の遺伝子操作されたマウスモデルの確立および高解像度大腸内視鏡によるその監視が提示されている。

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.4K ビュー.  Technische Universität Dresden. 分節型アデノクロス感染による結腸直腸癌の遺伝子操作されたマウスモデルの確立および高解像度大腸内視鏡によるその監視が提示されている。 

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Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate tumor biology and tumor cell dissemination. Orthotopic mouse models have been introduced to overcome these limitations; however, such models are technically demanding, especially in hollow organs such as the large bowel. In order to produce uniform tumors which reliably grow and metastasize, standardized techniques of tumor cell preparation and injection are critical. 
We have developed an orthotopic mouse model of colorectal cancer (CRC) which develops highly uniform tumors and can be used for tumor biology studies as well as therapeutic trials. Tumor cells from either primary tumors, 2-dimensional (2D) cell lines or 3-dimensional (3D) organoids are injected into the cecum and, depending on the metastatic potential of the injected tumor cells, form highly metastatic tumors. In addition, CTCs can be found regularly. We here describe the technique of tumor cell preparation from both 2D cell lines and 3D organoids as well as primary tumor tissue, the surgical and injection techniques as well as the isolation of CTCs from the tumor-bearing mice, and present tips for troubleshooting.

We describe the establishment of orthotopic colorectal tumors via injection of tumor cells or organoids into the cecum of mice and the subsequent isolation of circulating tumor cells (CTCs) from this model.

結腸直腸癌モデルマウスにおける循環腫瘍細胞の単離

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

がん研究

Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

The traditional subcutaneous tumor model is less than ideal for studying colorectal cancer. Orthotopic mouse models of colorectal cancer, which feature cancer cells growing in their natural location, replicate human disease with high fidelity. Two techniques can be used to establish this model. Both techniques are similar and require mouse anesthesia and laparotomy for exposure of the cecum. One technique involves injection of a colorectal cancer cell suspension into the cecal wall. Cancer cells are first grown in culture, harvested when subconfluent and prepared as a single cell suspension. A small volume of cells is injected slowly to avoid leakage. The other technique involves transplantation of a piece of subcutaneous tumor onto the cecum. A mouse with a previously established subcutaneous colorectal tumor is euthanized and the tumor is removed using sterile technique. The tumor piece is divided into small pieces for transplantation to another mouse. Prior to transplantation, the cecal wall is lightly damaged to facilitate tumor cell infiltration. The time to developing primary tumors and liver metastases will vary depending on the technique, cell line, and mouse species used. This orthotopic mouse model is useful for studying the natural progression of colorectal cancer and testing new therapeutic agents against colorectal cancer.

Two techniques can be used to establish this model: injection of a cancer cell suspension into the cecal wall or transplantation of a piece of subcutaneous tumor onto the cecum. This model is useful for studying the natural progression of colorectal cancer and testing new therapeutic agents against colorectal cancer.

大腸癌の同所性マウスモデル

The traditional subcutaneous tumor model is less than ideal for studying colorectal cancer. Orthotopic mouse models of colorectal cancer, which feature ...

生物学

Modeling Colitis-Associated Cancer with Azoxymethane (AOM) and Dextran Sulfate Sodium (DSS)

Individuals with inflammatory bowel disease (IBD), such as Crohn's disease (CD) or ulcerative colitis (UC) are at increased risk of developing colorectal cancer (CRC) over healthy individuals. This risk is proportional to the duration and extent of disease, with a cumulative incidence as high as 30% in individuals with longstanding UC with widespread colonic involvement.1 Colonic dysplasia in IBD and colitis associated cancer (CAC) are believed to develop as a result of repeated cycles of epithelial cell injury and repair while these cells are bathed in a chronic inflammatory cytokine milieu.2 While spontaneous and colitis-associated cancers share the quality of being adenocarcinomas, the sequence of underlying molecular events is believed to be different.3 This distinction argues the need for specific animal models of CAC.
Several mouse models currently exist for the study of CAC. Dextran sulfate sodium (DSS), an agent with direct toxic effects on the colonic epithelium, can be administered in drinking water to mice in multiple cycles to create a chronic inflammatory state. With sufficient duration, some of these mice will develop tumors.4 Tumor development is hastened in this model if administered in a pro-carcinogenic setting. These include mice with genetic mutations in tumorigenesis pathways (APC, p53, Msh2), as well as mice pre-treated with genotoxic agents (azoxymethane [AOM], 1,2-dimethylhydrazine [DMH]).5 
The combination of DSS with AOM as a model for colitis associated cancer has gained popularity for its reproducibility, potency, low price, and ease of use. Though they have a shared mechanism, AOM has been found to be more potent and stable in solution than DMH. While tumor development in other models generally requires several months, mice injected with AOM and subsequently treated with DSS develop adequate tumors in as little as 7-10 weeks.6, 7 Finally, AOM and DSS can be administered to mice of any genetic background (knock out, transgenic, etc.) without cross-breeding to a specific tumorigenic strain. Here, we demonstrate a protocol for inflammation-driven colonic tumorigenesis in mice utilizing a single injection of AOM followed by three seven-day cycles of DSS over a 10 week period. This model induces tumors with histological and molecular changes closely resembling those occurring in human CAC and provides a highly valuable model for the study of oncogenesis and chemoprevention in this disease.8

Modeling Colitis-Associated Cancer with Azoxymethane AOM and Dextran Sulfate Sodium DSS

We demonstrate a protocol in which administration of the genotoxic agent azoxymethane (AOM) followed by three cycles of the pro-inflammatory agent dextran sulfate sodium (DSS) rapidly and consistently generates colon tumors in mice with morphologic and molecular similarities to those seen in human colitis-associated cancer.

アゾキシメタン（AOM）とデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）によるモデリング大腸炎関連癌

Individuals with inflammatory bowel disease (IBD), such as Crohn's disease (CD) or ulcerative colitis (UC) are at increased risk of developing colorectal ...

医学

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) are a rigorous method for studying mammalian development and disease. Our laboratory has developed several GEMMs of prostate cancer (PCa) that lack expression of one or multiple tumor suppressor genes using the site-specific Cre-loxP recombinase system and a prostate-specific promoter. In this article, we describe our method for necropsy of these PCa GEMMs, primarily focusing on dissection of mouse prostate tumors. New methods developed over the last decade have facilitated the culture of epithelial-derived cells to model organ systems in vitro in three dimensions. We also detail a 3D cell culture method to generate tumor organoids from mouse PCa GEMMs. Pre-clinical cancer research has been dominated by 2D cell culture and cell line-derived or patient-derived xenograft models. These methods lack tumor microenvironment, a limitation of using these techniques in pre-clinical studies. GEMMs are more physiologically-relevant for understanding tumorigenesis and cancer progression. Tumor organoid culture is an in vitro model system that recapitulates tumor architecture and cell lineage characteristics. In addition, 3D cell culture methods allow for growth of normal cells for comparison to tumor cell cultures, rarely possible using 2D cell culture techniques. In combination, use of GEMMs and 3D cell culture in pre-clinical studies has the potential to improve our understanding of cancer biology.&#160;

We show a method for necropsy and dissection of mouse prostate cancer models, focusing on prostate tumor dissection. A step-by-step protocol for generation of mouse prostate tumor organoids is also presented.

前立腺癌の遺伝子組み換えマウスモデルからの腫瘍オルガノイドの生成

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

遺伝学

Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor types, numerous mouse models have been developed in order to investigate the next generation of cancer therapies. However, in GIST, most in vivo studies use xenograft mouse models which have inherent limitations. Here, we describe an immunocompetent, genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor harboring a KitV558&#916;/+ mutation. In this model, mutant KIT, the oncogene responsible for most GISTs, is driven by its endogenous promoter leading to a GIST which mimics the histological appearance and immune infiltrate seen in human GISTs. Furthermore, this model has been used successfully to investigate both targeted molecular and immune therapies. Here, we describe the breeding and maintenance of a KitV558&#916;/+ mouse colony. Additionally, this paper details the treatment and procurement of GIST, draining mesenteric lymph node, and adjacent cecum in KitV558&#916;/+ mice, as well as sample preparation for molecular and immunologic analyses.

The goal of this manuscript is to describe the KitV558&#916;/+&#160;mouse model and techniques for successful dissection and processing of mouse specimens.

消化管間質腫瘍の遺伝子操作マウスモデルにおける分子および免疫学的技術

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

乳癌の新規トランスジェニックマウスモデル：アデノ-Creを持つ乳管上皮の標的とすることにより、転移性乳癌の開始

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Modeling Prostate Cancer in Genetically-engineered Mouse Models: A CRISPR/Cas9-mediated Localized Gene Editing Technique in Mouse Anterior Prostate Lobe Cells

Source: Riedel, M. et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/57525" target="_blank">Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video describes a method for editing specific genes in prostate gland cells using an adenovirus-based delivery system. The approach allows for orthotopic and localized alteration of gene expression utilizing CRISPR technology to develop novel mouse models for prostate cancer.

遺伝子改変マウスモデルにおける前立腺癌のモデリング:マウス前立腺葉細胞におけるCRISPR/Cas9媒介局所遺伝子編集技術

Source: Riedel, M. et al. Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration. J. Vis. Exp. (2018)
This video describes a method ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

前立腺がん

動物モデル研究

Segmental Adeno-Cre Infection: A Technique to Generate Isolated Colorectal Cancer using Genetically Engineered Mouse Models

Source: Betzler, A. M., et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/55952"> A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2017).
This video describes the generation of a colorectal mouse model by segmental adeno-cre infection. The infected colon segment leads to tumorigenesis within this segment of the mucosa, resulting in adenomas ultimately progressing to invasive and metastatic carcinoma. This model is an attractive platform for studies of cancer biology and preclinical therapeutic trials.

分節性Adeno-Cre感染:遺伝子改変マウスモデルを用いた単離大腸がん作製技術

Source: Betzler, A. M., et al.  A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer.&#160;J. Vis. Exp. (2017).
This video describes the ...

大腸がん

Spontaneous Metastasis Mouse Models: A Platform to Study the Metastatic Potential of Orthotopically Injected Colorectal Cancer Cells

Source: Okazawa, Y., et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/57374"> High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2018).
This video describes the protocol to establish a spontaneous metastasis mouse model of colorectal cancer patient-derived xenografts or PDXs. These xenograft models partially mimic the features of human carcinomas and understand the critical aspects of human malignancies, including invasion and metastasis.&#160;

自然転移マウスモデル:同所注射された結腸直腸癌細胞の転移能を研究するためのプラットフォーム

Source: Okazawa, Y., et al.  High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a ...

Generating PDOX Mouse Model of Colorectal Cancer: Studying Progression of Colorectal Cancer in a Murine Model

Source: &#160;Moret, R. et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/59223"> Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the protocol for generating a patient-derived orthotopic xenograft colorectal cancer mouse model to study the progression of colorectal cancer cells in non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency (NOD/SCID) mice. This murine model helps in understanding primary tumor growth and metastases pattern.

大腸癌のPDOXマウスモデルの生成:マウスモデルにおける大腸癌の進行の研究

Source: &#160;Moret, R. et al.  Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and ...