עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הגרמנית (WE 3548 / 4-1) ו- Roland-Ernst-Stiftung for Gesundheitswesen (1/14).

ניסויים בבעלי חיים שהוצגו כאן נבדקו באופן עצמאי והותר על ידי מוסד וועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש בבעלי חיים ונערכו על פי הנחיות הפדרציה של המעבדה למדעי בעלי חיים (FELASA). כל האמצעים האפשריים נלקחו כדי למזער את הסבל כולל הרדמה ומשכך כאבים או, אם יש צורך, המתת חסד מוקדמת. 1. הכנת תאים ואורגנואידים הערה: השתמש בנפח של 20 μL עם 100,000 תאים עבור כל זריקה. השתמש במטריצה ​​קרום במרתף (BMM) על מנת למנוע דליפה ו להבטיח הזרקת סטנדרטי. על מנת להבטיח תוצאות לשחזור, לנהל מבחני אימות קו התא ( למשל , באמצעות פרופיל STR) במרווחי זמן קבועים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת השעיות תא ראשוני מ רקמות טריות הערה: תמיד לעבוד בתנאים סטריליים. העברה מיידית של טרירקמות resected מחדר הניתוח למעבדה על הקרח נדרש כדי להבטיח את הכדאיות של התאים. רווחת המטופל והטיפול המיטבי חייבים להיות תמיד העדיפות הראשונה. לכן, דגימות רקמות למחקר חייב להתקבל באופן שאינו מפריע לעבודת הפתולוגי שלאחר מכן ובימוי של הגידול resected. ברוב המקרים, לכן סביר לקבל את דגימות למחקר שהושג על ידי הפתולוג מאומן על מנת להבטיח אי-הפרעה עם האבחון הפתולוגי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר הסרת סטרילית מן הדגימה resected (אידיאלי ~ 1 ס&quot;מ 3 ), במקום מדגם רקמות בצינור 50 מ&quot;ל מראש מלא עם 20-30 מ&quot;ל של מלוחים שנאגרו מלוחים פוספט (PBS). חנות הצינור על הקרח ולהעביר את המעבדה מיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הרקמה בצלחת פטרי לשטוף אותו פעמיים עם הרבה PBS כדי להסיר את הדם הנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות (~ 2-4 מ&quot;מ) עם scaLpel ( לדוגמה , עם להב מס &#39;20 או # 36). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש דיסוציאטור על פי הוראות היצרן על מנת לנתק עוד את רקמת הגידול אל ההשעיה תא בודד. לחלופין, להשתמש בפרוטוקולים אחרים של עיכול הגידול האנזימטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים של ההשעיה תא בודד וכתוצאה מכך ( למשל , בדלפק coulter או hemocytometer). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה (5 דקות ב 1500 xg) ולשטוף את ההשעיה התא פעמיים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים BMM בריכוז של 5 x 10 6 תאים / מ&quot;ל ​​ולשמור אותם על הקרח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת שורות תאים להזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את כל שורות תאים סרטניים המעי הגס תחת תנאים קולטורינג סטנדרטיים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ) ולהכין אותם ביום הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים על פי תקן פרוטוקולים תרבות התא, לספור את התאים ( למשל , ב coulter הדלפק או hemocytometer) ולחשב את reqUired כמות עבור כל זריקות בהתאם למספר בעלי חיים להיות מוזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 3-5x של נפח צורך בפועל בחשבון pipetting הפסדים נפח מת של מזרק ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה (5 דקות ב 1500 גרם) לשטוף את ההשעיה התא פעמיים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים BMM בריכוז של 5 x 10 6 תאים / מ&quot;ל ​​ולשמור אותם על הקרח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה אורגנואידית הערה: כל התרבויות האורגנואידים 3D גדלים בתנאים רגילים culturing (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ). פרוטוקולים מפורטים לתרבות אורגנואידית פורסמו לפני כן. 18 , 19 , 20 בדומה שורות תאים קונבנציונאלי, אנו ממליצים נפח של 20 BMM μL עם 100,000 תאים לכל הזרקת. האורגנואידים מוכנים ביום הניתוח כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדיום הבא (בהפניה הבאהכדי DMEM / F12 + +): מתקדם Dulbecco השתנה בינוני של הנשר (DMEM) / F12 + 1% HEPES (1M) + 1% גלוטמין (200 מ&quot;מ) + 1% פניצילין / סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום מילוי צינורות 15 מ&quot;ל עם 1 מ&quot;ל DMEM / F12 + +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב את האורגנואים מפני השטח של צלחת התרבות ולהעביר את התוכן של 3 עד 5 בארות לתוך צינור 15 מ&quot;ל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשבור את organoids לתוך חתיכות קטנות יותר על ידי pipetting אותם למעלה ולמטה עם פיפטה זכוכית ממושכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל DMEM / F12 + + אל הצינור, ואחריו צנטריפוגה ב XG 1000 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant, resuspend גלולה ב 600 μL חיץ דיסוציאציה μL ולהעביר את ההשעיה היטב אחד של צלחת 6-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 1-5 דקות ולאחר מכן בזהירות pipet ההשעיה מעלה ומטה על מנת להמיס את האורגנואידים. הערה: בדוק את העיכול באמצעות מיקרוסקופ; הוא שלם כאשר כל אשכולות התא היו לנתקד לתאים בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם אכול מוצלח, להוסיף 1.4 מ&quot;ל של DMEM / F12 + + כדי לעצור את העיכול. ואז להעביר את כל הבארות של אורגנואידים מתעכל צינור 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את התאים ולחשב את הסכום הנדרש עבור כל הזריקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 3 - 5x של נפח צורך בפועל בחשבון pipetting הפסדים נפח מת של מזרק ההזרקה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה (5 דקות ב 1500 xg) ולשטוף את ההשעיה התא פעמיים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspended התאים BMM לריכוז של 5 x 10 6 תאים / מ&quot;ל ​​ולשמור אותם על הקרח. </li></ol></li></ol> 2. דגם עכבר Orthotopic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת חיות הנמען לניתוח הערה: השתמש 6-8 שבועות בן NOD.Cg-Prkdc SCID Il2rg tm1Wjl / SzJ (NOD גמא SCID, NSG) עכברים כמקבל. 21 NSG הם בין עכברים immunocompromised ביותר, חסר בוגרים, T ו- NK תאים יחד עם מספר רב של חיסון אחר De. 21 הם לגדול באופן אמין גידולים גם אם מספר תאים נמוך מוזרקים והם נוטים מאוד גרורות רחוקות. עכברי NSG הם מגדלים מעולה יכול להישמר קונבנציונאלי ספציפי פתוגן חינם (SPF) יחידות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני החתך הראשון, להזריק 0.05 מ&quot;ג / ק&quot;ג של בופרנורפין תת עורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש sevoflurane ב 3-3.5 כרך% עבור הרדמה כללית. אובדן רפלקס קמצוץ הבוהן מעיד על הרדמה מספקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את העיניים של עכברים הרדים עם משחה עיניים כדי למנוע התייבשות של הקרנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסן את העכברים במצב שכיבה על שולחן קטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את הבטן עם מכונת גילוח חשמלית (קרם דפילציה ניתן להשתמש לחילופין) לחטא עם לפחות 3 פעמים clorhexidine / יוד ו 70% אלכוהול לחילופין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות את שדה כירורגי עם וילונות סטריליים. הערה: השימוש באנטיביוטיקה perioperative הוא אופציונלי ובכפוף להנחיות מוסדיות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Midline laparotomy וחשיפה של cecum <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים (אזמלים ניתן להשתמש לחילופין) לעשות חתך קו האמצע קטן (3 - 5 מ&quot;מ) של העור על הבטן התחתונה. להרים את שרירי דופן דופן הבטן עם מלקחיים בזהירות לחתוך אותו במספריים, ובכך לפתוח את חלל הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות בזהירות exteriorize את cecum עם מלקחיים atraumatic. מקם את העטיפה הסופית העיוורת של cecum על הבטן הצביע cranially. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר exteriorized, לשמור על cecum לחות באמצעות מלוחים חמים מלוחים בכל עת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זריקה אורתופטית, סגירת הבטן והחלמה לאחר הניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזרקת intracecal, להשתמש מזרק 1 מ&quot;ל רגיל עם צינורית 30 G. הר זה מזרק על משאבת microinjection, אשר בתורו רכוב על micromanipulator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לתפוס את קצה cecum עם מלקחיים atraumatic בעדינות להחליק אותו על ידי stroking אותו למטהד עם קבוצה שנייה של מלקחיים מולחמים עם מלוחים חמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את הצינור ישירות מעל cecum. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים הבאים תחת שליטה חזותית עם מיקרוסקופ כירורגי בינוקולרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לתפוס את cecum עם שני מלקחיים atraumatic בשני הקצוות של החלק exteriorized של cecum, מעט למתוח אותו ואז לאט למשוך אותו על צינורית אשר ממוקם מקביל ומעל ישירות. זה חיוני לא לנקב את כל דופן המעי (ובכך להזריק את התאים לתוך לומן), כמו גם לא לחורר את serosa מעבר לנקודת החדירה הראשונית, כמו זה יוביל דליפה והפצה הצפק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזיז את המעיים לכיוון הצינורית, לא את הצינורית לכיוון המעיים. החזק ו למתוח את המעיים בין שני מלקחיים. הידיים של המנתח חייב להיות מונח על משטח כדי להפחית את הרעד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את התאים בין serosa (כפי שנראה דק מאוד, בטנה שקוף מעל thE כלי הדם intramural) ואת השרירים. צינורית ולכן יש להציב ויזואלית מעל כלי הדם מתחת מתחת לממברנה שקוף שקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במתג רגל כדי להתחיל את הזריקה כדי להפחית את הרעידות בזמן צינורית היא בתוך דופן המעיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צינורית נמצאת בעמדה, להתחיל את הזריקה. השתמש משך של 20 s, וכתוצאה מכך 1 μL / s הגדרה על יחידת הבקרה של המשאבה. הערה: הזריקה לתוך או ליד כלי דם פגום מוביל להפצה intravascular ישיר גרורות רחוק ולכן יש להימנע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת הזריקה, להסיר בזהירות את הצינור על ידי משיכת אותו לאחור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ספוגית יבשה מתחת cecum, ולאחר מכן לשטוף היטב את cecum עם מים מזוקקים על מנת lyse leaked תאים ובכך למנוע הפצה מלאכותית הצפק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגירת הבטן והתאוששות לאחר הניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי רמזיזים בעדינות את הצואה לחלל הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את דופן הבטן עם 6-0 התפרים פועל במהירות absorbable. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את העור עם קליפ הפצע כירורגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר על המפה חימום להגדיר 38 מעלות צלזיוס עד שהוא התאושש לחלוטין מן ההרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקפידה להתבונן במצב שלאחר הניתוח של העכברים במשך 48 שעות הבאות. במקרה של מצוקה, לטפל עם 0.05 מ&quot;ג / ק&quot;ג buprenorphine כל 12 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על העכברים לפחות פעם אחת ביום עבור סימנים של מצוקה בשל הגידול בגידול. </li></ol></li></ol> 3. בידוד של תאים סרטניים במחזור מ דוגמאות דם מלא הערה: השגת דם על ידי לנקב קרדיאלי עור על עכברים מורדמים, ואחריו המתת חסד. באופן אידיאלי, 1000 μL של דם נמשכים לתוך מזרק prefilled עם μL 100 של נוגדי קרישה (חומצה Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) או הפרין). השתמש אנטי אנושי, EpCAM (דלקת תא אפיתלמולקולה) נוגדן כדי לזהות את CTCs. זה עובד טוב מאוד אם אנושיים שורות תא אפיתל משמשים את המודל העכבר. עבור מכשירים אחרים, נוגדנים שונים עשויים להיות נדרשים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העשרת CTC: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני מילוי צינורות 15 מ&quot;ל עם 5 מ&quot;ל צפיפות בינוני שיפוע בזהירות להעביר את הדם לתוך צינור 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה (30 דקות ב 300 xg ללא בלימה) בזהירות להסיר את supernatant העליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את השאר לתוך צינור חדש 15 מ&quot;ל ו צנטריפוגה (15 דקות, 300 XG עם הבלם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את interfase המכיל את התאים mononuclear (להשליך את שאר) ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה 200 μL PBS / 1% EDTA ולהוסיף 4 μL של נוגדן EpCAM. דגירה 20 דקות על הקרח בחושך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקרנה וקטיף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המאגר הבא (הנקרא להלן חיץ לקטוף): PBS + 10% עגל בסרום בסרום (FCS) + 1% פניצילין / Sטרפטומיצין (1%) + 0.8% EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעט PAP לצייר מעגל ~ 1 ס&quot;מ בצלחת פטרי 6 ס&quot;מ סטרילי (מונע את הנוזל מפיזור בצלחת), ו 700 μL pipet של לקטוף למאגר לתוך מעגל זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL ההשעיה התא למאגר 700 μL לקטוף בתוך המעגל. בדוק את צפיפות התאים עם המיקרוסקופ. פיצול המדגם לתוך מנות שונות אם הוא צפוף מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן לתאים להתיישב (~ 5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך טיפת ההשעיה התא עבור מוכתם (= EpCAM חיובי) תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התא נמצא, לבחור את התא עם micromanipulator ולשים אותו חיץ 50 μL בהתאם ניתוח במורד המיועד ( למשל , חיץ RNA החילוץ או בינוני culturing). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לנתונים במורד הזרם המיועד, לבודד תאים שליליים של EpCAM ו / או בינוני כבקרות שליליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך ניתוח במורד הזרם ( למשל , תרבות התא, PCR). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2016.">Cancer statistics, 2016.</a> CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).</li><li>Weitz, J., Koch, M., Debus, J., H&#246;hler, T., Galle, P. R., B&#252;chler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+cancer.">Colorectal cancer.</a> Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).</li><li>Sch&#246;lch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+of+colorectal+cancer.">Circulating tumor cells of colorectal cancer.</a> Cancer Cell Microenviron. 1 (5), (2014).</li><li>Steinert, G., Sch&#246;lch, S., Koch, M., Weitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+significance+of+circulating+and+disseminated+tumour+cells+in+colorectal+cancer.">Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer.</a> Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).</li><li>Bork, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+relevance+of+minimal+residual+disease+in+colorectal+cancer.">Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer.</a> World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).</li><li>Bork, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumour+cells+and+outcome+in+non-metastatic+colorectal+cancer:+a+prospective+study.">Circulating tumour cells and outcome in non-metastatic colorectal cancer: a prospective study.</a> Br J Cancer. 112 (8), 1306-1313 (2015).</li><li>Rahbari, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmental+differences+of+circulating+tumor+cells+in+colorectal+cancer.">Compartmental differences of circulating tumor cells in colorectal cancer.</a> Ann Surg Oncol. 19 (7), 2195-2202 (2012).</li><li>Rahbari, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+Spread+Emerging+From+Liver+Metastases+of+Colorectal+Cancer:+Does+the+Seed+Leave+the+Soil+Again?.">Metastatic Spread Emerging From Liver Metastases of Colorectal Cancer: Does the Seed Leave the Soil Again?.</a> Ann Surg. 263 (2), 345-352 (2016).</li><li>Rahbari, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meta-analysis+shows+that+detection+of+circulating+tumor+cells+indicates+poor+prognosis+in+patients+with+colorectal+cancer.">Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer.</a> Gastroenterology. 138 (5), 1714-1726 (2010).</li><li>Steinert, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Escape+and+Survival+Mechanisms+in+Circulating+Tumor+Cells+of+Colorectal+Cancer.">Immune Escape and Survival Mechanisms in Circulating Tumor Cells of Colorectal Cancer.</a> Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).</li><li>Sharpless, N. E., Depinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mighty+mouse:+genetically+engineered+mouse+models+in+cancer+drug+development.">The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development.</a> Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).</li><li>Roper, J., Hung, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priceless+GEMMs:+genetically+engineered+mouse+models+for+colorectal+cancer+drug+development.">Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development.</a> Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).</li><li>Sch&#246;lch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+combined+with+TLR7/8+activation+induces+strong+immune+responses+against+gastrointestinal+tumors.">Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors.</a> Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).</li><li>Sch&#246;lch, S., Rauber, C., Weitz, J., Koch, M., Huber, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+activation+and+ionizing+radiation+induce+strong+immune+responses+against+multiple+tumor+entities.">TLR activation and ionizing radiation induce strong immune responses against multiple tumor entities.</a> Oncoimmunology. 4 (11), e1042201 (2015).</li><li>Sch&#246;lch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+exhibit+stem+cell+characteristics+in+an+orthotopic+mouse+model+of+colorectal+cancer.">Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer.</a> Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).</li><li>Nanduri, L. K., Garc&#237;a, S., Weitz, J., Sch&#246;lch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+Colorectal+Cancer-Derived+Circulating+Tumor+Cells.">Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells.</a> Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).</li><li>van Noort, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Drug+Candidates+for+the+Treatment+of+Metastatic+Colorectal+Cancer+through+Global+Inverse+Gene-Expression+Profiling.">Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling.</a> Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOD/SCID/gamma(c)(null)+mouse:+an+excellent+recipient+mouse+model+for+engraftment+of+human+cells.">NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells.</a> Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).</li><li>Simon, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+phenotypic+and+genomic+analysis+of+C57BL/6J+and+C57BL/6N+mouse+strains.">A comparative phenotypic and genomic analysis of C57BL/6J and C57BL/6N mouse strains.</a> Genome Biol. 14 (7), R82 (2013).</li><li>Kalish, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C57BL/6N+Mice+Are+More+Resistant+to+Ehrlich+Ascites+Tumors+Than+C57BL/6J+Mice:+The+Role+of+Macrophage+Nitric+Oxide.">C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide.</a> Med Sci Monit Basic Res. 21, 235-240 (2015).</li><li>Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+mouse+model+of+colorectal+cancer.">Orthotopic mouse model of colorectal cancer.</a> J Vis Exp. (10), e484 (2007).</li><li>Roper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+PI3K/MEK+inhibition+promotes+tumor+apoptosis+and+regression+in+PIK3CA+wild-type,+KRAS+mutant+colorectal+cancer.">Combination PI3K/MEK inhibition promotes tumor apoptosis and regression in PIK3CA wild-type, KRAS mutant colorectal cancer.</a> Cancer Lett. 347 (2), 204-211 (2014).</li><li>Coffee, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concomitant+BRAF+and+PI3K/mTOR+blockade+is+required+for+effective+treatment+of+BRAF(V600E)+colorectal+cancer.">Concomitant BRAF and PI3K/mTOR blockade is required for effective treatment of BRAF(V600E) colorectal cancer.</a> Clin Cancer Res. 19 (10), 2688-2698 (2013).</li><li>Belmont, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+dual+blockade+of+the+kinases+PI3K+and+mTOR+in+KRAS-mutant+colorectal+cancer+models+results+in+combined+sensitivity+to+inhibition+of+the+receptor+tyrosine+kinase+EGFR.">Resistance to dual blockade of the kinases PI3K and mTOR in KRAS-mutant colorectal cancer models results in combined sensitivity to inhibition of the receptor tyrosine kinase EGFR.</a> Sci Signal. 7 (351), ra107 (2014).</li><li>Hung, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+mouse+model+for+sporadic+and+metastatic+colon+tumors+and+its+use+in+assessing+drug+treatment.">Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).</li><li>Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Inducible,+Large-Intestine-Specific+Transgenic+Mouse+Model+for+Colitis+and+Colitis-Induced+Colon+Cancer+Research.">An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research.</a> Dig Dis Sci. 61 (4), 1069-1079 (2016).</li><li>Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+transgenic+mouse+for+colorectal+cancer+research+with+intestinal+cre+expression+limited+to+the+large+intestine.">Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine.</a> Mol Cancer Res. 8 (8), 1095-1104 (2010).</li><li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+inducible+colon-specific+Cre+enzyme+mouse+line+for+colon+cancer+research.">Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).</li></ol>

למחברים אין מה לגלות.

למרות הפעילות המוכחת שלהם במודלים עכבריים תת-עוריים, הרוב הגדול של המרכיבים החדשים נכשל בניסויים קליניים ומעולם לא הגיע למרפאה. 11 זה חוסר ברור של מודלים עכבר תת עוריים כדי לדמות במדויק את הביולוגיה ואת דפוסי הצמיחה של גידולים הובילה לפיתוח מודלים עכבר orthotopic מבוסס על הזרקה של תאים סרטניים ישירות לתוך האיבר המקורי. מודלים עכבר Orthutic מסוגלים לדמות את הביולוגיה והפצה של גידולים מוצקים הרבה יותר מדויק מאשר מודלים תת עוריים. 15 עם זאת, החסרונות העיקריים הם reproducibility עניים במיוחד באיברים תובעניים מבחינה טכנית כגון איברים חלולים כמו גם ניטור תובעני מבחינה טכנית של הגידול הגידול. במודל שלנו, יש לנו ולכן התמקד בגודל הגידול בנקודת זמן מוגדרת מראש ולא בהליכי הדמיה חוזרת, אשר מגבילה את מספר טכניאני משוכללת ובדיקות מלחיץ של בעלי החיים. המודל המתואר כאן יכול לשמש עבור יישומים שונים כגון אפיון של שורות תאים סרטניים, 15 חקירה של ביולוגיה הגידול והפצה כמו גם ניסויים טיפוליים. 17 נקודות קצה ברורות הן גודל הגידול הראשוני ומספר הגרורות הרחוקות, אך ניתן להשתמש גם בנקודות קצה משוכללות יותר, כגון מספרי CTC 17 או שיטות הדמיה. השלב הקריטי ביותר של הפרוטוקול שלנו הוא הזרקת תא הגידול תת. זה דורש בפועל חייב להתבצע בכל עת תחת שליטה חזותית ישירה. אם ההפקדה היא בכל מקום אחר אבל מתחת serosa אבל מעל הרירית, לא תהיה שום גידול גידול בכלל או צמיחה בלתי צפויות והפצה, עיבוד תוצאות שאין כמוהו. סיבות אפשריות אחרות לחוסר התפתחות הגידול כוללות תאים לא קיימא ( למשל &lt;/ Em&gt;, בשל טווח זמן ארוך בין הקציר הזרקת של התאים) או לא לגמרי עכברים סיגני. זה אפשרי אם C57Bl / 6 עכברים משמשים; כפי שיש מספר רב של תחמוצות של C57Bl / 6 ( למשל , C57Bl / 6J ו C57Bl / 6N) אשר מראים הבדלים גנטיים פנוטיפי שונים 22 אשר משתקפים גם הגידול לקחת שיעורי. 23 כאן מתואר טכניקה הזרקת מבוקרת מאוד מוביל לגידול גידול מאוד הפצה והפצה ומבדיל את המודל הזה מן המודלים שתוארו לעיל. 24 בנוסף, שטיפת cecum עם מים מזוקקים לאחר הזרקת תא הגידול מפחיתה באופן דרמטי את קצב הפצה הצפק מלאכותי; לכן, אם carcinomatosis peritoneal מתרחשת במודל שלנו, היא ככל הנראה תוצאה של הביולוגיה של קו התא ולא דלקת תא הגידול iatrogenic. מגבלות של זה מ &#39;Odel הם עכברים הנמענים אשר צריך להיות immunodeficient אם שורות תאים אנושיים יש להשתמש. זה מגביל מאוד את היישום של המודל במחקרים אימונולוגיים. עם זאת, מגבלה זו ניתן להתגבר על ידי שימוש של תאים תאיים Murine תא או אורגנואידים (נתונים שלא פורסמו). מגבלה נוספת היא השימוש של שורות תאים עצמם. תאים תאים סרטניים הם לעתים קרובות מאוד anaplastic, אשר משאירים שאלות לגבי ייצוג שלהם של הביולוגיה של הגידול המקורי. הגבלה זו אינה קיימת במודלי עכבר מהונדסים גנטית (GEMMs), המפתחים גידול חדש על ידי הכנסת מוטציות אונקוגניות ספציפיות לרקמות. 12 GEMMs כאלה מבוססים בדרך כלל על מוטציות מותנות של קו נבט ( כגון גן Apc מנוקב) וקריאה בתיווך ההפעלה של המוטציות, או על ידי זיהום מקומי עם adeno-cre 25 , 27 , 28 או יזם ספציפי רקמה נהיגהביטוי. 29 , 30 , 31 עם זאת, מודלים כאלה דורשים לעתים קרובות מעברים רבים יש ביולוגיה משתנה מאוד. אם קווי התא העיקרי משמשים המודל המוצג כאן, מגבלה של ייצוג נמוך ניתן להתגבר ללא הפסד של יתרונות אחרים של המודל שלנו כגון שחזור ואת עלות יחסית יעילות. מגבלה נוספת של הטכניקה המוצעת כאן היא התלות ב- EpCAM כסמן פני השטח. זה ידוע היטב כי EpCam יכול ללכת לאיבוד במהלך EMT וכי יש חלק של CTCs כי הם EpCAM שלילי. 10 , 15 לכן, בהתאם למטרת הניסוי וקווי התא המשמש להזרקת, אמצעים אחרים של הזיהוי ( למשל , GFP תיוג של התאים לפני ההזרקה) ניתן להשתמש. לסיכום, המודל המוצג כאן געל כלי גמיש ללמוד התפתחות הגידול והפצה בהקשר של microenvironment הגידול המקורי במעי הגס. אם קווי תאים גרורתיים משמשים, זה בנאמנות מדמה הפצת תאים סרטניים בכל האתרים הרלוונטיים עבור CRC כולל CTCs בזרם הדם. לכן כלי שימושי כדי ללמוד את השינויים פנוטיפי במהלך הגידול והפצה הגידול ומאפשר בידוד חוזר ואפיון של CTCs ב CRC. 15

סרטן המעי הגס (CRC) הוא אחד הגורמים השכיחים ביותר למוות סרטן במדינות מערביות. 1 בעוד הגידול הראשוני יכול לעיתים קרובות להיות resected, את התרחשות גרורות רחוקות באופן דרמטי מחריף את הפרוגנוזה ולעתים קרובות מוביל למוות. 2 , 3 מתאם ביולוגי של גרורות הוא מחזורי תאים סרטניים, אשר לנתק מן הגידול, לשרוד במחזור, לצרף את אפיתל באיבר היעד, לפלוש לאיבר ובסופו של דבר להתגבר על נגעים חדשים. 4 למרות שמדובר בחומר CTC ידוע בעל רלוונטיות פרוגנוסטית, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 הביולוגיה שלהם מובנת חלקית רק כתוצאה מן הנדירות הקיצונית שלהם ב- CRC. 10 מודלים עכבר הם לא חזקOol ללמוד היבטים שונים של ביולוגיה של סרטן. מודלים קלאסיים, תת עוריים מיוצרים על ידי הזרקה תת עורית של תאים סרטניים לעכברים הנמענים, אשר יכול להיות גם immunocompetent (אם תאים סרטניים Murine syngeneic משמשים) או immunodeficient. מודלים גידול תת-עוריים הם זולים ומייצרים נתונים במהירות; צמיחת הגידול של נקודת הסיום שלהם יכולה להיות נמדדת בקלות ובלא פולשניות. עם זאת, 88% של תרכובות חדשות שהפגינו פעילות אנטי-סרטנית במודלים כאלה נכשלות בניסויים קליניים. 11 זה בחלקו בשל הבדלים בין בני-אדם בין עכברים לעכברים; עם זאת, חלק גדול של כישלון זה נובע ערך מנבא נמוך של מודלים עכבר תת עורית. מודלים עכבר Orthotopic, שבו תאים סרטניים מוזרקים לתוך איבר המוצא ובכך לגדול microenvironment המקורי שלהם, ולכן משמשים יותר ויותר במחקר סרטן. 11 , 12 , </sלמעלה&gt; 13 , 14 מודלים אורתופטיים לא רק לדמות את התנאים גידול הגידול המקומי; כתוצאה מהאתר האנטומי של גידול הגידול, מודלים של עכבר אורטוטופיים מאפשרים גם סימולציה מציאותית של גרורות, ולכן הם משתמשים כדי לחקור את הביולוגיה של CTC 8 , 15 , 16 או את תגובתם לטיפולים שונים ב- CRC. 13 , 17 החיסרון העיקרי של מודלים עכבר אורתוטופיים היא המורכבות הטכנית שלהם. בהתאם האיבר שבו תאים להיות מוזרק, עקומת למידה עד הנסיין הוא מסוגל לגדל גידולים לשחזור הוא ארוך למדי. זה במיוחד חל על מודלים של סרטן המעי הגס, כמו תאים סרטניים צריך להיות מוזרק לתוך דופן המעיים, אשר לעתים קרובות התוצאות ניקוב, דליפת תא הגידול או הפסד endoluminal תא הגידול. זהRticle מיועד לתאר את השיטה של ​​הכנת תאים דגימות רקמה ראשונית, שורות תאים 2D ותרבות אורגנואידית 3D הזרקתם לתוך cecum של עכברים. הטכניקה המתוארת כאן מוביל לגידולים אחידים מאוד, בהתאם לביולוגיה הגידול של קו התא המשמש להזרקת, היווצרות של גרורות מרוחקות ו CTCs בעכברים הנמען. 15

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1294">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:421px;">Cell culture Media and Components</td>
			<td style="width:297px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:457px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Advanced DMEM F12</td>
			<td style="width:297px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12634010</td>
			<td style="width:457px;">DMEM/ F12 +++ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">HEPES (1 M)</td>
			<td style="width:297px;">Life Technologies GmbH</td>
			<td style="width:119px;">15630056</td>
			<td style="width:457px;">DMEM/ F12 +++ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Glutamax-I Supplement (200 mM)</td>
			<td style="width:297px;">Life Technologies GmbH</td>
			<td style="width:119px;">35050038</td>
			<td style="width:457px;">DMEM/ F12 +++ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Penicillin/Streptomycin (PenStrep)</td>
			<td style="width:297px;">Life Technologies GmbH</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td style="width:457px;">DMEM/ F12 +++ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">DMEM</td>
			<td style="width:297px;">Life Technologies GmbH</td>
			<td style="width:119px;">61965026</td>
			<td>basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:297px;">BIOCHROM AG</td>
			<td style="width:119px;">S 0115</td>
			<td>basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">TrypLE Express enzymatic dissociation buffer</td>
			<td style="width:297px;">Life Technologies GmbH</td>
			<td style="width:119px;">12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free)</td>
			<td style="width:297px;">CORNING B.V. Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:297px;">Life Technologies GmbH</td>
			<td style="width:119px;">14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Trypsin-EDTA (0,25%, Phenol-Red)</td>
			<td style="width:297px;">Life Technologies GmbH</td>
			<td style="width:119px;">25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">6-/48-well plates with lid</td>
			<td style="width:297px;">CORNING</td>
			<td style="width:119px;">3516/3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">cell culture flask 75cm&#178;, 250 mL</td>
			<td style="width:297px;">VWR International GmbH</td>
			<td style="width:119px;">734-2066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">cell culture flask 150cm&#178;, 600 mL</td>
			<td style="width:297px;">Corning B.V. Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">355001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:421px;">Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL</td>
			<td style="width:297px;">Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td style="width:119px;">72.706.400/ 72.695.400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">15 ml, 50 ml centrifuge tubes</td>
			<td style="width:297px;">Greiner-Bio-One GmbH</td>
			<td style="width:119px;">188271/227270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine)</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad Laboratories GmbH</td>
			<td style="width:119px;">1450016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:421px;">Pasteur pipettes (glass, 150 mm)</td>
			<td style="width:297px;">Fisher Scientific GmbH</td>
			<td style="width:119px;">11546963/ FB50251</td>
			<td>thinly pulled by using a bunsen burner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gentleMACS Dissociator</td>
			<td style="width:297px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>for primary tumor tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACSmix Tube Rotator</td>
			<td style="width:297px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td>for primary tumor tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gentleMACS C Tubes</td>
			<td style="width:297px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>for primary tumor tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Tumor Dissociation Kit</td>
			<td style="width:297px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-929</td>
			<td>for primary tumor tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 70&#181;m Cell Strainer</td>
			<td style="width:297px;">Corning B.V. Life Sciences</td>
			<td>352350</td>
			<td>for primary tumor tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Name</td>
			<td style="width:297px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:421px;">Surgical Equipment</td>
			<td style="width:297px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Sevoflurane</td>
			<td style="width:297px;">AbbVie Germany GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Medical oxygen</td>
			<td style="width:297px;">Air Liquide Medical GmbH</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:297px;">Temgesic</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Bepanthen - opthalmic ointment</td>
			<td style="width:297px;">Bayer Vital GmbH</td>
			<td style="width:119px;">10047757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Normal saline 0.9% (E154)</td>
			<td style="width:297px;">Serumwerk Bernburg AG</td>
			<td style="width:119px;">10013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Aqua ad injectabilia</td>
			<td style="width:297px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">235144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO</td>
			<td style="width:297px;">Braun/neoLab</td>
			<td style="width:119px;">194291661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">30G injection needle</td>
			<td style="width:297px;">BECTON DICKINSON</td>
			<td style="width:119px;">304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">cellulose swabs</td>
			<td style="width:297px;">Lohmann &#38; Rauscher Deutschland</td>
			<td style="width:119px;">13356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Micro-Adson Forceps</td>
			<td style="width:297px;">FST - Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Iris Scissor - ToughCut</td>
			<td style="width:297px;">FST - Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Olsen-Hegar Needle Holder</td>
			<td style="width:297px;">FST - Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">12002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">AutoClip Kit</td>
			<td style="width:297px;">FST - Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">12020-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture)</td>
			<td style="width:297px;">Johnson &#38; Johnson Medical GmbH</td>
			<td style="width:119px;">Z1012H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:421px;">Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer</td>
			<td style="width:297px;">Parkland Scientific</td>
			<td style="width:119px;">V3000PS/PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">UltraMicro Pump with Micro4 Controller</td>
			<td style="width:297px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">UMP3-4</td>
			<td>equipment for highly controlled orthotopic injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Footswitch for SYS-Micro4 Controller</td>
			<td style="width:297px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">15867</td>
			<td>equipment for highly controlled orthotopic injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Three-axis Manual Micromanipulator</td>
			<td style="width:297px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">M325</td>
			<td>equipment for highly controlled orthotopic injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Magnetic Stand for Micromanipulator</td>
			<td style="width:297px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">M10</td>
			<td>equipment for highly controlled orthotopic injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand</td>
			<td style="width:297px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">5479</td>
			<td>equipment for highly controlled orthotopic injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Hot Plate 062</td>
			<td style="width:297px;">Labotect</td>
			<td style="width:119px;">13854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Isis - Hair shaver</td>
			<td style="width:297px;">AESCULAP - Braun</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Binocular Surgical Microscope</td>
			<td style="width:297px;">Parkland Scientific</td>
			<td style="width:119px;">VS-2Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Name</td>
			<td style="width:297px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:421px;">CTC isolation</td>
			<td style="width:297px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">EDTA</td>
			<td style="width:297px;">Roth</td>
			<td>8040.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Density gradient medium &#8211; Ficoll</td>
			<td>StemCell - Lymphoprep</td>
			<td>7801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:421px;">Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>324210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:421px;">Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">118210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Dish, &#248; 60 x 15 mm, 21 cm&#178;, Vent</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence Cell Culture Microscope</td>
			<td style="width:297px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transferman 4r Micromanipulator</td>
			<td style="width:297px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTram Air</td>
			<td style="width:297px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:457px;">aspiration pump connected to the micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dmz Universal Microelectrode Puller</td>
			<td style="width:297px;">Dagan Corporation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism Glass Capillaries</td>
			<td style="width:297px;">Dagan Corporation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">PAP pen</td>
			<td style="width:297px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:297px;">Life Technologies GmbH</td>
			<td style="width:119px;">14190169</td>
			<td>picking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:297px;">BIOCHROM AG</td>
			<td style="width:119px;">S 0115</td>
			<td>picking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Penicillin/Streptomycin (PenStrep)</td>
			<td style="width:297px;">Life Technologies GmbH</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td>picking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">EDTA</td>
			<td style="width:297px;">Roth</td>
			<td>8040.1</td>
			<td>picking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Name</td>
			<td style="width:297px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:421px;">Immunohistochemistry</td>
			<td style="width:297px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">324201</td>
			<td>EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">HRP rabbit anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:297px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97046</td>
			<td>EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of circulating tumor cells in an orthotopic mouse model of colorectal cancer

למרות היתרונות של תחולה קלה ויעילות עלות, מודלים עכברי תת עוריים יש מגבלות חמורות לא מדויק המדמה גידול ביולוגיה גידול תאים סרטניים. מודלים עכבר Orthotopic כבר הציג להתגבר על מגבלות אלה; עם זאת, מודלים אלה הם תובעניים מבחינה טכנית, במיוחד איברים חלולים כגון המעיים הגדולים. כדי לייצר גידולים אחידים אשר לגדול באופן אמין גרורות, טכניקות סטנדרטיות של הכנת תאים סרטניים הזרקה הם קריטיים. פיתחנו מודל עכבר אורטוטופי של סרטן המעי הגס (CRC), אשר מפתחת גידולים אחידים מאוד וניתן להשתמש בו ללימודי ביולוגיה של הגידול, כמו גם ניסויים טיפוליים. תאים סרטניים משני גידולים ראשוניים, תאים דו מימדיים (2D) או תאים תלת מימדיים (3D) מוזרקים לתוך cecum, בהתאם לפוטנציאל הגרורתי של תאים סרטניים מוזרקים, יוצרים גידולים גרורתיים מאוד. בנוסף,CTCs ניתן למצוא באופן קבוע. אנו מתארים כאן את הטכניקה של הכנת תאים סרטניים משני שורות תאים דו-ממדיים ואורגנואידים תלת-ממדיים, כמו גם ברקמת הגידול הראשית, טכניקות ההזרקה וההזרקה, כמו גם בידוד של CTCs מן העכברים הנושאים גידולים, ומציעים עצות לפתרון בעיות.

מוצלח לשעתקו של גידולים המעי הגס במודל זה באופן ביקורתי תלוי הזרקת מדויק של תאים ללא דליפה או דליפה. אם זה הושג, מודל זה הוא אמין מאוד ורק לעתים רחוקות תוצאות ההפצה הצפק מלאכותית. קינטיקה הצמיחה של גידולים כמו גם דפוסי ההפצה שלהם תלויים בביולוגיה של אורגנואידים בשימוש ותאים. 15 בעוד HCT116 תאים גרורות באופן אמין לכבד במודל זה, SW620 תאים טופס גידולים אורטוטופיים, אבל לא גרורות. 15 השימוש HCT116 תאים במודל זה אמין תוצאות עכברים moribund בתוך 35 ימים של הזרקת תאים סרטניים. גידולים ראשוניים למדוד על 10 מ&quot;מ בגודל ( איור 1 א ו איור 2 א ), גרורות בכבד ( איור 1 ב </str<html> Ong&gt; ו איור 2 ב ), גרורות ריאות ( איור 1 ג ו איור 2 ג ) ו מחזור תאים סרטניים ( איור 3 ) נמצאים כמעט תמיד. ב עכברים הנושאים HCT116 גידולים, 35 ימים לאחר הזרקת תאים סרטניים CTCs נמצאים בתדירות גבוהה וכמות והוא יכול להיות מבודד בקלות עבור ניתוחים במורד הזרם ( איור 3 ). <img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55357/55357fig1.jpg" /> איור 1: תמונות Macroscopic לאחר ניתוחים 35 ימים לאחר הזרקת אורתופטי של HCT116 תאים CRC האדם לתוך עכברים NSG. ( א ) הגידול הראשוני (קו מקווקו) ב cecum. ( ב ) כבד עם גרורות מרובות. ( ג ) גרורות ריאות (חיצים).1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55357/55357fig2.jpg" /> איור 2: תמונות היסטולוגיות של האורגנים המוצגות באיור 1 . ( א ) הגידול הראשוני (H &amp; E). ( B ) גרורות כבד (H &amp; E). ( ג ) גרורות ריאות (אימונוהיסטוכימיה נגד APCAM). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55357/55357fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55357/55357fig3.jpg" /> איור 3: מחזורי תאים סרטניים (HCT116 תאים בעכברים NSG, 35 ימים לאחר הזרקת תא הגידול). שדה בהיר ( א </חזקה)&gt; ו immunofluorescence (anti-hEpCAM-Alexa488 ( B )) תמונות של CTCs בתא דם monopuclear הפריפריאלי (PBMC) חלק. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55357/55357fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer at JoVE.com

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

אנו מתארים את הקמתם של גידולים המעי הגס אורטוטופיים באמצעות הזרקה של תאים סרטניים או אורגנואידים לתוך cecum של עכברים הבידוד הבאים של תאים סרטניים במחזור (CTCs) מן המודל הזה.

בידוד של תאים סרטניים במחזור מודל עכבר אורתופטי של סרטן המעי הגס

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

isolation-circulating-tumor-cells-an-orthotopic-mouse-model

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.9K Views.  Technische Universität Dresden.  אנו מתארים את הקמתם של גידולים המעי הגס אורטוטופיים באמצעות הזרקה של תאים סרטניים או אורגנואידים לתוך cecum של עכברים הבידוד הבאים של תאים סרטניים במחזור (CTCs) מן המודל הזה. 

Video: Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will survive longer than five years. In order to understand and mimic the microenvironment of pancreatic tumors, we utilized a murine orthotopic model of pancreatic cancer that allows non-invasive imaging of tumor progression in real time. Pancreatic cancer cells expressing green fluorescent protein (PANC-1 GFP) were suspended in basement membrane matrix, high concentration, (e.g., Matrigel HC) with serum-free media and then injected into the tail of the pancreas via laparotomy. The cell suspension in the high concentration basement membrane matrix becomes a gel-like substance once it reaches room temperature; therefore, it gels when it comes in contact with the pancreas, creating a seal at the injection site and preventing any cell leakage. Tumor growth and metastasis to other organs are monitored in live animals by using fluorescence. It is critical to use the appropriate filters for excitation and emission of GFP. The steps for the orthotopic implantation are detailed in this article so researchers can easily replicate the procedure in nude mice. The main steps of this protocol are preparation of the cell suspension, surgical implantation, and whole body fluorescent in vivo imaging. This orthotopic model is designed to investigate the efficacy of novel therapeutics on primary and metastatic tumors.

A procedure to implant green fluorescent protein-expressing pancreatic cancer cells (PANC-1 GFP) orthotopically into the pancreas of Balb-c Ola Hsd-Fox1nu mice to assess tumor progression and metastasis is presented here.

דגם פלורסנט Orthotopic עכבר של סרטן הלבלב

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is important to control peritoneal dissemination. However, it is still unclear how tumor cells detach from primary lesions and attach to the mesothelium. The establishment of an appropriate animal model is needed to gain an understanding of the mechanism of peritoneal dissemination in vivo. In the current study, we introduce the process from the local injection of EOC cells into the murine ovarian surface to the development of metastasis, including the peritoneum and distant organs. Female nude mice (BALB/c nu/nu) at 8 weeks of age were used. Under a microscopic field of view, EOC cells (1 x 105 cells/&#181;l of medium-extracellular matrix (ECM)-based hydrogel/unilateral ovary/mouse) were injected into murine ovaries through a retroperitoneal approach from the dorsal flank. This proposed method is a less invasive procedure for the mouse and minimizes damage to the ovary. Here, we describe the methodological steps in the development of the original and metastatic tumor formation of EOC.

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

To clarify the multistep process of peritoneal dissemination of ovarian carcinoma, the current study presents a murine experimental model of original tumor development and peritoneal metastasis via orthotopic inoculation with these tumor cells.

Murine ניסיוני דגם של התפתחות גידולים מקורית גרור הצפק<em&gt; דרך</em&gt; Orthotopic הרכבה עם קרצינומה של תאי השחלות

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip for downstream analysis and/or culture. The strategy employs the use of a novel Parylene C membrane slot pore microfilter to capture CTC and a coating of poly (N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) for thermoresponsive viable release of the captured CTC. The capture of live cells is enabled by leveraging the design of a slot pore geometry with specific dimensions to reduce the shear stress typically associated with the filtration process. While the microfilter exhibits a high capture efficiency, the release of these cells is non-trivial. Typically, only a small percentage of cells are released when techniques such as reverse flow or cell scraping are used. The strong adhesion of these epithelial cancer cells to the Parylene C membrane is attributable to non-specific electrostatic interaction. To counteract this effect, we employed the use of PIPAAm coating and exploited its thermal responsive interfacial properties to release the cells from the filter. Blood is first filtered at room temperature. Below 32 &#176;C, PIPAAm is hydrophilic. Thereafter, the filter is placed in either culture media or a buffer maintained at 37 &#176;C, which results in the PIPAAm turning hydrophobic, and subsequently releasing the electrostatically bound cells.

A protocol to utilize a poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) coated microfilter for effective capture and thermoresponsive release of viable circulating tumor cells (CTC) is presented. This method allows capture of CTC from patients&#39; blood and subsequent release of viable CTC for downstream off-chip culture, analyses and characterization.

לכידת שחרור בתאי גידול במחזור קיימא מן הדם

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified to secrete human Prostate Specific Antigen (PSA), and the procedure for the confirmation of tumor implantation. In brief, mice are anesthetized using injectable drugs and are made to lay in the dorsal position. Urine is vacated from the bladder and 50 &#181;L of poly-L-lysine (PLL) is slowly instilled at a rate of 10 &#181;L/20 s using a 24 G IV catheter. It is left in the bladder for 20 min by stoppering the catheter. The catheter is removed and PLL is vacated by gentle pressure on the bladder. This is followed by instillation of the murine bladder cancer cell line (1 x 105 cells/50 &#181;L) at a rate of 10 &#181;L/20 s. The catheter is stoppered to prevent premature evacuation. After 1 h, the mice are revived with a reversal drug, and the bladder is vacated. The slow instillation rate is important, as it reduces vesico-ureteral reflux, which can cause tumors to occur in the upper urinary tract and in the kidneys. The cell line should be well re-suspended to reduce clumping of cells, as this can lead to uneven tumor sizes after implantation.
This technique induces tumors with high efficiency. Tumor growth is monitored by urinary PSA secretion. PSA marker monitoring is more reliable than ultrasound or fluorescence imaging for the detection of the presence of tumors in the bladder. Tumors in mice generally reach a maximum size that negatively impacts health by about 3 - 4 weeks if left untreated. By monitoring tumor growth, it is possible to differentiate mice that were cured from those that were not successfully implanted with tumors. With only end-point analysis, the latter may be mistakenly assumed to have been cured by therapy.

This protocol describes the generation of murine orthotopic bladder tumors in female C57BL/6J mice and the monitoring of tumor growth.

מודל גידול Murine Orthotopic שלפוחית ​​השתן סרטן מערכת איתור

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations and do not accurately simulate tumor biology and tumor cell dissemination. Genetically engineered mouse models have been introduced to overcome these limitations; however, such models are technically demanding, especially in large organs such as the colon in which only a single tumor is desired.
As a result, an immunocompetent, genetically engineered mouse model of colorectal cancer was developed which develops highly uniform tumors and can be used for tumor biology studies as well as therapeutic trials. Tumor development is initiated by surgical, segmental infection of the distal colon with adeno-cre virus in compound conditionally mutant mice. The tumors can be easily detected and monitored via colonoscopy. We here describe the surgical technique of segmental adeno-cre infection of the colon, the surveillance of the tumor via high-resolution colonoscopy and present the resulting colorectal tumors.

A protocol for the establishment of a genetically engineered mouse model of colorectal cancer by segmental adeno-cre infection and its surveillance via high-resolution colonoscopy is presented.

דגם עכבר מהונדס גנטית של סרטן המעי הגס ספוראדי

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In particular, endothelial cells (EC) constituting the inner surface of vessels, directly participate in oxygen delivery, nutrient supply, and removal of waste products to and from tumors, and are thereby prominently involved in the constitution of the tumor microenvironment (TME). Tumor endothelial cells (TECs) can be used as cellular biosensors of the intratumoral microenvironment established by communication between tumor and stromal cells. TECs also serve as targets of therapy. Accordingly, in culture these cells allow studies on mechanisms of response or resistance to anti-angiogenic treatment. Recently, it was found that TECs isolated from human colorectal carcinoma (CRC) exhibit memory-like effects based on the specific TME they were derived from. Moreover, these TECs actively contribute to the establishment of a specific TME by the secretion of different factors. For example, TECs in a prognostically favorable Th1-TME secrete the anti-angiogenic tumor-suppressive factor secreted protein, acidic and rich in cysteine-like 1 (SPARCL1). SPARCL1 regulates vessel homeostasis and inhibits tumor cell proliferation and migration. Hence, cultures of pure, viable TECs isolated from human solid tumors are a valuable tool for functional studies on the role of the vascular system in tumorigenesis. Here, a new up-to-date protocol for the isolation of primary EC from the normal colon as well as CRC is described. The technique is based on mechanical and enzymatic tissue digestion, immunolabeling, and fluorescence activated cell sorting (FACS)-sorting of triple-positive cells (CD31, VE-cadherin, CD105). With this protocol, viable TEC or normal endothelial cell (NEC) cultures could be isolated from colon tissues with a success rate of 62.12% when subjected to FACS-sorting (41 pure EC cultures from 66 tissue samples). Accordingly, this protocol provides a robust approach to isolate human EC cultures from normal colon and CRC.

Tumor endothelial cells are important determinants of the tumor microenvironment and the course of the disease. Here, a protocol for the isolation of pure and viable endothelial cells from human colorectal carcinoma and normal colon to be used in drug testing and pathogenesis research is described.

בידוד של תאי אנדותל אדם נורמלי המעי הגס, סרטן המעי הגס - פרוטוקול משופר

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful biomarkers for clinical practice. Here, we present a protocol to extract, reverse transcribe and evaluate the expression levels of circulating miRNAs from plasma samples of patients with colorectal cancer (CRC). microRNAs (miRNAs) are a class of non-coding RNAs of 18-25 nucleotides in length that regulate the expression of target genes at the translational level and play an important role, including that of pro- and anti-angiogenic function, in the physiopathology of various organs. miRNAs are stable in biological fluids such as serum and plasma, which renders them ideal circulating biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and treatment decision-making and monitoring. Circulating miRNA extraction was performed using a rapid and effective method that involves both organic and column-based methodologies. For miRNA retrotranscription, we used a multi-step procedure that considers polyadenylation at 3&#39; and the ligation of an adapter at 5&#39; of the mature miRNAs, followed by random miRNA pre-amplification. We selected a 24-miRNA custom panel to be tested by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and spotted the miRNA probes on array custom plates. We performed qRT-PCR plate runs on a real-time PCR System. Housekeeping miRNAs for normalization were selected using GeNorm software (v. 3.2). Data were analyzed using Expression suite software (v 1.1) and statistical analyses were performed. The method proved to be reliable and technically robust and could be useful to evaluate biomarker levels in liquid samples such as plasma and/or serum.

We present a protocol to evaluate the expression levels of circulating microRNA (miRNAs) in plasma samples from cancer patients. In particular, we used a commercially available kit for circulating miRNA extraction and reverse transcription. Finally, we analyzed a panel of 24 selected miRNAs using real-time pre-spotted probe custom plates.

זיהוי של לוח מותאם אישית MicroRNA במחזור בחולים עם סרטן המעי הגס גרורתי

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new tumors at distant sites. CTCs are found in the bloodstream of patients as single cells (single CTCs) or as multicellular aggregates (CTC clusters and CTC-white blood cell clusters), with the latter displaying a higher metastatic ability. Beyond enumeration, phenotypic and molecular analysis is extraordinarily important to dissect CTC biology and to identify actionable vulnerabilities. Here, we provide a detailed description of a workflow that includes CTC immunostaining and micromanipulation, ex vivo culture to assess&#160;proliferative and survival capabilities of individual cells, and in vivo metastasis-formation assays. Additionally, we provide a protocol to achieve the dissociation of CTC clusters into individual cells and the investigation of intra-cluster heterogeneity. With these approaches, for instance, we precisely quantify survival and proliferative potential of single CTCs and individual cells within CTC clusters, leading us to the observation that cells within clusters display better survival and proliferation in ex vivo cultures compared to single CTCs. Overall, our workflow offers a platform to dissect the characteristics of CTCs at the single cell level, aiming towards the identification of metastasis-relevant pathways and a better understanding of CTC biology.

Here, we present an integrated workflow to identify phenotypic and molecular features that characterize circulating tumor cells (CTCs). We combine live immunostaining and robotic micromanipulation of single and clustered CTCs with single cell-based techniques for downstream analysis and assessment of metastasis-seeding ability.

מיקרומניפולציה של במחזור תאים סרטניים לניתוח מולקולרי במורד הזרם והערכה פוטנציאלית גרורתית

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional (3D) tumor architecture and low relevance to human cancer. Researchers have recently developed a 3D in vitro cancer model referred to as tumor organoids that can mimic the characteristics of a native tumor in a culture dish. Here, experimental procedures are described in detail for the establishment of bladder tumor organoids from a carcinogen-induced murine bladder tumor, including culture, passage, and maintenance of the resulting 3D tumor organoids in vitro. In addition, protocols to manipulate the established bladder tumor organoid lines for genetic engineering using lentivirus-mediated transduction are described, including optimized conditions for the efficient introduction of new genetic elements into tumor organoids. Finally, the procedure for orthotopic transplantation of bladder tumor organoids into the wall of the murine bladder for further analysis is laid out. The methods described in this article can facilitate the establishment of an in vitro model for bladder cancer for the development of better therapeutic options.

This protocol provides detailed experimental steps to establish a three-dimensional in vitro culture of bladder tumor organoids derived from carcinogen-induced murine bladder cancer. Culture methods including passaging, genetic engineering, and orthotopic transplantation of tumor organoids are described.

תרבות, מניפולציה, והשתלת אורתוגרטופית של שלפוחית השתן של העכבר הגידול אורגנואידים

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the limitations of current treatments, as the majority of patients do not respond to immunotherapy. Development of accurate preclinical models to quickly identify novel and effective therapeutic combinations are critical to address this unmet clinical need. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) is a canonical example of an immune checkpoint blockade resistant tumor with only 2% of patients responding to immunotherapy. The genetically engineered KrasG12D+/-;Trp53R172H+/-;Pdx-1 Cre (KPC) mouse model of PDA recapitulates human disease and is a valuable tool for assessing therapies for immunotherapy resistant in the preclinical setting, but time to tumor onset is highly variable. Surgical orthotopic tumor implantation models of PDA maintain the immunobiological hallmarks of the KPC tissue-specific tumor microenvironment (TME) but require a time-intensive procedure and introduce aberrant inflammation. Here, we use an ultrasound-guided orthotopic tumor implantation model (UG-OTIM) to non-invasively inject KPC-derived PDA cell lines directly into the mouse pancreas. UG-OTIM tumors grow in the endogenous tissue site, faithfully recapitulate histological features of the PDA TME, and reach enrollment-sized tumors for preclinical studies by four weeks after injection with minimal seeding on the peritoneal wall. The UG-OTIM system described here is a rapid and reproducible tumor model that may allow for high throughput analysis of novel therapeutic combinations in the murine PDA TME.

We describe a protocol for the ultrasound guided implantation of murine-derived pancreatic ductal adenocarcinoma cell lines directly into the native tumor site. This approach resulted in pancreatic tumors detectable by ultrasound scanning within 2-4 weeks of injection, and significantly reduced the proportion tumor cell seeding on the peritoneal wall as compared to surgical orthotopic implantation.

אולטרה סאונד-הדרכה אורתודפית של הלבלב מורלין אדנוקרצינומה

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...