Wir danken Christine Kerschbamer, Thomas Letschka, Sabine Oettl, Margot Raffeiner und Florian Senoner vom Versuchszentrum Laimburg und Mirelle Borges Dias Schnetzer von Dualsystems Biotech AG für die technische Unterstützung und Julia Strobl für das Manuskript Korrektur. Diese Arbeit wurde im Rahmen des APPL2.0 Projekt durchgeführt und wurde von der Autonomen Provinz Bozen / Bolzano, Italien und dem Südtiroler Apfelkonsortium teilweise finanziert.

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Im Y2H Bildschirm wird das Potential Effektor-Protein mit verschiedenen hypothetischen interagierende Proteine ​​(Schritt 7) co-exprimiert wird. Jeder wachsende Hefe Klon enthält den Köder, aber eine (potentiell) unterschiedliche Interaktor. Die interagierenden Proteine ​​werden in einer cDNA-Bibliothek codiert wird, die in die Beute Plasmide kloniert wird. Der Köder und die Beute Plasmide jedes Co-cistronically-Code für einen Teil eines Hefe-Transkriptionsfaktors. Im Falle einer physikalischen Wechselwirkung zwischen Köder (Effektorzellen) und einer Beute plasmid-kodierten Interaktor die beiden Transkriptionsfaktor Teile (die DNA-Bindungsdomäne und die Aktivierungsdomäne) vereinigt sind, und die Expression des Reportergens induziert wird. Die Hefe in der Lage, auf Histidin und Adenin-verarmten SD-Selektionsplatten zu wachsen. Die Art der Beute cDNA-Bibliothek ist abhängig von der abgeschirmten Effektor und muss entsprechend gewählt werden. Die Beute und Köder Vektor, sowie der Hefestamm, müssen kompatibel sein. In diesem Bildschirm Bindung eine LexA DNA-Domäne und die Gal4 Aktivierung domain wurden als kompatibel Hefe-Transkriptionsfaktor-Einheiten eingesetzt. Die cDNA-Bibliothek kann individuell konstruiert werden, nach Maß, oder im Handel erhalten. Die Herstellung der cDNA Beute-Bibliothek ist nicht Teil dieses Protokolls. In diesem Protokoll wird ein selbst erstellter, normalisierte cDNA - Bibliothek aus der RNA von Malus x domestica Blätter verwendet wurde und kloniert in pGAD-HA 41. Der Effektor (Köder) Hefestamm exprimierenden wurde mit der Beute-Bibliothek transformiert, und Klone wurden auf Histidin und Adenin-verarmten SD-Selektionsplatten ausgewählt. Plasmid-DNA aus den Hefekolonien, ein säulenbasierte DNA Plasmid Mini Kit für Bakterien Extrakt in Kombination mit einer mechanischen Störung Schritt unter Verwendung von Glasperlen empfohlen, Hefe Lyse (Schritt 8) verbessern. In diesem Plasmid Reinigung wird der Köder und die Beute Vektor gereinigt in relativ geringen Konzentrationen gleichzeitig werden. Jedoch ist die Menge an Plasmid DNA genug, um das Wechselwirkungspartner durch Sequenzierung wit zu identifizierenhout vor Plasmid Ausbreitung (Schritt 8.4). Als Alternative gereinigte DNA in Schritt 8.4 kann in kompetente E. coli und ausgewählt mit Beute - Vektor-vermittelter Antibiotikaresistenz transformiert werden (zB das Ampicillin bei pGAD-HA). Die ausgewählte E. coli - Kolonien tragen nur die pGAD-HA Bibliothek Plasmid und High-Yield - Plasmid Reinigung kann mit diesen Klonen durchgeführt werden. Auch die erfolgreiche Transformation von pLexA-N und pGAD-HA-Konstrukte ergänzt das Tryptophan und Leucin-Auxotrophie von NMY51. Eine Wechselwirkung zwischen dem Effektor und einem Protein (kodiert auf pGAD-HA) führt zur Aktivierung des Reportersystems in NMY51 Stämmen. Im Fall der Selbstaktivierung, NMY51 mit dem Effektor transformierte pLexA-N in Kombination mit dem leeren Bibliotheksvektor pGAD-HA wächst auf selektiven Platten fehlt trp-leu-his-ade aufgrund der unerwünschten Aktivierung des NMY51 Reportersystems exprimiert 40. Die Selbstaktivierung kann w seineak und in Abwesenheit von trp-leu-his oder die Aktivierung durch Wachstum stark sein kann und dadurch auf trp-leu-his-ade Platten 41 auftreten können. Selbstaktivierung kann einen massiven Hintergrund von falsch-positiven Klonen im eigentlichen Y2H Bildschirm verursachen. Um dies zu vermeiden, muss eine Selbstaktivierungstest mit dem Köder werden durchgeführt, in dem der Effektor-exprimierenden Vektor co-transformiert mit dem leeren Vektor-Bibliothek. In dieser experimentellen Einstellung, Reportergenexpression muss nicht induziert werden. Wenn Selbstaktivierung ( das heißt Wachstum auf selektiven Platten) in dem Test sichtbar ist, kann das Medium mit unterschiedlichen Konzentrationen von 3-Amino-1,2,4-triazol 45 (3-AT) ergänzt werden. 3-AT ist ein Inhibitor der imidazoleglycerol-phosphat - Dehydratase (HIS3), ein Enzym wichtig während Histidinbiosynthese 46. Die Supplementation mit 3-AT können die schwachen Effekte der Selbstaktivierung während Y2H Bildschirme 47, reduzieren48. Verschiedene Konzentrationen von 3-AT sollte getestet werden. In diesem Protokoll, 1-40 mM 3-AT wurden verwendet. Die niedrigste Konzentration, die Selbstaktivierung zur Unterdrückung führt sollten anschließend im Y2H Bildschirm verwendet werden. Die selektiven Platten des Selbstaktivierungstest kann nur dann, wenn die SD-trp-leu-Platten der eine ausreichende Anzahl von Klonen enthalten Cotransformation ausgewertet werden. Als Hinweis ≥ 500 Kolonien pro 90 mm (Durchmesser) Petrischale ausreichend sind. Um die genaue Transfektionseffizienz zu bestimmen, wird empfohlen, serielle Verdünnungen der co-transformierter Hefe herzustellen und sie auf SD-trp-leu-Platten zu verteilen. Selbstaktivierung zu reduzieren, kann der Effektor in pLexA-C geklont werden, ein Köder-Expressionsvektor, der das LexA-Tag an den C-Terminus des Proteins verbindet. Die Orientierung der Lex-A - Tag kann Selbstaktivierung 24 dämpfen. Jedoch ist es nicht möglich, in jedem Falle zu verringern oder zu Selbstaktivierung abzuschaffen. Die Formation derrot oder rötlich Kolonien deutet auf eine schwache oder falsch-positive Interaktion. Der ade2 Reportergen von NMY51 wird nur aktiviert , wenn es um eine Interaktion von Protein-Protein kommt, was wiederum blockiert die Akkumulation eines roten Farbstoffes in diesem Hefestamm 40. In Abwesenheit einer Wechselwirkung sind NMY51 rötlich, während die Kolonien tragenden starke Interaktoren weiß sind. Die Beobachtung der Koloniefarbe auf den Selektionsplatten ist somit ein weiterer wichtiger Hinweis, um zu beurteilen, ob die jeweiligen Kolonien Echt- oder falsch-positiven Interaktoren. Es ist schließlich notwendig, anzupassen oder bestimmte Testeinstellungen ändern in Bezug auf die Art der Köder und die Interaktion Eigenschaften. Mittlerweile wurden eine Reihe von Verbesserungen und derivative Techniken des gemeinsamen Y2H etabliert für die Analyse von sehr schwierig Protein-Interaktionen in verschiedenen Host-Systemen zu ermöglichen. Eine Überprüfung von Stynen et al. 49 Adressen and beschreibt verschiedene Aspekte der Y2H, seine Verbesserungen und Anpassungen und liefert somit wertvolle Informationen darüber, wie die entsprechende Interaktion Test zu wählen. Y2H Bildschirme und abgeleitete Techniken weit verbreitet in verschiedenen Forschungsbereichen eingesetzt werden, wo auch immer Identifizierung von binären Protein-Interaktionen erforderlich ist. Selbst wenn kritische Kontrollen durchgeführt werden, wie beispielsweise Selbstaktivierungstests des Köders und ein-zu-eins - Wieder Transformationen der identifizierten interagierende Proteine, die Y2H anfällig falsche Ergebnisse liefern 26, 50, 51. Die Hefe als Modell für alle Interaktionsstudien nicht geeignet. Hefe nicht notwendigerweise eine zelluläre Umgebung dar, die die entsprechende posttranslationale Modifikation und Faltung für jedes 24 - Protein unterstützt. Weiterhin ist in der Y2H Einstellung werden die Proteine ​​überexprimiert, und ihre Expression ist nicht die Kontrolledurch ihren natürlichen Promotor führte. Die Y2H zwingt die proteinösen Bindungspartner an den Zellkern, die nicht notwendigerweise ihre natürliche subzellulären Ziel. Die nativen zellulären Umstände der Interaktion kann somit nicht von der Hefe reflektiert werden und zu falsch negativen oder falsch-positiven Ergebnissen führen kann. Die meisten Y2H werden auf Hefe-Auxotrophie Komplementation als selektives Prinzip. Diese Ernährungs Auswahl wird durch eine hohe Empfindlichkeit aus, aber auf Kosten einer verringerten Selektivität im Vergleich zu anderen (beispielsweise chromogene reporter) -Assays 49. Wenn unreducible Selbstaktivierung (siehe oben) oder andere Beschränkungen auftreten , für eine bestimmte Effektorfunktion ist die Y2H kein geeigneter Test 25. In Tabelle 1 und Abbildung 1, die erwarteten Ergebnisse des Selbstaktivierungstest gegeben. Das Fehlen von realen Interaktionen (dh falsche Negative) durch Protein Toxizität, fehlerhafte translationale Protein verursacht werdenVerarbeitung, sterische Hinderung der Interaktion, unterrepräsentierte Interaktionspartner in der Beute Bibliothek, Membranlokalisierung des Köders oder fehlenden Komponenten , die für die Interaktion 24. Es wird empfohlen, de novo verstärken das Volllängen - Gen des identifizierten interagierenden Proteins aus cDNA, subklonieren es in pGAD-HA, und führen eine Eins-zu-Eins - Wechselwirkungsassay die erzeugte pGAD-HA - Konstrukt in den Köder-exprimierenden durch Transformieren NMY51 Stamm. Dies ist notwendig, da die beobachtete Interaktors in dem Beute-Bibliothek nur ein Fragment eines größeren Proteins sein könnte. Jedoch ist die Information für die jeweiligen Volllängen-Gen nur zugänglich, wenn beträchtliche genomischen und transkriptomischen Sequenzdaten verfügbar sind. Das Transformationsprotokoll für das Selbstaktivierungstest hier beschrieben sind, können für eine solche Eins-zu-Eins-Assays angewendet werden, und die Wechselwirkung zwischen dem Bait und dem Interaktor reproduzierbar sein müssen. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Wechselwirkungen in einem Y2H Bildschirm identifiziert muss immer von einer anderen unabhängigen Technik bestätigt werden. Diese unabhängige Technik muss auf die natürliche Umgebung des eigentlichen Protein-Protein-Wechselwirkung näher sein. In dem Fall des phytoplasmal Effektor ATP_00189 wurde die Wechselwirkung mit den TCP - Transkriptionsfaktoren von Malus x domestica in planta mit bimolekularen fluoreszierendes Komplementation (BiFC) in Nicotiana benthamiana prüft Protoplasten 28 (nicht Teil des Protokolls). Der Effektor-Protein ATP_00189 wurde aus der Pflanze Erreger P. mali abgeleitet. In planta BIFC wurde somit ATP_00189 Wechselwirkungen mit den Malus x domestica Transkriptionsfaktoren zu überprüfen gewählt zuvor in dem Y2H 28 identifiziert. BiFC ist ein Protein-Protein-Interaktionsassay, der nicht die subzelluläre Translokation der interagierenden Proteine ​​in den Zellkern, um das Reportersystem zur Aktivierung erfordert &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 52. Darüber hinaus ahmt die in planta - Expression und Modifikation Maschinen die Umgebung der natürlichen Interaktion zwischen Pflanze bakterielle Effektor in seiner Wirtspflanze. Allerdings ist ein globaler Bildschirm BIFC mit nicht durchführbar ist. Es gibt mehrere Schritte in dem Protokoll, das sorgfältig behandelt werden müssen. Wenn das Gen von Interesse zu verstärken (Schritt 4), ist es wichtig zu bestimmen, dass Primer an Pflanzen-DNA binden. Somit DNA aus nicht-infizierten Pflanzen müssen als negative Kontrolle einbezogen. Die Sequenz des Gens von Interesse nicht enthalten die EcoRI und SalI-Restriktionsstellen, die für die gerichtete Klonierung des Einsatzes verwendet werden. Wenn die Sequenz diese Seiten enthält, müssen verschiedene Restriktionsenzyme für das Klonen ausgewählt werden. Hefe-Transformation ist eine zentrale Methode während dieses Protokolls. Die Transfektionseffizienz ist abhängig von der Kompetenz der Hefezellen, ihre Lebensfähigkeit, den Wachstumszustand, und die Qualität der Transfektion REAGent 53, 54. Für das vorgeschlagene Protokoll wird dringend empfohlen, Hefe zu verwenden, die aus frischen Platten nicht älter als zwei Wochen (gehalten bei 4 ° C), wenn die Transformationen durchführen. Oft wird das Wachstum der transformierten Hefe verzögert, wenn selektive Flüssigkulturen mit Kolonien aus alten Agarplatten inokuliert. Es ist auch hilfreich, um eine flüssige Starterkultur als Inokulum für den tatsächlichen Experimente zu verwenden und nicht die Hefe von der Platte direkt zu verwenden. Geringe Effizienz bei der Transfektion der Beute in den Köder-exprimierenden Hefe kann auf die Unterrepräsentation bestimmter Beuteproteine ​​(potentielle Interaktionspartner) führen und den gesamten Bildschirm so schräg kann. In diesem Protokoll wird ein Hefe-Transfektionseffizienz von ~ 150.000 cfu / &amp; mgr; g DNA transfiziert in der Y2H funktionierte gut. die Mängel und Nachteile des Y2H Technik zu kennen und die Ergebnisse in einer kritischen und in geeigneter Weise zu interpretieren ist unverzichtbar, um die korr Zeichnungect Schlussfolgerungen. Y2H Assays und die Derivate werden seit vielen Jahren verwendet und haben viele Verbesserungen und Anpassungen in Bezug auf die verschiedenen Ködercharakteristik, die subzelluläre Lokalisierung der Wechselwirkung, die erwarteten Bindungspartner und andere Faktoren unterzogen, die für die Interaktion erforderlich sein könnten (siehe Y3H 55, 56, 57). Vor kurzem Array-basierten Y2H Bildschirme entwickelt worden, die für automatisierte Hochdurchsatz - Analyse zahlreicher Ködern gegen Millionen preys 58 ermöglichen. Die Zukunft liegt höchstwahrscheinlich in der Automatisierung und Hochdurchsatz-Ansätze zu diesem Test für die Aufklärung komplexer Signalwege und Interaktom in verschiedenen Forschungsbereichen zu ermöglichen.

<html> Hefe - Zwei-Hybrid - Screens (Y2H) wurden 1 vor etwa 27 Jahren entwickelt und haben seitdem breite Anwendung in verschiedenen Gebieten verwendet worden , um spezifische Protein-Protein - Wechselwirkungen zu bestimmen , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 . Die physikalische Wechselwirkung eines bakteriellen Effektor mit einem Host-Zielprotein ist oft Voraussetzung für die funktionelle Manipulation dieses Zielproteins. Diese Interaktionen analysieren hat in den Fokus der vielen verschiedenen Bereichen der Infektion 12 Biologie bewegt, 13, 14, 15,&quot;&gt; 16, 17, 18. Das Prinzip des Y2H Bildschirm ist , dass die Wechselwirkung der beiden Proteine in die Rekonstitution eines funktionellen Transkriptionsfaktors führt, der die Expression von Reportergenen antreibt. Die bekannte Effektor (der&quot; Köder &quot;) translatorisch verschmolzenen an die DNA-Bindungsdomäne (DBD) des Transkriptionsfaktors, und die möglichen Wechselwirkungspartner (die &quot;Beute&quot;) an die Aktivierungsdomäne (AD) der jeweiligen Transkriptionsfaktor fusioniert ist. Da der Wechselwirkungspartner unbekannt ist, eine Bibliothek von potentiellen Interaktoren in die so genannte geklont &quot;Beute-Bibliothek&quot;. Normalerweise diese Bibliothek durch Klonieren von cDNAs in einen geeigneten Beute-Vektor Expressionsplasmid codierend das AD hergestellt ist, die mit dem Köder-Vektor kodiert DBD. bei einer Wechselwirkung kompatibel ist, die rekonstituiert Transkriptionsfaktoren die Expression von Reportergenen, induzieren, die im allgemeinen das Wachstum von Hefe-Auswahl zu ermöglichen. dieIdentifizierung der Interaktionspartner wird durch die Sequenzierung der Beute Plasmid mit Plasmid-spezifischen Primer erreicht. Bakterien haben verschiedene Strategien entwickelt , zu manipulieren und ihre Host-Stoffwechsel verwerten oder Abwehrmechanismen zu umgehen und Effektor - Molekülen über verschiedene Bakterien Sekretion Systeme 19, 20, 21 absondern. die Bindungspartner dieser bakteriellen Effektoren bestimmen, ist daher der erste Schritt in der Stellweges in dem Host zu identifizieren. Dies führt zu einem verbesserten Verständnis der spezifischen Mechanismen Pathogenität. Y2H Bildschirme werden durchgeführt , bakterielle Effektor Interaktionen während phytoplasmoses zu identifizieren, und oft ist ein entscheidender Y2H anfänglichen Experiment zur weiteren Charakterisierung der molekularen Mechanismen Pathogenität in phytoplasma Forschung 22, 23. Doch das trafin den meisten Publikationen hod Beschreibung ist eher selten, und diese Techniken werden oft an Biotech-Unternehmen ausgelagert. Um die Aufmerksamkeit auf die Durchführbarkeit dieses Verfahrens zeichnen, dieses Protokoll liefert eine Schritt-für-Schritt-Informationen Interaktionspartner eines bakteriellen Effektor-Molekül in seinem natürlichen Wirt identifizieren. Trotz der breiten Nutzung und den schnellen Vorlauf Ansatz von Y2H Bildschirme, darf nicht vergessen werden, dass bestimmte Interaktionen nicht in der Hefe-System auftreten könnten. Dies ist aufgrund der Tatsache , dass die Hefezelle als eine Art von &quot;in vivo Reaktionsbehälter&quot; mit bestimmten biologischen Einschränkungen verwendet. Mehrere Autoren haben die Vor- und Nachteile von Y2H und seine Derivate 11, 24, 25, 27 26, gerichtet. Allgemeine Überlegungen sind beispielsweise, dass die Hefezelle nicht die entsprechende bieten könnteGenexpression, (post-) translationale oder translocational Bedingungen für die jeweiligen Proteine ​​untersucht. Dies kann auf dem Bildschirm zu falsch negativen Ergebnissen führen. Positive Wechselwirkungen können wiederum Artefakte und in der natürlichen Situation (dh im Fall von Effektoren in den geeigneten Wirt) auftreten , möglicherweise nicht. Es ist daher unerlässlich, um die Wechselwirkungen von der heterologen Hefe-Expressionssystem mit einem unabhängigen Interaktionstest in einem eng verwandten biologischen Systems zu bestätigen. In dieser Studie wurden identifiziert die Bindungspartner der Effektor ATP_00189 aus dem nicht-kultivierbaren Pflanze Erreger Candidatus Phytoplasma mali (P. mali). Die Ergebnisse liefern wichtige Einblicke in die molekularen Mechanismen , die Symptomentwicklung von Apple proliferation zugrunde liegenden 28, eine Krankheit , die hohe wirtschaftliche Verluste in den betroffenen Apfelanbauregionen in Europa 29 verursacht.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1514">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:565px;">Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:211px;">Applichem</td>
			<td style="width:324px;">A6284</td>
			<td style="width:415px;">for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trishydroxymethylaminomethane (Tris)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2264</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodiumchloride (NaCl)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2942</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2937</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">N-Lauroylsarcosin sodium salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A7402</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ammonium acetate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>9688</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1108</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3928</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>51976</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNAse</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2760</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chloroform:Isoamyl 24:1</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1935</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proofreading Polymerase (e.g. iProof)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>203433</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EcoRI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0271</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SalI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0641</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Column-based DNA Purification Kit (e.g. QIAquick)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1493</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8056</td>
			<td>for self-activation assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Arginine Monohydrochloride&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3680</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Isoleucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3642</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-lysine Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3448</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Methionine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3897</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Phenylalanine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3464</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Threonine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3946</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tyrosine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3401</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Uracile</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0667</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Valine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3406</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Adenine Hemisulfate Salt&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1596</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.22 &#181;m Pore Filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16541</td>
			<td>for sterile filtration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Histidine Monohydrochloride</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3719</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Leucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3496</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tryptophane&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3410</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Nitrogen Base&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51483</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-Glucose Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1349</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2641-1</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peptone</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2208</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyethylene Glycol 4000 (PEG)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1249</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3478</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Salmon Sperm DNA&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2159</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody against Lex-A tag (e.g. Anti-LexA DNA binding region)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-719</td>
			<td>for Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plasmid Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PLN350</td>
			<td>for plasmid purification from yeast and bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Acid Washed Glass Beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td>for plasmid purification from yeast</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0839</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Extract</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1552</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacuum concentrator centrifuge (e.g. Concentrator 5301)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z368245 (Sigma)</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bait vector (e.g. pLexA-N)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Prey vector (e.g. pGAD-HA)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control prey vector (e.g. pLexA-p53)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control bait vector (e.g. pACT-largeT)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electrocompetent E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C640003</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3&#916;200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plastic paraffin film (e.g. Parafilm M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gas permeable sealer (e.g. BREATHseal)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>676 051</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">quantitative PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855195</td>
			<td>for quantitative PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge (e.g. Centrifuge 5804 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free)</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2500010</td>
			<td>for PCR and DNA works</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpell</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0301</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile filter (0.22 &#181;m; Polyethersulfone))</td>
			<td>VWR-International</td>
			<td>514-0073 (European Catalogue number)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 90 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633180</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 150 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>639161</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer (e.g. BioPhotometer)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>550507804</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer Cuvettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759015</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water Bath (e.g. Water Bath Memmert WB7)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WB7</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Western Blot Equipment</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>diverse</td>
			<td>for protein detection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">dNTPs</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2201210</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 ml; 1000 ml; 2000 ml) and breathable cotton plugs (e.g. Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z232793, Z232858, Z232866</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaking Incubator (e.g. GFL 3031)</td>
			<td>GFL</td>
			<td>3031</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>KB 53 (E3.1)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ice Maker (e.g. Ice Maker IF 825)</td>
			<td>Omniwash</td>
			<td>IF 825</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.2 ml, 1.5 ml and 2.0 ml Reaction Vials (Polypropylene)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10-1000 &#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>diverse</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spreader</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SPR-L-S01</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vortex shaker (e.g. MS 3 Minishaker)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3617000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">T4-Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fridge (4&#176;C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>81.767.580.4</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Freezer (-20&#176;C) (e.g. Liebherr Comfort Professional G5216)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>G5216</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Graduated Cylinder (e.g. Brand)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z327352; Z327417; Z327441&#160;&#160;</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Serological Pipettes (e.g. Fisherbrand)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S55701</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mechanical Pipettor (e.g. Pipetboy acu 2)</td>
			<td>Integra-Biosciences</td>
			<td>155000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cuvettes for Electroporation (1 mm)</td>
			<td>Molecular Bio Products</td>
			<td>5510-11</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electroporator (e.g. Eporator)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4309000019</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gel and Blot imaging system (e.g. ChemiDoc MP System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708280</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 ml)</td>
			<td>VWR-International&#160;</td>
			<td>525-0403 (European Catalogue number)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 ml)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dithiothreitol (DTT, e.g. DTT, 1M)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P2325</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM))</td>
			<td>Ambion&#160;</td>
			<td>AM8110G (distributed by Thermo Scientific)</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, e.g. Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y2021 Sigma&#160;</td>
			<td>for yeast culture (ready-made mix)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unravelling the function of a bacterial effector from a non-cultivable plant pathogen using a yeast two-hybrid screen

Die Entwirrung der molekularen Mechanismen der Krankheitsmanifestationen ist wichtig, Pathologien und Symptomentwicklung in der Pflanzenwissenschaft zu verstehen. Bakterien haben verschiedene Strategien entwickelt, ihre Wirts Stoffwechsel zu ihrem eigenen Vorteil zu manipulieren. Diese bakterielle Manipulation ist oft verbunden mit schweren Symptomentwicklung oder dem Tod der betroffenen Pflanzen. Die Bestimmung der spezifischen bakteriellen Moleküle verantwortlich für die Host-Manipulation ist ein wichtiger Bereich in der mikrobiologischen Forschung geworden. Nach der Identifizierung dieser Bakterien-Moleküle, die sogenannten &quot;Effektoren&quot;, ist es wichtig, ihre Funktion aufzuklären. Ein einfacher Ansatz die Funktion eines Effektor zu bestimmen, ist seine proteinösen Bindungspartner in seinem natürlichen Wirt über eine Hefe-Zwei-Hybrid (Y2H) Bildschirm zu identifizieren. Normalerweise birgt der Host zahlreiche potentielle Bindungspartner , die nicht ausreichend durch ein beliebiges in silico - Algorithmus vorhergesagt werden kann. Es ist daher die beste Wahl, um perform einen Bildschirm mit dem hypothetischen Effektor gegen eine ganze Bibliothek von exprimierten Wirtsproteine. Es ist besonders schwierig, wenn der Erreger wie phytoplasma kultivierbaren ist. Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die DNA-Aufreinigung aus einem phytoplasma-infizierten holzig Wirtspflanze, die Verstärkung des potentiellen Effektor, und die anschließende Identifizierung der molekularen Interaktionspartner der Anlage mit einem Y2H Bildschirm. Obwohl Y2H Bildschirme häufig verwendet werden, gibt es einen Trend, diese Technik zu Biotech-Unternehmen auszulagern, die den Y2H Service zu einem Preis anbieten. Dieses Protokoll bietet Anweisungen, wie ein Y2H in jedem anständig ausgestatteten molekularbiologischen Labor unter Verwendung von Standardlabortechniken auszuführen.

Vor dem eigentlichen kann Y2H Bildschirm der Köder durchgeführt werden müssen für Selbstaktivierung getestet werden. Dies wird durch die Umwandlung der Köder Expressionsvektor zusammen mit dem leeren Beute Bibliothek Vektor und Überprüfung Wachstum auf selektiven Platten erreicht. Um zu analysieren , ob die phytoplasmal Protein ATP_00189 selbstaktivierende ist, wurde die Selbstaktivierung Test in Abschnitt 5. Der Köderplasmid ergänzt den trp und die Beute Plasmid , das das leu Auxotrophie von S. cerevisiae NMY51 40 wie beschrieben durchgeführt. Eine erfolgreiche Co-Transformation wird also durch Wachstum auf selektiven Platten fehlen trp und leu gekennzeichnet. Die Wechselwirkung des Köder und Beute-Protein führt zu einer Komplementierung der seine und ade Auxotrophie von NMY51. Wenn Selbstaktivierung durch den Köder in der Abwesenheit einer Wechselwirkung auftritt, wächst die Hefe auf selektiven Platten seiner und ade fehlt. Starke und schwache SelbstAktivierung auftreten. Starke Selbstaktivierung des Köders wird durch Wachstum des co-transformierte Hefe auf trp-leu-his-ade abgereicherten Selektionsplatten gekennzeichnet. Schwache Selbstaktivierung führt zu Wachstum auf trp-leu-his aber nicht auf trp-leu-his-ade abgereicherten Selektionsplatten. Die richtige positive Kontrollen sind unverzichtbar für die Ergebnisse der Selbstaktivierungstest zu interpretieren. Eine Zusammenfassung der erwarteten Ergebnisse der Selbstaktivierungstest und deren Interpretation ist in Tabelle 1 und visualisiert in Abbildung 1 zur Verfügung gestellt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55150/55150fig1.jpg" /> Abbildung 1: Beispiel von Bait Selbstaktivierung Tests eines Bait Bevor ein Y2H Bildschirm durchführen. S. cerevisiae NMY51 wurde co-transformiert mit zusammenwirkenden Köder (pLEX-p53) und Beute (PACT larget) als eine positive Kontrolle (linkes Bild: ac), einem schwach selbstaktivierende plus eine leere Beute library - Vektor (Mitteltafel: df) und eine nicht selbstaktivierende Köder plus eine leere Beute Bibliothek Vektor (rechtes Bild: gi). Die Co-transformierten Hefe wurden auf SD - Platten fehlen trp und leu (oberes Bild: a, d, g), trp, leu und sein (Mitteltafel: b, e, h) und trp, leu, sein und ade (unterer Panel: c, f, i). Die Auswahl auf Medium ohne trp und leu ist eine positive Kontrolle für die erfolgreiche Co-Transformation, wie der Köder Vektor, der das trp Auxotrophie und die Beute Vektor der leu Auxotrophie von NMY51 (Wachstum auf SD-trp-leu) ergänzt. Im Falle einer Wechselwirkung zwischen Köder und Beute oder eine Selbstaktivierung des Köders wird der Reporterexpression von NMY51 eingeschaltet und ergänzt die His- und ade Auxotrophie (Wachstum auf SD-trp-leu-his-ADE). Ein schwaches Selbstaktivierung wird durch Wachstum auf SD-trp-leu-his - Platten (Mitteltafel, df) gekennzeichnet. Schwache Selbstaktivierung eines Köders müssen für die Analyse der Köder vor vermindert werdenin einem Y2H Bildschirm, zum Beispiel durch Zugabe von 3-AT zur selektiven Medien. Aminosäure Depletionen sind angegeben mit &quot;-&quot; in den jeweiligen Mediennamen. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> keiner </td><td> Kolonien </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td></tr><tr><td> keiner </td><td> pGAD-HA </td><td> kein Wachstum </td><td> Kolonien </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> keiner </td><td> Kolonien </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> pGAD-HA </td><td> Kolonien </td><td> Kolonien </td><td&gt; Kolonien </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td></tr><tr><td> pLexA-p53 </td><td> PACT larget </td><td> Kolonien </td><td> Kolonien </td><td> Kolonien </td><td> Kolonien </td><td> Kolonien </td></tr><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> pGAD-HA </td><td> Kolonien </td><td> Kolonien </td><td> Kolonien </td><td> kein Wachstum </td><td> kein Wachstum </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Erwartete Ergebnisse in einem Bait Selbstaktivierungstest. Die Transformation von S. cerevisiae NMY51 ergibt in Differential Wachstum auf Selektivmedien basierend auf den Eigenschaften von cotransformiert Köder und Beute. Wachstum auf selektiven Platten wurde bei 30 ° C nach der Transformation von verschiedenen Vektor-Kombinationen (af) nach 72 h Inkubation ausgewertet. Schwache Selbstaktivierung wird durch das Wachstum der Hefe auf SD-trp-leu-his und starke Selbstaktivierung durch Wachstum auf SD-trp-leu-his-ade Auswahl plat gekennzeichnetes in Abwesenheit eines Interaktionspartner. Die pLexA-N kodierten phytoplasmal Effektor ATP_00189 zeigt keine Selbstaktivierung, die durch die Unfähigkeit des Bait-Vektor gekennzeichnet ist NMY51 transformiert in Abwesenheit seines und ADE zu wachsen. Je nach dem Köder kann ein Y2H Bildschirm zahlreiche Hefe-Klone wachsen auf selektiven Platten gewinnen. Alle Klone müssen für mögliche Redundanzen analysiert und geprüft werden. Selbst wenn eine normalisierte cDNA-Bibliothek verwendet worden ist, ist es sehr wahrscheinlich, dass ein Interaktors in vielen verschiedenen Klone repräsentiert wird. In Abhängigkeit von der Bibliothek Klonierungstechnik ist es auch möglich, daß nur Fragmente des vollständigen Gens in einigen Beutevektoren eingefügt werden. Es ist daher ratsam, die de novo verstärken (von cDNA) und subklonieren das Gen voller Länge des Interaktors und die Interaktion zu testen in einer Eins-zu-Eins - Y2H Analyse (Abbildung 2). <img alt = &quot;2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55150 / 55150fig2.jpg&quot; /&gt; Abbildung 2: Beispiel einer Wechselwirkung zwischen Köder und Beute in einem Y2H Experiment. Ein Hefe-Zwei-Hybrid (Y2H) Bildschirm wurde durchgeführt, und Plasmide, die aus positiven Interaktor Klone wurden gereinigt. Die Beute Vektor wurde sequenziert und die Host - Interaktionspartner Malus x domestica MdTCP24 und MdTCP25 wurden identifiziert. Als Negativkontrolle MdTCP34 (für die keine Interaktor in der Y2H Bibliothek Bildschirm identifiziert) wurde parallel subkloniert. Die volle Länge Gene wurden aus Apfel cDNA amplifiziert, subkloniert in dem Beute - Vektor (co-cistronically der Aktivierungsdomäne AD exprimierenden) und de novo co-transformiert mit dem Bait - Vektor des bakteriellen Effektor ATP_00189 an die DNA - Bindungsdomäne (BD) gekoppelt ausdrückt. Diese Zahl wird von 28 genommen. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier ein</a> , <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">um zu vergrößern</a>Version dieser Figur.

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Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Bakterielle Effektor-Proteine ​​sind wichtig für den Aufbau erfolgreicher Infektionen. Dieses Protokoll beschreibt die experimentelle Identifizierung von proteinösen Bindungspartner eines bakteriellen Effektor-Protein in seiner natürlichen pflanzlichen Wirt. Die Identifizierung dieser Effektor - Wechselwirkungen über Hefe - Zwei-Hybrid - Screens ist ein wichtiges Instrument in entwirren molekularen Pathogenität Strategien werden.

Die Entwirrung der Funktion eines bakteriellen Effektor aus einem nicht-kultivierter Pflanzenschädling eine Hefe mit Zwei-Hybrid-Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

unravelling-function-bacterial-effector-from-non-cultivable-plant

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K Aufrufe.  Laimburg Research Centre.  Bakterielle Effektor-Proteine ​​sind wichtig für den Aufbau erfolgreicher Infektionen. Dieses Protokoll beschreibt die experimentelle Identifizierung von proteinösen Bindungspartner eines bakteriellen Effektor-Protein in seiner natürlichen pflanzlichen Wirt. Die Identifizierung dieser Effektor - Wechselwirkungen über Hefe - Zwei-Hybrid - Screens ist ein wichtiges Instrument in entwirren molekularen Pathogenität Strategien werden. 

Serie: Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

Mit Luciferase to Image Bakterielle Infektionen bei Mäusen

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be applied to the study of cell invasion by virtually any culturable bacterium. The stages at which specific aspects of invasion can be studied, such as the role of actin rearrangement or caveolae, will be highlighted. Host cells are grown in flasks and when ready for use are seeded into 24-well plates containing Thermanox coverslips. Using coverslips allows subsequent removal of the cells from the wells to reduce interference from serum proteins deposited onto the sides of the wells (to which S. aureus would attach). Bacteria are grown to the required density and washed to remove any secreted proteins (e.g. toxins). Coverslips with confluent layers of endothelial cells are transferred to new 24-well plates containing fresh culture medium before the addition of bacteria. Bacteria and cells are then incubated together for the required amount of time in 5% CO2 at 37&deg;C. For S. aureus this is typically between 15-90 minutes. Thermanox coverslips are removed from each well and dip-washed in PBS to remove unattached bacteria. If total associated bacteria (adherent and internalised) are to be quantified, coverslips are then placed in a fresh well containing 0.5% Triton X-100 in PBS. Gentle pipetting leads to complete cell lysis and bacteria are enumerated by serial dilution and plating onto agar. If the number of bacteria that have invaded the cells is needed, coverslips are added to wells containing 500 &mu;l tissue culture medium supplemented with gentamicin and incubation continued for 1 h, which will kill all external bacteria. Coverslips can then be washed, cells lysed and bacteria enumerated by plating onto agar as described above. If the experiment requires direct visualisation, coverslips can be fixed and stained for light, fluorescence or confocal microscopy or prepared for electron microscopy.

A general protocol for the study of invasion of host cells by a bacterial pathogen, focusing on Staphylococcus aureus and human endothelial cells.

Invasion von menschlichen Zellen durch einen bakteriellen Erreger

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

Die Nutzung der EpiAirway Modell zur Charakterisierung Langfristige Host-Pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Induktion der Graft-versus-Host-Krankheit und<em&gt; In Vivo</em&gt; T-Zell-Überwachung mit einem MHC-matched Mausmodell

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks to human and animal health. Among cereal production, maize is arguably the most affected crop, due to pathogen-induced losses in grain integrity and mycotoxin seed contamination. The two most prevalent and problematic mycotoxins for maize growers and food and feed processors are aflatoxin and fumonisin, produced by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides, respectively.
Recent studies in molecular plant-pathogen interactions have demonstrated promise in understanding specific mechanisms associated with plant responses to fungal infection and mycotoxin contamination1,2,3,4,5,6. Because many labs are using kernel assays to study plant-pathogen interactions, there is a need for a standardized method for quantifying different biological parameters, so results from different laboratories can be cross-interpreted. For a robust and reproducible means for quantitative analyses on seeds, we have developed in-lab kernel assays and subsequent methods to quantify fungal growth, biomass, and mycotoxin contamination. Four sterilized maize kernels are inoculated in glass vials with a fungal suspension (106) and incubated for a predetermined period. Sample vials are then selected for enumeration of conidia by hemocytometer, ergosterol-based biomass analysis by high performance liquid chromatography (HPLC), aflatoxin quantification using an AflaTest fluorometer method, and fumonisin quantification by HPLC.

The devastation of cereal crops by seed-infecting fungi has prompted numerous research efforts to better understand plant-pathogen interactions. To study seed-fungal interactions in a laboratory setting, we developed a robust method for the quantification of fungal reproduction, biomass, and mycotoxin contamination using kernel bioassays.

Die Quantifizierung der Pilzbesiedlung, Sporogenese und Produktion von Mykotoxinen Kernel-Bioassays

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

This protocol outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and colitis, as well as the methods used to characterize Citrobacter rodentium infection in mice. C. rodentium is a gram negative, murine specific bacterial pathogen that is closely related to the clinically important human pathogens enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli. Upon infection with C. rodentium, immunocompetent mice suffer from modest and transient weight loss and diarrhea. Histologically, intestinal crypt elongation, immune cell infiltration, and goblet cell depletion are observed. Clearance of infection is achieved after 3 to 4 weeks. Measurement of intestinal epithelial barrier integrity, bacterial load, and histological damage at different time points after infection, allow the characterization of mouse strains susceptible to infection.
The virulence mechanisms by which bacterial pathogens colonize the intestinal tract of their hosts, as well as specific host responses that defend against such infections are poorly understood. Therefore the C. rodentium model of enteric bacterial infection serves as a valuable tool to aid in our understanding of these processes. Enteric bacteria have also been linked to Inflammatory Bowel Diseases (IBDs). It has been hypothesized that the maladaptive chronic inflammatory responses seen in IBD patients develop in genetically susceptible individuals following abnormal exposure of the intestinal mucosal immune system to enteric bacteria. Therefore, the study of models of infectious colitis offers significant potential for defining potentially pathogenic host responses to enteric bacteria. C. rodentium induced colitis is one such rare model that allows for the analysis of host responses to enteric bacteria, furthering our understanding of potential mechanisms of IBD pathogenesis; essential in the development of novel preventative and therapeutic treatments.

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Citrobacter rodentium infection provides a valuable model to study enteric bacterial infections as well as host immune responses and colitis in mice. This protocol outlines the measurement of barrier integrity, pathogen load and histological damage allowing for the thorough characterization of pathogen and host contributions to murine infectious colitis.

Die<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Model: Studieren Erreger und Wirt Beiträge zur Infectious Colitis

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

Automatische Trennung von<em&gt; C. elegans</em&gt; Variabel durch einen bakteriellen Erreger kolonisiert

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

Erkennen Cortex Fragmente während der bakteriellen Sporenauskeimung

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

Die Beurteilung Retinal Microglial Phagozytische Funktion<em&gt; In Vivo</em&gt; Mit einem Durchfluss-Zytometrie basierten Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...