Biz yazının redaksiyon için teknik destek için Dualsystems Biotech AG ve Julia Strobl gelen Laimburg Araştırma Merkezi ve Mirelle Borges Dias Schnetzer Christine Kerschbamer, Thomas Letschka, Sabine Oettl Margot Raffeiner ve Florian Senoner teşekkür ederiz. Bu çalışma APPL2.0 projesinin bir parçası olarak gerçekleştirildi ve kısmen Bozen / Bolzano, İtalya Özerk İli ve Güney Tirol Apple Konsorsiyumu tarafından finanse edildi.

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Y2H ekranında potansiyel efektör protein, farklı hipotetik etkileşen proteinlerin (basamak 7) benzer olan eksprese eş. Her büyüyen maya klonu yem ama (potansiyel olarak) farklı interaktör içerir. etkileşen proteinler av plazmid içine klonlanır bir cDNA kütüphanesinden kodlanır. yem ve av, bir maya transkripsiyon faktörünün bir kısmını, her eş-cistronically kodu plazmidler. yem (efektör) ve av plasmidle kodlanmış uygulayıcının arasında fiziksel bir etkileşim halinde, iki transkripsiyon faktör parçaları (DNA bağlama domeni ve aktivasyon alanı) birleşirler ve raportör gen ekspresyonu indüklenir. maya histidine- ve adenin tükenmiş SD seçimi plakalar üzerinde büyümek mümkün. av cDNA kütüphanesinin tür filtrelenmiş efektör bağlıdır ve buna göre seçilmelidir. av ve yem vektörü olarak maya suşu, uyumlu olmalıdır. Bu ekranda, bir LexA DNA etki alanı ve Gal4 aktivasyon Domai bağlayıcın uyumludur, Maya transkripsiyon faktörü birimler olarak kullanılmıştır. cDNA kütüphanesi tek tek özel elde ticari olarak yapılan ya da inşa edilebilir. cDNA av kütüphanenin hazırlanması Bu protokolün bir parçası değildir. Bu protokol, Malus domestica X yaprakların RNA&#39;dan İnşası normalleştirilmiş cDNA kütüphanesi kullanıldı ve pGAD-HA 41 içine klonlandı. Maya suşu -expressing efektör (yem) av kütüphanesi ile transforme edildi ve klonlar histidine- ve adenin tükenmiş SD seçme plakaları üzerinde seçilir. Maya kolonilerden plazmid DNA elde etmek için, bakteriler için bir sütun-bazlı DNA plazmid mini kiti maya hücrelerinin yok (adım 8) geliştirmek için, cam boncuklar kullanılarak bir mekanik aksama aşama ile birlikte tavsiye edilmektedir. Bu plazmid saflaştırma olarak, yem ve av vektörü nispeten düşük konsantrasyonlarda eş zamanlı olarak saflaştırılabilir olacaktır. Bununla birlikte, plasmid DNA miktarı dizi wit ile etkileşimi ortak tanımlamak için yeterlidirhout önce plazmid yayılma (adım 8.4). Bir alternatif olarak, adım 8.4 içinde saflaştırılmış DNA kompetan E. coli &#39;ye transforme edilebilir (ör pGAD-HA halinde ampisilin) av vektör aracılı antibiyotik direnci seçilebilir. Seçilen E. koloniler yalnızca pGAD-HA Kitaplık plasmidi taşıyan coli ve yüksek verimli plazmid saflaştırma, bu klonlar ile gerçekleştirilebilir. pLexA N ve pGAD-HA konstruktlarının başarılı dönüşüm NMY51 triptofan ve lösin oksotrofi tamamlar. efektör ve bir proteini (pGAD-HA kodlanmış) arasında bir etkileşim NMY51 suşları raportör sistemin aktivasyonuna yol açar. kendi kendine aktivasyon durumunda, NMY51 bağlı NMY51 raportör sistemi istenmeyen aktivasyonuna pGAD-HA Trp-Leu-His-ade eksik seçici plakalar üzerinde yetişen boş kütüphanesinin vektör ile kombinasyon halinde pLexA-N eksprese efektör ile transforme 40. kendi kendine aktivasyon W olabilirEAK ve yokluğunda oluşabilecek Trp-Leu-His ya da etkinleştirme güçlü ve Trp-Leu-His-ade plakalar 41 büyüme ile karakterize edilebilir. Kendinden aktivasyon gerçek Y2H ekranında yanlış pozitif klonların büyük bir arka plan neden olabilir. Bunu önlemek için, yem ile kendi kendine aktivasyon testi olan efektör-eksprese eden vektör ko-transforme edilmiş boş kütüphanesinin vektörü ile, yapılmalıdır. Bu deneysel ortamda, raportör gen sentezleme neden olmamalıdır. Kendi kendine aktivasyon (yani, seçici plakalar üzerine büyüme) test görülebiliyorsa, ortam 3-amino-1,2,4-triazol 45 (3-AT) farklı konsantrasyonları ile desteklenebilir. 3-AT imidazoleglycerol fosfat dehidrataz (HIS3), histidin biyosentezi 46 boyunca önemli bir enzim olan bir inhibitördür. 3-AT ile takviyesi, Y2H ekranlarında 47 sırasında kendini aktivasyonu zayıf etkilerini azaltabilir48. 3-AT farklı konsantrasyonları test edilmelidir. Bu protokol, 1-40 mM 3-kullanılmıştır. kendi kendine aktivasyon baskıya neden en düşük konsantrasyon, daha sonra Y2H ekranında kullanılmalıdır. ko-transformasyon, SD-Trp-Leu plakalar klon yeterli sayıda içeren self-aktivasyon tahlili seçici plakalar sadece değerlendirilebilir. bir gösterge ≥ olarak 90 mm (çap) bir petri 500 koloni yeterlidir. Tam transfeksiyon etkinliğini belirlemek için, ko-transforme edilmiş maya seri dilüsyonları hazırlamak ve SD-Trp-Leu plakaları üzerine yayılır önerilir. Kendi kendine aktivasyonunu önlemek için, efektör pLexA-C, proteinin C-ucuna LexA etiketi sigortalar bir yem sentezleme vektörü içine klonlanabilir. Lex-A etiketinin oryantasyon kendini aktivasyonunu 24 azaltabilir. Bununla birlikte, her durumda azaltılması ya da kendi kendine aktivasyonunu ortadan kaldırmak mümkün değildir. oluşumukırmızı veya kırmızımsı koloniler zayıf ya da yanlış pozitif etkileşim gösterir. Bu, bir protein-protein etkileşimi için söz konusu olduğunda NMY51 bölgesinin ade2 raportör gen sadece aktif olan bir dönüş blokları bu maya kökü 40 kırmızı boya birikimi. Güçlü inter aktörlerin taşıyan klonlar beyazdı sırasında başka bir etkileşim olmaması durumunda, NMY51, kırmızımsı. Seçim plakalar üzerinde koloni renginin gözlem ve böylece söz konusu koloniler true-ya da yanlış pozitif interaktörler olup olmadığını yargılamak başka bir önemli ipucu sağlar. Uyum ya da yem niteliği ve etkileşim özellikleri açısından belirli tahlil ayarlarını değiştirmek için sonunda gereklidir. Artık, iyileştirmeler ve ortak Y2H türev bir dizi teknik, farklı ev sahibi sistemlerinde oldukça zor protein etkileşimleri analiz için kurulmuştur. Stynen ve arkadaşları tarafından bir inceleme. 49 adreslerind Y2H, onun iyileştirmeler ve uyarlamalar farklı yönlerini açıklar ve böylece uygun etkileşim deneyi nasıl seçileceği hakkında yararlı bilgiler sağlar. Y2H ekranlar ve türetilmiş teknikleri yaygın ikili protein etkileşimleri belirlenmesi gerekli olduğu her yerde farklı araştırma alanlarında, kullanılır hale gelmiştir. Kritik kontrolleri, yem kendi kendine aktivasyon testi ve tespit etkileşen proteinlerin bire bir tekrar dönüşüm olarak gerçekleştirilse bile, Y2H yanlış sonuçlar 26, 50, 51 oluşturmak için müsaittir. bir model olarak maya tüm etkileşim çalışmaları için uygun değildir. Maya mutlaka her protein 24 için uygun post-translasyonel modifikasyonu ve katlama destekleyen bir hücresel ortam teşkil etmez. Ayrıca, Y2H ortamda proteinler aşırı ifade edilir ve ifade kontrol değildirdoğal promoter tarafından yol açtı. Y2H mutlaka doğal hücre içi hedef değil çekirdeği, proteinli etkileşim ortakları zorlar. etkileşim yerli hücresel koşullar dolayısıyla maya tarafından yansıtılması değil ve-yanlış negatif ya da yanlış pozitif sonuçlara yol açabilir. En Y2H seçici bir madde olarak maya oksotrofi tamamlama dayanmaktadır. Bu besin seçimi yüksek hassasiyet ile karakterize, ancak diğer karşılaştırıldığında azalmış seçicilik pahasına (örneğin, kromojenik raportör) 49 deneyleri edilir. Azaltılamaz kendine aktivasyon (yukarıya bakınız) veya başka sınırlamalar belirli efektör için oluşursa, Y2H uygun bir deney, 25 değildir. Tablo 1 ve Şekil 1 &#39;de, kendi kendine aktivasyon testinde beklenen sonuçlar verilmiştir. Gerçek etkileşimler (yani, yanlış negatif) yokluğu protein zehirlenmesi, yanlış çeviri proteini neden olabiliretkileşim 24 için gerekli işleme, etkileşim sterik engel, av kütüphanede az temsil edilen etkileşim ortakları, yem membran lokalizasyonu, ya da eksik parçalar. Bu de novo önerilir pGAD-HA alt-klonlanmıştır, cDNA&#39;dan tanımlanır etkileşim proteininin tam uzunlukta genini çoğaltmak ve üretilen pGAD-HA içine inşa dönüştürerek bire bir etkileşim deneyi gerçekleştirmek yem eksprese NMY51 süzün. av kitaplığında gözlenen uygulayıcı sadece daha büyük bir proteinin bir parçası olabilir, çünkü bu gereklidir. Ancak, ilgili tam uzunlukta geni için bilgi önemli genomik ve transkriptomik dizi verileri mevcut ise sadece erişilebilir. Burada tarif edilen kendi kendine aktivasyon deneyi için transformasyon protokolü, bire-bir tahlil için uygulanabilir ve yem ve uygulayıcının arasındaki etkileşim tekrar üretilebilir olmalıdır. <p cleşek = &quot;jove_content&quot;&gt; bir Y2H ekranında tanımlanan etkileşimler her zaman başka bir bağımsız tekniği ile teyit edilmesi gerekir. Bu bağımsız bir teknik, gerçek protein-protein etkileşimi, doğal ortamda daha yakın olması gerekir. Phytoplasmal efektör ATP_00189 durumunda, Malus domestica X TCP transkripsiyon faktörleri ile etkileşimi, Nicotiana benthamiana bimoleküler floresan tamamlama (BiFC) ile planta doğrulanmıştır 28 (bu protokol parçası değil) protoplastlannda. efektör protein ATP_00189 bitki patojeni P. mali&#39;nin türetilmiştir. Planta BiFC böylece Malus x domestica transkripsiyon faktörleri ile ATP_00189 etkileşimlerini doğrulamak için seçildi Daha önce Y2H 28 tespit edilmiştir. BiFC raportör sistemi &lt;etkinleştirmek için çekirdeğe etkileşen proteinlerin hücre içi translokasyon gerektirmeyen bir protein-protein etkileşimi deneyidirsup class = &quot;xref&quot;&gt; 52. Ayrıca, içinde planta ifadesi ve modifikasyon makine taklit onun bitki konak bitki bakteriyel efektör arasındaki doğal etkileşim ortamı. Bununla birlikte, BIFC kullanarak küresel ekran mümkün değildir. dikkatle ele alınması gereken protokol çeşitli adımlar vardır. Çevrede (basamak 4) geni amplifiye, primerler, bitki DNA&#39;ya bağlanan ekarte etmek önemlidir. Bu nedenle, enfekte olmayan bitkilerden DNA, bir negatif kontrol olarak dahil edilmesi gerekir. ilgi konusu genin dizisinin ucun doğrudan klonlanması için kullanılan, EcoRI ve SalI kısıtlama alanları içermemelidir. dizisi bu siteleri içeren olursa, klonlama için farklı sınırlama enzimleri seçilmelidir. Maya dönüşüm Bu protokol sırasında merkezi bir yöntemdir. Transfeksiyon verimi maya hücrelerinin yetkinlik, bunların canlılığı, büyümesi durumu ve transfeksiyon Reaktifler kalitesine bağlıdırent 53, 54. Önerilen protokolü için, son derece dönüşümleri yaparken (4 ° C&#39;de muhafaza) iki hafta daha eski olmayan yeni plakalardan mayayı kullanılması tavsiye edilir. Seçici sıvı kültürler bir agar plakalarından koloniler ile aşılanır, çoğu zaman, dönüştürülmüş maya büyümesi geciktirilir. Plaka doğrudan mayayı kullanmak gerçek deneyler için bir aşı gibi bir sıvı starter kültür kullanımı ve de yararlıdır. Düşük verimlilik, belirli av proteinleri (potansiyel interaktörler) underrepresentation yol açabilir yem-ifade mayaya av transfecting ve böylece bütün ekranı çarpık zaman. Bu protokolde, Y2H içinde ~ 150,000 cfu / ug transfekte DNA maya transfeksiyon verimliliği iyi çalıştı. Y2H tekniğinin kusurları ve dezavantajları bilmek ve eleştirel ve uygun bir şekilde sonuçları yorumlama Corr çizim için vazgeçilmezdirEKT sonuçlar. Y2H deneyleri ve türevleri yıllardır kullanılmaktadır ve farklı yem özelliklerine göre birçok yenilik ve uyarlamalar geçirmiş, etkileşim hücre içi lokalizasyonu, etkileşim için gerekli olabilecek beklenen bağlama partnerleri ve diğer faktörler (bkz Y3H 55, 56, 57). Son zamanlarda, bir dizi-bazlı Y2H ekranları ile av 58 milyonlarca karşı çok sayıda yemler otomatik yüksek verimli analizlere imkan vermek geliştirilmiştir. geleceği muhtemelen farklı araştırma alanlarda karmaşık sinyal yollarının ve interactomes açıklanması için izin vermek için bu deneyde otomasyon ve yüksek verimli yaklaşımları yer alır.

<html> Bira mayası iki-hibrid ekranlar (Y2H), 11 yaklaşık 27 yıl önce 1 geliştirilmiş ve yaygın olarak özel protein-protein etkileşimlerini 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 belirlemek için çeşitli alanlarda kullanılmaktadır zamandan beri edildi . bir konakçı hedef proteine ​​bakteriyel efektör fiziksel etkileşim genellikle, bu hedef proteinin fonksiyonel manipülasyonu için bir ön koşuldur. Bu etkileşimler analiz enfeksiyon biyoloji 12, 13, 14, 15, birçok farklı sektörlerin odak taşındı,&quot;16, 17, 18. Y2H ekran ilkesi iki proteinin etkileşim haberci genlerin ekspresyonunu tahrik eden bir fonksiyonel bir transkripsiyon faktörünün sulandırıldıktan neden olmasıdır. Bilinmektedir efektör (&gt;&quot; yem &quot;) translasyon birleştirilir DNA bağlama sahası transkripsiyon faktörünün (DBD), ve potansiyel etkileşim mümkün ( &quot;av&quot;) karşılıklı etkileşim eşleri, potansiyel bir kütüphane bilinmediği için., ilgili transkripsiyon faktörünün aktivasyon alanı (AD) kaynaştırılmış oldukları Uygulayıcılar sözde klonlanır &quot;av-kütüphane&quot;. Normal olarak, bu kütüphane yapılır DBD kodlanmış yem vektör ile uyumlu AD kodlayan uygun bir av vektörü ifade plazması içine cDNA&#39;ları klonlanmasıyla. etkileşim halinde, yeniden transkripsiyon faktörleri genellikle maya büyümesi seçilmesine olanak tanır haberci genlerin ekspresyonunu indükler.interactors tanımlama plazmid özgü primerler ile bir av plasmidi dizilenmesi ile elde edilir. Bakteriler işlemek ve ev sahibinin metabolizmasını istismar veya savunma mekanizmalarını kaçmasına ve farklı bakteri salgı sistemlerinin 19, 20, 21 üzerinden efektör molekülleri salgılaması için çeşitli stratejiler geliştirmiştir. Bu bakteri etkileyiciler bağlayıcı partnerleri belirlenmesi ve böylece ev sahibi manipüle yolu belirlemede ilk adımdır. Bu özel patojenite mekanizmaları daha iyi anlaşılması yol açar. Y2H ekranlar phytoplasmoses sırasında bakteriyel efektör etkileşimlerini tespit etmek için gerçekleştirilir ve genellikle, Y2H fitoplazmalar Research 22, 23 moleküler patojenite mekanizmaların daha fazla karakterizasyon için çok önemli bir başlangıç deneydir. Bununla birlikte, bir araya geldiEn yayınlarda hod açıklama oldukça azdır ve bu teknikler genellikle biyoteknoloji şirketleri için yaptırılmaktadır. Bu yöntemin fizibilite dikkat çekmek için, bu protokol doğal konakta bakteriyel efektör molekülünün etkileşim ortakları belirlemek için adım-adım bilgi sağlar. Geniş kullanım ve Y2H ekranlarının hızlı ileri yaklaşıma rağmen, belli etkileşimler maya sistemde meydana olmayabilir unutmamak gerekir. Bu maya hücresi, belirli bir biyolojik sınırlamalar ile &quot;in vivo Reaksiyon kabı&quot; bir tür olarak kullanılması gerçeğinden kaynaklanmaktadır. Birçok yazar avantajları ve Y2H ve türevleri 11, 24, 25, 26, 27 dezavantajları ele alınmıştır. Genel hususlar maya hücresi, uygun temin olmayabilir, örneğin, şunlardırGen ifadesi, (post) translasyonel veya ilgili proteinlerin translocational koşullar çalışılmaktadır. Bu ekranda yalancı negatif sonuçlara yol açabilir. Olumlu etkileşimler da eserler olabilir ve (uygun bir konak içinde efektör durumunda, örneğin), doğal durumda ortaya olmayabilir. Bir daha yakından ilişkili biyolojik sistemde bağımsız bir etkileşim testi ile heterolog maya ifade sisteminden etkileşimi onaylamak için böylece vazgeçilmezdir. Bu çalışmada, sigara tarıma bitki patojeni mali Candidatus fitoplazmalar (S. Mali) efektör ATP_00189 bağlayıcı partnerleri tespit edilmiştir. Sonuçlar elma çoğalması 28, Avrupa&#39;da 29 etkilenen elma büyüyen bölgelerde yüksek ekonomik kayıplara neden olan bir hastalık belirtisi gelişimine neden olan moleküler mekanizmalar önemli bir anlayış sağlamak.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1514">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:565px;">Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:211px;">Applichem</td>
			<td style="width:324px;">A6284</td>
			<td style="width:415px;">for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trishydroxymethylaminomethane (Tris)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2264</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodiumchloride (NaCl)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2942</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2937</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">N-Lauroylsarcosin sodium salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A7402</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ammonium acetate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>9688</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1108</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3928</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>51976</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNAse</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2760</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chloroform:Isoamyl 24:1</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1935</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proofreading Polymerase (e.g. iProof)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>203433</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EcoRI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0271</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SalI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0641</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Column-based DNA Purification Kit (e.g. QIAquick)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1493</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8056</td>
			<td>for self-activation assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Arginine Monohydrochloride&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3680</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Isoleucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3642</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-lysine Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3448</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Methionine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3897</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Phenylalanine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3464</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Threonine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3946</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tyrosine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3401</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Uracile</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0667</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Valine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3406</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Adenine Hemisulfate Salt&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1596</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.22 &#181;m Pore Filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16541</td>
			<td>for sterile filtration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Histidine Monohydrochloride</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3719</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Leucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3496</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tryptophane&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3410</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Nitrogen Base&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51483</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-Glucose Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1349</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2641-1</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peptone</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2208</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyethylene Glycol 4000 (PEG)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1249</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3478</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Salmon Sperm DNA&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2159</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody against Lex-A tag (e.g. Anti-LexA DNA binding region)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-719</td>
			<td>for Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plasmid Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PLN350</td>
			<td>for plasmid purification from yeast and bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Acid Washed Glass Beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td>for plasmid purification from yeast</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0839</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Extract</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1552</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacuum concentrator centrifuge (e.g. Concentrator 5301)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z368245 (Sigma)</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bait vector (e.g. pLexA-N)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Prey vector (e.g. pGAD-HA)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control prey vector (e.g. pLexA-p53)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control bait vector (e.g. pACT-largeT)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electrocompetent E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C640003</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3&#916;200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plastic paraffin film (e.g. Parafilm M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gas permeable sealer (e.g. BREATHseal)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>676 051</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">quantitative PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855195</td>
			<td>for quantitative PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge (e.g. Centrifuge 5804 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free)</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2500010</td>
			<td>for PCR and DNA works</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpell</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0301</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile filter (0.22 &#181;m; Polyethersulfone))</td>
			<td>VWR-International</td>
			<td>514-0073 (European Catalogue number)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 90 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633180</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 150 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>639161</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer (e.g. BioPhotometer)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>550507804</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer Cuvettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759015</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water Bath (e.g. Water Bath Memmert WB7)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WB7</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Western Blot Equipment</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>diverse</td>
			<td>for protein detection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">dNTPs</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2201210</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 ml; 1000 ml; 2000 ml) and breathable cotton plugs (e.g. Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z232793, Z232858, Z232866</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaking Incubator (e.g. GFL 3031)</td>
			<td>GFL</td>
			<td>3031</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>KB 53 (E3.1)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ice Maker (e.g. Ice Maker IF 825)</td>
			<td>Omniwash</td>
			<td>IF 825</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.2 ml, 1.5 ml and 2.0 ml Reaction Vials (Polypropylene)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10-1000 &#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>diverse</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spreader</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SPR-L-S01</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vortex shaker (e.g. MS 3 Minishaker)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3617000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">T4-Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fridge (4&#176;C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>81.767.580.4</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Freezer (-20&#176;C) (e.g. Liebherr Comfort Professional G5216)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>G5216</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Graduated Cylinder (e.g. Brand)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z327352; Z327417; Z327441&#160;&#160;</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Serological Pipettes (e.g. Fisherbrand)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S55701</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mechanical Pipettor (e.g. Pipetboy acu 2)</td>
			<td>Integra-Biosciences</td>
			<td>155000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cuvettes for Electroporation (1 mm)</td>
			<td>Molecular Bio Products</td>
			<td>5510-11</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electroporator (e.g. Eporator)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4309000019</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gel and Blot imaging system (e.g. ChemiDoc MP System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708280</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 ml)</td>
			<td>VWR-International&#160;</td>
			<td>525-0403 (European Catalogue number)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 ml)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dithiothreitol (DTT, e.g. DTT, 1M)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P2325</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM))</td>
			<td>Ambion&#160;</td>
			<td>AM8110G (distributed by Thermo Scientific)</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, e.g. Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y2021 Sigma&#160;</td>
			<td>for yeast culture (ready-made mix)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unravelling the function of a bacterial effector from a non-cultivable plant pathogen using a yeast two-hybrid screen

Hastalık belirtileri moleküler mekanizmalarını aydınlatmak bitki bilimi patolojileri ve semptom gelişimini anlamak önemlidir. Bakteriler kendi çıkarları için ev sahibi metabolizmasını işlemek için farklı stratejiler geliştirmişlerdir. Bu bakteri manipülasyon sıklıkla şiddetli semptom gelişimi veya etkilenen bitkilerin ölümü ile birleştirilir. konak manipülasyon sorumlu özel bakteriyel molekülleri belirlenmesi mikrobiyolojik araştırmalarda önemli bir alan haline gelmiştir. adı bu bakteriyel moleküllerin tespit edilmesinden sonra &quot;efektörleri,&quot; kendi fonksiyonu ortaya çıkarmak için önemlidir. Basit bir yaklaşım, bir efektör işlevi, bir maya iki-hibrid (Y2H) ekran ile doğal konukçuda da proteinli bağlanma ortağı tespit etmek belirlemek için. Normalde ev sahibi siliko algoritma herhangi biri tarafından yeterince tahmin edilemez çok sayıda potansiyel bağlanma ortakları barındırır. Nedenle perfo için en iyi seçimdirifade konak proteinlerin bir bütün kütüphane karşı varsayımsal efektör içeren bir ekran rm. etkeni phytoplasma gibi İşlenen ise özellikle zordur. Bu protokol phytoplasma enfekte odunsu konukçu bitki, potansiyel efektör yükseltilmesi ve Y2H ekrana sahip tesisin moleküler etkileşim ortağı sonraki kimlik DNA saflaştırılması için adım adım yönergeler sağlar. Y2H ekranlar yaygın olarak kullanılan olsa bile, bir ücret karşılığında Y2H hizmeti sunan biyoteknoloji şirketleri bu tekniği fason bir eğilim vardır. Bu protokol, standart laboratuvar teknikleri kullanarak herhangi bir terbiyeli donanımlı moleküler biyoloji laboratuarında bir Y2H gerçekleştirmek ilişkin yönergeler sağlar.

Gerçek Y2H ekranı uygulanmadan önce yem kendi kendine aktivasyonu için test edilmelidir. Bu, boş bir av kütüphane vektörü ile birlikte yem ekspresyon vektörü dönüştürme ve seçici plakalar üzerine büyüme kontrol ederek elde edilir. Bölüm 5. yem plazmid gezimi tamamlayan ve av S. cerevisiae NMY51 40 ley oksotrofinin plazmid açıklandığı gibi phytoplasmal protein ATP_00189 kendini aktive edici olup olmadığını analiz etmek için, kendi kendine aktivasyon testi yapıldı. Başarılı bir ko-transformasyon, böylece Trp ve Leu yoksun seçici plakalar üzerine büyümesiyle karakterize edilir. yem ve av protein etkileşimi NMY51 ve onun ve ade oksotrofinin bir tamamlama yol açar. etkileşim yokluğunda yem ile kendini etkinleştirme belirirse, maya, onun ve ade eksik seçici plakalar üzerinde yetişir. Güçlü ve zayıf özAktivasyon oluşabilir. yem güçlü kendi kendine aktivasyon Trp-Leu-His-ADE tükenmiş seçme plakaları üzerinde eş-dönüştürülmüş maya büyümesi ile karakterize edilir. Zayıf kendilik aktivasyonu üzerinde büyümesine yol açar trp-leu-onun değil trp-leu-onun-ade tükenmiş seçim plakalar üzerinde. Uygun pozitif kontroller kendine aktivasyon tahlilinin sonuçlarını yorumlamak için vazgeçilmezdir. Bir öz-aktivasyon testinin beklenen sonuçların özeti ve yorumlanması Tablo 1&#39;de verilmiştir ve Şekil 1&#39;de görüntülenmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55150/55150fig1.jpg" /> Şekil 1: Bir Y2H Ekran Gösteri Önce bir Bait Bait Öz-aktivasyon Testleri örneği. , Zayıf bir kendi kendine aktive olan bir artı boş bir av Terazi: S. Cerevisiae NMY51 pozitif bir kontrol (AC sol panel) ve (Plex-p53) ve yırtıcı (Paktı-larget) yem etkileşim ile birlikte transforme edilmiş olanry vektörü (orta panel: df) ve kendinden aktive yem artı boş av kütüphane vektörü (sağ panel: gi). , Trp, Leu ve (orta panel: B, E, H): CO-dönüştürülmüş maya Trp ve Leu (a, D, G, üst panel) barındırmayan SD tabakalarına kültürlendi ve Trp, Leu, His ve ade (düşük Panel: c, f, i). yem vektör trp oksotrofinin ve av vektör NMY51 (SD-trp-leu üzerinde büyüme) ve leu oksotrofi tamamlar olarak orta eksik trp ve leu üzerinde seçim, başarılı ko-dönüşüm için olumlu bir kontroldür. yem ve yırtıcı ya da yem kendi kendine aktivasyonu arasındaki etkileşim halinde, NMY51 muhabiri ifadesi açık ve onun ve ade oksotrofi (SD-trp-leu-onun-ade üzerinde büyüme) tamamlar. Zayıf bir kendilik aktivasyonu SD-trp-leu-onun plakaları üzerinde büyüme ile karakterizedir (orta panel, df). Bir yem zayıf kendilik aktivasyonu önce yem analiz etmek için azalmış olmalıdırBir Y2H ekranında, seçici ortama 3-AT ekleyerek örneğin. Amino asit fakirleşme ile gösterilir &quot;-&quot; ilgili ortam adı. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> Yok </td><td> koloniler </td><td> büyüme yok </td><td> büyüme yok </td><td> büyüme yok </td><td> büyüme yok </td></tr><tr><td> Yok </td><td> pGAD-HA </td><td> büyüme yok </td><td> koloniler </td><td> büyüme yok </td><td> büyüme yok </td><td> büyüme yok </td></tr><tr><td> pLexA -N </td><td> Yok </td><td> koloniler </td><td> büyüme yok </td><td> büyüme yok </td><td> büyüme yok </td><td> büyüme yok </td></tr><tr><td> pLexA -N </td><td> pGAD-HA </td><td> koloniler </td><td> koloniler </td><td&gt; koloniler </td><td> büyüme yok </td><td> büyüme yok </td></tr><tr><td> pLexA p53 </td><td> Paktı-larget </td><td> koloniler </td><td> koloniler </td><td> koloniler </td><td> koloniler </td><td> koloniler </td></tr><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> pGAD-HA </td><td> koloniler </td><td> koloniler </td><td> koloniler </td><td> büyüme yok </td><td> büyüme yok </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Bait Öz aktivasyon Testi Beklenen sonuçlar. S. Cerevisiae NMY51 dönüşüm birlikte dönüştürülmüş yem ve av özelliklerine göre seçici ortam üzerinde farklı büyüme elde edilir. seçici plakalar üzerine büyüme 30 ° C de 72 saat inkübe edildikten sonra, farklı vektör kombinasyonları (AF) transformasyonu sonra değerlendirildi. Zayıf kendilik aktivasyonu üzerinde maya büyüme ile karakterizedir SD-trp-leu-onun ve SD-trp-leu-onun-ade seçim plat üzerinde büyüme ile güçlü kendilik aktivasyonubir etkileşim ortağının yokluğunda es. pLexA-N kodlanmış phytoplasmal efektör ATP_00189 NMY51 kendisinin ve ade yokluğunda büyüme dönüştürülmüş yem vektörünün yetersizlik ile karakterize kendine aktivasyonu, sergilemez. yem bağlı olarak, bir Y2H ekran seçici plakalar üzerinde büyüyen çok sayıda maya klonları elde edebilirsiniz. Tüm klonlar, analiz ve olası işten kontrol edilmelidir. normalleştirilmiş cDNA kütüphanesi kullanılmıştır bile, bir uygulayıcı farklı klonlar temsil edilir çok muhtemeldir. Kütüphane klonlama tekniğe bağlı olarak, tam genin sadece fragmanları bir av vektörlerine eklenir da mümkündür. (CDNA&#39;dan) yükseltmek ve uygulayıcının tam uzunlukta geni alt klon ve bire-bir Y2H analizi (Şekil 2) bir etkileşim test etmek de novo böylece tavsiye edilir. <img alt = &quot;Şekil 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55150 / 55150fig2.jpg&quot; /&gt; Şekil 2: Bir Y2H Deney Yem ve Prey arasında bir etkileşim örneği. Bir maya iki-hibrid (Y2H) Ekran uygulandı ve pozitif uygulayıcı klonlardan plazmidler saflaştırılmıştır. Av vektör dizisi ve Malus x domestica konak etkileşim ortakları MdTCP24 ve MdTCP25 tespit edilmiştir. Bir negatif kontrol MdTCP34 (bunlar için herhangi bir uygulayıcı Y2H kitaplık taraması tespit edilmiştir) ve paralel alt-klonlanmıştır. Tam uzunluktaki genleri av vektörü (ko-cistronically aktivasyon alanı AD eksprese) içine alt klonlanmış, elma cDNA&#39;dan amplifiye edildi de novo DNA bağlama sahası (BD) birleştirilmiş bakteriyel efektör ATP_00189 ifade yem vektörü ile ko-transformasyona. Bu rakam, 28 alınır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">Bir büyük görmek için tıklayınız</a>Bu rakamın sürümü.

Watch this Scientific Journal Video about Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen at JoVE.com

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Bakteriyel efektör proteinleri başarılı enfeksiyonları kurulması için önemlidir. Bu protokol, doğal bitki konukçuda bir bakteriyel efektör proteininin proteinli bağlanma partnerleri ile deneysel tanımlanmasını açıklar. Maya iki hibrit ekranlarından yoluyla bu efektör etkileşimleri belirlenmesi moleküler patojenite stratejilerinin çözülüyor önemli bir araç haline gelmiştir.

Bir Maya İki hibrid Ekran kullanarak Olmayan ekilebilir Bitki Patojen bir Bakteriyel Efektör Fonksiyonu aydınlatmak

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

unravelling-function-bacterial-effector-from-non-cultivable-plant

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K Görüntüleme.  Laimburg Research Centre.  Bakteriyel efektör proteinleri başarılı enfeksiyonları kurulması için önemlidir. Bu protokol, doğal bitki konukçuda bir bakteriyel efektör proteininin proteinli bağlanma partnerleri ile deneysel tanımlanmasını açıklar. Maya iki hibrit ekranlarından yoluyla bu efektör etkileşimleri belirlenmesi moleküler patojenite stratejilerinin çözülüyor önemli bir araç haline gelmiştir. 

Video: Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

Farelerde Görüntü Bakteriyel Enfeksiyonlar Lusiferaz Kullanımı

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be applied to the study of cell invasion by virtually any culturable bacterium. The stages at which specific aspects of invasion can be studied, such as the role of actin rearrangement or caveolae, will be highlighted. Host cells are grown in flasks and when ready for use are seeded into 24-well plates containing Thermanox coverslips. Using coverslips allows subsequent removal of the cells from the wells to reduce interference from serum proteins deposited onto the sides of the wells (to which S. aureus would attach). Bacteria are grown to the required density and washed to remove any secreted proteins (e.g. toxins). Coverslips with confluent layers of endothelial cells are transferred to new 24-well plates containing fresh culture medium before the addition of bacteria. Bacteria and cells are then incubated together for the required amount of time in 5% CO2 at 37&deg;C. For S. aureus this is typically between 15-90 minutes. Thermanox coverslips are removed from each well and dip-washed in PBS to remove unattached bacteria. If total associated bacteria (adherent and internalised) are to be quantified, coverslips are then placed in a fresh well containing 0.5% Triton X-100 in PBS. Gentle pipetting leads to complete cell lysis and bacteria are enumerated by serial dilution and plating onto agar. If the number of bacteria that have invaded the cells is needed, coverslips are added to wells containing 500 &mu;l tissue culture medium supplemented with gentamicin and incubation continued for 1 h, which will kill all external bacteria. Coverslips can then be washed, cells lysed and bacteria enumerated by plating onto agar as described above. If the experiment requires direct visualisation, coverslips can be fixed and stained for light, fluorescence or confocal microscopy or prepared for electron microscopy.

A general protocol for the study of invasion of host cells by a bacterial pathogen, focusing on Staphylococcus aureus and human endothelial cells.

Bakteriyel Patojen İnsan Hücreleri Invasion

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

Uzun vadeli Host-patojen Etkileşimleri karakterize EpiAirway Model kullanın.

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Graft-versus-host hastalığı indüksiyonu ve<em&gt; In Vivo</emBir MHC-eşlemeli murin Model Kullanma&gt; T Hücre İzleme

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks to human and animal health. Among cereal production, maize is arguably the most affected crop, due to pathogen-induced losses in grain integrity and mycotoxin seed contamination. The two most prevalent and problematic mycotoxins for maize growers and food and feed processors are aflatoxin and fumonisin, produced by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides, respectively.
Recent studies in molecular plant-pathogen interactions have demonstrated promise in understanding specific mechanisms associated with plant responses to fungal infection and mycotoxin contamination1,2,3,4,5,6. Because many labs are using kernel assays to study plant-pathogen interactions, there is a need for a standardized method for quantifying different biological parameters, so results from different laboratories can be cross-interpreted. For a robust and reproducible means for quantitative analyses on seeds, we have developed in-lab kernel assays and subsequent methods to quantify fungal growth, biomass, and mycotoxin contamination. Four sterilized maize kernels are inoculated in glass vials with a fungal suspension (106) and incubated for a predetermined period. Sample vials are then selected for enumeration of conidia by hemocytometer, ergosterol-based biomass analysis by high performance liquid chromatography (HPLC), aflatoxin quantification using an AflaTest fluorometer method, and fumonisin quantification by HPLC.

The devastation of cereal crops by seed-infecting fungi has prompted numerous research efforts to better understand plant-pathogen interactions. To study seed-fungal interactions in a laboratory setting, we developed a robust method for the quantification of fungal reproduction, biomass, and mycotoxin contamination using kernel bioassays.

Çekirdek biyoanalizlerin kullanarak Fungal Kolonizasyon, Sporogenesis ve Mikotoksin Üretimi Kantitasyonu

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

This protocol outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and colitis, as well as the methods used to characterize Citrobacter rodentium infection in mice. C. rodentium is a gram negative, murine specific bacterial pathogen that is closely related to the clinically important human pathogens enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli. Upon infection with C. rodentium, immunocompetent mice suffer from modest and transient weight loss and diarrhea. Histologically, intestinal crypt elongation, immune cell infiltration, and goblet cell depletion are observed. Clearance of infection is achieved after 3 to 4 weeks. Measurement of intestinal epithelial barrier integrity, bacterial load, and histological damage at different time points after infection, allow the characterization of mouse strains susceptible to infection.
The virulence mechanisms by which bacterial pathogens colonize the intestinal tract of their hosts, as well as specific host responses that defend against such infections are poorly understood. Therefore the C. rodentium model of enteric bacterial infection serves as a valuable tool to aid in our understanding of these processes. Enteric bacteria have also been linked to Inflammatory Bowel Diseases (IBDs). It has been hypothesized that the maladaptive chronic inflammatory responses seen in IBD patients develop in genetically susceptible individuals following abnormal exposure of the intestinal mucosal immune system to enteric bacteria. Therefore, the study of models of infectious colitis offers significant potential for defining potentially pathogenic host responses to enteric bacteria. C. rodentium induced colitis is one such rare model that allows for the analysis of host responses to enteric bacteria, furthering our understanding of potential mechanisms of IBD pathogenesis; essential in the development of novel preventative and therapeutic treatments.

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Citrobacter rodentium infection provides a valuable model to study enteric bacterial infections as well as host immune responses and colitis in mice. This protocol outlines the measurement of barrier integrity, pathogen load and histological damage allowing for the thorough characterization of pathogen and host contributions to murine infectious colitis.

<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Model: Bulaşıcı Kolit için çalışılması Patojen ve Host Katılımlar

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

Otomatik Ayırma<em&gt; C. elegans</em&gt; Değişken derecelerde Bakteriyel Patojen tarafından kolonileştirildiğini

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

Bakteriyel Spor Filizlenmesinin sırasında Cortex Fragments algılama

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt; A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Bir Maya İki hibrid Ekran kullanarak Olmayan ekilebilir Bitki Patojen bir Bakteriyel Efektör Fonksiyonu aydınlatmak

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Farelerde Görüntü Bakteriyel Enfeksiyonlar Lusiferaz Kullanımı

Bakteriyel Patojen İnsan Hücreleri Invasion

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

Uzun vadeli Host-patojen Etkileşimleri karakterize EpiAirway Model kullanın.

Graft-versus-host hastalığı indüksiyonu ve

Çekirdek biyoanalizlerin kullanarak Fungal Kolonizasyon, Sporogenesis ve Mikotoksin Üretimi Kantitasyonu

Otomatik Ayırma

Bakteriyel Spor Filizlenmesinin sırasında Cortex Fragments algılama

Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi