This work was funded by the National Science Foundation (CBET 0845754, AHH).

Aljinat Disklerin Oluşumunda 1. Hazırlık <ol><li> % 4 Hazırlama (a / h) 37 ° C su banyosu içinde, eklenmiş kalsiyum klorid veya magnezyum klorid ve yer olmadan 1x Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin aljinat çözeltisi. aljinat çözeltisi konsantrasyonları değişebilir, ancak 1-4% (w / v) aljinat çözeltileri önerilir. </li><li> İstenen bir hücre tipi için sıcak bir hücre kültür ortamı baz ile 1 (ör Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı).: 1 oranında aljinat çözeltisi karıştırın. Alginat konsantrasyonu orjinal konsantrasyonunun yarısı, yani.,% 2 (w / v). Steril 0.2 mikron naylon şırınga filtreleri kullanarak aljinat / medya çözümü sterilize edin. </li><li> (- 300 ml ~ 200) kalıp daldırın kadar çözelti steril su içinde, steril 102 mM kalsiyum klorür dihidrat banyo hazırlayın. </li><li> Steril &quot;jel oluşumu kalıp&quot; alüminyum levha içinde x 3 a 3 (6 mm çap x 3 mm uzunluğunda silindirik kuyu toplayın, bkz <strong&gt; Şekil 1) ve omurun (Alt: Bir alüminyum plaka x 3 3, en alüminyum plaka x 3, bir 1.5) ve aşağıdaki şekilde kalıplar hazırlamak: <ol><li> Yaklaşık 1 dakika kalın filtre kağıdı (kurutma filtre kağıdı) ve alt ve üst endplate&#39;lerin boyutları hücre microsieve zarı (10 mikron gözenek boyutu) kesin ve doyana kadar kalsiyum klorür banyosuna koyun. Eğer arzu edilirse, kullanımdan önce, 30 dakika boyunca otoklavda veya ultraviyole ışık ile kalın bir filtre kağıdı ve microsieve membran sterilize edin. </li><li> Ayar kalıp yapısının bir yarısının (alt yarısı). <ol><li> aşağıdaki sırayla birbiri üstüne aşağıdaki öğeleri yerleştirin ve steril bir spatula kullanılarak pürüzsüz: büyük uç plakası, kalın bir filtre kağıdı ve microsieve membran (3 inç x 3 inç olarak). </li><li> Ters çevirin ve aşırı kalsiyum klorür çözeltisinin kaybını sağlamak için kağıt havlu yığını üzerine kalıp basın. </li><li> c üstünde silindirik kuyuları ile &quot;jel oluşumu kalıp&quot; koyunell microsieve zarı ve hafifçe sol ve sağ tarafta bağlayıcı klipleri kullanarak iki tarafta birbirine kalıp tutturmak. Tamamen sonra kuyuları kapsayacak şekilde (in x 3 1.5) üst plak için yeterli odadan emin olun. </li></ol></li><li> Set-up kalıp yapısının ikinci yarısında (üst yarısı). <ol><li> aşağıdaki sırayla birbirlerine tepesinde aşağıdaki öğeleri koyun ve pürüzsüz: küçük uç plakası, kalın filtre kağıdı, microsieve membran. </li><li> Ters çevirin ve aşırı kalsiyum klorür çözeltisinin kaybını sağlamak için kağıt havlu yığını üzerine kalıp bu yarım basın. Şu anda bağlayıcı klipleri kullanarak kalıp bu yarısını tutturmak yok. </li></ol></li></ol></li><li> Kültür hücreleri olarak üreticinin talimatlarına göre önerilir. katmanlı aljinat hidrojeller gömmek için istenen hücreler hasat. Tavsiye hücre yoğunluğu 1 - 2 x 10 6 hücre / mL, ancak bu arzu edilen deneyler bağlı olarak değişebilir. Not: Bu yöntemi kullanırkenfarklı hücre tipleri ile katmanları yapmak için, katman paralel olarak kültür iki hücre tipleri emin olun. Mezenkimal kök hücreler (MSC&#39;ler) 1 x 10 6 hücre bir hücre yoğunluğunda tohumlandı / ml, aşağıdaki protokol için bir örnek olarak kullanılacaktır. gerektiği gibi hücre sayısı ve disk numarası deneyler için ölçeklendirilebilir. <ol><li> Bazal üreme ortamı, 10 ml (Dulbecco Modifiye Eagle ortamı,% 10 fetal sığır serumu,% 2 L-glutamin, 1 5000 hücre / cm2 - bir ya da iki hafta önce 3.000 hücre yoğunluğunda, tohum mezenkimal kök hücreleri gömme T-75 şişelerinde% temel olmayan amino asitler,% 1 penisilin / streptomisin). </li><li> 3 gün ve hücreler, 80 kadar bazal üreme ortamı 10 ml yerine - - her 2 harcanan Ortamı çıkarın% 90 konfluent. </li><li> ilave kalsiyum klorür veya hücreleri durulama magnezyum klorür olmadan 1x Dulbecco&#39;nun fosfat tamponlu tuzlu 3 ml, hücreler hasat harcanan ortamı çıkarın ve pipet için. pipet,% 0.25 Try 3 ml bu çözüm çıkarınT-75 şişelerinde büyüyen hücreler üzerine psin-EDTA ve 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edilir. Bazal büyüme ortamının 9 ml - hücreleri yapışık yüzeyden kaldırılır sonra 6 ekleyin. </li><li> Santrifüj MSC&#39;ler, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 600 x g&#39;de, süpernatanı havalandırın, ve 1 ile yeniden askıya - bazal üreme ortamı, 5 ml. Cihaz yönergeleri kullanarak hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. </li><li> Santrifüj aynı koşullar kullanılarak, toplam hücre yeniden süspanse 1 x 10 6 hücreleri çıkarın ve süpernatant aspire. </li></ol></li></ol> Hücre Tohumlu Aljinat Disklerin 2. oluşumu <ol><li> 1 x 10 6 hücre / ml hücre yoğunluğu elde etmek için steril aljinat / ortam çözeltisi 1 ml hücre pelletini yeniden askıya. Hücreler uygun olarak karıştırıldığı zaman hücre alginat karışımı görünüşte homojen bulutlu olacaktır. </li><li> Pipet kalıbın alt yarısında, altı 6 mm çap x 3 mm uzunluğunda kuyulara hücre alginat karışımı 130 ulkabarcıkları yaratmak için değil, böylece damla damla inşa. Hafif dışbükey menisküsün her bir kenarında üzerinde görünür olmalıdır. </li><li> Dikkatle steril bir spatula kullanarak kalıp yapısının üst yarısını pürüzsüz ve hücre microsieve zarı kuyularının üstünde olacak şekilde, ters çevirin. Kalıp hücresi ve tamamen aljinat karışımı içeren kuyuları kapsayacak şekilde emin olun, kuyu üstüne inşa yerleştirin. </li><li> ortasına bastırarak ederken, yüklenen kalıp yapı kaldırın ve bağlayıcı kalıp yapısının üst ve alt yarılarını tutturmak için kalan iki taraf (alt ve üst) klip. Hücre-aljinat çözümleri güvenli şu anda kuyularda sokuldu edilmelidir. </li><li> Tüm yapı altında olduğundan emin, 102 mM kalsiyum klorür banyosuna bağlanmış kalıp yapı daldırın. 90 dakika için oda sıcaklığında, hücre kültürü kaputu inkübe edin. </li><li> 90 dakika sonunda, 102 mM kalsiyum klorür kalıp yapı kaldırmaHücre kültürü kaputu kağıt havlu yığını üzerinde banyo ve yer. Dört bağlayıcı klipleri çıkarın ve kalıp yapının iki yarısını ayırın. kuyularda oluşan hidrojeller kabarcıkları olmamalıdır ve tamamen kuyu doldurmalıdır. </li><li> Bir spatula kullanarak, dikkatli dikkatli gevşetin ve hidrojeller dışarı kama hidrojeller içeren kuyuların kenarına iz. Kalıp yapısı arasında hidrojeller ayrılmasından sonra, doğrudan kalsiyum klorür ve magnezyum klorür ile 1x Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu bir banyo içine hidrojeller bırakın. 5 dakika - 1 için aşırı kalsiyum klorür solüsyonu yıkayın tamamen jelleri örtün. </li><li> Tamamen hidrojeller kapsayan arzu edilen çanak bazal büyüme ortamı çözeltisine (örn., 6 havuzlu plakalar) içine hidrojeller aktarın. 37 ° C&#39;de hücre kültürü inkübatöründe en az 1 saat% 5 katman adımına devam etmeden önce CO2 inkübe edin. Not: hücreleri ihtiva eden hidrojeller tutulabilir3 gün - başka hücre popülasyonu ile jellerin katman kadar şu anda süresiz hücre kültür inkübatör medya değişiklikleri her 2 tamamlamış olması şartıyla, arzu edilir. </li></ol> Aljinat Disklerin 3. Katmanlama <ol><li> 1 saat inkübasyon son yarım saat süresince, toplamak ve jeller tavlamak için steril kalıpları ve solüsyon hazırlanır. <ol><li> x (bir plak için 3 (alüminyum levha içinde x 3 a 3 6 mm çap x 1.5 mm uzunluğunda kuyu) &quot;jel oluşumu kalıp&quot; yüksekliğinin kuyu yarısı olan bir kalıp sıkarak &quot;kesme kalıp&quot; hazırlayın sağ ve sol tarafta bağlayıcı klipleri kullanarak alüminyum levha 3). </li><li> x ((alüminyum levha içinde x 3 a 3 9 mm çap x 3 mm boyunda kuyu) bir plak için &quot;jel oluşumu kalıp&quot; den çapı 3 mm daha geniş bir kalıp sıkarak 3 &quot;tavlama kalıp&quot; hazırlayın sağ ve sol tarafta bağlayıcı klipleri kullanarak alüminyum levha 3). </li><li> ihtiva eden bir çözelti hazırlayın100 mM sodyum sitrat / 30 mM EDTA, steril su içinde (sodyum sitrat dihidrat, etilendiamintetraasetik asit tetrasodyum tuzu dihidrat). </li></ol></li><li> istenen hücre popülasyonlarının jeller çıkarın (bu örnekte, iki hMSCs diskleri) çanak ortamdan ve &quot;kesme kalıbı&quot; kuyu içine koyun. Her jel kalıp üzerinde çıkıntılı jel yarısı ile kuyu içine rahatça oturmalıdır. </li><li> Bir neşter kullanılarak, kalıp yüzeyi boyunca jel (Bu devre hidrojel kesecek) dilim. jel üst yarısını çevirmek ve açık kalıp kuyunun içine yerleştirin. jel yarısı da iyi kalıp içine rahatça sığacak, ancak şimdi her iki yarım jeller görünür kesilmiş iç yüzeyi ile kalıp yüksekliği olmalıdır. İkinci jel ile tekrarlayın. Not: Uyarı: Yalnızca iç kesim yüzeyleri katmanlı diskleri oluşturacaktır. Dış yüzeyler kullanılarak yarıları ayırma neden olur. Bu jel yüzeyi önlemek aktarılır microsieve membrandan bu doku şüphesiTavlama işleminin başarısı. </li><li> microsieve membran tavlanabilir jel yarılarının her temas halinde olduğundan emin olduktan ve tamamen bunları kapsayan, kuyu üzerine kuru hücre microsieve membranın bir parça yerleştirin. tamamen jelleri kapsayacak şekilde emin olun, microsieve membran üstüne kalın filtre kağıdı yerleştirin. </li><li> Bu doyana kadar kalın filtre kağıdı üzerine, 100 mM sodyum sitrat / 30 mM EDTA (sodyum sitrat dihidrat, Etilendiamintetraasetik asit tetrasodyum tuzu dihidrat) çözeltisi Pipet. Yaklaşık 750 | il dört kuyu için yeterlidir. </li><li> Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca jeller inkübe edin. Sonra, hücre microsieve zarı ve kalın filtre kağıdı çıkarın ve atın. bağlayıcı klipleri çıkarın ve kalıp açın. </li><li> Her tavlı jel, kesme yüzeyi yukarı bakacak şekilde hazırlanan &quot;tavlama kalıp&quot; olarak hidrojel bir sodyum sitrat / EDTA ile muamele edilmiş yarısını aktarın. Bu tavlanmış Kat yarısı olacakdürme. </li><li> kesim yüzeyi olduğunu bu yüzden ikinci yarı jel saygısız, zaten &quot;tavlama kalıp&quot; olarak jel üzerine (bir farklı hücre tipi içerebilir) spatula, asansör kullanma ve ikinci sodyum sitrat / EDTA ile tedavi edilen yarı jel yerleştirin zaten &quot;tavlama kalıp&quot; olarak jel kesim yüzeyi ile temasa geçin. </li><li> hafifçe aşağı iki jeller arasındaki kabarcıklarını çıkarmak için bir spatula kullanarak iki jeller basın. birbirlerinin üstüne doğrudan olduğundan emin olmak için gerekli olarak da, j eller yerleştirin. </li><li> Yavaşça &quot;tavlama kalıp&quot; kaldırma ve 30 dakika boyunca 102 mM kalsiyum klorür banyosu içinde daldırın. Bir plak ile kuyu örtmeyin. </li><li> 30 dakika inkübasyondan sonra, &quot;tavlama kalıp&quot; kaldırmak ve kağıt havlu üzerine koyun. bağlayıcı klipleri çıkarın ve plak kalıp ayırın. </li><li> tavlanmış jeller toplamak ve kalsiyum klorid ve M ile bir 1 x Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin içine yerleştirin, spatulaagnesium klorür banyo jelleri yıkamak. Daha sonra, arzu edilen bir çanak hücre kültür ortamına tavlanmış hidrojeller transferi (örneğin., 6-yuvalı plaka) kültür. </li></ol>

<ol>
	<li>Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Basic+Science+of+Articular+Cartilage.">The Basic Science of Articular Cartilage.</a> Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).</li><li>Neidlinger-Wilke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+loading+of+the+intervertebral+disc:+from+the+macroscopic+to+the+cellular+level.">Mechanical loading of the intervertebral disc: from the macroscopic to the cellular level.</a> Eur. Spine J. 23 (3), 333-343 (2013).</li><li>Klein, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+of+stratified+articular+cartilage+from+chondrocyte+subpopulations.">Tissue engineering of stratified articular cartilage from chondrocyte subpopulations.</a> Osteoarth. Cartilage. 11 (8), 595-602 (2003).</li><li>Han, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+Grafts+for+Articular+Cartilage+Defects.">Scaffold-free Grafts for Articular Cartilage Defects.</a> Clin. Orthop. Relat. R. 466 (8), 1912-1920 (2008).</li><li>Ng, K. W., Ateshian, G. A., Hung, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zonal+chondrocytes+seeded+in+a+layered+agarose+hydrogel+create+engineered+cartilage+with+depth-dependent+cellular+and+mechanical+inhomogeneity.">Zonal chondrocytes seeded in a layered agarose hydrogel create engineered cartilage with depth-dependent cellular and mechanical inhomogeneity.</a> Tissue Eng. A. 15 (9), 2315-2324 (2009).</li><li>Ng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+layered+agarose+approach+to+fabricate+depth-dependent+inhomogeneity+in+chondrocyte-seeded+constructs.">A layered agarose approach to fabricate depth-dependent inhomogeneity in chondrocyte-seeded constructs.</a> J. Orthop. Res. 23 (1), 134-141 (2005).</li><li>Nguyen, L. H., Kudva, A. K., Saxena, N. S., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+articular+cartilage+with+spatially-varying+matrix+composition+and+mechanical+properties+from+a+single+stem+cell+population+using+a+multi-layered+hydrogel.">Engineering articular cartilage with spatially-varying matrix composition and mechanical properties from a single stem cell population using a multi-layered hydrogel.</a> Biomaterials. 32 (29), 6946-6952 (2011).</li><li>Leone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+multilayered+composite+hydrogel+as+osteochondral+substitute.">Continuous multilayered composite hydrogel as osteochondral substitute.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 103 (8), 2521-2530 (2015).</li><li>Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+catalyze+cartilage+formation+by+neonatal+articular+chondrocytes+in+3D+biomimetic+hydrogels.">Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels.</a> Sci. Rep. 3, (2013).</li><li>Vigf&#250;sd&#242;ttir, &. #. 1. 9. 3. ;. T., Pasrija, C., Thakore, P. I., Schmidt, R. B., Hsieh, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Pericellular+Matrix+in+Mesenchymal+Stem+Cell+Deformation+during+Chondrogenic+Differentiation.">Role of Pericellular Matrix in Mesenchymal Stem Cell Deformation during Chondrogenic Differentiation.</a> Cell. Mol. Bioeng. 3 (4), 387-397 (2010).</li><li>Lee, C. S. D., Gleghorn, J. P., Won Choi, N., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+layered+chondrocyte-seeded+alginate+hydrogel+scaffolds.">Integration of layered chondrocyte-seeded alginate hydrogel scaffolds.</a> Biomaterials. 28 (19), 2987-2993 (2007).</li><li>Gleghorn, J. P., Lee, C. S. D., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+properties+of+laminated+alginate+gels+for+tissue+engineering+of+layered+structures.">Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 85 (3), 611-618 (2008).</li><li>Gharravi, A. M., Orazizadeh, M., Ansari-Asl, K., Banoni, S., Izadi, S., Hashemitabar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Fabrication+of+Anatomical+Bioreactor+Systems+Containing+Alginate+Scaffolds+for+Cartilage+Tissue+Engineering.">Design and Fabrication of Anatomical Bioreactor Systems Containing Alginate Scaffolds for Cartilage Tissue Engineering.</a> Avicenna J. Med. Biotechnol. 4 (2), 65-74 (2012).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Three-Dimensional+Alginate+Gels.">Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells in Three-Dimensional Alginate Gels.</a> Tissue Eng. A. 14 (5), 667-680 (2008).</li><li>Yeatts, A. B., Gordon, C. N., Fisher, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+an+aggregated+alginate+construct+in+a+tubular+perfusion+system.">Formation of an aggregated alginate construct in a tubular perfusion system.</a> Tissue Eng. C, Methods. 17 (12), 1171-1178 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada, örneğin, örneğin, fizyolojik olarak tabakalı dokularda olanlar, kıkırdak gibi çeşitli hücre popülasyonlarının, ko-kültürlere Katmanlı aljinat hidrojel disklerin oluşturulması için bir protokol açıklar. Bu tarif edilen, kültür platformu olarak tabakalı yapılar, aynı kültür ortamı ya da yük altında maruz iki farklı hücre popülasyonlarının arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılabilir. Aljinat biyolojik olarak uyumlu olduğu bulunmuştur ve başarılı bir şekilde kıkırdak biyoloji ve doku mühendisliği araştırma 12,14 kullanılmaktadır anyonik lineer polisakkarittir. Aljinat hidrojeller, çapraz bağlama için iki değerlikli katyonlar kullanılarak oluşturulur, örneğin., Kalsiyum iyonları. Bu çapraz bağlar, örneğin sodyum sitrat veya EDTA gibi bir şelatör kullanılarak katyonları kaldırarak geri alınabilir, ve bu süreç jeller 3,4,12 içinde kültürlenmiştir kondrositler izole edilmesi için, daha önce kullanılmıştır. Benzer şekilde, aynı prensipde başarıyla bilayers veya aljinat boncukları bir araya 11,12,15 hatta kümeler halinde aljinat sayfaları yapıştırılması için uygulanmıştır. Burada tarif edilen bir platform aynı sürecine dayanır, ama küçük disk şeklinde tabakalı hidrojeller oluşturmak için kullanılır. Bu, ilk, alginat diskler bir kalsiyum açısından zengin banyosuna daldırılmış kalıpları kullanılarak oluşturulmuş olan bir iki aşamalı bir işlemdir. Bunlar daha sonra yarım dilimlenmiş ve yerel olarak çapraz bağlanmış alginat, kalsiyum iyonlarını serbest bırakmak için bir kalsiyum kenetleme çözeltisi ile muamele edilir. Birlikte, bu muamele edilmiş yüzeylerin yerleştirilmesi ve bir kalsiyum bakımından daha zengin bir diskleri yeniden daldırma ile, çapraz bağlar iki katmanlı yapılar yapmak yenilenmiş. Böylece çoğu zaman değerli hücrelerin atık yanı sıra imalat malzemeleri en aza indirerek, Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi bu küçük katmanlı jeller, biyopsi yumruk gibi mekanik test olarak deneyleri ve deneyler ile uyumlu kolay kültüre örnekleri oluşturmak için gereksinimini ortadan kaldırır. Da gösterildiği gibiKontrol veya toplu hidrojeller Bu prosedür aşırı ilave etme besin uzunluğu ve olmamasına rağmen hücre popülasyonuna vergi değil gösteren Şekil 3, biçimlendirilmiş ve hidrojeller katmanlama bu işlem benzer şekilde yüksek canlılığı ile sonuçlanmıştır. jel bir başlangıç ​​örtüşen bölgede eksikliği ilk ko-kültür ve zamanla bu arayüzü değişiklikleri gözlemlemek için yeteneği sırasında fiziksel ayrılık sağlar. Çalışmalar uzun kültür süreler boyunca bu arayüz sayesinde hücresel çapraz infiltrasyonu ve hücre dışı matriks birikimi 11 tanımını kaybedebilir olduğunu göstermiştir. hücre dışı matris yatırılır olarak temel katmanlı disk, bir adezyon molekülü ihtiva etmese de, aynı zamanda hücre popülasyonlarının birleştirilmesi ve tabakalar arasında değişen bir arayüz araştırmak için bir potansiyel bulunmaktadır. Bu iki katmanlı diskler dinamik kompresyon uyarılması için rahatlıkla kullanılabilir. Biz thes onaylamak için başardıkE hidrojel yarısı ayrılması olmadan dinamik sıkıştırma dayanacak. Bununla birlikte, bu işlem sırasında, dört saatlik döngüsel sıkıştırma sırasında tabakalı hidrojeller tarafından sergilenen tepe yük, hidrojeller tabakalı olmayan, toplu önemli ölçüde farklı olduğu bulunmuştur. Planlanırken Bu sonuç, örneğin., Her katmanda aynı hücre popülasyonu / koşulu ile iki katmanlı hidrojel, önemli bir ayrıntı dikkat, katmanlar arasındaki karmaşık, doğrusal olmayan gerilme transferi önerir ve fiziksel katmanlı kontrol jeli için bir ihtiyaç ortaya koymaktadır mekanik yükleme ile ilgili çalışmalar için deneysel tasarım. gözlenen farklılıkların daha iyi anlaşılması bu jellerin içinde mekansal mekaniğinin sayısal modelleme yoluyla elde edilebilir. Sadece bu tür analizler tabakalar arasındaki gerilme dağılımı ve transfer açıklamak yardımcı olacağını, ama aynı zamanda, özellikle mekanik özellikleri değişen katmanları ile, bu katmanlı jeller hücresel davranışı yorumlamak için vesile olacaktır. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Bu tarif edildiği gibi ko-kültür sırasında hücre popülasyonlarının fiziksel ayrılması için kullanılabilecek bir çok yönlü bir kültür sistemi olup. Ayrıca, aynı zamanda daha da geliştirilmesi için bir taban yapısı olarak kullanılabilir. Mevcut yapıya değişiklikler, katmanların sayısı arttırıldığında boyutları veya tabakaların göreli sertliğinin değiştirilmesi, ve tabakaların bir ya da daha fazlası içine, ek hücre dışı matris bileşenleri içeren içerebilir. Ancak, bu açılımlar dikkatli değerlendirme gerektirir. diskler içinde güçlerinin dağılımında değişiklikler, boyutu ve katman sayısı arttırıldığında ek olarak, mekanik uyarılması sırasında jeller ve fiziksel kararsızlık merkezinde hücre canlılığı düşüşlere neden olabilir. Ayrıca, hücre dışı matriks ve jel oluşumu ve tavlama süreçleri engel olabilir yapışma kısımlarını sağlamak için aljinat proteinleri veya değişiklik uyarıcı büyük eklemeler. Bu kültür platformu wa3D kültür farklı hücre popülasyonları arasındaki ilişkileri araştıran araştırma uygulamaları için geliştirilen s. Bu nedenle, klinik uygulamalar için ölçeklenebilirlik eksikliğine ile sınırlıdır. Böyle 3D baskı gibi tabakalı hidrojeller oluşturmak için alternatif yöntemler, sonuçta nedeniyle gelecekte beklenen ölçeklenebilirlik gelişmelere, disk iç mikro üzerinde kontrol ve macroscale geometrik özellikleri customizability daha klinik olarak anlamlı olabilir. araştırma uygulamaları için, burada gösterildiği gibi, alginat diskler birbirinden bağımsız hücre türlerine uygulanmasını kısıtlayabilecek hücreleri için yapışma kısımları sağlamaz. kullanım kolaylığı göz önünde benzer sınırlamalar muzdarip olan, agaroz olduğunda karşılaştırılabilir alternatif aljinat için. Bundan başka, bu aljinat çapraz bağlar güvenli kalsiyum kenetleme maddeleri kullanılarak temizlenebilir ise, alt analizi için hücreler serbest bırakmak için enzimlerin kullanımını gerektirir. Öncelikle, bu kültür platformu understandi iyileştirilmesi ile yardımcı olacaktırHücre hidrojellerin popülasyonlar ve potansiyel bu ko-kültür mekanik stimülasyon etkileri arasındaki ilişkilerin ng. Bu anlayış, sonra heterojen dokular için tedavilerin gelişimini bilgilendirmek özellikle eklem kıkırdağı veya intervertebral diskler olarak taşıyan dokuları yükleme olacaktır.

Böyle eklem kıkırdağı veya intervertebral diskleri gibi sıkıştırma yükü taşıyan dokular dokuda hem biyomekanik fonksiyon ve uygun mekano-iletimi için kritik olan heterojen doku bölgeleri oluşur. Sadece hücresel organizasyonu ve farklı bölgelerde farklı işlev, ancak hücre dışı matris (ECM) ayrıca kompozisyon ve organizasyonda çeşitlidir. Örneğin, eklem kıkırdağı değişen hücre morfolojisi, mekanik fonksiyon ve ECM ile üç birincil bölgeler oluşur. Yük taşıyan sorumlulukları diferansiyel kendi ECM kurşun farklılıklar; Orta ve derin bölgeler sıkıştırma 1 yanıt esas hesap ise yüzeysel bir tabaka esas olarak, yük germe cevap yer almaktadır. Benzer bir şekilde, intervertebral disk, jel benzeri bir çekirdeği pulposus katmanlı bir halka fibrozis ile çevrilidir ve bu iki farklı alanlarda hücreler biyofiziksel uyarıcıların farklı deneyimDoku maruz ve mekanik kuvvetlere yanıt olarak, 2., Doku tabakaları içinde dokular, hücreler ve hücre-dışı matrisler Bu tip birbiriyle etkileşime girer. Böyle heterojen doku yapılarının Rekapütülasyon doku mühendisliği ve rejeneratif tıpta bir sorun olmaya devam etmektedir, ve biyolojik önemi anlayışımız sınırlıdır. Bir yapının farklı hücre popülasyonlarının tabakalı dokular yanı sıra ko-kültürler analiz etmek için platformlar kültürlenmesi için bir ihtiyaç vardır. Eklem kıkırdak doku mühendisliği, iskele-az katmanlı yapılar bu dokuda 3,4 farklı katmanlarını taklit etmek çeşitli ECM yatırmak için bölgesel kondrositlerin yeteneği yararlanarak inşa edilmiştir. Ancak, katmanlı hidrojel yapıları bağımsız sağlam dokuyu oluşturmak için yeteneğinden yoksun hücre popülasyonlarının farklı tipleri etkileşimini araştırmak için bir fırsat sağlar. Örneğin, farklı popmezenkimal kök hücrelerin ulations katmanlı yapıları içinde birlikte yetiştirilebilir. Böyle katmanlı iskeleleri kondrosit ve gelişmiş doku mühendisliği için 5 mezenkimal kök hücrelerin ayırt hem kullanılmıştır. Sadece farklı hücre popülasyonu içindeki hidrojel tabakaları kültürlenen-co, ancak tek bir hücre tipi, aynı zamanda hücre 6,7 farklı yanıtlar ortaya çıkarmak için çeşitli sertlik veya biyokimyasal içeriğe sahip manipüle edilmiştir tabakalar içinde kültürlenebilir. Birçok farklı biyo materyal hidrojeller, örneğin polietilen glikol veya poli vinil alkol bazları 7-9 kullananlar gibi kıkırdak doku mühendisliği için hücre popülasyonlarının katman kullanılmaktadır. Ancak, aljinat hidrojeller ko-kültür heterojen hücre popülasyonlarının eğitim için katmanlı iskeleleri oluşturmak için basit biyomalzeme biridir. agaroz hidrojeller de kolayca oluşurken, aljinat hidrojeller kolay izin yararı vartek tek hücrelerin analizi için 3-D yapısının bir hücre olation önce 10 tarif edildiği gibi. Daha önceki çalışmalarda, iki tabakalı aljinat hidrojellerin ince tabakalar halinde oluşmuş ve bu levhalar, kesitler dilimlenmiş (örn., Bir biyopsi yumruk kullanarak) bu tür biyokimyasal içerik veya arayüzey kayma özelliklerinin 11,12 analizi için olduğu gibi özel uygulamalar için. İnce aljinat tabakaların oluşturulması için bir diğer yöntem, çoklu katmanlar içine sınıflandırması için potansiyel olarak tarif edilmiştir, ama yine de, mekanik test 13 kullanım için hidrojel değişiklik gerektirir. Burada, tekrarlanabilir hücrelerinin ko-kültür farklı popülasyonlarda kullanım için çift tabakalı alginat hidrojel diskler yaratmak için bir yöntem sunulmaktadır. Bu aljinat disk platformu birkaç avantajlara sahiptir. Öncelikle, tekrarlanabilir şekli ve küçük boyutlu bir biyopsi pu gerektirmeden gömülü hücrelerin mekanik uyarılması için elverişlinch veya birçok uygulama için hidrojel diğer fiziksel değişiklik. Buna ek olarak, hücre canlılığı, tabaka oluşturma süreci sırasında yüksek kalır ve jel oluşumu sonrası jel içinde iki hücre popülasyonlarının arasında net bir ayrım: ilk üst üste bölgesi ile görülebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="808">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Alginic Acid sodium salt</td>
			<td style="width:180px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1112</td>
			<td style="width:295px;">Solution made in wt% using DPBS (-/-)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">1x Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (-/-)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">1x Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (+/+)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11965</td>
			<td>Example. Use desired medium type</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Syringe Filters (0.02um Nylon)</td>
			<td style="width:180px;">FisherBrand</td>
			<td style="width:119px;">0979C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">BP510</td>
			<td>Prepare solution in sterile water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Criterion Blotter Filter Paper</td>
			<td style="width:180px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1704085</td>
			<td>Cut to size of endplates for mold formation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Cell Microsieve Membrane (10um pore size)</td>
			<td style="width:180px;">Biodesign Inc of New York</td>
			<td style="width:119px;">N10R</td>
			<td>Cut to size of endplates for mold formation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">0.25% Trypsin-EDTA (1x), phenol red</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">25200</td>
			<td>Thaw in 37&#7506;C water bath</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium citrate dihydrate</td>
			<td style="width:180px;">FisherScience</td>
			<td style="width:119px;">S93364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td style="width:180px;">FisherBioreagent</td>
			<td style="width:119px;">BP121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">26140</td>
			<td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Penicilin/Streptomycin (10000 U/ml)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">15140</td>
			<td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">L-Glutamine (200mM)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Non-essential Amino Acids (100x)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11140050</td>
			<td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

layered alginate constructs: a platform for co-culture of heterogeneous cell populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Şekil 1 aljinat hidrojellerin oluşumunu ve katmanlarını gösteriyor. Bu hidrojeller ve tabakalı, yüksek ve dökme hidrojeller karşılaştırılabilir kalır içinde gömülü insan mezenkimal kök hücrelerin Şekil 2. Hücre canlılığı) &#39;de gösterildiği gibi, Şekil 3&#39; de gösterildiği gibi, hücre popülasyonlarının tam bir başlangıç ​​ayrılma göstermez iki katmanlı jeller tamamlandı. Canlılık değerlendirildi tavlama sonrası, ardından merkezi erişmek için dikey jelleri dilimleme ve Ethidium homodimer-1 üreticinin talimatlarına kullanarak bir canlı hücre izci, CMFDA (yeşil) ve ölü hücreleri (kırmızı) ile tavlanmış jeller canlı hücrelerin boyanması. Konfokal Z yığınları yaklaşık 100 um jele, bir floresans mikroskobu kullanılarak kesme yüzeyinin alınmıştır. Bu görüntüler bir 2B görüntü içine tahmin edildi. Canlı ve ölü hücreler daha sonra vardı ImageJ yazılım parçacık analizörü özelliğini kullanarak sayısal. <p<html> fo class = &quot;jove_content&quot;: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Bu katmanlı hidrojeller, hücrelerin eksik, bir kondrojenik tepkiye yol için gerekli benzer halkalı sıkıştırma, dayanabilmesi olacağını doğrulamak istedi. % 10 suşu - Bu hidrojeller 0 ila 1 Hz, 4 saat süre ile kültür ve daha sonra serbest siklik sıkıştırma yedi gün sonra bozulmadan kalır tespit ettik. Ancak, her çevrimde pik stres izole ve dört saatlik uyarılması üzerine eğilimleri analiz ettikten sonra, eğilimler katmanlı hidrojeller toplu olmayan katmanlı, hidrojeller ile karşılaştırıldığında halkalı sıkıştırma farklı bir tepki olduğunu göstermektedir. Döngüsel sıkıştırma dört saatten katmanlı ve non-katmanlı jeller (Şekil 4) arasında anlamlı farklılık (p = 0.03) zirve stres eğilimleri sonuçlandı. İstatistikler Student T-testi (alfa = 0.05) kullanılarak tamamlanmıştır. jpg &quot;/&gt; Şekil 1:. Katmanlı Hidrojel Oluşumunun şematik A. alt ve üst kalıp yarımları için yığın sırasının bir tasviri ile% 2 aljinat + hücre karışımının eklenmesi için yığılmış kalıp resmi. B. şematik jel katman için prosedürü tasvir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54380/54380fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54380/54380fig2.jpg" /> Şekil 2:. Katmanlı hidrojel model hücre çizgisi 293FT HEK hücreleri hücre popülasyonlarının Örnek ayrılması, ya canlı hücre izleyici CMFDA (yeşil) veya CMTPX (kırmızı) ile boyanmıştır. (Ağırlık / hacim) alginat diskler, ve daha sonra bu disklerin yarıları birlikte katmanlı edilen bu hücre gruplarının her biri% 2 içine gömülmüştür. Bir parça görüntüleme sırasında tanımlamak için CMTPX taraftan kesildi. Ölçek çubuğu = 100 &amp; #181;. M <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54380/54380fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54380/54380fig3.jpg" /> Şekil 3:. İşlem tamamlandığında Katmanlama sonra Katmanlı hidrojel içinde yüksek hücre viyabilitesi dökme ve iki tabakalı hidrojeller gömülü insan mezenkimal kök hücrelerin canlı hücre (yeşil) izleyici CMFDA ve ölü hücreler (kırmızı) ile boyandı Etidyum homodimer-1 ile boyanmıştır . Canlılık katman işleminden sonra hem hidrojel gruplar için yüksek kaldı. Ölçek çubuğu = 100 mikron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54380/54380fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54380/54380fig4.jpg" /> Figür., e 4: Siklik Sıkıştırma Katmanlı Hidrojel Siklik Sıkıştırma Tepki önemli ölçüde farklı akım hidrojeller, yedi gün boyunca, bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edildi ve daha sonra, 0 tabi tutuldu - 1 Hz, dört saat süre ile,% 10 serbest siklik sıkıştırma. her döngüsü için pik gerilimler (± SEM) izole edildi ve yükleme dönemi boyunca trendleri analiz edildi. 0 dan serbest halkalı sıkıştırma altında Eğilimler - katmanlı (n = 9) ve toplu için% 10 suşu (n = 8) jeller (p = 0.03) önemli ölçüde farklıdır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54380/54380fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations at JoVE.com

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

Katmanlı Aljinat Yapıları: Heterojen hücre popülasyonlarının Co-kültür için bir platform

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

layered-alginate-constructs-platform-for-co-culture-heterogeneous

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.8K Görüntüleme.  University of Maryland. Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct. 

Video: Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Farklı soy İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) Yayılması ve Farklılaşma için 3D Platformu olarak aljinat Mikrokapsül

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Biyomühendislik

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Sulu İki fazlı sistemler kullanma Hücre Co-kültür desenlendirme

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (&ge;105) in milliliter-scale volumes (&ge;0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 - 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 - 20 &mu;l). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries ("cell perfusion chambers"), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with "transfer" microcapillaries ("central hub"), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.

We have developed an automated cell culture and interrogation platform for micro-scale cell stimulation experiments. The platform offers simple, versatile, and precise control in cultivating and stimulating small populations of cells, and recovering lysates for molecular analyses. The platform is well suited to studies that use precious cells and/or reagents.

Mikro ölçekli Hücre Stimülasyon deneyler için Çok Yönlü Otomatik Platformu

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Sağlam, mikroakışkan Hücre içi Delivery Platform olarak hücre Sıkma

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Doku Mühendisliği: Katmanlı Hücre Sheets teslimi için bir Multisellüler 3D İskele İnşaatı

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have contributed dramatically to the understanding of basic mechanobiology. These techniques have been extensively used to demonstrate how the onset and progression of various diseases are heavily influenced by mechanical cues. This article presents a multi-functional biaxial stretching (BAXS) platform that can either mechanically stimulate single cells or quantify the mechanical stiffness of tissues. The BAXS platform consists of four voice coil motors that can be controlled independently. Single cells can be cultured on a flexible substrate that can be attached to the motors allowing one to expose the cells to complex, dynamic, and spatially varying strain fields. Conversely, by incorporating a force load cell, one can also quantify the mechanical properties of primary tissues as they are exposed to deformation cycles. In both cases, a proper set of clamps must be designed and mounted to the BAXS platform motors in order to firmly hold the flexible substrate or the tissue of interest. The BAXS platform can be mounted on an inverted microscope to perform simultaneous transmitted light and/or fluorescence imaging to examine the structural or biochemical response of the sample during stretching experiments. This article provides experimental details of the design and usage of the BAXS platform and presents results for single cell and whole tissue studies. The BAXS platform was used to measure the deformation of nuclei in single mouse myoblast cells in response to substrate strain and to measure the stiffness of isolated mouse aortas. The BAXS platform is a versatile tool that can be combined with various optical microscopies in order to provide novel mechanobiological insights at the sub-cellular, cellular and whole tissue levels.

We present in this article a novel stretching platform that can be used to investigate single cell responses to complex anisotropic biaxial mechanical deformation and quantify the mechanical properties of biological tissues.

Hücre ve Doku mechanobiology Applications A Novel Germe Platformu

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

Üç Verici Kartezyen Yazıcı Kullanımı Bioprinted Hücresel Yapıların Canlılık

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

We describe a set of protocols that together provide a tissue-mimicking hydrogel bioink with which functional and viable 3-D tissue constructs can be bioprinted for use in in vitro screening applications.

Bioprinting cellularized dokuya özel Hidrojel Bioink kullanılarak dahil edilmesi

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet encapsulation has been studied extensively as a means to increase islet survival in allogeneic or xenogeneic transplants. Alginate encapsulation is commonly achieved by nozzle extrusion and external gelation. Using this method, cell-containing alginate droplets formed at the tip of nozzles fall into a solution containing divalent cations that cause ionotropic alginate gelation as they diffuse into the droplets. The requirement for droplet formation at the nozzle tip limits the volumetric throughput and alginate concentration that can be achieved. This video describes a scalable emulsification method to encapsulate mammalian cells in 0.5% to 10% alginate with 70% to 90% cell survival. By this alternative method, alginate droplets containing cells and calcium carbonate are emulsified in mineral oil, followed by a decrease in pH leading to internal calcium release and ionotropic alginate gelation. The current method allows the production of alginate beads within 20 min of emulsification. The equipment required for the encapsulation step consists in simple stirred vessels available to most laboratories.

This video and manuscript describe an emulsion-based method to encapsulate mammalian cells in 0.5% to 10% alginate beads which can be produced in large batches using a simple stirred vessel. The encapsulated cells can be cultured in vitro or transplanted for cellular therapy applications.