作者は感謝して宇宙海軍戦システムセンター太平洋（SSC PACIFIC）契約番号N6601-13-C-2027の下で国防脅威削減局（DTRA）により資金調達を認めます。この材料の出版物は、本明細書の調査結果や結論の政府による承認を構成するものではありません。

1.ハイドロゲルBioink製剤と準備<ol><li>先に肝臓に記載のようなソリューションをダイジェスト、組織特異的な生化学的プロフィールを提供する組織特異ECMを調製するために、20 注意：一般的には、このECMダイジェストが使用される最終的なヒドロゲルbioink体積の40％を含むであろう。 ECM消化溶液の数百ミリリットルを調製等分し、そして将来の使用のために-80℃で凍結することができます。 </li><li> （2-ヒドロキシエトキシ）-2-メチルプロピオフェノンを、水中0.1％のw / vの - 、製剤ヒドロゲル光開始剤を溶解し、2-ヒドロキシ-4 &#39;の前。 注：50〜100ミリリットルの範囲内のボリュームは、事前に準備することができ、数ヶ月間、4℃で遮光保存しました。 </li><li>ヒドロゲルbioinksを形成するために、最初に水、光開始剤の溶液中のヒアルロン酸（HA）ハイドロゲルキットからの基材成分を溶解します。 <ol><li>水-Pで別々にチオール化HAおよびチオール化ゼラ​​チンを溶かしますVソリューション/ wの2％を作るためにhotoinitiator溶液（ステップ1.2）。 </li><li> 8％のw / v溶液を作るために水 - 光開始剤溶液（ステップ1.2）中のポリエチレングリコールジアクリレート（PEGDA）、ヒドロゲルキット中の架橋剤を溶解させます。 </li><li> 8％重量/容量の溶液を作るために水 - 光開始剤溶液（ステップ1.2）に、ポリエチレングリコール（PEG）8アームアルキン（10kDaのMW）を溶解します。 </li></ol></li><li>追加のカスタマイズが可能であるが、一般的に、以下のスキームを使用して、ヒドロゲルを形成します。 <ol><li>一般的な非組織として2％のHAをチオール化4部、4部の2％チオール化ゼラ​​チン、1部の架橋剤1 1部の架橋剤2~8を有する部品組織のECM溶液および2部の肝細胞培養培地（HCM）（または10部の水を結合固有ヒドロゲル）。 注：追加の未修正のHAまたはゼラチンがよりスムーズにbioink押し出しを作るために添加することができます。これは、以下に説明します。 </li></ol></li><li>使用前に混合する10秒間ボルテックス高（速度10のうち10）上で得られた混合物を。&lt;/李&gt; <li>ヒドロゲルbioinkの使用<ol><li>押出又はbioprinting試験のために、注射器またはプリンタカートリッジ内に混合物を移し、それを37℃で30分（ステージ1架橋）のために自然に架橋することを可能にします。 </li><li>レオロジー測定のために35mmのペトリ皿に混合物を移し、それを30分間架橋することを可能にします。 注：この混合物は、直ちにチオール - アクリレート結合形成を介して架橋し始め、粘度が増加し始めます。混合物を転送中に、ピペットまたはシリンジの目詰まりを避けるために、10分以内に注射器、プリントカートリッジ、またはターゲットの場所に転送する必要があります。 </li><li>二次架橋（ステージ2）が望まれる場合、チオール-アルキン重合反応を開始する段階に紫外線（波長365nm、18 W / cm 2）を1架橋ゲルを照射します。 注：照射時間は、材料の表面積に依存します。一般に、材料の平方センチメートルは1-必要ですこのUVパワーでUV露光の2秒。 </li></ol></li></ol> 2.プリンタの互換性テスト<ol><li>標準の注射器と小さなゲージの針先端（20〜30ゲージ）を使用して、簡単な押出試験で実験台上bioprintingデバイスとの統合テスト、テスト押出特性に先立ち。 <ol><li>いくつかまたは全くバンプ付きヒドロゲルの円滑押し出されたフィラメントを達成するために、標準的な注射器を介してbioinkを押してください。線または単純なパターンの押出は、成功を決定するのに十分です。 </li></ol></li><li> bioprinterの統合については、プリンタのカートリッジにそれらをピペットで準備をbioinkロード、およびbioinkのための30分は、カートリッジ内に自発的なステージ1の架橋を受けることができます。 注：bioinkの体積が特定のアプリケーションに依存し、ユーザによって決定されるべきです。プリンタのカートリッジは、似ているかbioprinterデバイスと互換性のある注射器であってもよいです。 </li><li>押し出しの互換性を評価しますbioinkを使用して単純なパターンを印刷することによってbioprintingため。例えば、平行線で構成される7×7ミリメートルのパターンを印刷します。約300mm /分の速度でXY平面内でプリントヘッドを移動しながら、圧力（ 例えば、20 kPaの空気圧）を適用します。 注：様々なサイズのプリントヘッドのノズル径を用いることができるが、400〜500μMの直径の開口を有する円錐形のノズルは250〜350μmの範囲のスフェロイドを印刷するために最適です。 <ol><li>押出材がゴツゴツまたは不規則である場合は、ステップ2.4​​を参照するか、ステージ1架橋された材料を軟化させるPEGDAの量を減らします。適切に準備bioink製剤は、所望のパターンまたはアーキテクチャで正確な堆積を可能にする、スムーズに押し出します。 注意：使用に特に組織構造物の印刷のために家に設計されたカスタムの3-D bioprintingデバイスを記載bioprinting手順を32など、特定の印刷パラメータは、デバイスの種類ごとに劇的に変化し、TESTINを必要とするように。ユーザーによるグラム。 </li></ol></li><li>押出特性を改善するために、（それぞれ、1.5 mg / mlで、30 mg / mlで）bioinksに未修飾HAおよびゼラチンを補います。 </li></ol>原発性肝構築とBioprinting 3.検証<ol><li>細胞成分33 ​​としてハンギングドロップ法により3次元一次細胞、肝スフェロイドを準備 注：Bioprintingは、同様にハイドロゲルbioinksに懸濁させ、個々の細胞を用いてスフェロイドずに行うのではなく、することができます。スフェロイドは、細胞 - 細胞相互作用を促進し、機能性を構築するためにここで使用されています。使用スフェロイドまたは細胞の数は、特定の用途に依存し、ユーザによって決定されるべきです。これらの手順は、滅菌用品を使用して、無菌条件下で行うべきです。 <ol><li>肝細胞基本培地（HBM）および滅菌フィルタにHCMサプリメント成分キットの解凍内容を追加することで、HCMを準備します。 <ol><li>サプリメント成分未解凍液体ゴマ。 </li><li>硫酸ゲンタマイシン/アンホテリシンBを0.5ml;ヒドロコルチゾン21-ヘミスクシネート0.5 mlであり、インスリンは0.5 mlで10 mlのウシ血清アルブミン[脂肪酸フリー]; 0.5mlの補助成分（アスコルビン酸を追加したヒト組換え上皮成長因子、0.5ミリリットル、転送、0.5ミリリットル）500ミリリットルHBMへ。 </li><li>ボトルトップフィルターユニットまたはシリンジチップフィルターを使用して、0.45μmのか、0.22μmのフィルターを通して滅菌濾過します。 </li></ol></li><li>各細胞型は、製造業者の指示に従って、解凍された後、血球計数器で計数することによって、一次ヒト肝細胞、クッパー細胞、および星細胞の細胞密度を決定します。 </li><li>コニカルチューブ中で37℃に温めされたHCM培地中の細胞数で80:10:10の割合で、一次ヒト肝細胞、クッパー細胞、および星状細胞を組み合わせます。 注：使用するメディアの量は、アプリケーションに固有の全体的な細胞数に依存し、第によって決定されるべきですEのユーザ。 </li><li> 20℃で520×gで5分間、細胞懸濁液を遠心します。 </li><li>細胞ペレットを残し、上清を吸引除去します。 </li><li> 40μlの培地あたり1,000個の細胞を含む細胞懸濁液を得HCM培地中で細胞ペレットを再懸濁します。総容積が生成されるスフェロイドの数に依存しています。 </li><li>ドロッププレートを吊り96ウェルフォーマットに細胞懸濁液を移します。多細胞スフェロイドを形成している間に3日間、5％CO 2で、HCMで各ウェルに約1,000セルの合計を追加し、37℃で維持します。 </li><li>ピペッターを使用して、懸滴プレートから肝スフェロイドを収集します。滅菌15ミリリットルコニカルチューブに移します。 </li></ol></li><li>肝臓特異的ヒドロゲルbioinkでBioprint肝スフェロイド<ol><li>架橋剤として8％PEGDAと8％の8アームPEGのアルキンを用いて、ステップ1で説明したように、肝臓のECM含有ヒドロゲルbioinkの製剤を準備します。 RESUにその能力のために、この組み合わせを使用しますネイティブの肝臓組織にずり弾性率の近いヒドロゲル中にlting。 </li><li>スフェロイドは、それらが、ステップ3.1.7に配置された円錐管の底に沈殿してみましょう。これは、回転楕円体の大きさや密度に基づいて変化するが、一般的に1〜2分以内に起こります。慎重に吸引することにより、またはピペットですべてのメディアを削除します。 </li><li>スフェロイドを含むコニカルチューブに新たに調製されたヒドロゲルbioink液の所望の体積を転送します。一般に、適切な量は、印刷される3次元構造物の体積の10％-25％大きいです。慎重ヒドロゲルbioink溶液中でスフェロイドを再懸濁するために上下にピペットと。ピペットまたは血清学的ピペットを用いてbioprinterカートリッジに移します。 </li><li> bioprinterカートリッジの内部に、溶液を30分間、最初の架橋段階（チオール - アクリレート反応）を受けることを可能にします。 注：回転楕円体のサイズに応じて、カートリッジがあることが必要になることがあり、ゆっくりと回転または内容と混合する必要があるかもしれませんステージ1の架橋中にbioink全体に分布してスフェロイドを維持するための無菌へら。これは、懸濁された細胞の代わりに、スフェロイドを用いて調製bioinksの必要性が少ないです。 注：ステージ1の架橋に続いて、ユーザーは数時間の操作ウィンドウを持っています。しかし、細胞生存率を改善するために迅速にbioprinting処理を行うことが推奨されます。 </li><li>ステージ1の架橋後、原発性肝スフェロイド（または他の細胞）を含む、所望のヒドロゲル構造を作成するbioprintingデバイスを使用します。 注：この技術は、構造体の様々なbiofabricatingためのシステムを提供します。そのような総容積のようなパラメータは、細胞またはスフェロイドの数、印刷構造体の幾何学的形状、および構築物が印刷された基板は、ユーザの目的に大きく依存しています。 </li><li>所望の形状に堆積した後、共安定化、二次架橋メカニズムを開始するために2-4秒間UV光を管理しますnstructsと所望のレベルまでの剛性を高めることができます。 注：PEG-アルキンの濃度、ひいては全体的な最終の架橋密度は、主に、最終的な構築物の剛性を制御します。 </li><li>多層構造を作成するために、ステップ3.2.4と3.2.5を繰り返します。 </li></ol></li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ヒトでまたはin vitroスクリーニングアプリケーションのための最終的な使用のために、3次元組織構築をbiofabricateしようとしたときに考慮することが重要であるいくつかのコンポーネントがあります。 biofabricationデバイス自体が終了コンストラクトに到達するための一般的な方法論を決定しながら、適切な細胞成分を採用することにより、エンド潜在的な機能性を決定します。それは二重の役割を果たすように、第3の成分、生体材料は、同様に重要です。具体的には、生体材料の成分は、biofabricationハードウェア（ すなわち 、bioprinters）の両方と互換性があり、また、潜在的に脆弱な生体細胞のコンポーネントをサポートしている必要があります。 bioprintable材料はいくつかの重要なパラメータを満たすために必要があるとして、これらの要件の両方を最適化することは、困難な場合があります：1）効率的で邪魔されない印刷を容易にするために、適切な化学的、機械的、および時間的特性を有しています。 2）準備段階とbioprin中に細胞生存率をサポートティン手順と、 3）と最高bioprinting以下の細胞生存率および最終的な組織体の機能を増強するもてなしの環境を提供しています。私たちは、これらの要件を満たすためにここに記載された方法論で説明するモジュール式のハイドロゲルbioinkシステムを採用しています。まず、成長因子、コラーゲン、GAGは、特定の組織型のECM由来するエラスチンを組み込むことによって、我々は、標的組織のタイプを彷彿とさせる生化学的プロフィールを達成することができます。第二に、同様の2が、さらにターゲットにマッチし、決定材料の弾性率に到達するために、第2の架橋工程で変更することができ、我々が最も押し出しベースと互換性のあるソフトな押出し可能な材料を達成することができます独立した架橋反応を採用することにより、選択した組織。34 それが有用になるこのシステムの重要な特徴は、polymeを操作するために利用することができ、複数の化学反応をサポートする機能ですrization動態およびbioinkシステムの機械的特性。 2つの独立した反応の種類、チオール - アクリレートおよびチオールアルキンを採用することにより、我々は注射器またはbioprinting装置を通して押し出すことができる柔らかい材料になり、ステージ1チオール - アクリレートの反応を実行する能力を達成するため、ステージ2チオール唯一の最終bioprinted構築物の弾性率を決定する光開始剤の存在下でUV照射時に開始される-alkyne反応。これらの複数のステップは、bioprintable材料になります。このように、押出成形およびその後の弾性率のカスタマイズをサポートする安定bioinkを達成するために、これらの別々の反応タイプを維持することが重要です。 biofabricationためのシステムを使用する主要な欠点​​は、二次架橋剤を介して、または別の組織由来のECM材料を含めることによって終了弾性率を操作するのいずれかを介して行われたカスタマイズのための容易さであります<html>または成長因子カクテル。組織におけるECMは、多くの場合、組織型との間の全体的な分布に変化する成長因子および他のサイトカイン、様々なが含まれています。我々は、これらの要因は、このような初代ヒト肝細胞などの特定の細胞型の機能を維持するために不可欠であると考えています。この概念の実装は、以前にヘパリン化ヒアルロン酸サンドイッチ培養における初代ヒト肝細胞の生存能力および機能を増加させることが実証された。20、ヘパリン結合性増殖因子、ならびに肝臓ECMから他のECM成分とヒドロゲルにヘパリン鎖を組み合わせることにより、我々ができました長期間in vitroでの生存能力および機能を維持し、初代ヒト肝細胞にこの肝臓特異的な生化学的プロフィールを提示します。このアプローチは、容易に、研究者は、他の組織を脱細胞化および可溶化することによって、これらの組織特異的因子の要約を達成することができ、他の組織タイプに拡張することができます。 10トンは&quot;&gt;ユーザーが知っておくべきことは、このbioinkシステムの基本構成要素は、以前bioprintingに実装されているが、10,12,17あまり微妙な、組織特異的なアプローチだけでなく、他の再生医療の様々な用途で、35- 45 biofabricationは、すべての組織タイプに試みられていない。このように、このような付加的な組織構築物を作成するために必要ないくつかの更なる開発やトラブルシューティングがあるかもしれない。しかし、そのようなここに記載されるようなモジュラーシステムは、非常によく適合することができる。他の可能性を制限は、いくつかの細胞型が特定の生体材料に向かって有することができる天然の親和性が含まれる。一般的には、我々が発見した、このヒドロゲル系支持体のヒアルロン酸、ゼラチン、及びPEGベースの基本コンポーネント生存細胞型の多様な文化、まだこのような固有の繊維状のNAは、コラーゲンなどの異なる組成の操作された環境では、パフォーマンスが向上した細胞のいくつかの種類であってもよいですより弾力的な性質によるも​​のであるチャー、またはエラスチン、。このように、与えられた組織タイプ及び最終用途のための最適な材料への配慮が重要であり、ここに記載のヒドロゲルbioinkシステムは、全ての用途に適切ではないかもしれません。さらに、bioprintingが行われる環境条件を考慮することが重要です。準備と印刷時間があまりにも37°Cの下でより迅速なプロトコルがbioinksを使用するために、引き出された場合には、このプロトコルの開発中に、私たちは近く、周囲から貧しい生存能力につながる任意の細胞培地なしbioinksを使用して、（室温）の条件を移行しました劇的に細胞の生存率を増加メディアコンポーネントを有します。 最近まで、いくつかの材料または材料系は、特にbioprintingシステムとインターフェースするために開発されました。その結果、大部分の材料は、細胞を支持するか、それらの生物学的特性を活用する、単純化され、または、biofabricationとの適合性ハードウェア。いくつかの材料は、両方のレルムに最適です。この方法に記載されたシステムは、押出bioprintingために必要な機械的特性を容易にしつつ、生物学的特徴付けのカスタマイズを可能にする、これらの特性を切り離します。このヒドロゲルbioinkシステムの付加的な区別は、それがbiofabricatingのために使用される標的組織の両方の生化学的および物理的パラメータを模倣することができることです。これは、ほぼすべての組織の生化学的要因の要約を可能にすること、ならびに任意の軟組織の弾性率に一致する、柔軟性の印象的なレベルをサポートしています。組織の両方のこれらの側面への配慮はほとんどタンデムで検討されていません。 この技術のモジュール性は、多種多様な用途に実装する柔軟性を提供します。様々な組織タイプを模倣する能力は、この作品で例として使用されるだけでなく、肝臓コンストラクトをbiofabricateする機能を提供していますが、コン体内の他の組織の多くを表す構造体。おそらく、これらのパラメータを使用して、最も明白な幅広い用途は、移植または薬物および毒物学スクリーニングのような実際のアプリケーションのために設計構築の終了機能を最適化するために、特定の組織の両方の側面を一致させる能力です。患者への移植のための人間サイズの組織の生成が原因で組織工学臓器に機能的血管系を製造する能力について、規制のハードル、細胞ソーシング、および制限のため、多くの研究者のための最終的な目標ですが、この崇高な目標は、さらなる発展と時間が必要になります実現することができます。しかし、このようなここに記載の方法などの技術は現在、in vitroでのプラットフォーム用の「オルガノイド」を生成するために実装され始めています。私たちのチームだけでなく、他の人は、現在、毒性試験が実施されたモデルシステムを作成するために、オルガノイドbiofabricationを利用しています。さらに、オルガノイドのために使用することができます研究の病理および疾患の進行、癌などの、46およびテスト潜在的な治療処置。最後に、このシステムはまた、別の重要な使用をサポートしています。独立してこれらのパラメータを操作することによって、研究者は、機械的要因に対する生化学の相対的な重要性を決定するために、基本的な科学実験を行うことができます。

近年では、様々な技術は、それらを製造し、またはbiofabricateしようとしていることにより、機能の臓器や組織の代替エネルギー源の必要性に対処し、その利用可能になっています。 Bioprintingは、これらの技術の最も有望なの一つとして浮上しています。 Bioprintingが3次元でパターン生存器官状又は組織様構造を構築したりするために使用することができる生物学的部品のロボット添加剤製造の形態と考えることができる。多くの場合1、bioprinting 3（3次元を使用しますこれにより、解剖学的に模倣生理的なアーキテクチャを反復する、正確な位置への細胞や生体材料を堆積するために、コンピュータによって指示される-D）印刷装置。2これらのデバイスは、細胞凝集体の形態をとることができる「bioink」を、印刷、ヒドロゲルに封入された細胞または粘性流体、または細胞を播種したマイクロキャリア、ならびに無細胞PLAのような機械的な構造または行為を提供する無細胞ポリマーceholders 3,4 bioprintingプロセスに続いて、得られた構造は、機能的な組織または器官の構造体へと成長することができ、その意図された最終用途に使用される。5,6日に、完全な完全に機能する人間サイズの器官が印刷されていません、しかし、それは研究開発をbioprintingの主要な長期にわたる目標である。2しかし、「オルガノイド「組織構築物は、現在病理学モデリング、薬剤開発、および毒性スクリーニングなどのアプリケーションの数に実装されている小規模な。 研究者はbioprinting技術を適用する際に発生した主な障害の1つは、非常にいくつかの材料がbioprintingの明示的な目的のために開発されているということです。効果的bioprintingで成功するために、生体材料は、4つの基本要件を満たす必要があります。生体材料の堆積を可能にする1）適切な機械的特性を有する必要がある（これは、ゲルまたはIのようなノズルを通して押し出すこと液滴としてnkjet）堆積後の3-D構造の構成要素としてその形状を保持するために、2）能力、3）2前の特性のユーザ制御、および4）セルフレンドリーで協力的な環境では、すべてのための機能bioprinting手順の段階。7歴史的には、仕事をbioprintingことが多い代わりにbioprintingとその後のポスト印刷用途に必要な性質を持っている生体材料の設計、彼らの互換性を考慮せずにbioprintingデバイス内の既存の伝統的な生体材料を採用しようとしています。 bioinksの様々な堆積および製造ハードウェアとのより良いインタフェースに最近開発されてきました。彼らは一般的にどちらかの前駆体として不十分な機械的特性、または場合はノズルを詰まらせることができます印刷または押出プロセス時に壊れなっ重合ヒドロゲルと流体ソリューションを存在するため、標準的なハイドロゲルシステムは、重大な問題を提起します。私たちのチームだけでなく、パーソナルプラグインRSは、ヒドロゲル基質への細胞スフェロイド印刷、マイクロキャピラリーチューブから5,8セルとハイドロゲルフィラメント押し出し、動的架橋特性を有する9-11押出可能なヒアルロン酸（HA） -金ナノ粒子ヒドロゲルを含むこれらのbioprinting問題に対処するために、様々なハイドロゲル製剤を、模索しています、光重合性を使用して、ハイドロゲル剛性の12時間的制御は、17 HAおよびゼラチン、13フィブリノゲン-トロンビン系架橋、14,15のイオン交換アルギン酸-コラーゲンゲル、16をメタクリル化し、最近の急速な重合紫外線（UV）-initiated架橋これらの例は、によって効果的にbioprintedことができる材料を生成することの実現可能性を実証します。しかし、成功した生存可能で機能的な3次元組織構築物を生成する、ハードウェアとの統合に加えて、生体材料は、細胞の維持に援助することを生化学的および機械的な手がかりが含まれている必要があります生存率および機能。これらの付加的な要因、生化学的および機械的なプロファイルは、bioprinted組織構築の成功の機能に大きな影響を持つことができます。 両方の細胞およびネイティブ細胞外マトリックス（ECM）は、成長因子および他の細胞の他のサイトカインなどのシグナル伝達分子の広い範囲を提示する責任があります。これらの信号の組み合わせは、組織への組織によって異なりますが、細胞や組織の行動を調節するのに非常に強力で影響力のあることができる。18で検討されている異なる器官からの組織特異的なECM成分を採用し、ヒドロゲルとして、またはヒドロゲルの一部として実装します、与えられた組織を脱細胞化して粉砕し、それを溶解から構成されている成功。19-21このアプローチは、任意の組織からの組織特異的生化学的シグナルを生成するために使用することができ、3次元ヒドロゲル構築物に組み込むことができる。22 さらに、それは広く、体内の組織は剛性の広い範囲を占めることが文書化されている。このように23、調整する能力、そのような弾性率E &#39;または剪断弾性率G&#39;のような生体材料の機械的特性は、組織工学における有用なツールであります。上述したように、bioink機械的性質の制御は、次いで、さらに弾性率のレベルは標的臓器の種類のものと一致する達成可能な後の時点にて二次架橋することによって操作することができ、ソフトゲルを用いた押出によるbiofabricationを可能にします。例えば、生体材料は、天然の肝臓、23のように5〜10キロパスカルの剛性を一致させるか、理論的には24,25の中に機能するこれらのオルガノイドの能力を増加させ、ネイティブの心臓組織のような10〜15キロパスカルの剛性と一致するようにカスタマイズすることができましたその天然の組織の対応と同様に。細胞表現型への環境剛性の影響はEXPとなっています特に幹細胞については、近年lored。エングラーら基板弾性が基板のそれに一致する組織の弾力性と系統に向かって間葉系幹細胞（MSC）の駆動に支援することを実証した。25この概念はさらに、筋肉、心臓機能、肝表現型、造血幹細胞の増殖への分化のために検討されています、および幹細胞治療可能性の維持。24,26-29が同調することができることは、異なる弾性率のヒドロゲルは、組織構築物をbiofabricateするために使用される生体材料の重要な特徴である。30 ここでは、押出bioprintedできるヒドロゲル系を処方するために我々の研究室で使用される汎用性の高いアプローチを示し、特定の組織型の生化学的プロフィールを含み、2）その組織タイプの弾性率を模倣する、1）、カスタマイズプロトコルを記述する。これらの要件に対処することにより、我々は、pに目指しますin vivoでの物理化学的および生物学的特性を再現することができる材料をrovide組織。31は、本明細書に記載のモジュール式のハイドロゲル複合システムは、押出可能のbioinksを得るために、マルチ架橋アプローチを活用し、安定させる二次架橋を可能にし、剛性を増加させます最終生成物は、組織タイプの範囲と一致します。生化学的なカスタマイズは、組織特異的なECM成分を使用することによって満たされます。デモンストレーションとして、我々は機能的肝オルガノイドの構築をbioprintするために、このヒドロゲル系の肝特異的多様性を採用しています。記載されているプロトコルは、カスタムの3-D bioprintingデバイスを使用しています。一般に、このプロトコルは、ほとんどの押出によるプリンタに適合させることができる、特定の印刷パラメータは、デバイスの種類ごとに劇的に変化し、ユーザによる検査を必要とします。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="903">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hyaluronic acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">53747</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Gelatin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G6144</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">410896</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:340px;">Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP)</td>
			<td style="width:108px;">ESI-BIO</td>
			<td style="width:119px;">GS315</td>
			<td style="width:336px;">Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa</td>
			<td style="width:108px;">Creative PEGWorks</td>
			<td>PSB-887</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Primary human hepatocytes</td>
			<td style="width:108px;">Triangle Research Labs</td>
			<td>HUCPM6</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Primary human liver stellate cells</td>
			<td style="width:108px;">ScienCell</td>
			<td style="width:119px;">5300</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Primary human Kupffer cells</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">HUKCCS</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hepatocyte Basal Media (HBM)</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3199</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:340px;">Hepatocyte Media Supplement Kit</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3198</td>
			<td style="width:336px;">HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5mL; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 mL; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5mL; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 mL; insulin, 0.5 mL; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 mL; transferring, 0.5 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td style="width:336px;">Other manufacturers are ok.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Ammonium hydroxide</td>
			<td style="width:108px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A669</td>
			<td style="width:336px;">Other manufacturers are ok.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Fresh porcine cadaver tissue</td>
			<td style="width:108px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Lyophilizer</td>
			<td style="width:108px;">any</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Freezer mill</td>
			<td style="width:108px;">any</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:340px;">Bioprinter</td>
			<td style="width:108px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;">The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hanging drop cell culture plate</td>
			<td style="width:108px;">InSphero</td>
			<td>CS-06-001</td>
			<td style="width:336px;">InSphero GravityPlus 3D Culture Platform</td>
		</tr>
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bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

上記の手順が正しく実行されると、ヒドロゲルは、標的組織型に特異的な生化学的プロファイルが含まれている必要があり、20は bioprintingと、最終的な弾性率、34を超える高度の制御を可能にし、組織構築物中の生存機能セルをサポートしています。 ハイドロゲルのカスタマイズ 最良模倣ネイティブ肝臓に、ヒドロゲルbioinkが肝臓ECM溶液および増殖因子配列によって補充した、20 ECMソリューションは、成長因子およびサイトカイン（pg / mlで示す、 図1A）の多種多様を含みます。これらは、脳由来神経栄養因子（BDNF）、bFGFを、骨形成タンパク質5（BMP-5）、FGF-4、インスリン様増殖因子結合タンパク質2（IGFBP-2）、TGF-b1を、BMP-7、EGFを含みます、FGF-7、成長ホルモン（GH）、ヘパリン結合EGF様成長因子（HB-EGF）、HGFおよびneurotrophin 3（NT-3）。さらに、ECMソリューションは、比色アッセイによって分析され、追加の構造部品が含まれています。肝臓のECMソリューションについては20、肝臓のECMソリューションの総コラーゲン含有量は、91.33±0.58 mg / mlで、エラスチン含有量は、189.33±48.40 mg / mlであった、としました。グリコサミノグリカン（GAG）含量は86.00±53.45 mg / mlで（ 図1B）でした。 ハイドロゲルは、機械的性質はレオメーターでのせん断応力スイープ試験（0.6から10 Paで、発振周波数1 Hz）を使用して特徴付けることができるbioink。10,12,13,34中性pHで発生する自発的なステージ1チオール-アクリレート化学を許可することにより、 113.66±22.59 PaでのG &#39;と柔らかいヒドロゲルが形成されています。 UV光重合によりステージ2チオール-アルキン架橋の開始後、約10キロパスカル（10637±113.83 Paで、FiguにG &#39;が増加図1C再）、肝臓組織の弾力性を模倣します。濃度の追加の操作、分子量、および架橋剤の形状は、ステージ2 G &#39;値の広い範囲を達成することができます。34 bioprintedヒドロゲルの品質 化学戦略とヒドロゲルbioinksのステージ1とステージ2の架橋の実装は、図2に記載されている。一般的に、アクリル化PEGポリマーをベースとするようExtralinkなどの架橋剤は、自然発生的に中性でHA上のチオール基とゼラチン鎖と反応しますソフト押出可能なヒドロゲルを形成する細胞の存在下でのpH（ステージ1）。このソフトヒドロゲルは、UV光が未反応のチオールとアルキン修飾PEGポリマーに基づく第二架橋剤の重合を開始するために使用された後bioinkとしてbioprintedできます。架橋剤の特定の分子量および形状は行きますVERN bioprinted構文の終わり剛性。 7×7ミリメートルパターンは、テスト目的（ 図3A）のために実装されました。最初のテストは、最初の配合物は押出可能であることが示されたが、不規則なと（ 図3B）の間に、押出後に凝集登場しました。押出特性を改善するために、未修飾HAおよびゼラチンbioinks（1.5 mg / mlで、30 mg / mlで）を補充しました。改善された滑らかな印刷された構造は、 図3Cに示されています。 生存率とbioprinted初代ヒト肝構築物の基本的な機能 生理活性肝臓特異的ヒドロゲルbioink bioprinter 3-Dを使用したが、以前にプラスチックカバースリップ上に、ドロップ文化をぶら下げすることにより調製初代ヒト肝スフェロイドを、カプセル化し、堆積させるために使用されました。細胞培養環境の様々な強固なハンドリングと転送のために許可されたプラスチックカバースリップ上に印刷されています。 bioprinting後、こんにちは肝臓の構築におけるGH細胞生存率は、LIVE / DEAD生存性/細胞毒性染色および共焦点顕微鏡（ 図4A）の後に観察されました。最適な環境条件の下では生存率が85％以上である必要があります。初代ヒト肝細胞は、一般的に、環境変数のいくつかの最適化が必要な機械的および化学的ストレスに敏感であると考えています。 bioprintingおよび生存率の検証に続いて、培養物中に配置されている追加の肝臓の構築物は、分泌された尿素およびアルブミンの分析のために3日目、7日目、10日目、および14日目に培地を除去しアリコートを分析することによって、機能性について評価することができます。尿素比色アッセイは、15および20 ng / mlで（ 図4B）との間で、残りの、14日間の時間経過にわたって肝臓の構造からの尿素分泌の比較的一貫したレベルを明らかにしました。検出された尿素レベルは異なる時点で互いに有意に異なっていませんでしたポイント。ヒトアルブミンELISAアッセイは、構造からのアルブミン生産も125と140 ng / mlで（ 図4C）との間で安定して残り、時間の経過とともに比較的一定のままであることを明らかにしています。また、発現されたタンパク質（肝臓組織、細胞内アルブミンの陽性発現、CYP3A4（代謝に関与するチトクロームP450アイソフォーム）、E-カドヘリン（上皮細胞間接着タンパク質）を示すマーカーについて染色し、ジペプチジルペプチダーゼ4時高い肝臓における）（ 図4D-F）が観察されます。まとめると、この生存率および機能データは、組織特異的ヒドロゲルはbioprinted初代細胞系肝構築物の生存能力および機能を維持する助bioinkことを示唆しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53606/53606fig1.jpg" /> 図1. ハイドロゲルの成分特性評価および剛性評価。 A）成長因子および肝臓から調製したECMソリューションのためのプロテオミクスアレイによるサイトカイン分析。B）、コラーゲン、グリコサミノグリカン、および肝臓のECMソリューションにおけるエラスチン含有量の比色分析の定量化。bioink剛性を制御する能力のC）実証。ステージ1の架橋後、ゲルは、比較的柔らかく、滑らかに押し出すことが可能です。肝組織の弾性率を模倣するUV光によるステージ後2架橋、桁を超えて弾性率が増加します。エラーバーは標準偏差を示す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53606/53606fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53606/53606fig2.jpg" /> 押出bioprintingおよび組織を制御するための複数のPEG系架橋剤は、機械的性質を構築採用2.図。Sアクリレート系架橋剤（架橋剤1）、アルキンベースの架橋剤（架橋剤2）から成る印刷可能なbioinksの製剤のtrategyは、HAをチオール化、ゼラチン、組織のECM材料、および未修飾HAとゼラチンをチオール化。 bioink製剤を調製し、自然に柔らかく、押出可能材料で、その結果、結合チオール - アクリレートを介して架橋されています。 Bioprintingが行われます。最後に、bioprinted層が溶融され、安定化、および肝臓弾性率にしました。このプロセスは、多層構造を生成するために繰り返すことができる。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53606/53606fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53606/53606fig3.jpg" /> bioinks 図 3 Bioprinting試験。A） は、7×7 mm巻きパターンbioink押出試験に使用しましたbioprinterでる。B）PEGDAと8アームPEGアルキンbioinkの初期製剤は、不規則な堆積をもたらした。C）bioinkの円滑な押し出し、その結果、生のHAおよびゼラチン改善された押出を追加します。スケールバー- 。1ミリメートル<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53606/53606fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53606/53606fig4.jpg" /> 生存率および肝臓特異的ヒドロゲルbioink。A）bioprintingのための肝臓bioinkの実装にbioprinted肝スフェロイドの機能の 図4. デモンストレーションは 、高い生存能力構築をもたらしました。グリーン - AM染色生存細胞をカルセイン。レッド- 。肝臓が分泌するエチジウムホモダイマー染色された死細胞B）尿素およびC）アルブミンは14日の上に構築します文化の中でAYSは、それぞれ、比色およびELISAアッセイによって定量しました。エラーバーは標準偏差を示します。肝臓組織に関連するマーカーの免疫染色：D）CYP3A4、E）細胞内アルブミン、およびF）DPP4とE-カドヘリン。緑または赤 - 染色を示しました。ブルー- 。DAPI <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53606/53606fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting細胞化は、組織特異的ヒドロゲルBioinkを使用して構築します

我々は、一緒に機能し、生存可能な3次元組織構築物はインビトロスクリーニング用途に使用するためbioprinted可能な組織を模倣ヒドロゲルbioinkを提供するプロトコルのセットを記述する。

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

bioprinting-cellularized-constructs-using-tissue-specific-hydrogel

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.6K ビュー.  Wake Forest Univeristy Health Sciences. 我々は、一緒に機能し、生存可能な3次元組織構築物はインビトロスクリーニング用途に使用するためbioprinted可能な組織を模倣ヒドロゲルbioinkを提供するプロトコルのセットを記述する。 

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Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of this hydrogel are two protein block-copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. A highly hydrophilic random coil is inserted into one of the block-copolymers for water retention. Mixing of the two protein block copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit with crosslinkers at either end that rapidly self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is very stable under both acidic and basic conditions, at temperatures up to 50 &#176;C, and in organic solvents. The hydrogel rapidly reforms after shear-induced rupture. Incorporation of a &#34;docking station peptide&#34; into the hydrogel building block enables convenient incorporation of &#34;docking protein&#34;-tagged target proteins. The hydrogel is compatible with tissue culture growth media, supports the diffusion of 20 kDa molecules, and enables the immobilization of bioactive globular proteins. The application of the intein-mediated protein hydrogel as an organic-solvent-compatible biocatalyst was demonstrated by encapsulating the horseradish peroxidase enzyme and corroborating its activity.

We present the synthesis of a split-intein-mediated protein hydrogel. The building blocks of this hydrogel are two protein copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. Mixing of the two protein copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit that self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is highly pH- and temperature-stable, compatible with organic solvents, and easily incorporates functional globular proteins.

インテイン媒介人工タンパク質ヒドロゲルの合成

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

生物工学

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

エンジニアリング3D細胞化血管組織再生のためのコラーゲンゲル

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

三ディスペンサーデカルトプリンタを使用してBioprinted細胞構築物の生存率

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using an automated robotic dispensing system. The particular bioink was selected as it allows cells to sediment towards and sense the features. The dispensing system bioprints viable cells in hydrogel bioinks using a backpressure assisted print head. However, by replacing the print head with a sharpened stylus or scalpel, the dispensing system can also be employed to create topographical cues through surface etching. The stylus movement can be programmed in steps of 10 &#181;m in the X, Y and Z directions. The patterned grooves were able to orientate mesenchymal stem cells, influencing them to adopt an elongated morphology in alignment with the grooves&#39; direction. The patterning could be designed using plotting software in straight lines, concentric circles, and sinusoidal waves. In a subsequent procedure, fibroblasts and mesenchymal stem cells were suspended in a 2% gelatin bioink, for bioprinting in a backpressure driven extrusion printhead. The cell bearing bioink was then printed using the same programmed coordinates used for the etching. The bioprinted cells were able to sense and react to the etched features as demonstrated by their elongated orientation along the direction of the etched grooves.

This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

細胞の表面のガイダンスとBioprintingための自動ロボット調剤技術

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

3D Bioprintingを用いたスフェロイドの機械的統合を示す心臓組織の創出

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

軟骨と皮膚組織類縁ミキシング ユニット Bioink Precellularization の小説のパッシブ バイオプリンティング

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Design of an Open-Source, Low-Cost Bioink and Food Melt Extrusion 3D Printer

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling costs. This increasing popularity is partly driven by falling barriers to entry such as system set-up costs and ease of operation. The following protocol presents the design and construction of an Additive Manufacturing Melt Extrusion (ADDME) 3D printer for the fabrication of custom parts and components. ADDME has been designed with a combination of 3D-printed, laser-cut, and online-sourced components. The protocol is arranged into easy-to-follow sections, with detailed diagrams and parts lists under the headings of framing, y-axis and bed, x-axis, extrusion, electronics, and software. The performance of ADDME is evaluated through extrusion testing and 3D printing of complex objects using viscous cream, chocolate, and Pluronic F-127 (a model for bioinks). The results indicate that ADDME is a capable platform for the fabrication of materials and constructs for use in a wide range of industries. The combination of detailed diagrams and video content facilitates access to low-cost, easy-to-operate equipment for individuals interested in 3D printing of complex objects from a wide range of materials.

The aim of this work is to design and construct a reservoir-based melt extrusion three-dimensional printer made from open-source and low-cost components for applications in the biomedical and food printing industries.

オープンソース、低コストのバイオインク、食品溶融物押出3Dプリンタの設計

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

3D細胞-細胞-膵組織コンストラクトを印刷するための膵組織由来細胞外マトリックスバイオインク

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed from mammal collagen. Thus, the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequences and target motifs of matrix metalloproteinase (MMP) remain on the molecular chains, which help achieve cell attachment and degradation. Furthermore, formation properties of GelMA are versatile. The methacrylamide groups allow a material to become rapidly crosslinked under light irradiation in the presence of a photoinitiator. Therefore, it makes great sense to establish suitable methods for synthesizing three-dimensional (3D) structures with this promising material. However, its low viscosity restricts GelMA's printability. Presented here are methods to carry out 3D bioprinting of GelMA hydrogels, namely the fabrication of GelMA microspheres, GelMA fibers, GelMA complex structures, and GelMA-based microfluidic chips. The resulting structures and biocompatibility of the materials as well as the printing methods are discussed. It is believed that this protocol may serve as a bridge between previously applied biomaterials and GelMA as well as contribute to the establishment of GelMA-based 3D architectures for biomedical applications.

Presented here is a method for the 3D bioprinting of gelatin methacryloyl.

ゼラチンメタクリロイルヒドロゲルベースバイオインクの3Dバイオプリンティングのプロトコル

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by shear stress and improve the survival of the encapsulated cells. However, rapid gravity-driven cell sedimentation in the reservoir could lead to an inhomogeneous cell distribution in bioprinted structures and therefore hinder the application of liquid-like bioinks. Here, we developed a novel multilayered modified strategy for liquid-like bioinks (e.g., gelatin methacryloyl with low viscosity) to prevent the sedimentation of encapsulated cells. Multiple liquid interfaces were manipulated in the multilayered bioink to provide interfacial retention. Consequently, the cell sedimentation action going across adjacent layers in the multilayered system was retarded in the bioink reservoir. It was found that the interfacial retention was much higher than the sedimental pull of cells, demonstrating a critical role of the interfacial retention in preventing cell sedimentation and promoting a more homogeneous dispersion of cells in the multilayered bioink.

Here, we developed a novel multilayered modified strategy for liquid-like bioinks (gelatin methacryloyl with low viscosity) to prevent the sedimentation of encapsulated cells.

均質な細胞分布のための三次元バイオプリンティングにおける多層ヒドロゲルバイオインクの使用

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by ...