This work was funded by a New Faculty Award II from the California Institute of Regenerative Medicine (CIRM; RN2-00921-1), NIH-funded National Research Award (F32-HL104924), and CIRM Training Grant (TG21163). Materials were provided by: Glycosan Biosystems Inc / BioTime and Dr. Stephen Badylak (University of Pittsburgh)

PNIPAAMコーティングされたプレートの1。作成<ol><li> 60％トルエン/ 40％ヘキサン溶液2ml中のPNIPAAmを2.6g溶解する。 </li><li> PNIPAAMが溶解するまで、撹拌を10分間60℃に混合物を加熱する。 </li><li>ブフナー漏斗中の直径60mmの円と場所紙にろ紙をカット。 </li><li>予め秤量したガラスビーカーにブフナー漏斗を通して溶液を濾過（ヘキサンは、プラスチックを溶かすように、プラスチックを使用しないでください）​​。 </li><li>ベル真空（24 psi）でO / N（16時間）にビーカーと内容を配置します。注：残留物をイソプロピルと反応させるまでは、それが酸素と接触しないことを確認しますので、酸化する。 </li><li> PNIPAAMの重量を確立するためにビーカーを秤量する。 </li><li> w / w溶液50:50の作成、のPNIPAAmにイソプロピルアルコールを追加します。 </li><li> UV光の下で組織培養プレートの表面に溶液2mlを置き、5分間コート。 </li><li>二回温PBS 2mlでプレートを洗浄し細胞培養に使用する前に。 </li></ol>細胞シートの2。作成注：標的器官の一次細胞の細胞シートは、多数の異なる方法を使用して作成することができ、または、ここで説明したように、熱応答性ポリマーを用いて組織培養表面をコーティングすることにより。プリコーティングされた感熱プレートはまた、多くのベンダーによって提供されています。 注：このプロトコルは、35mmディッシュを用いて培養するためのものである。簡単に述べると、細胞をまず、隣接セル間の横方向の接続を確立するためにコンフルエンスで24時間、最低37℃でインキュベートする。細胞シートを解放するために、プレートは32°C以下の温度にさらされる。細胞シートは、その後、血管内皮細胞と血管新生許容ヒドロゲルを含む強塩基繊維マトリックスに転送される。 <ol><li>細胞集団を分離します。注：この方法は、個別の導出手順や細胞の種類に依存している。ラットの大動脈平滑ムーSCLE細胞（RASMC）は、この例で使用されている。これらは、ラットの腹部大動脈から単離した初代平滑筋細胞である。 </li><li>温かい2mlのPBSで細胞を洗浄する。 </li><li> 5分間、細胞にトリプシン（または他の切断/解離溶液）3mlのを追加します。 </li><li> 10％ウシ胎児血清（FBS）を含む培地、またはリン酸緩衝溶液（PBS）を3mlの添加によりトリプシンを阻害する。 </li><li>円錐管中の細胞を収集し、アリコートを数える。 </li><li> 5分間1000rpmで（228×g）で細胞をスピン。 </li><li>上清を吸引し、その増殖培地中で細胞を再懸濁（SmGM2プラス弾丸キット培養液をRASMCに使用されます）。 </li><li> 100％コンフルエンスを達成する濃度でPNIPAAM塗装板 - 35mmの感熱プレート上の細胞を含む培地を配置します。注：のRASMCの場合その数は/ cm 2の 100,000個の細胞であると決定された。しかし、通過中の細胞の喪失に起因し、そのバージニア州の120％<html> LUEが使用されます。 </li><li> 37℃のCO / Nにおけるインキュベーターに置きます。注意：プレートへの細胞接着を維持するために、37℃で細胞を維持することが重要である。 </li></ol>ファウンマトリックスの調製注：さまざまな3D繊維状マトリックスは、繊細な細胞シートとの間に強い繊維状マトリックスの層に使用することができる。いくつかの例には、これらの研究に使用ゲルフォーム、バイオガラス、天然の無細胞化材料26またはnanospun材料27,28ブタ膀胱マトリックス（UBM）は寛大に私たちの共同研究者、博士Badylakから提供された29。 <ol><li>使用前に、脱細胞化マトリックスが使用される場合、細胞内容物の欠如を含むマトリックスの特性を決定し、27,28、細胞特異的生存率、および空隙22 </li><li>所望のサイズおよび形状に予め滅菌行列をカット。注：ここでは、ホールパンチが4mmの直径の円を切断するために使用される。 </li></ol>ve_title &quot;&gt; 4。新生血管許容的ヒドロゲルに内皮細胞を播種注：内皮細胞は幹細胞または前駆細胞からの分化を含む多様な供給源から得ることができる。ここで、HUVECを使用している。 <ol><li>架橋時間がある限り、任意の許容性ヒドロゲル（フィブリン、コラーゲンゲル）を使用して、細胞が生存留まるように十分に短い。注：ここでは、ジスルフィド架橋で架橋されたヒアルロン酸（HA）ベースのゲルが使用される。 </li><li>会社のプロトコルに従って、HAハイドロゲルを準備します。 </li><li>内皮細胞を回収し、1×トリプシンを用いて、単一細胞溶液中に分散。注：のAccutaseまたは細胞解離緩衝液はまた、単一の細胞分散のために使用することができる。 </li><li> 15ミリリットルの円錐チューブに溶液/細胞を回収、PBSでFBS（これは、細胞が血清に接触しないことが重要である場合）、大豆トリプシン阻害剤の等量を用いて、トリプシン酵素を失活または10％。 </li><li> C言語細胞をount、パッチ寸法（以前に定量化）するために必要な体積を計算する。注：4mmのパッチについては、こちらを200万内皮細胞が使用される。 </li><li> 200万細胞を抽出し、新たな15ミリリットルコニカルチューブに入れる。 </li><li> 5分間（228×g）でスピン。 </li><li>コニカルチューブ中のペレットとして細胞を残し、上澄み液を吸引。 </li><li> 1比：1でHAとゼラチン液体材料を混ぜる。その後、ペレットを含むコニカルチューブに全体積の80％を追加します。 </li><li> 1 HA /ゼラチン混合物：1の内皮細胞を再懸濁</li><li>ステップ2からベースの繊維状マトリックスにHA /ゼラチン混合物中に懸濁した細胞を配置します。 </li><li>架橋剤の所望の総体積の5分の1（20％）を追加</li><li> 37℃で1時間インキュベートする。 </li></ol>細胞シートの5の単離<ol><li>で細胞培養フード内インキュベーターと場所からの細胞を含む35ミリメートルPNIPAAM処理プレートを外しRT。 </li><li>すぐに細胞から培地を吸引し、37℃に加熱された6％の通常のゼラチンの2ミリリットルを追加します。 </li><li>ゼラチンはまだ暖かいですが、通常のゼラチン（ムービー1）の表面下に沈め、ゼラチン中に金属格子を配置します。 </li><li>ゼラチンを硬化させること、5〜7分間氷の上にプレート全体を置きます。 </li><li> 7分後、慎重にプレートの側からゼラチンエッジを分離するために、スパチュラを使用し、その後、プレート（注）から金属格子持ち上げるために鉗子を使用します。6％のゼラチンを、そして細胞シートは、格子を持ち上げる必要があります。 </li><li>皿に細胞シートを移動し、慎重に構造物の上に格子を設定し、ベース繊維マトリックスヒドロゲルの組み合わせの上に置きます。注：細胞シートの頂端側は、まだトップの位置になります。 </li><li>温かいメディア（37℃）の2ミリリットルを追加します。 </li><li> O / Nがヒドロゲル表面に付着した細胞のシートを可能にインキュベートする。 </li><li> Tを削除する解決策は（約1時間）、または翌日を温めた後、彼は金属格子。 </li></ol>

<ol>
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We have nothing to disclose.

プロトコルにおける重要なステップは次のとおりです。温度応答性高分子の板表面を被覆し、プレートを冷却した後、細胞シートを操作する。異なるセルは、異なる物理的特性を示すので、接着性のような、昇降時間は、各異なる細胞型について最適化されるべきである。このプロトコルの第2、及び最も重要な挑戦的な成分は、細胞シート、組織アセンブリのための方法の重要な態様での操作に集中する。細胞シート内の単一細胞層は非常に脆く、鉗子で操作した場合、容易に引き裂くことができる。細胞シートを所定の位置に保持されていない場合また、それらは収縮する傾向があり、容易に折り畳むことができる。支援画面を使用して提案された細胞シートの転送が脆弱な細胞シートの操作を補助する。 この原稿で提示設計手法は、組織工学アプリのさまざまな細胞シートを作成することはかなり低コスト·アプローチを提供していますカチオン。また、大学の研究室内PNIPAAMコーティングしたプレートを作成すると、複数の細胞型、および表面に適合させることができるプロトコルに、この方法及び修正を標準化することができる。細胞シートではなく、組織化されていない単一の細胞の使用は、組織アセンブリを助け、また、生存および移植された組織の統合の可能性を増加させることができる。しかし、これらの構築物のインビボ送達の方法は、（このプロトコールに記載されていない）は、各組織タイプのために最適化される必要がある。将来のアプリケーションは、特定の器官系用の組織を生成するための探査および最適化された方法論が含まれています。

Injection of cells and/or single materials alone has shown variable success in other organ systems and limited success in cardiac regeneration.5,7-12 Currently, stem cell-derived cells are delivered to damaged tissue using a variety of delivery methods including: direct cell injection into tissue and perfusion into the blood supply.13-17 Others have implanted cells alone, materials alone and/or in combination with material carriers to help regenerate damaged organs.18-21 This design combines multiple strategies that provide material strength, patterning in multiple materials and multiple cell types. 
Specifically, the base acellularized fibrous matrix provides the foundational physical strength to the construct, making it suitable for suturing in into the patient, if necessary. The void spaces in the base matrix are filled with endothelial cells in a neovascular permissive hydrogel22 for rapidly establishing vascularization of the implanted construct. This composite is then integrated with pre-patterned cell sheets that allow enhanced cell-to-cell communication, more closely mimic the native tissue.1,23-25 The overall production process for the layered cellular patch is outlined by the flowchart in Figure 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="695">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">Table of Reagents:</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:221px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Reagent</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:140px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:221px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Calcein-AM</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:140px;">C3099</td>
			<td style="width:221px;">Cell tracker / live dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Lysotracker Red</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:140px;">L7528</td>
			<td style="width:221px;">Cell tracker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Neutral Red</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">N7005</td>
			<td style="width:221px;">Visible Cell dye</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:207px;">pNIPAAM</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">412780250</td>
			<td style="width:221px;">Poly(N-isopropylacrylamide)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Toluene</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">244511-1L</td>
			<td style="width:221px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Hexane</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">296090-1L</td>
			<td style="width:221px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">RAOSMC</td>
			<td style="width:128px;">Lonza</td>
			<td style="width:140px;">R-ASM-580</td>
			<td style="width:221px;">Rat Aortic Smooth Muscle Cells</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:207px;">SmGM2</td>
			<td style="width:128px;">Lonza</td>
			<td style="width:140px;">CC-4149</td>
			<td style="width:221px;">Smooth Muscle Media</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:207px;">HUVEC</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:140px;">C-003-5C</td>
			<td style="width:221px;">Human Venous Endothelial Cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">HyStem</td>
			<td style="width:128px;">Glycosan/Biotime</td>
			<td style="width:140px;">------------</td>
			<td style="width:221px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:128px;">VWR International</td>
			<td style="width:140px;">BDH1133-4LP</td>
			<td style="width:221px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Trypsin</td>
			<td style="width:128px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:140px;">25-053-C1</td>
			<td style="width:221px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">PBS</td>
			<td style="width:128px;">Gibco</td>
			<td style="width:140px;">14287-072</td>
			<td style="width:221px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">FBS</td>
			<td style="width:128px;">Gibco</td>
			<td style="width:140px;">16140-071</td>
			<td style="width:221px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Table of Specific Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">&#160;Equipment&#160;</td>
			<td style="width:128px;">&#160;Company&#160;</td>
			<td style="width:140px;">&#160;Catalogue number&#160;</td>
			<td style="width:221px;">&#160;Comments (optional)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">&#160;Filter paper&#160;</td>
			<td style="width:128px;">&#160;Ahlstrom&#160;</td>
			<td style="width:140px;">&#160;6310-0900&#160;</td>
			<td style="width:221px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">&#160;Buchner Funnel&#160;</td>
			<td style="width:128px;">&#160;Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:140px;">&#160;Z247308&#160;</td>
			<td style="width:221px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">&#160;UpCell Plates&#160;</td>
			<td style="width:128px;">&#160;Nunc&#160;</td>
			<td style="width:140px;">&#160;2014-11&#160;</td>
			<td style="width:221px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">&#160;UV light.&#160;</td>
			<td style="width:128px;">&#160;Jelight Company&#160;</td>
			<td style="width:140px;">&#160;UVO Cleaner Model No.42&#160;</td>
			<td style="width:221px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue engineering: construction of a multicellular 3d scaffold for the delivery of layered cell sheets

そのような大人の人間の心のような多くの組織は、十分に損傷後に再生することができません。組織工学における2,3の戦略は、回復と修復に体を支援するために技術革新を提案する。例えば、TEアプローチは、心筋梗塞（MI）後の心臓リモデリングを減弱、おそらくほぼ正常プレMIレベルに総心臓機能を高めることができるかもしれません。4、心臓組織の正常な再生がの適切な送達を含む任意の機能的な組織と同様に移植された細胞/組織移植片の統合と生存に有利な環境合図で複数の細胞タイプ。送達ビヒクル、細胞の生存に及ぼす影響、材料強度、及び細胞 - 組織組織の促進として評価可溶性シグナル、細胞間相互作用、およびマトリックス材料：操作された組織が含む複数のパラメータに対処すべきである。のみこれらの必須要素を無視し、移植片細胞の直接注入を利用する研究。2,5,6これらの成分を組み合わせた組織の設計は、まだ開発されなければならない。ここでは、「組織」における新たな血管の形成を増強するための標的臓器の細胞型および内皮細胞を含む生物学的由来の材料の2つの異なる種類のパターン化された細胞シートの積層を使用して統合された設計の例を提示する。これらの研究は、心臓のような組織の発生に焦点を当てているが、この組織の設計は、最小限の設計および材料の変更と心臓以外の多くの臓器に適用することができ、再生治療のための既製品であることを意味する。プロトコルは5詳細な手順が含まれています。温度感受性ポリ（N -isopropylacrylamide）（PNIPAAM）が被覆組織培養皿に使用される。その後、組織特異的細胞は強い横癒着による細胞シートを形成するためにコーティングされたプレート/マイクロパターン表面の表面上で培養される。第三に、ベースマトリックスは、血管新生permissiを多孔性マトリックスを組み合わせることにより、組織のために作成されヒドロゲルおよび内皮ve細胞。最後に、細胞シートは、完全な構築物を作るPNIPAAM被覆皿から持ち上げ、ベース要素に転送される。

フロー図（ 図1）は 、多層パッチを製造する全体的な方法を示している。細胞シートは、32℃以下の温度をドロップすることによってPNIPAAM処理プレートから剥がれた。その後、細胞シートは、下層繊維性マトリックス（ 図1）に播種した内皮細胞を含有する架橋されたヒドロゲルの上に配置される。前処理された感熱プレートは、細胞シートを作成するために使用することができる。特別トポロジカル表面は、特にパターンのセル30（ すなわち、整列させる）ために使用されます。 ベース繊維状マトリックスは、天然組織マトリックスまたはエレクトロを脱細胞化から生成することができる。ここでは、繊維性材料シートは、パッチベース（ 図2A）のために直径4mmに切断した。この材料の特徴付けは、空隙を充填するために使用することができるハイドロゲルの量を決定するために重要である。ここで使用される行列はpreviouされましたずるいことを特徴と発表した。22 内皮細胞を含有するヒドロゲルは、架橋された繊維マトリックスにHAヒドロゲルの液体成分を適用した後である。蛍光/透過顕微鏡検査は、架橋されたヒドロゲル内に捕捉されたカルセインAM（ 図2B）で染色した生きた細胞を示す。 細胞シートを作成するプロセスは、ベンダーから購入した当社独自のPNIPAAm被覆プレートとプレコーティングしたプレートとの比較を含めて、（ 図3）に結像される。 RASMCは、37℃で少なくとも16時間PNIPAAM処理された表面上にメッキされている。この最小時間は、細胞が隣接する細胞（ 図3A）と、その横ボーダーの癒着を確立することができます。注：細胞は、これらの横方向の寮生を確立するために、合流点でなければなりません。少なくとも16時間培養後、細胞のプレートを32°C以下に降下し、氷fを用い、室温まで移動させなければならないまたは5-8分冷却プロセス（ 図3B）を高速化します。温度降下は、細胞シート、プレートのリフトオフを可能にする材料コーティングのコンフォメーションの接触角を変化させる。 図3Cは、プレートから細胞シートの持ち上げを示している。 実験室でコーティングされたプレートを作成し、細胞シートを移動させるために、いくつかの最適化の後に、うまくいった。4Dは移送前RASMCのコンフルエントな単層を示しています。細胞が持ち上げるさせたときに、シートはそれ自体に折り畳ま固執する傾向があった（ 図3E）。実際には、社内のPNIPAAmを作成または購入したものは困難であったと、多くの場合、シートの裂けが生じます（ 図に細胞シートを操作する3F）。したがって、シートを移送するためのソリューションを開発した。細胞は、インキュベーターから取り出し、冷却を開始したら、6％のゼラチンは追加の金属lのセルをカバーするために使用されたゲル（ 図3G）内に埋め込 ​​まattice。プレートが冷却されるように、細胞を持ち上げ、そしてゼラチンが硬化する。鉗子を用いて、ゼラチン - 格子及び細胞シートを培養プレートから一緒に除去することができる。すべて同じ時間（ 図3H）で。次に、これらの3成分基づく構築物（ 図3I）の上に配置されている。ここでは、細胞シート（ピンク）は、基礎となるベースマトリックス（ピンク細胞シートの下に厚い白マトリックス）よりもはるかに大きい。細胞シートは、簡単にサイズにトリミングすることができる。 最終的な細胞パッチ（ 図4）は 、パッチベースと寛容なヒドロゲルの予め形成された複合体に細胞シートを積層して作成されます。下から上に、パッチは繊維マトリックスで構成され、内皮細胞を含むヒアルロン酸ヒドロゲルを播種した後、細胞シートは、この行列の上に階層化されている。ゼラチン/格子明朝を使用せずに細胞シートを操作するための初期の試みのATUは、多くの場合、折り畳まれた（ 図4A-Dは上から見て）引き裂かれた非常に小さな細胞シートが得られた。 図4（a）は、早期のパッチを表すことのMitoTracker赤を組み合わせた合成写真をデザインRASMC（ 図4B）、カルセインAM緑色蛍光HUVECS（ 図染め図4（c））、及び透過光画像（ 図4D）。クローサー10倍の画像は、細胞シートのために供給され、HA /ハイドロゲルは、マトリックス（ 図4E-H）せず。 図4Eは mitotrakerレッド（ 図4F）の複合体である、カルセインAM緑のHUVEC（ 図4G）と透過光（ 図4H）。 （ベースマトリックス、HA / HUVEC）、および各コンポーネントの細胞シート画像の下からの眺めは、図4I-Lでのショーです。合成画像を図4J-Lで表され、個別部品を有する図4I、図4J SHで細胞シート（赤）、内皮細胞（緑色）は、 図4Kにあり、透過画像（ 図4L）OWS合成画像（ 図4M）は、行列の全領域を覆う均一な細胞シートを有するパッチを示していいずれの折り畳みまたは引裂き。なしで4M-Pはマトリックスに見上げ下からでもある図 。 図4Nは、ニュートラルレッドを含む、細胞シートである。シートはこれらの分野でのマトリックスのエッジに直接隣接ひだので繰り返しますが、太い赤ストリップはマトリックスの周りに表示されます。透過光画像化（ 図40）は、細胞の形態、およびマトリックスの構造を示している。最後に（ 図4P）は 、マトリックスは、DAPIと同じ波長で蛍光を発する特別な品質を有する。そのため、マトリックスの紫外線励起は、それが細胞シート（明るい赤）とは別に、明らかに表示するために使用されている。パッチのエッジはにトリミングすることができるマトリックスの縁の上にぶら下がっているシートのいずれかのエッジを削除します。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51044/51044fig1highres.jpg" width="500" /> 組織総会の図1のフローチャート。セル·シートは、温度応答性のPNIPAAmコーティングしたプレート上に細胞を播種し、細胞がコンフルエントに到達し、隣接するセルへの横方向の接続を確立するのに十分な時間を可能にすることによって作成される。細胞シートは、温度（黄色のディスク）を減少させることによって解放される。同時に、内皮細胞は強い塩基繊維性マトリックス、および化学的に架橋（白ディスク）のボイド空間に注入された新生血管許容HAハイドロゲルの中に埋め込まれている。必要に応じて細胞シート（黄色のディスク）の場合、内皮マトリックスの組み合わせ（白）を介して積層される。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51044/51044fig1highres.jpg" target="_blank">にはこちらをクリックしてください</a>この図の拡大版を表示します。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51044/51044fig2highres.jpg" width="500" /> ベースマトリックスと内皮カプセルの2イメージ図。 （A）は強い塩基繊維状マトリックスは丸い形状に打ち抜く。ここでは直径4 mmのインビボ動物モデルに基づいて使用されている。のMitoTrackerグリーン（カルセインAM）ベースマトリックスの表面上のHAハイドロゲル中に懸濁し（10倍）で染色した（B）HUVECS。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51044/51044fig2highres.jpg" target="_blank">拡大表示はこちらをクリックしてくださいこの図のバージョン。</a> <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51044/51044fig3highres.jpg" width="500" /> 細胞シートの3創造図。 （A）RASMC C16時間（10X）のためPNIPAAM処理した35ミリメートル、皿にultured。（B）RASMCは5-7分間氷上にプレートを配置した後に解除した。商業的に購入から解放する細胞シートのエッジ（C）画像を温度応答性細胞培養皿（10×）（DF）画像は、社内で作成PNIPAAMコートディッシュから細胞シートの生成のための同様の結果を示している。（D）コンフルエントRASMCは35ミリメートル、標準的な組織培養プレート（4X）上に成長させた。（E ）冷却した後、彼らは（4X）切り離されるように、細胞シートが収縮し、折り畳まれた。（F）により、単一細胞シートの脆さのために、細胞シートは、多くの場合、持ち上げたり、他の操作（4X）中に損傷されている。（G）で細胞シートの穿孔を軽減するためには、金属スクリーンは、細胞シートの転送を支援するために物理的な支持体として用いた。 RASMCは、6％のゼラチンおよび多孔質金属スクリーンのサポート、で覆われ、ニュートラルレッドで染色したND硬化させる。（H）画面のサポートにより、細胞シートは、最小限のダメージ（4X）で転送されます。（I） 大きなRASMC細胞シート層（ピンク色）を次に強い塩基繊維状パッチヒドロゲルの組み合わせ（矢印）の上に置いた。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51044/51044fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51044/51044fig4highres.jpg" width="500" /> 層化セルパッチ。細胞の図4。画像が pNIPPAMコーティングされた表面上で培養し、繊維マトリックスの表面にシートとして移動した。ゼラチン/金属格子で転送されなかった初期の試験では、小さなぼろぼろパッチ（AD）をもたらした。 （A）（BD）のコンポジット映像、を含む強い塩基繊維状マトリックスヒドロゲル組み合わせと組み合わせた細胞シートの（B）のMitoTracker Redにより染色された二枚のRASMCにおける、及び（C）HUVECを透過光で緑色、及び（D）で染色した。（E）複合画像Calceing AMは、ヒドロゲル中に懸濁した。強い塩基繊維状マトリックスヒドロゲル組み合わせの（H）伝送画像のHUVEC（緑）、および（F）のMitoTrackerレッドのRASMC。（G）グリーン蛍光染色したHUVEC。（I）複合画像から探し上向きに強い塩基繊維状マトリックス（染色されていない）を介してパッチの下部、HAは、それぞれのHUVEC（緑）、のRASMCの細胞シート（赤）を含む。（J）赤色蛍光のRASMCシート、ベース繊維状行列-を通して見たヒドロゲルの組み合わせ。（K）の緑色蛍光HUVECS。（L）パッチ構築物の透過像。（M）ベース繊維状マトリックスヒドロゲルの組み合わせ（自家青）オーバー細胞シート（赤）のコンポジット映像。シートカバーに（N）細胞エッジにおけるベース繊維状マトリックス、ハイドロゲルの組み合わせを示して増加した蛍光が原因です細胞のバンチング。コンストラクトの（O）伝送画像。（P）自然繊維質ベースマトリックスは、DAPI（青色波長）における自家蛍光である。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51044/51044fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <a href="/files/ftp_upload/51044/My_Movie.wmv" target="_blank">ムービー1</a> 。細胞のシートを転送するプロセスは、文書で提出された補足的な映画の中で強調表示されます。映画は、段階的なプロセスで、インキュベーターから細胞の除去を示す図である。 6％のゼラチン、目が挿入されたメディアの交換Eの金属スクリーン、氷上で細胞の萎縮、別の皿に、転送中の細胞の画像を、最後にシートから画面の除去のPNIPAAmコートディッシュからの細胞の転送。

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Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

組織工学：層状細胞シートの送達のための多細胞3D足場の構築

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

tissue-engineering-construction-multicellular-3d-scaffold-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.4K ビュー.  University of California, Merced. For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

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Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

組織工学のための二軸メカニカルローディングバイオリアクターの設計

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

生物工学

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

人間の3次元の組織工学<em&gt; in vitroで</em&gt;腫瘍テストシステム

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3次元細胞培養のための自己申告足場

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

エンジニアリング3D細胞化血管組織再生のためのコラーゲンゲル

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created. 
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

三層のための3つのユニークな環境を提供するために、エレクトロスピニング法を適応させます<em&gt;インビトロ</em&gt;気道壁のモデル

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue geometry. The resulting 3D hydrogel-based cellular constructs have been introduced as an alternative to animal experiments for advanced biological studies, pharmacological assays and organ transplant applications. Although hydrogel-based particles and fibers can be easily fabricated, it is difficult to manipulate them for tissue reconstruction. In this video, we describe a fabrication method for micropatterned alginate hydrogel sheets, together with their assembly to form a macro-scale 3D cell culture system with a controlled cellular microenvironment. Using a mist form of the calcium gelling agent, thin hydrogel sheets are easily generated with a thickness in the range of 100 - 200 &#181;m, and with precise micropatterns. Cells can then be cultured with the geometric guidance of the hydrogel sheets in freestanding conditions. Furthermore, the hydrogel sheets can be readily manipulated using a micropipette with an end-cut tip, and can be assembled into multi-layered structures by stacking them using a patterned polydimethylsiloxane (PDMS) frame. These modular hydrogel sheets, which can be fabricated using a facile process, have potential applications of in vitro drug assays and biological studies, including functional studies of micro- and macrostructure and tissue reconstruction.

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

マイクロパターンマクロスケール3D細胞構造のためのモジュラーヒドロゲルシートの構築

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

3D相互作用の研究のための3Dコラーゲンゲルおよびマイクロチャネルの作製<em&gt;インビボ</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing drugs targeted at the liver, requires a platform in which cells receive proper biochemical and mechanical cues. Recent liver tissue engineering systems have employed three-dimensional (3D) scaffolds composed of synthetic or natural hydrogels, given their high water retention and their ability to provide the mechanical stimuli needed by the cells. There has been growing interest in the inverted colloidal crystal (ICC) scaffold, a recent development, which allows high spatial organization, homotypic and heterotypic cell interaction, as well as cell-extracellular matrix (ECM) interaction. Herein, we describe a protocol to fabricate the ICC scaffold using poly (ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) and the particle leaching method. Briefly, a lattice is made from microsphere particles, after which a pre-polymer solution is added, properly polymerized, and the particles are then removed, or leached, using an organic solvent (e.g., tetrahydrofuran). The dissolution of the lattice results in a highly porous scaffold with controlled pore sizes and interconnectivities that allow media to reach cells more easily. This unique structure allows high surface area for the cells to adhere to as well as easy communication between pores, and the ability to coat the PEGDA ICC scaffold with proteins also shows a marked effect on cell performance. We analyze the morphology of the scaffold as well as the hepatocarcinoma cell (Huh-7.5) behavior in terms of viability and function to explore the effect of ICC structure and ECM coatings. Overall, this paper provides a detailed protocol of an emerging scaffold that has wide applications in tissue engineering, especially liver tissue engineering.

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

This manuscript presents a detailed protocol for the fabrication of an emerging three-dimensional hepatocyte culture platform, the inverted colloidal crystal scaffold, and the concomitant techniques to assess hepatocyte behavior. The size-controllable pores, interconnectivity and ability to conjugate extracellular matrix proteins to the poly(ethylene glycol) (PEG) scaffold enhance Huh-7.5 cell performance.

肝組織工学のための三次元細胞培養プラットフォーム：逆コロイド結晶ポリ（エチレングリコール）足場の作製

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus of this article is on the methods for fabricating ECM-derived porous foams and microcarriers for use as biologically-relevant substrates in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative scaffolds and cell delivery systems for tissue engineering and regenerative medicine. Using decellularized tissues or purified insoluble collagen as a starting material, the techniques can be applied to synthesize a broad array of tissue-specific bioscaffolds with customizable geometries. The approach involves mechanical processing and mild enzymatic digestion to yield an ECM suspension that is used to fabricate the three-dimensional foams or microcarriers through controlled freezing and lyophilization procedures. These pure ECM-derived scaffolds are highly porous, yet stable without the need for chemical crosslinking agents or other additives that may negatively impact cell function. The scaffold properties can be tuned to some extent by varying factors such as the ECM suspension concentration, mechanical processing methods, or synthesis conditions. In general, the scaffolds are robust and easy to handle, and can be processed as tissues for most standard biological assays, providing a versatile and user-friendly 3D cell culture platform that mimics the native ECM composition. Overall, these straightforward methods for fabricating customized ECM-derived foams and microcarriers may be of interest to both biologists and biomedical engineers as tissue-specific cell-instructive platforms for in vitro and in vivo applications.

The tissue-specific extracellular matrix (ECM) is a key mediator of cell function. This article describes methods for synthesizing pure ECM-derived foams and microcarriers that are stable in culture without the need for chemical crosslinking for applications in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative bioscaffolds.

組織特異的細胞培養および配信プラットフォームとして、細胞外マトリックス由来のフォームおよびマイクロキャリアの作製

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

軟骨と皮膚組織類縁ミキシング ユニット Bioink Precellularization の小説のパッシブ バイオプリンティング

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...