私たちは、原稿を校正するための技術支援のためのDualsystemsバイオテックAGとジュリアシュトローブルからLaimburg研究センターとMirelleボルヘスディアスSchnetzerからクリスティンKerschbamer、トーマスLetschka、ザビーネOettl、マーゴットラファイナー、フロリアンSenonerに感謝します。この作品はAPPL2.0プロジェクトの一環として実施し、部分的にボルツァーノ/ボルツァーノ、イタリアの自治州と南チロルアップルコンソーシアムによって資金を供給されました。

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

Y2H画面では、潜在的なエフェクタータンパク質は、異なる仮想的な相互作用するタンパク質（ステップ7）と共発現です。各成長酵母クローンは、餌が、（潜在的に）異なる相互作用物質が含まれています。相互作用するタンパク質は、獲物プラスミド中にクローニングされたcDNAライブラリーでエンコードされています。ベイトとプレイは、酵母転写因子の一部は、各共同cistronicallyコードをプラスミド。ベイト（エフェクター）と獲物プラスミドにコードされた相互作用物質の間の物理的相互作用の場合には、2つの転写因子部分（DNA結合ドメインおよび活性化ドメイン）が一体化され、そしてレポーター遺伝子の発現が誘導されます。酵母はヒスチジンおよびアデニン枯渇SD選択プレート上で増殖することができます。獲物cDNAライブラリーの種類をスクリーニングエフェクターに依存し、それに応じて選択されなければなりません。獲物とベイトベクター、ならびに酵母株は、互換性がなければなりません。この画面では、LexAのDNA結合ドメインとGAL4活性化domainは互換性のある酵母転写因子単位として使用しました。 cDNAライブラリーは、個別にカスタム得商業製、又は、構成することができます。 cDNAの獲物ライブラリーの調製は、このプロトコルの一部ではありません。このプロトコルでは、 マリュス第X domestica葉のRNAからの自己構築し、正規化されたcDNAライブラリーを使用し、pGAD-HA 41にクローニングしました。酵母株を発現性エフェクター（ベイト）は獲物ライブラリーで形質転換し、クローンはヒスチジンおよびアデニン枯渇SD選択プレート上で選択しました。酵母コロニーからプラスミドDNAを抽出するには、細菌の列ベースのDNAプラスミドミニキットは、酵母溶解（ステップ8）を改善するために、ガラスビーズを用いて機械的破壊のステップと組み合わせてお勧めします。このプラスミド精製では、ベイトおよびプレイベクターは、比較的低濃度で同時に精製されるであろう。しかしながら、プラスミドDNAの量は、配列決定ウィット介して相互作用パートナーを同定するために十分ですハウト前プラスミド増殖（ステップ8.4）。別の方法として、ステップ8.4で精製されたDNAは、コンピテント大腸菌に形質転換することができ、（ 例えば、pGAD-HAの場合にはアンピシリン）獲物ベクター媒介抗生物質耐性により選択します。選択された大腸菌コロニーは、pGAD-HAライブラリープラスミドを運び、かつ高収率プラスミド精製は、これらのクローンを用いて行うことができます。 pLexA-NとpGAD-HA構築物を形質転換の成功はNMY51のトリプトファンおよびロイシン栄養要求性を補完します。エフェクターおよびタンパク質（pGAD-HAにコードされる）との間の相互作用はNMY51株におけるレポーターシステムの活性化をもたらします。自己活性化の場合には、NMY51が原因NMY51レポーター系の望ましくない活性化にpGAD-HAは、TRP-レウ-彼-ADEを欠く選択プレート上で成長し、空のライブラリーベクターと組み合わせてpLexA-Nを発現するエフェクターで形質転換します40。自己活性化は、ワットすることができますEAKおよびTrp-Leuの-彼の不在下で発生する可能性があります、または活性化が強くなるとのtrp-leuへ-彼-ADEプレート41上に成長することを特徴とすることができます。自己活性化は、実際のY2H画面における偽陽性クローンの大規模なバックグラウンドを引き起こす可能性があります。これを回避するために、ベイト自己活性化試験を実施しなければならない、エフェクター発現ベクターは空のライブラリーベクターで同時形質転換しました。この実験設定では、レポーター遺伝子の発現が誘導されてはなりません。自己活性化（ すなわち、選択プレート上で成長）試験で表示されている場合、媒体は、3-アミノ-1,2,4-トリアゾール45（3-AT）の種々の濃度で補充することができます。 3-ATはimidazoleglycerolリン酸デヒドラターゼ（HIS3）、ヒスチジン生合成46の間に重要な酵素の阻害剤です。 3-ATの補充は、Y2Hスクリーン47の間に自己活性化の弱い影響を低減することができます48。 3-ATの異なる濃度の試験すべきです。このプロトコルでは - 1 40mMの3-ATを使用しました。自己活性化の抑制につながる最低濃度は、その後Y2H画面で使用されるべきです。同時形質転換のSD-TRP-Leuのプレートは、クローンの十分な数が含まれている場合、自己活性化アッセイの選択プレートのみを評価することができます。表示≥として90ミリメートル（直径）ペトリ皿当たり500コロニーが十分です。正確なトランスフェクション効率を決定するために、同時形質転換した酵母の連続希釈液を準備し、SD-TRP-Leuのプレート上にそれらを広げることをお勧めします。 自己活性化を減少させるために、エフェクターはpLexA-C、タンパク質のC末端へのLexAタグを融合ベイト発現ベクターにクローニングすることができます。レックスタグの向きは、自己活性化24を減衰させることができます。しかし、自己活性化を低減または廃止するすべての場合には不可能です。の形成赤色系のコロニーが弱いまたは偽陽性の相互作用を示しています。それは、タンパク質間相互作用に来るときNMY51のADE2レポーター遺伝子のみが活性化されるターンブロックで、この酵母株40における赤色色素の蓄積。強力な相互作用を運ぶコロニーは白色である一方で相互作用が存在しない場合には、NMY51は、赤みを帯びています。選択プレート上のコロニーの色の観察は、このようにそれぞれのコロニーが真陽性または偽陽性相互作用しているかどうかを判断するために、さらに重要なヒントを提供します。 適応や餌の性質と相互作用特性に関して、特定のアッセイの設定を変更することが最終的に必要です。今では、改善と共通Y2Hの派生技術の数が異なるホスト・システムではなく、困難なタンパク質相互作用の分析を可能にするために確立されています。 Stynen らによるレビュー。 49アドレスNDはY2H、その改善、および適応のさまざまな側面を説明し、このようにして、適切な相互作用アッセイを選択する方法についての有益な情報を提供しています。 Y2Hスクリーン派生技術が広くバイナリタンパク質相互作用の同定が必要とされる限り、異なる研究分野で使用されるようになっています。重要なコントロールが、そのような餌の自己活性化試験および同定相互作用タンパク質の一対一の再変換のように、実行された場合でも、Y2Hは誤った結果26、50、51を生成しやすいです。モデルとしての酵母は、すべての相互作用の研究には適していません。酵母は、必ずしもすべてのタンパク質24のための適切な翻訳後修飾や折りたたみをサポート細胞環境を構成するものではありません。また、Y2H設定で、タンパク質が過剰発現され、それらの発現は、コントロールではありませんその天然のプロモーターが率います。 Y2Hは、必ずしもそれらの自然の細胞内宛先ではない核へのタンパク質性相互作用パートナーを強制します。相互作用のネイティブの細胞の状況は、このように酵母によって反映されない場合がありますと、偽陰性または偽陽性結果につながる可能性があります。ほとんどのY2Hは、選択原則として酵母栄養要求性の相補性に基づいています。この栄養選択は、高感度によって特徴づけられるが、他に比べて減少した選択性を犠牲にして（ 例えば、発色性レポーター）が49をアッセイされます。非還元自己活性化（上記参照）または他の制限は、特定のエフェクターのために発生した場合、Y2Hは、適切なアッセイ25ではありません。 表1及び図1に、自己活性化試験の予想結果が与えられています。実際の相互作用（ すなわち、偽陰性）の不在は、タンパク質の毒性、誤った翻訳タンパク質によって引き起こされる可能性が処理、相互作用の立体障害、過小評価獲物ライブラリ内の相互作用パートナー、餌の膜局在化、または相互作用24のために必要な不足しているコンポーネント。 餌を発現への構築、cDNAから同定された相互作用するタンパク質の完全長遺伝子を増幅pGAD-HAにそれをサブクローニングし、生成されたpGAD-HAを変換することにより、1対1の相互作用アッセイを行うデノボに推奨されますNMY51株。獲物ライブラリーに存在する観測された相互作用因子だけより大きなタンパク質の断片であるかもしれないので、これは必要です。しかし、それぞれの完全長遺伝子の情報がかなりのゲノムおよびトランスクリプトーム配列データが利用可能である場合にのみアクセス可能です。ここに記載の自己活性化アッセイのための形質転換プロトコールは、一対一のアッセイに適用することができ、かつ餌と相互作用因子との間の相互作用が再現可能でなければなりません。 マリュスののx domesticaが ニコチアナベンタミアナで二分子蛍光相補性（BIFC）と植物体で確認されたのTCP転写因子との相互作用は、28（このプロトコルの一部ではない）をプロトプラスト。エフェクタータンパク質のATP_00189は、植物病原体のP.マリから派生しました。 プランタ BIFC ではこのようにマルスのx domesticaの転写因子とのATP_00189相互作用を確認するために選ばれました 以前Y2H 28で識別されました。 BIFCは、レポーター系を活性化するために、核への相互作用するタンパク質の細胞内移行を必要としない、タンパク質 - タンパク質相互作用アッセイです&lt;SUPクラス= &quot;外部参照&quot;&gt; 52。さらに、 植物体の発現および変形例では機械がその植物宿主中の植物細菌のエフェクター間の自然の相互作用の環境を模倣します。しかし、BIFCを使用してグローバル画面は現実的ではありません。 慎重に対処しなければならないプロトコルにはいくつかのステップがあります。関心（ステップ4）の遺伝子を増幅する場合には、プライマーは、植物DNAに結合することを排除することが重要です。このように、非感染植物からのDNAは、陰性対照として含まれている必要があります。目的の遺伝子の配列は、インサートの方向性クローニングのために使用されたEcoRIおよびSalI制限部位を含んではなりません。シーケンスは、これらのサイトが含まれている場合は、クローニングのための異なる制限酵素を選択する必要があります。酵母の形質転換は、このプロトコル中の中心的なメソッドです。トランスフェクション効率は、酵母細胞、それらの生存率、増殖状態、およびトランスフェクションの質の能力に依存REAGENT 53、54。提案されたプロトコルの場合、非常に変換を実行するときに2週間（4℃で保存）よりも古くない新鮮なプレートから酵母を使用することをお勧めします。選択液体培養が古い寒天プレートからコロニーを接種されたとき、多くの場合、形質転換酵母の成長が遅れています。プレートから直接酵母を使用するように、実際の実験のための接種物としての液体スターター培養物を使用しないためにも有用です。低効率は、ベイトを発現する酵母に獲物をトランスフェクトするときは、特定の獲物タンパク質（潜在的な相互作用）の過少につながることができますので、画面全体を歪曲することができます。このプロトコルでは、Y2Hで〜15万のcfu /μgでトランスフェクトされたDNAの酵母トランスフェクション効率はよく働きました。 Y2H技術の欠陥や欠点を知り、重要かつ適切な方法で結果を解釈すると、CORRを描画することが不可欠です電気ショック療法の結論。 Y2Hアッセイおよび誘導体は、長年使用されており、異なる餌特性に対して多くの改良及び適応を受けた、相互作用の細胞内局在性は、相互作用のために必要とされるかもしれない期待結合パートナー、およびその他の要因が（参照しますY3H 55、56、57）。最近では、アレイベースのY2Hスクリーンは獲物58の何百万人に対する多数の餌の自動化、ハイスループット分析を可能にするように開発されてきました。今後は、最も可能性の高い別の研究分野における複雑なシグナル伝達経路とインタラクトームの解明を可能にするために、このアッセイに自動化と高スループットのアプローチです。

<html>酵母ツーハイブリッドスクリーニング（Y2H）は1約27年前に開発され、広く、特定のタンパク質-タンパク質相互作用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11を決定するために、様々な分野で利用されているので有しました。ホスト標的タンパク質と細菌のエフェクターの物理的相互作用は、多くの場合、この標的タンパク質の機能的操作のための前提条件です。これらの相互作用を分析して、感染生物学12、13、14、15の多くの異なるセクターの焦点に移動しました、&quot;&gt; 16、17、18。Y2Hスクリーンの原理は、2つのタンパク質の相互作用は、レポーター遺伝子の発現を駆動する機能的転写因子の再構成をもたらすことである。既知のエフェクター（「ベイト」）が翻訳的に融合させますDNA結合ドメイン転写因子（DBD）、および潜在的な相互作用パートナー（「プレイ」）の相互作用パートナーは、潜在的なライブラリ不明であるので、それぞれの転写因子の活性化ドメイン（AD）に融合されているに相互作用は、いわゆる中にクローン化された「プレイ・ライブラリー。」通常、このライブラリーはベイトベクターと互換性のDBDを符号化されている。相互作用の場合には、ADをコードする適切な獲物ベクター発現プラスミドにcDNAをクローニングすることによって作られ、再構成された転写因子は、一般的に、酵母の増殖選択を可能にする、レポーター遺伝子の発現を誘導します。相互作用物質の同定は、プラスミド特異的プライマーと獲物プラスミドを配列決定することによって達成されます。 細菌は、操作とその宿主の代謝を利用するか、防御機構を回避し、異なる細菌分泌系19、20、21を介してエフェクター分子を分泌するために様々な戦略を開発しました。これらの細菌のエフェクターの結合パートナーを決定することは、このようホストでの操作経路を特定するための最初のステップです。これは、特定の病原性のメカニズムの理解の向上につながります。 Y2Hスクリーンはphytoplasmoses中の細菌エフェクターの相互作用を同定するために実施され、多くの場合、Y2Hは、ファイトプラズマ研究22、23の分子病原性機構のさらなる特徴付けのための重要な最初の実験です。しかし、会いましたほとんどの出版物におけるHOD説明はかなり希少であり、これらの技術は、多くの場合、バイオテクノロジー企業に外注しています。この方法の実現可能性に注意を引くために、このプロトコルは、その自然宿主における細菌エフェクター分子の相互作用パートナーを識別するためのステップバイステップの情報を提供します。 幅広い用途とY2H画面の早送りアプローチにもかかわらず、それは特定の相互作用は酵母系で発生していない可能性があることを忘れてはなりません。これは、酵母細胞は、特定の生物学的な制限が「 インビボ反応容器」の一種として使用されるという事実によるものです。いくつかの著者は、Y2H及びその誘導体11、24、25、26、27の利点と欠点に対処しています。一般的な考慮事項は、酵母細胞は、適切なを提供しない場合があること、例えば、遺伝子発現、（後）の翻訳、またはそれぞれのタンパク質の転条件が検討されて。これは、画面内の偽陰性の結果につながることができます。正の相互作用は、順番にアーティファクトすることができ、（ すなわち、適切な宿主内でのエフェクターの場合には）自然な状況で発生していない可能性があります。より密接に関連する生物学的システムにおける独立した相互作用試験で異種酵母発現系の相互作用を確認することが不可欠です。 本研究では、非耕作植物病原体マリCandidatusファイトプラズマ（P.のマリ）からエフェクターATP_00189の結合パートナーを同定しました。結果は、リンゴの増殖28、欧州29に影響を受けたリンゴに成長している地域では高い経済的損失の原因となる疾患の症状の開発の根底にある分子メカニズムに重要な洞察を提供します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1514">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:565px;">Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:211px;">Applichem</td>
			<td style="width:324px;">A6284</td>
			<td style="width:415px;">for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trishydroxymethylaminomethane (Tris)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2264</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodiumchloride (NaCl)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2942</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2937</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">N-Lauroylsarcosin sodium salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A7402</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ammonium acetate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>9688</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1108</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3928</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>51976</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNAse</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2760</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chloroform:Isoamyl 24:1</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1935</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proofreading Polymerase (e.g. iProof)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>203433</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EcoRI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0271</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SalI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0641</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Column-based DNA Purification Kit (e.g. QIAquick)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1493</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8056</td>
			<td>for self-activation assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Arginine Monohydrochloride&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3680</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Isoleucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3642</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-lysine Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3448</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Methionine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3897</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Phenylalanine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3464</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Threonine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3946</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tyrosine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3401</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Uracile</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0667</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Valine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3406</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Adenine Hemisulfate Salt&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1596</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.22 &#181;m Pore Filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16541</td>
			<td>for sterile filtration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Histidine Monohydrochloride</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3719</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Leucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3496</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tryptophane&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3410</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Nitrogen Base&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51483</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-Glucose Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1349</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2641-1</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peptone</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2208</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyethylene Glycol 4000 (PEG)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1249</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3478</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Salmon Sperm DNA&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2159</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody against Lex-A tag (e.g. Anti-LexA DNA binding region)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-719</td>
			<td>for Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plasmid Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PLN350</td>
			<td>for plasmid purification from yeast and bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Acid Washed Glass Beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td>for plasmid purification from yeast</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0839</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Extract</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1552</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacuum concentrator centrifuge (e.g. Concentrator 5301)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z368245 (Sigma)</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bait vector (e.g. pLexA-N)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Prey vector (e.g. pGAD-HA)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control prey vector (e.g. pLexA-p53)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control bait vector (e.g. pACT-largeT)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electrocompetent E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C640003</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3&#916;200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plastic paraffin film (e.g. Parafilm M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gas permeable sealer (e.g. BREATHseal)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>676 051</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">quantitative PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855195</td>
			<td>for quantitative PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge (e.g. Centrifuge 5804 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free)</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2500010</td>
			<td>for PCR and DNA works</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpell</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0301</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile filter (0.22 &#181;m; Polyethersulfone))</td>
			<td>VWR-International</td>
			<td>514-0073 (European Catalogue number)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 90 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633180</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 150 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>639161</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer (e.g. BioPhotometer)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>550507804</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer Cuvettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759015</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water Bath (e.g. Water Bath Memmert WB7)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WB7</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Western Blot Equipment</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>diverse</td>
			<td>for protein detection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">dNTPs</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2201210</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 ml; 1000 ml; 2000 ml) and breathable cotton plugs (e.g. Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z232793, Z232858, Z232866</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaking Incubator (e.g. GFL 3031)</td>
			<td>GFL</td>
			<td>3031</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>KB 53 (E3.1)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ice Maker (e.g. Ice Maker IF 825)</td>
			<td>Omniwash</td>
			<td>IF 825</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.2 ml, 1.5 ml and 2.0 ml Reaction Vials (Polypropylene)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10-1000 &#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>diverse</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spreader</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SPR-L-S01</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vortex shaker (e.g. MS 3 Minishaker)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3617000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">T4-Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fridge (4&#176;C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>81.767.580.4</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Freezer (-20&#176;C) (e.g. Liebherr Comfort Professional G5216)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>G5216</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Graduated Cylinder (e.g. Brand)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z327352; Z327417; Z327441&#160;&#160;</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Serological Pipettes (e.g. Fisherbrand)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S55701</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mechanical Pipettor (e.g. Pipetboy acu 2)</td>
			<td>Integra-Biosciences</td>
			<td>155000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cuvettes for Electroporation (1 mm)</td>
			<td>Molecular Bio Products</td>
			<td>5510-11</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electroporator (e.g. Eporator)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4309000019</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gel and Blot imaging system (e.g. ChemiDoc MP System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708280</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 ml)</td>
			<td>VWR-International&#160;</td>
			<td>525-0403 (European Catalogue number)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 ml)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dithiothreitol (DTT, e.g. DTT, 1M)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P2325</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM))</td>
			<td>Ambion&#160;</td>
			<td>AM8110G (distributed by Thermo Scientific)</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, e.g. Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y2021 Sigma&#160;</td>
			<td>for yeast culture (ready-made mix)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unravelling the function of a bacterial effector from a non-cultivable plant pathogen using a yeast two-hybrid screen

病気の症状の分子機構をUnravellingする植物科学における病理および症状の発展を理解することが重要です。細菌は、自分の利益のためにそれらの宿主代謝を操作するために異なる戦略を進化させてきました。この細菌の操作は、多くの場合、重度の症状の開発や影響を受けた植物の死に連結されています。ホスト操作を担当する特定の細菌の分子を決定することは、微生物学的研究の重要な分野となっています。呼ばれるこれらの細菌の分子の同定後、「エフェクター、「彼らの機能を解明することが重要です。エフェクターの機能を決定するための直接的なアプローチは、酵母ツーハイブリッド（Y2H）画面を介して、その自然宿主でのタンパク質性結合パートナーを同定することです。通常、ホストは、 インシリコのアルゴリズム内の任意により十分に予測できない多数の潜在的な結合パートナーを保有します。したがってperfoするための最良の選択であります表現宿主タンパク質のライブラリ全体に対して仮想的なエフェクターで画面をRM。原因物質は、ファイトプラズマのような耕せないであれば、特に困難です。このプロトコルは、ファイトプラズマ感染木本宿主植物、潜在的なエフェクターの増幅、およびY2Hスクリーンでの植物の分子相互作用パートナーのその後の識別からのDNA精製のためのステップバイステップの手順を説明します。 Y2Hスクリーンが一般的に使用されているにもかかわらず、コストでY2Hサービスを提供していますバイオテクノロジー企業にこの技術をアウトソーシングする傾向があります。このプロトコルは、標準的な実験室技術を使用して任意のまともな装備の分子生物学研究室でY2Hを実行する方法について説明します。

実際Y2H画面を行うことができる前に、餌は、自己活性化のためにテストする必要があります。これは、空の餌ライブラリーベクターと共にベイト発現ベクターを形質転換し、選択プレート上での増殖を検査することによって達成されます。 ベイトプラスミドはTRPを補完し、獲物がS.セレビシエ NMY51 40のレイの栄養要求性をプラスミド部5で説明したようにphytoplasmalタンパク質ATP_00189が自己活性化であるか否かを分析するために、自己活性化試験を行いました。成功した同時形質転換は、このようにtrpおよびロイシンを欠く選択プレート上での増殖によって特徴づけられます。ベイトおよびプレイタンパク質の相互作用は、NMY51の彼とADEの栄養要求性の相補性につながります。相互作用の非存在下での餌による自己活性化が表示された場合、酵母は彼とADEを欠く選択プレート上で成長します。強者と弱者の自己活性化が発生する可能性があります。餌の強い自己活性化は、TRP-レイ-彼-ADE枯渇選択プレート上で同時形質転換した酵母の増殖を特徴とします。弱い自己活性化はなく、TRP-レイ-彼-ADE枯渇選択プレート上のtrp-leuへ-彼の成長につながります。適切な陽性対照は、自己活性化アッセイの結果を解釈するために不可欠です。自己活性化アッセイおよびそれらの解釈の期待される結果の概要を表1に提供され、 図1に可視化されます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55150/55150fig1.jpg" /> 図1：Y2H スクリーンを実行する前に、ベイトのベイト自己活性化テストの例 。 、弱い自己活性化に加えて、空の獲物天秤座：S.セレビシエ NMY51はポジティブコントロール（AC左パネル ）として（PLEX-p53の）および獲物（PACT-largeT）餌を相互作用で同時形質転換しました。RYベクトル（ 中央のパネル：DF）とされない自己活性化餌プラス空の獲物のライブラリーベクター（ 右パネル：GI）。 、TRP、レイと彼：同時形質転換した酵母は、trpおよびレイ（、D、G上のパネル ）欠けているSDプレート上で培養した（ 中央のパネルを：B、E、H）とのtrp、レイ、彼とADE（ 下パネル：C、F、I）。ベイトベクターはNMY51のレイの栄養要求性（SD-TRP-レイ上での成長）のtrp栄養要求性と獲物のベクトルを補完するようtrpおよびレイを欠く培地上での選択は、同時形質転換の成功のための陽性対照です。ベイトおよびプレイや餌の自己活性化の間の相互作用の場合には、NMY51のレポーター発現がオンになり、彼とADEの栄養要求性（SD-TRP-レイ-彼-ADE上での成長）を補完します。弱い自己活性化は、SD-TRP-レイ-彼のプレート上で成長することを特徴とする（ 中央のパネルは、df）。餌の弱い自己活性化は、前に餌を分析するために減少されなければなりませんY2H画面において、選択培地に3-ATを添加することによって、例えば 。アミノ酸の枯渇がで示されている「 - 」それぞれのメディア名に。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td>なし</td><td>コロニー</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td></tr><tr><td>なし</td><td> pGAD-HA </td><td>全く成長しません</td><td>コロニー</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td>なし</td><td>コロニー</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> pGAD-HA </td><td>コロニー</td><td>コロニー</td><td&gt;コロニー</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td></tr><tr><td> pLexA-p53を</td><td> PACT-largeT </td><td>コロニー</td><td>コロニー</td><td>コロニー</td><td>コロニー</td><td>コロニー</td></tr><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> pGAD-HA </td><td>コロニー</td><td>コロニー</td><td>コロニー</td><td>全く成長しません</td><td>全く成長しません</td></tr></tbody></table> 表1：ベイト自己活性化アッセイで予想される結果。 S.セレビシエ NMY51の変換は、同時形質転換ベイトおよびプレイの特性に基づいて選択培地上の差動の成長にもたらします。選択プレート上での増殖は、30℃で72時間のインキュベーション後の異なるベクターの組合せ（AF）の形質転換の際に評価しました。弱い自己活性化は、SD-TRP-レイ-彼-ADE選択プラット上の成長によってSD-TRP-レイ - 彼との強い自己活性化に酵母増殖によって特徴付けられます相互作用パートナーの不在下でES。 pLexA-N符号化されたphytoplasmalエフェクターATP_00189はNMY51が彼とADEの非存在下で増殖するように形質転換された餌ベクトルのできないことによって特徴づけられる自己活性化を示しません。 餌に応じて、Y2H画面は選択プレート上で増殖する多数の酵母クローンを得ることができます。全てのクローンを分析し、可能な冗長性をチェックする必要があります。正規化されたcDNAライブラリーが使用された場合でも、インタラクターは、多くの異なるクローンで表される可能性が高いです。ライブラリーのクローニング技術によって、完全な遺伝子の断片のみが、いくつかの餌ベクターに挿入することも可能です。 （cDNAから）を増幅し、相互作用物質の完全長遺伝子をサブクローニングし、1対1 Y2H分析（ 図2）での相互作用をテストするために新たにすることが賢明です。 <img aLT = &quot;図2&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 55150 / 55150fig2.jpg&quot; /&gt; 図2：Y2H 実験で、ベイトとプレイとの間の相互作用の例。酵母ツーハイブリッド（Y2H）画面を実施し、陽性の相互作用因子のクローンからプラスミドを精製しました。獲物ベクターは、配列決定したとマルスのx domesticaホスト相互作用パートナーMdTCP24とMdTCP25が同定されました。 （何の相互作用因子がY2Hライブラリ画面で確認されなかったために）ネガティブコントロールMdTCP34として並列にサブクローニングしました。完全長遺伝子は、餌ベクター（共cistronically活性化ドメインADを発現する）およびデノボ DNA結合ドメイン（BD）に接続された細菌のエフェクターATP_00189を発現ベイトベクターで同時形質転換にサブクローニングリンゴのcDNAから増幅しました。この数字は28から取得されます。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">拡大表示するにはここをクリックしてください。</a>この図のバージョン。

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Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

細菌のエフェクタータンパク質は、成功した感染を確立するために重要です。このプロトコルは、その自然の植物宿主における細菌のエフェクタータンパク質のタンパク質性結合パートナーの実験的同定を記載します。酵母ツーハイブリッドスクリーニングを介してこれらのエフェクターの相互作用を同定することは、分子病原性戦略の解明に重要なツールとなっています。

酵母ツーハイブリッドスクリーンを用いた非耕作植物病原体から細菌のエフェクターの機能をUnravelling

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

unravelling-function-bacterial-effector-from-non-cultivable-plant

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K ビュー.  Laimburg Research Centre. 細菌のエフェクタータンパク質は、成功した感染を確立するために重要です。このプロトコルは、その自然の植物宿主における細菌のエフェクタータンパク質のタンパク質性結合パートナーの実験的同定を記載します。酵母ツーハイブリッドスクリーニングを介してこれらのエフェクターの相互作用を同定することは、分子病原性戦略の解明に重?...

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Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

マウスでイメージ細菌感染にルシフェラーゼを用いた

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

免疫・感染学

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be applied to the study of cell invasion by virtually any culturable bacterium. The stages at which specific aspects of invasion can be studied, such as the role of actin rearrangement or caveolae, will be highlighted. Host cells are grown in flasks and when ready for use are seeded into 24-well plates containing Thermanox coverslips. Using coverslips allows subsequent removal of the cells from the wells to reduce interference from serum proteins deposited onto the sides of the wells (to which S. aureus would attach). Bacteria are grown to the required density and washed to remove any secreted proteins (e.g. toxins). Coverslips with confluent layers of endothelial cells are transferred to new 24-well plates containing fresh culture medium before the addition of bacteria. Bacteria and cells are then incubated together for the required amount of time in 5% CO2 at 37&deg;C. For S. aureus this is typically between 15-90 minutes. Thermanox coverslips are removed from each well and dip-washed in PBS to remove unattached bacteria. If total associated bacteria (adherent and internalised) are to be quantified, coverslips are then placed in a fresh well containing 0.5% Triton X-100 in PBS. Gentle pipetting leads to complete cell lysis and bacteria are enumerated by serial dilution and plating onto agar. If the number of bacteria that have invaded the cells is needed, coverslips are added to wells containing 500 &mu;l tissue culture medium supplemented with gentamicin and incubation continued for 1 h, which will kill all external bacteria. Coverslips can then be washed, cells lysed and bacteria enumerated by plating onto agar as described above. If the experiment requires direct visualisation, coverslips can be fixed and stained for light, fluorescence or confocal microscopy or prepared for electron microscopy.

A general protocol for the study of invasion of host cells by a bacterial pathogen, focusing on Staphylococcus aureus and human endothelial cells.

細菌性病原体によるヒト細胞の浸潤

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

長期宿主 - 病原体相互作用を特徴付けるためのEpiAirwayモデルの利用

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

移植片対宿主病の誘導および<emインビボで&gt;</emMHCマッチしたマウスモデルを使用する&gt; T細胞のモニタリング

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks to human and animal health. Among cereal production, maize is arguably the most affected crop, due to pathogen-induced losses in grain integrity and mycotoxin seed contamination. The two most prevalent and problematic mycotoxins for maize growers and food and feed processors are aflatoxin and fumonisin, produced by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides, respectively.
Recent studies in molecular plant-pathogen interactions have demonstrated promise in understanding specific mechanisms associated with plant responses to fungal infection and mycotoxin contamination1,2,3,4,5,6. Because many labs are using kernel assays to study plant-pathogen interactions, there is a need for a standardized method for quantifying different biological parameters, so results from different laboratories can be cross-interpreted. For a robust and reproducible means for quantitative analyses on seeds, we have developed in-lab kernel assays and subsequent methods to quantify fungal growth, biomass, and mycotoxin contamination. Four sterilized maize kernels are inoculated in glass vials with a fungal suspension (106) and incubated for a predetermined period. Sample vials are then selected for enumeration of conidia by hemocytometer, ergosterol-based biomass analysis by high performance liquid chromatography (HPLC), aflatoxin quantification using an AflaTest fluorometer method, and fumonisin quantification by HPLC.

The devastation of cereal crops by seed-infecting fungi has prompted numerous research efforts to better understand plant-pathogen interactions. To study seed-fungal interactions in a laboratory setting, we developed a robust method for the quantification of fungal reproduction, biomass, and mycotoxin contamination using kernel bioassays.

真菌の植民地、減数、およびカーネルのバイオアッセイを用いたマイコトキシンの生産の定量化

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

This protocol outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and colitis, as well as the methods used to characterize Citrobacter rodentium infection in mice. C. rodentium is a gram negative, murine specific bacterial pathogen that is closely related to the clinically important human pathogens enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli. Upon infection with C. rodentium, immunocompetent mice suffer from modest and transient weight loss and diarrhea. Histologically, intestinal crypt elongation, immune cell infiltration, and goblet cell depletion are observed. Clearance of infection is achieved after 3 to 4 weeks. Measurement of intestinal epithelial barrier integrity, bacterial load, and histological damage at different time points after infection, allow the characterization of mouse strains susceptible to infection.
The virulence mechanisms by which bacterial pathogens colonize the intestinal tract of their hosts, as well as specific host responses that defend against such infections are poorly understood. Therefore the C. rodentium model of enteric bacterial infection serves as a valuable tool to aid in our understanding of these processes. Enteric bacteria have also been linked to Inflammatory Bowel Diseases (IBDs). It has been hypothesized that the maladaptive chronic inflammatory responses seen in IBD patients develop in genetically susceptible individuals following abnormal exposure of the intestinal mucosal immune system to enteric bacteria. Therefore, the study of models of infectious colitis offers significant potential for defining potentially pathogenic host responses to enteric bacteria. C. rodentium induced colitis is one such rare model that allows for the analysis of host responses to enteric bacteria, furthering our understanding of potential mechanisms of IBD pathogenesis; essential in the development of novel preventative and therapeutic treatments.

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Citrobacter rodentium infection provides a valuable model to study enteric bacterial infections as well as host immune responses and colitis in mice. This protocol outlines the measurement of barrier integrity, pathogen load and histological damage allowing for the thorough characterization of pathogen and host contributions to murine infectious colitis.

ザ<em&gt;シトロrodentium</em&gt;マウスモデル：感染性大腸炎に勉強病原体とホスト貢献

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

の自動分離<em&gt; C.虫</em&gt;可変細菌性病原体の植民地

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

細菌胞子の発芽中に皮質断片を検出

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

網膜ミクログリアの貪食機能を評価します<em&gt;インビボ</em&gt;フローサイトメトリーベースのアッセイを使用しました

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...