This work was funded by the National Science Foundation (CBET 0845754, AHH).

アルギン酸ディスクの形成のために1.準備<ol><li> 37℃の水浴中で添加し、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムと場所なしで1×ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水で4％（w / v）のアルギン酸塩溶液を調製します。 （w / v）のアルギン酸塩溶液が推奨されている4％ - アルギン酸塩溶液の濃度は様々であるが、1することができます。 </li><li>所望の細胞型のために暖かい細胞培養培地塩基（ 例えば 、ダルベッコ改変イーグル培地。）との1：1の割合でアルギン酸塩溶液を混ぜます。アルギン酸塩の濃度は、現在元の濃度の半分、 すなわち 、2％（W / V）。無菌の0.2μmのナイロンシリンジフィルターを用いて、アルギン酸塩/培地溶液を滅菌します。 </li><li> （ - 300ミリリットル〜200）を金型を沈めるために十分な溶液で滅菌水に無菌の102 mMの塩化カルシウム二水和物のバスを準備します。 </li><li>アルミ板で×3の3中の滅菌「ゲル形成型」（直径6mmのx 3ミリメートル背の高い円筒形の井戸を収集し、参照してください。 <strong&gt;図1）およびエンドプレート（下：1のアルミニウム板中のx 3の3、トップ：アルミ板で×3で1 1.5）と、次のように金型を準備します。 <ol><li>上部および下部終板のサイズに厚い濾紙（吸取濾紙）および細胞マイクロ篩膜（10ミクロン孔径）を切断し、飽和、約1分まで塩化カルシウム浴中に置き。所望の場合、使用前に30分間、オートクレーブまたは紫外光を介して厚い濾紙とマイクロシーブ膜を滅菌します。 </li><li>セットアップモールド構造体の半分（下半分）を。 <ol><li>次の順序で互いに上に以下の項目を配置し、滅菌スパチュラを用いて平滑化：大規模なエンドプレート、厚手のろ紙、その後、マイクロシーブ膜（3×3でで）。 </li><li>反転および過剰な塩化カルシウム溶液の損失を保証するために、ペーパータオルのスタックに金型を押してください。 </li><li> Cの上に円筒状のウェルを備えた「ゲル形成型」を配置しますエル膜をマイクロシーブ、静かに左右にバインダークリップを使用して、両側に一緒に金型を固定します。完全後で井戸をカバーするために（中×3で1.5）トップエンドプレートのための十分な余地を残していることを確認してください。 </li></ol></li><li>セットアップモールド構造体の後半（上半分）を。 <ol><li>次の順序で互いに上に以下の項目を配置し、円滑：小端板、厚手のろ紙、マイクロシーブ膜。 </li><li>過剰の塩化カルシウム溶液の損失を保証するために、ペーパータオルのスタック上に金型のこの半分を反転し、押します。この時点でバインダークリップを使用して、金型のこの半分を固定しないでください。 </li></ol></li></ol></li><li>培養細胞は、製造業者の指示に従ってお勧めします。層状のアルギン酸ハイドロゲルに埋め込むべき所望の細胞を採取します。推奨される細胞密度は1 - 2×10 6細胞/ mlで、これは、所望の実験に応じて変化させることができます。 注：この方法を使用する場合異なる細胞型を有する層を作製するために、重ね着に並列に文化2つの細胞型に確認してください。 （MSCS）は、1×10 6細胞/ mlの細胞密度で播種した間葉系幹細胞は、以下のプロトコルのための例として使用されます。必要に応じて、細胞数とディスク番号が実験のためにスケーリングすることができます。 <ol><li>基礎成長培地10mlの（ダルベッコ改変イーグル培地、10％ウシ胎児血清、2％L-グルタミン、1で5,000細胞/ cm 2 - 1〜2週間前に3,000の細胞密度で、種間葉系幹細胞を包埋しますT-75フラスコ中の％非必須アミノ酸、1％ペニシリン/ストレプトマイシン）。 </li><li> 3日後、細胞が80になるまで、基礎増殖培地10mlで置き換える - - すべての2使用済みメディアを取り出し、90％のコンフルエント。 </li><li>収穫細胞に、細胞をすすぐために使用済み培地、および追加された塩化カルシウムや塩化マグネシウムなしの1×ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水のピペット3ミリリットルを削除します。ピペット、0.25％の試行の3ミリリットルをこのソリューションを削除しますT-75フラスコ中で増殖している細胞へPSIN-EDTA、および37℃で5分間インキュベートします。基礎成長培地の9ミリリットル - 細胞が付着面から持ち上げた後、6を追加します。 </li><li>遠心機MSCは、室温で5分間、600×gで、上清を吸引し、そして1に再懸濁 - 基礎成長培地5mlの。デバイス命令を使用して、血球計数器を用いて細胞を数えます。 </li><li>同じ条件を用いて、全細胞の再懸濁、遠心機から1×10 6細胞を除去し、上清を吸引除去します。 </li></ol></li></ol>セルシードアルギン酸ディスクの2形成<ol><li> 1×10 6細胞/ mlの細胞密度を達成するために、滅菌アルギネート/培地溶液1mlで細胞ペレットを再懸濁します。細胞が適切に混在している場合、細胞 - アルギン酸塩の混合物は、外観が均一に曇っなります。 </li><li>ピペット金型の下半分の6つの直径6mmのx 3ミリメートル背の高いウェルに細胞 - アルギン酸塩の混合物130μlの気泡を作成しないように、滴下して構築します。わずかな凸状メニスカスは、各ウェルの縁上記表示されるはずです。 </li><li>慎重に滅菌スパチュラを用いて、金型構造体の上半分を滑らかと細胞マイクロシーブ膜が井戸の上になるように、それを裏返します。完全セルとアルギン酸塩の混合物を含むウェルをカバーするのに確認して、井戸の上にモールド構造体を配置します。 </li><li>中央をしっかり押しながら、ロードされたモールド構造体を持ち上げて、バインダーは、モールド構造体の上部と下部の半分を固定するために、残りの二辺（上部と下部）をクリップします。細胞アルギン酸ソリューションは確実にこの時点でウェルに囲まれるべきです。 </li><li>構築物全体が水没していることを確認して、102 mMの塩化カルシウム浴中の固定金型構造体を浸し。 90分間室温で細胞培養フード中でインキュベートします。 </li><li> 90分の終わりに、102 mMの塩化カルシウムからモールド構造体を除去します細胞培養フード内ペーパータオルのスタック上の風呂と場所。すべての4つのバインダークリップを外し、金型構造体の2つの半分を分けます。ウェル内に形成されたヒドロゲルは、任意の気泡を持つべきではないと完全に井戸を埋める必要があります。 </li><li>へらを使用して、慎重に慎重に緩め、ヒドロゲルをウェッジハイドロゲルを含むウェルの縁をたどります。金型構築物からヒドロゲルを除去した後、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムと1×ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水の槽に直接ヒドロゲルをドロップします。 5分 - 1のための過剰な塩化カルシウム溶液を洗い流し、完全にゲルをカバーしています。 </li><li>完全にハイドロゲルをカバーする目的の皿の中の基礎増殖培地溶液（ 例えば 、6ウェルプレート）にヒドロゲルを転送します。積層工程に進む前に、37℃で細胞培養インキュベーター中で少なくとも1時間、5％CO 2インキュベートします。 注：細胞を含むヒドロゲルを中に保持することができます3日 - 別の細胞集団とゲルの積層までこの時無期限細胞培養インキュベーターは、メディアの変更はすべて2完了したことを条件とする、望ましいです。 </li></ol>アルギン酸ディスクの3層化<ol><li> 1時間のインキュベーションの最後の半分の時間の間に、ゲルをアニールするための無菌金型やソリューションを収集し、準備します。 <ol><li> x方向（エンドプレートに3（アルミ板に×3の3で、直径6mmのx 1.5ミリメートル背の高い井戸） &quot;ゲル形成型」の高さのウェルの半分を持っている金型を固定することにより、「切断金型を&quot;準備左右にバインダークリップを使用してアルミニウム板3）。 </li><li> X 3（終板に「ゲル形成型」よりも直径が3ミリメートル大きい金型を固定することにより、「アニーリング金型」（9ミリメートルの直径のx 3ミリメートルのアルミニウム板中のx 3の3で背の高い井戸）を準備左右にバインダークリップを使用してアルミニウム板3）。 </li><li>の溶液を準備します100mMの滅菌水にクエン​​酸ナトリウム/ 30mMのEDTA（クエン酸ナトリウム二水和物、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩二水和物）。 </li></ol></li><li>皿にメディアから（この例では、hMSCを持つ2つのディスク）所望の細胞集団のゲルを外し、「切断金型」ウェルに配置します。各ゲルは、金型の上に突出したゲルの半分でウェルにぴったりとフィットする必要があります。 </li><li>メスを用いて、（これは半分にヒドロゲルを削減する）金型の表面に沿ってゲルスライス。ゲルの上半分を反転し、開放金型のウェルに配置します。ゲルの半分もよく、金型にぴったりとフィットする必要がありますが、今、両方の半ゲルは、可視カット内面に金型の高さでなければなりません。第二のゲルで繰り返します。 注：警告：のみ内側の切断面は、層状のディスクを形成することになります。外表面を使用して分離半分になります。これは、ゲル表面防止に転写マイクロシーブ膜からそのテクスチャを疑われますアニール処理の成功。 </li><li>マイクロシーブ膜をアニールするゲルの半分の全てに接触していることを確認すると、それらを完全にカバーし、井戸の上に乾電池マイクロシーブ膜のピースを置きます。完全にゲルをカバーすることを確認して、マイクロシーブ膜の上に厚手のろ紙を置きます。 </li><li>それが飽和するまでの厚さの濾紙上に100mMのクエン酸ナトリウム/ 30mMのEDTA（クエン酸ナトリウム二水和物、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩二水和物）の溶液をピペット。約750μlの4つのウェルのために十分です。 </li><li>室温で1分間ゲルをインキュベートします。その後、細胞マイクロ篩膜と厚いろ紙を削除し、それらを捨てます。バインダークリップを外し、金型を開きます。 </li><li>各アニールゲルについて、切断面を上に​​向けて準備された「アニーリング金型」にヒドロゲルの1クエン酸ナトリウム/ EDTA処理の半分を転送します。これは、アニール定数の半分になりますruct。 </li><li>切断面が入っているように、この第2の半ゲルを反転、既に「アニーリング型」のゲル上に（異なる細胞型を含んでいてもよい）へら、リフトを使用し、第二クエン酸ナトリウム/ EDTA処理した半ゲルを配置「アニーリング型」で既にゲルの切断面に接触します。 </li><li>そっと2つのゲルの間の任意の気泡を除去するためにスパチュラを用いて2つのゲルを押し。また、必要に応じて、彼らは互いの上に直接あることを確認するために、ゲルを再配置します。 </li><li>穏やかに「アニール型」を持ち上げ、30分間、102 mMの塩化カルシウム浴中に沈めます。エンドプレートでウェルをカバーしないでください。 </li><li> 30分のインキュベーションの後、「アニーリングモールド」を削除し、ペーパータオルの上に置きます。バインダークリップを外し、エンドプレートからモールドを分離します。 </li><li>スパチュラを用いて、アニールゲルを収集し、塩化カルシウムおよびmは1×ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水に入れますagnesium塩化物浴は、ゲルを洗浄します。続いて、転送は、培養のための所望のディッシュ（ 例えば 、6ウェルプレート）で細胞培養培地にヒドロゲルをアニール。 </li></ol>

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	<li>Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Basic+Science+of+Articular+Cartilage.">The Basic Science of Articular Cartilage.</a> Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).</li><li>Neidlinger-Wilke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+loading+of+the+intervertebral+disc:+from+the+macroscopic+to+the+cellular+level.">Mechanical loading of the intervertebral disc: from the macroscopic to the cellular level.</a> Eur. Spine J. 23 (3), 333-343 (2013).</li><li>Klein, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+of+stratified+articular+cartilage+from+chondrocyte+subpopulations.">Tissue engineering of stratified articular cartilage from chondrocyte subpopulations.</a> Osteoarth. Cartilage. 11 (8), 595-602 (2003).</li><li>Han, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+Grafts+for+Articular+Cartilage+Defects.">Scaffold-free Grafts for Articular Cartilage Defects.</a> Clin. Orthop. Relat. R. 466 (8), 1912-1920 (2008).</li><li>Ng, K. W., Ateshian, G. A., Hung, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zonal+chondrocytes+seeded+in+a+layered+agarose+hydrogel+create+engineered+cartilage+with+depth-dependent+cellular+and+mechanical+inhomogeneity.">Zonal chondrocytes seeded in a layered agarose hydrogel create engineered cartilage with depth-dependent cellular and mechanical inhomogeneity.</a> Tissue Eng. A. 15 (9), 2315-2324 (2009).</li><li>Ng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+layered+agarose+approach+to+fabricate+depth-dependent+inhomogeneity+in+chondrocyte-seeded+constructs.">A layered agarose approach to fabricate depth-dependent inhomogeneity in chondrocyte-seeded constructs.</a> J. Orthop. Res. 23 (1), 134-141 (2005).</li><li>Nguyen, L. H., Kudva, A. K., Saxena, N. S., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+articular+cartilage+with+spatially-varying+matrix+composition+and+mechanical+properties+from+a+single+stem+cell+population+using+a+multi-layered+hydrogel.">Engineering articular cartilage with spatially-varying matrix composition and mechanical properties from a single stem cell population using a multi-layered hydrogel.</a> Biomaterials. 32 (29), 6946-6952 (2011).</li><li>Leone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+multilayered+composite+hydrogel+as+osteochondral+substitute.">Continuous multilayered composite hydrogel as osteochondral substitute.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 103 (8), 2521-2530 (2015).</li><li>Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+catalyze+cartilage+formation+by+neonatal+articular+chondrocytes+in+3D+biomimetic+hydrogels.">Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels.</a> Sci. Rep. 3, (2013).</li><li>Vigf&#250;sd&#242;ttir, &. #. 1. 9. 3. ;. T., Pasrija, C., Thakore, P. I., Schmidt, R. B., Hsieh, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Pericellular+Matrix+in+Mesenchymal+Stem+Cell+Deformation+during+Chondrogenic+Differentiation.">Role of Pericellular Matrix in Mesenchymal Stem Cell Deformation during Chondrogenic Differentiation.</a> Cell. Mol. Bioeng. 3 (4), 387-397 (2010).</li><li>Lee, C. S. D., Gleghorn, J. P., Won Choi, N., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+layered+chondrocyte-seeded+alginate+hydrogel+scaffolds.">Integration of layered chondrocyte-seeded alginate hydrogel scaffolds.</a> Biomaterials. 28 (19), 2987-2993 (2007).</li><li>Gleghorn, J. P., Lee, C. S. D., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+properties+of+laminated+alginate+gels+for+tissue+engineering+of+layered+structures.">Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 85 (3), 611-618 (2008).</li><li>Gharravi, A. M., Orazizadeh, M., Ansari-Asl, K., Banoni, S., Izadi, S., Hashemitabar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Fabrication+of+Anatomical+Bioreactor+Systems+Containing+Alginate+Scaffolds+for+Cartilage+Tissue+Engineering.">Design and Fabrication of Anatomical Bioreactor Systems Containing Alginate Scaffolds for Cartilage Tissue Engineering.</a> Avicenna J. Med. Biotechnol. 4 (2), 65-74 (2012).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Three-Dimensional+Alginate+Gels.">Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells in Three-Dimensional Alginate Gels.</a> Tissue Eng. A. 14 (5), 667-680 (2008).</li><li>Yeatts, A. B., Gordon, C. N., Fisher, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+an+aggregated+alginate+construct+in+a+tubular+perfusion+system.">Formation of an aggregated alginate construct in a tubular perfusion system.</a> Tissue Eng. C, Methods. 17 (12), 1171-1178 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ここでは、軟骨、例えば 、生理学的に層状の組織のものなど、複数の細胞集団の共培養を、研究するための層状のアルギン酸ハイドロゲルディスクを形成するためのプロトコルについて説明します。そのような記載培養プラットフォームとしての層状構造は、同一の培養環境や負荷の下で施す二つの異なる細胞集団との間の相互作用を調べるために使用することができます。 アルギン酸塩は生体適合性であることが見出されており、正常軟骨生物学および組織工学研究12,14のために使用されている陰イオン性直鎖ポリサッカライドです。アルギン酸塩ヒドロゲルは、架橋のために二価の陽イオンを用いて形成されている、例えば 、カルシウムイオン。これらの架橋は、例えば、クエン酸ナトリウムまたはEDTAのようなキレート剤を用いて陽イオンを除去することによって元に戻すことができ、このプロセスはゲル3,4,12で培養された軟骨細胞を単離するために以前に使用されてきました。同様に、同じ原理また、成功したアルギン酸塩二重層内のシートまたは一緒にアルギン酸ビーズの偶数クラスタ11,12,15を接着させるために適用されています。ここで説明するプラットフォームは、同じプロセスに依存しているが、小さな円盤状の積層ヒドロゲルを形成するために使用されます。これは最初、アルギン酸ディスクは、カルシウムに富んだ浴に浸漬金型を用いて形成された二段階のプロセスです。これらは、次いで、半分にスライスし、局所的に架橋されたアルギン酸塩からのカルシウムイオンを放出するカル​​シウムキレート溶液で処理されます。一緒にこれらの処理された表面を配置し、カルシウムが豊富な溶液中のディスクを再浸漬することにより、架橋は、二層構造を作り、改質されています。 図4に示すように、これらの小さな層状ゲルは、それによってしばしば貴重な細胞ならびに加工材料の無駄を最小限に抑え、生検パンチは、このような機械的試験などのアッセイおよび実験との互換性が簡単に培養サンプルを生成する必要性を排除します。 に示すように図3は 、ヒドロゲルを形成し、積層する。このプロセスは、この手順では、過度に栄養を補給の長さと不在にもかかわらず、細胞集団に課税されていないことを示す制御またはバルクヒドロゲルなどの同様に高い生存率をもたらしました。ゲル中の最初の重複領域の欠如は、初期の共培養と時間をかけてそのインターフェイスに変更を観察する能力の間に物理的な分離を可能にします。研究は、長い培養期間にわたって、このインタフェースは、携帯クロス浸潤および細胞外マトリックスの沈着11による定義を失う可能性があることを示しています。細胞外マトリックスが堆積されているように、初期層ディスクは、任意の接着分子が含まれていませんが、また、細胞集団のマージと層の間の変更のインタフェースを調査するための可能性があります。 これらの二層ディスクは、動的圧縮刺激のために容易に使用することができます。私たちは、thesということを確認することができました電子ヒドロゲルは、半分を分離することなく動的圧縮に耐えます。しかし、このプロセスの間、4時間環式圧縮中に層状ヒドロゲルによって示されるピーク負荷は、非階層化、バルク、ヒドロゲルと有意に異なることが見出されました。計画する際に、この結果は、 例えば 、各層における同じ細胞集団/条件付き二層ヒドロゲルは、重要な詳細を注意することが、層の間の複雑な非線形歪みの伝達を示唆し、物理階層制御ゲルの必要性を明らかに機械的負荷を含む研究のための実験的なデザイン。観察された差のより良い理解は、これらのゲル内の空間的力学の計算モデルを介して達成することができます。だけでなく、このような分析は、層の間のひずみ分布と転送を明確に役立つだろうが、それはまた、特に機械的特性を変化させた層で、これらの層状ゲル中で細胞の挙動を解釈するためのインストゥルメンタルであろう。 <p class= &quot;jove_contentは&quot;&gt;これは、説明したように、共培養中の細胞集団の物理的な分離のために使用することができる汎用性の培養システムです。さらに、それはまた、さらなる発展のための基本構造として使用することができます。既存の構造の変化は、層の数を増加させる大きさまたは層の相対的な剛性を変化させると、層の一つ以上に付加的な細胞外マトリックス成分を組み込む含むことができます。しかし、これらの拡張は慎重な評価が必要になります。ディスク全体の力の分布の変化に加えて、層の大きさと数を増やすと、機械的刺激の間ゲルおよび物理的不安定性の中心における細胞生存率の減少につながります。さらに、大きな細胞外マトリックスの付加および接着部分を提供するために、アルギン酸塩へのタンパク質または改変を刺激するには、ゲル形成およびアニーリングプロセスを妨害することができます。 この培養プラットフォームWA3D培養における異なる細胞集団間の関係を調査するための研究用途のために開発されよ。したがって、臨床応用のための拡張性の欠如によって制限されます。このような3Dプリンティングなどの層状のハイドロゲルを作成するための別の方法は、最終的に起因する予想される将来の拡張性の進歩、ディスク内部の微細構造を制御し、マクロスケールの幾何学的特徴のカスタマイズにより臨床的に関連する可能性があります。研究用途のために、ここで提示されるよう、アルギン酸ディスクは独立して、他の細胞型への適用が制限される可能性が細胞のための接着部分を提供していません。使いやすさを考慮するとアルギン酸塩と同等の代替は、同様の制限を受けるアガロースです。また、アルギン酸塩架橋が安全カルシウムキレート化剤を用いて除去することができ、一方、下流の分析のために細胞を放出するために酵素の使用を必要とします。主に、この培養プラットフォームはunderstandiを向上させる助けになるだろう細胞ヒドロゲルの人口およびこれらの共培養の機械的刺激の潜在的影響の間の関係のngの。この理解は、その後、特に、関節軟骨や椎間板などのベアリングの組織をロードし、異種の組織のための治療法の開発に通知します。

このような関節軟骨や椎間板などの圧縮荷重支持組織は、組織の両方の生体力学的機能と適切なメカノトランスダクションのために重要である異種の組織領域で構成されています。だけでなく、細胞組織化され、さまざまな地域での異なる機能が、細胞外マトリックス（ECM）は、組成や組織に変化しています。例えば、関節軟骨は、細胞の形態、機械的機能、およびECMを変えて3プライマリゾーンで構成されています。耐荷重の責任を差動に自分のECMリードの違い。真ん中の深いゾーンは圧縮1への応答のために主に責任がありながら、表層は、主に、ロードするために引張応答に関与しています。同様に、椎間板に、ゲル状の髄核は、ラメラ線維輪に囲まれており、これらの二つの異なる領域内の細胞は、生物物理学的刺激の異なる種類を体験されています組織が ​​受けると、機械的な力に応答するように2組織層内の組織、細胞と細胞外マトリックスのこれらのタイプでは、互いに相互作用します。 このような不均質な組織構造の要約は、組織工学および再生医療における課題のままであり、その生物学的意義の理解は限られています。層状組織ならびに1つの構築物内の細胞の異なる集団の共培養物を分析するためのプラットフォームを培養する必要があります。関節軟骨組織工学では、足場レス層状構築物は、この組織3,4の異なる層を模倣するために様々なECMを堆積する帯状の軟骨細胞の能力を活用することによって構築されてきました。しかしながら、層状ヒドロゲル構築物は、独立して、強固な組織を形成する能力を欠いている細胞集団の多様な種類の相互作用を調査するための機会を提供します。例えば、異なるポップ間葉系幹細胞のulations層状のコンストラクト内で共培養することができます。このような層状足場は、軟骨細胞および改善された組織工学5のための間葉系幹細胞を分化の両方で使用されてきました。異なる細胞集団は、類似のハイドロゲル層に共培養することができるが、単一の細胞型は、細胞6,7から異なる応答を誘発するために剛性または生化学的なコンテンツを変化しているために操作された層内に培養することができる。のみならず多くの異なる生体材料のヒドロゲルは、ポリエチレングリコール又はポリビニルアルコールベース7-9を使用するもののような軟骨組織工学のための細胞集団の層に使用されてきました。しかし、アルギン酸ハイドロゲルは、共培養に不均一な細胞集団を研究するための層状の足場を作成するための最も簡単な生体材料の一つです。アガロースハイドロゲルも容易に形成されているが、アルギン酸ハイドロゲルは容易であることが可能という利点を持っています個々の細胞の分析のために3-D構築物からの細胞のオレーション以前10に記載されているように。以前の研究では、二層アルギン酸ハイドロゲルは、薄いシートに形成されており、これらのシートから、セクションでは、スライスした（ 例えば 、生検パンチを使用して）、そのような生化学的コンテンツや界面剪断特性11,12の分析のためのような特定のアプリケーションのために。薄いアルギネートシートを形成するための別の方法は、複数の層に層別化の可能性と説明したが、依然として機械的試験13に使用するためのヒドロゲルの変更を必要とするであろう。 ここでは、再現性の細胞の異なる集団を共培養に使用するための二層アルギン酸ヒドロゲルのディスクを作成するための方法を提示します。このアルギン酸ディスク・プラットフォームは、いくつかの利点を有しています。主に、再現可能な形状とサイズが小さい生検PUを必要とせずに埋め込まれた細胞の機械的刺激のために助長していますNCH​​や多くのアプリケーションのためのヒドロゲルに他の物理的変化。さらに、細胞生存率は、積層プロセス中に高いままであり、ゲル形成後のゲル内の2つの細胞集団の明確な分離はありません最初のオーバーラップ領域で表示されます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="808">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Alginic Acid sodium salt</td>
			<td style="width:180px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1112</td>
			<td style="width:295px;">Solution made in wt% using DPBS (-/-)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">1x Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (-/-)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">1x Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (+/+)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11965</td>
			<td>Example. Use desired medium type</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Syringe Filters (0.02um Nylon)</td>
			<td style="width:180px;">FisherBrand</td>
			<td style="width:119px;">0979C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">BP510</td>
			<td>Prepare solution in sterile water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Criterion Blotter Filter Paper</td>
			<td style="width:180px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1704085</td>
			<td>Cut to size of endplates for mold formation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Cell Microsieve Membrane (10um pore size)</td>
			<td style="width:180px;">Biodesign Inc of New York</td>
			<td style="width:119px;">N10R</td>
			<td>Cut to size of endplates for mold formation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">0.25% Trypsin-EDTA (1x), phenol red</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">25200</td>
			<td>Thaw in 37&#7506;C water bath</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium citrate dihydrate</td>
			<td style="width:180px;">FisherScience</td>
			<td style="width:119px;">S93364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td style="width:180px;">FisherBioreagent</td>
			<td style="width:119px;">BP121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">26140</td>
			<td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Penicilin/Streptomycin (10000 U/ml)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">15140</td>
			<td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">L-Glutamine (200mM)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Non-essential Amino Acids (100x)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11140050</td>
			<td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

layered alginate constructs: a platform for co-culture of heterogeneous cell populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

図1は、アルギン酸塩ヒドロゲルの形成と階層化を示しています。 図2に示すように、完成した二層状ゲルは、細胞集団の完全な初期の分離を示す。ヒト間葉系幹細胞の細胞生存率）をこれらのヒドロゲル内に埋め込 ​​まれ、層状、図3に示すように、バルクのヒドロゲル高と同等のままである。生存率を評価しました。アニール後、センターにアクセスするには、垂直方向にゲルをスライスした後、製造元の指示を使用して、エチジウムホモダイマー1で生細胞トラッカー、CMFDA（緑）および死細胞（赤）とアニールゲル中の生きた細胞を染色します。共焦点Z - スタックは、約100μmのゲルに蛍光顕微鏡を使用して切断面を撮影しました。これらの画像は、1つの2D画像に投影しました。生細胞と死細胞を、次いで、ImageJソフトウェアにおける粒子分析機能を用いて定量しました。 <p<html> FOクラス= &quot;jove_content&quot;：キープtogether.withinページ= &quot;1&quot;&gt;私たちは、これらの層状ヒドロゲルは、細胞を欠く、軟骨形成応答を誘導するために必要なものと同様の環状圧縮に耐えることができるだろうことを確認したかったです。 10％の株を - 私たちは、ヒドロゲルは0から1 Hzで4時間培養し、その後の一軸周期的な圧縮で7日後に無傷のままでないことがわかりました。しかし、各サイクルからのピーク応力を分離し、4時間の刺激を介して傾向を分析した後、トレンドは、層状のヒドロゲルはバルク、非階層化、ヒドロゲルに比べて、環状の圧縮に異なる応答を有することを示しています。巡回圧縮4時間以上は、階層化および非階層化ゲル（ 図4）の間で有意差（P = 0.03）ピーク応力の傾向をもたらしました。統計はスチューデントのt検定（α= 0.05）を使用して完了しました。 JPG &quot;/&gt; 図1： 階層化ヒドロゲル形成の概略A.。下部および上部の半型のための重なり順の描写で2％アルギン酸+細胞混合物の添加のために積み重ねられた金型のイメージ。 B.回路図は、ゲルの重ね着に手順を示す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54380/54380fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54380/54380fig2.jpg" /> 図2：レイヤーヒドロゲルモデル細胞株HEK 293FT細胞における細胞集団の代表的な分離は、いずれの生細胞トラッカーCMFDA（緑）またはCMTPX（赤）で染色しました。これらのセル群の各々は、アルギン酸塩ディスク（w / v）の2％に包埋した後、これらのディスクの半分を一緒に積層しました。ピースは、撮像中にそれを識別するためにCMTPX側から切断しました。スケールバー= 100＆＃181;メートル<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54380/54380fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54380/54380fig3.jpg" /> 図 3： プロセスが完了したレイヤリング後の階層化ハイドロゲル内の高い細胞生存率バルクと二層のヒドロゲル中に埋め込 ​​まれたヒト間葉系幹細胞は、生細胞（緑）トラッカーCMFDAおよび死細胞（赤）で染色したエチジウムホモダイマー-1で染色しました。生存率は、積層プロセス後の両方のヒドロゲルのグループの高止まり。スケールバー=100μmである。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54380/54380fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54380/54380fig4.jpg" /> Figur。E 4： 環状圧縮階層ヒドロゲル環状圧縮応答の有意に異なる傾向ヒドロゲルは、7日間、細胞培養インキュベーター中でインキュベートし、続いて0に供した- 1 Hzで4時間、10％一軸環状圧縮。各サイクルのピークストレス（±SEM）を単離し、負荷期間の傾向を分析します。 0から一軸周期的な圧縮下の動向-階層（N = 9）とバルクのための10％の株（N = 8）ゲルは、（P = 0.03）が有意に異なっている。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54380/54380fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

階層化アルギン酸構築：異種細胞集団の共培養のためのプラットフォーム

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

layered-alginate-constructs-platform-for-co-culture-heterogeneous

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.8K ビュー.  University of Maryland. Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct. 

ビデオ: Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

異なる系統にヒト胚性幹細胞（hESCの）の伝播との差別化のための3Dプラットフォームとしてのアルギン酸マイクロカプセル

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

生物工学

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

水性二相系を用いた細胞の共培養パターニング

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (&ge;105) in milliliter-scale volumes (&ge;0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 - 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 - 20 &mu;l). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries ("cell perfusion chambers"), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with "transfer" microcapillaries ("central hub"), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.

We have developed an automated cell culture and interrogation platform for micro-scale cell stimulation experiments. The platform offers simple, versatile, and precise control in cultivating and stimulating small populations of cells, and recovering lysates for molecular analyses. The platform is well suited to studies that use precious cells and/or reagents.

マイクロスケール細胞刺激のための実験のための多目的自動化プラットフォーム

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

堅牢、マイクロ流体細胞内送達プラットフォームとしての細胞絞る

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

組織工学：層状細胞シートの送達のための多細胞3D足場の構築

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have contributed dramatically to the understanding of basic mechanobiology. These techniques have been extensively used to demonstrate how the onset and progression of various diseases are heavily influenced by mechanical cues. This article presents a multi-functional biaxial stretching (BAXS) platform that can either mechanically stimulate single cells or quantify the mechanical stiffness of tissues. The BAXS platform consists of four voice coil motors that can be controlled independently. Single cells can be cultured on a flexible substrate that can be attached to the motors allowing one to expose the cells to complex, dynamic, and spatially varying strain fields. Conversely, by incorporating a force load cell, one can also quantify the mechanical properties of primary tissues as they are exposed to deformation cycles. In both cases, a proper set of clamps must be designed and mounted to the BAXS platform motors in order to firmly hold the flexible substrate or the tissue of interest. The BAXS platform can be mounted on an inverted microscope to perform simultaneous transmitted light and/or fluorescence imaging to examine the structural or biochemical response of the sample during stretching experiments. This article provides experimental details of the design and usage of the BAXS platform and presents results for single cell and whole tissue studies. The BAXS platform was used to measure the deformation of nuclei in single mouse myoblast cells in response to substrate strain and to measure the stiffness of isolated mouse aortas. The BAXS platform is a versatile tool that can be combined with various optical microscopies in order to provide novel mechanobiological insights at the sub-cellular, cellular and whole tissue levels.

We present in this article a novel stretching platform that can be used to investigate single cell responses to complex anisotropic biaxial mechanical deformation and quantify the mechanical properties of biological tissues.

細胞および組織メカノでのアプリケーションのためのプラットフォームをストレッチ小説

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

三ディスペンサーデカルトプリンタを使用してBioprinted細胞構築物の生存率

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

We describe a set of protocols that together provide a tissue-mimicking hydrogel bioink with which functional and viable 3-D tissue constructs can be bioprinted for use in in vitro screening applications.

Bioprinting細胞化は、組織特異的ヒドロゲルBioinkを使用して構築します

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

ハイスループットシングルセルの単離および培養のためのマイクロ流体プラットフォーム

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet encapsulation has been studied extensively as a means to increase islet survival in allogeneic or xenogeneic transplants. Alginate encapsulation is commonly achieved by nozzle extrusion and external gelation. Using this method, cell-containing alginate droplets formed at the tip of nozzles fall into a solution containing divalent cations that cause ionotropic alginate gelation as they diffuse into the droplets. The requirement for droplet formation at the nozzle tip limits the volumetric throughput and alginate concentration that can be achieved. This video describes a scalable emulsification method to encapsulate mammalian cells in 0.5% to 10% alginate with 70% to 90% cell survival. By this alternative method, alginate droplets containing cells and calcium carbonate are emulsified in mineral oil, followed by a decrease in pH leading to internal calcium release and ionotropic alginate gelation. The current method allows the production of alginate beads within 20 min of emulsification. The equipment required for the encapsulation step consists in simple stirred vessels available to most laboratories.

This video and manuscript describe an emulsion-based method to encapsulate mammalian cells in 0.5% to 10% alginate beads which can be produced in large batches using a simple stirred vessel. The encapsulated cells can be cultured in vitro or transplanted for cellular therapy applications.