This work was funded by the National Science Foundation (CBET 0845754, AHH).

1. הכנה להרכבת דיסקים אלגינט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 4% (w / v) פתרון אלגינט ב בופר פוספט של 1x Dulbecco ללא סידן כלורי הוסיף או מגנזיום כלוריד ומקום באמבט המים 37 מעלות צלזיוס. ריכוזים של פתרון אלגינט יכולים להשתנות, אבל 1 - 4% (w / v) פתרונות אלגינט מומלצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב את הפתרון אלגינט ביחס של 1: 1 עם בסיס תקשורת תרבית תאים חם (למשל, בינוני הנשר השונה של Dulbecco.) עבור סוג התא הרצוי. ריכוז אלגינט הוא עכשיו מחצית הריכוז המקורי, כלומר., 2% (w / v). לעקר פתרון אלגינט / מדיה באמצעות מסנני מזרק 0.2 מיקרומטר ניילון סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אמבט של מימית סידן כלורי סטרילי 102 מ&quot;מ במים סטריליים עם פתרון מספיק כדי להטביע תבניות (~ 200 - 300 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את סטרילי &quot;היווצרות קריש העובש&quot; (6 מ&quot;מ קוטר x 3 מ&quot;מ בארות גליליות גבוהות בתוך 3 x 3 לוחית אלומיניום, ראה <strong&gt; איור 1) ו endplates (תחתונה: אחד 3 x 3 לוחית אלומיניום, למעלה: אחד 1.5 אינץ &#39;x 3 לוחית אלומיניום) ולהכין תבניות כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכי נייר סינון עבה (נייר סינון נייר סופג) ואת קרום התא microsieve (10 מיקרומטר גודל נקבובי) את הגדלים של העליון endplates התחתונה ומניח אותם באמבטית סידן כלורי עד רווי, כ 1 דקות. אם תרצה, לעקר את נייר סינון העבה קרום microsieve באמצעות אור אולטרה סגול חיטוי או למשך 30 דקות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרה למחצית (חצי התחתונה) של מבנה העובש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הפריטים הבאים על גבי אחד אחר לפי הסדר הבא ו להחליק בעזרת מרית סטרילי: endplate גדול (3 אינץ &#39;x 3), נייר סינון עבה, ולאחר מכן קרום microsieve. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך ולחץ על עובש על ערימה של מגבות נייר כדי להבטיח הפסד של פתרון כלוריד סידן עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את &quot;עובש היווצרות קריש&quot; עם הבארות הגליליות על גבי גell microsieve קרום בעדינות להדק את התבנית יחד על שני הצדדים באמצעות קליפים קלסר על שמאל ובצד ימין. הקפד להשאיר מספיק מקום עבור endplate העליון (1.5 x 3) כדי לכסות את הבארות לחלוטין מאוחר יותר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרה במחצית השנייה (חצי העליונה) של מבנה העובש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הפריטים הבאים על גבי אחד אחר לפי הסדר הבא ואת smoothen: endplate קטן, נייר סינון עבה, קרום microsieve. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך ולחץ המחצית של עובש על ערימה של מגבות נייר כדי להבטיח הפסד של פתרון כלוריד סידן עודף. אל תהדק המחצית של עובש באמצעות קליפים קלסר בשלב זה. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאים מומלצים לפי הוראות יצרן. קציר התאים הרצויים להטבעה הידרוג אלגינט השכבתית. צפיפות התאים המומלצת היא 1 - 2 x 10 6 תאים / מיליליטר, אבל זה יכול להיות מגוון בהתאם ניסויים רצויים. הערה: בעת שימוש בשיטה זולהכנת שכבות עם תאים מסוגים שונים, הקפידו סוגי תאי תרבות שניהם במקביל עבור שכבות. בתאי גזע mesenchymal (MSCs) זורעים בצפיפות תא של 1 x 10 6 תאים / מ&quot;ל ישמש כדוגמה בפרוטוקול הבא. מספר סלולרי ומספר דיסק וניתן לשנותם לניסויים לפי הצורך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבוע עד שבועיים לפני הטבעה, תאי גזע זרע mesenchymal בצפיפות תא של 3,000 - 5,000 תאים / 2 ס&quot;מ ב 10 מ&quot;ל של התקשורת צמיחה הבזליים (בינוני הנשר שונה של Dulbecco, 10% בסרום שור עוברית, 2% L-Glutamine, 1 שאינם חיוניים% חומצות אמינו, 1% פניצילין / סטרפטומיצין) צלוחיות T-75. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר מדיה בזבזה כל 2 - 3 ימים ולהחליף עם 10 מיליליטר של תקשורת צמיחה הבזליים עד שהתאים הם 80 - 90% ומחוברות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקצור תאים, להסיר התקשורת בילו, פיפטה 3 מ&quot;ל של בופר פוספט של 1x Dulbecco ללא סידן כלורי הוסיף או מגנזיום כלוריד כדי לשטוף תאים. הסר פתרון זה, פיפטה 3 מ&quot;ל של נסה 0.25%psin-EDTA על תאים הגדלים צלוחיות T-75, ו דגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר התאים נוקף מפני השטח החסיד, להוסיף 6 - 9 מיליליטר של תקשורת צמיחה הבזליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MSCs צנטריפוגה ב 600 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, לשאוב supernatant, מחדש להשעות ב 1 - 5 מ&quot;ל של התקשורת צמיחה הבזליים. ספירת התאים באמצעות hemocytometer באמצעות הוראות התקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר 1 x 10 6 תאים מן resuspension התא הכולל, צנטריפוגה באמצעות אותם התנאים, ואת לשאוב supernatant. </li></ol></li></ol> 2. כינונה של דיסקי אלגינט Seeded ניידים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות את התא גלולה עם 1 מ&quot;ל של הפתרון אלגינט / מדיה סטרילי כדי להשיג צפיפות התאים של 1 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. תערובת התא-אלגינט תהיה מעונן homogenously במראה כאשר תאים מעורבבים כראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 130 μl של התערובת אלגינט תא לשש 6 מ&quot;מ קוטר x בארות גבוהות 3 מ&quot;מ במחצית התחתונה של העובשלבנות dropwise, כדי לא ליצור בועות. המניסקוס קמור קל צריך להיות גלוי מעל הקצה של כל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להחליק את המחצית העליונה של מבנה העובש בעזרת מרית סטרילי והפוך אותו, כך קרום התא microsieve הוא על גבי הבארות. מניחים את התבנית לבנות על גבי בארות, והקפד לכסות את הבארות המכיל את התא תערובת אלגינט לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את מבנה עובש טעון, תוך כדי לחיצה כלפי מטה בחוזקה על מרכז, קלסר קליפ שני הצדדים הנותרים (העליון והתחתון) להדק את חצאי העליון והתחתון של המבנה עובש. הפתרונות-אלגינט התא צריך להיות השוכן בבטחה בארות בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את מבנה עובש מהודק באמבטיה כלוריד 102 מ&quot;מ סידן, ולוודא כי המבנה כולו הוא שקוע. מדגירים את מכסה המנוע תרבית תאים בטמפרטורת החדר למשך 90 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף של 90 דקות, להסיר את מבנה התבנית מן כלוריד סידן 102 מ&quot;מאמבטיה ומניח על ערימה של מגבות נייר בשכונת תרבית תאים. הסר את כל הארבעה מהדקים להפריד בין שני החצאים של מבנה העובש. הידרוג נוצר הבארות לא צריך שום בועות וצריך למלא את הבארות לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מרית, בזהירות להתחקות קצה בארות המכיל את הידרוג כדי לשחרר בזהירות טריז את הידרוג. לאחר הסרת הידרוג מן המבנה עובש, ושחרר את הידרוג ישירות לתוך אמבט של בופר פוספט של 1x Dulbecco עם כלוריד סידן מגנזיום כלוריד. מכסה את ג&#39;ל לחלוטין לשטוף פתרון כלוריד סידן העודף עבור 1 - 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את הידרוג לתוך פתרון תקשורת צמיחה הבזליים בצלחת רצויה (למשל., 6 צלחות גם) המכסה את הידרוג לחלוטין. דגירה במשך שעה 1 לפחות בחממת תרבית תאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לפני שתמשיך לשלב השכבות. הערה: הידרוג המכיל תאים יכול להישמרחממת תרבית תאים ללא הגבלה זמן בשלב זה עד שכבות של ג&#39;ל עם אוכלוסיית תא אחרת היא רצויה, ובלבד שינויי תקשורת הושלמו כל 2 - 3 ימים. </li></ol> 3. שכבות של דיסקים אלגינט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך חצי השעה האחרונה של דגירה 1 hr, לאסוף ולהכין תבניות סטרילית פתרון חישול הג&#39;לים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את &quot;עובש החיתוך&quot; על ידי הידוק עובש כי יש חצי בארות של הגובה של &quot;עובש היווצרות הקריש&quot; (6 מ&quot;מ קוטר x 1.5 בארות גבוהות מ&quot;מ בתוך 3 x 3 לוחית אלומיניום) אל endplate (3 x 3 ב לוחית אלומיניום) באמצעות קליפים קלסר על שמאל ובצד ימין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את &quot;עובש החישול&quot; על ידי הידוק עובש כי הוא 3 מ&quot;מ גדול יותר בקוטר מאשר &quot;עובש היווצרות הקריש&quot; (9 מ&quot;מ קוטר x 3 מ&quot;מ בארות גבוהות בתוך 3 x 3 לוחית אלומיניום) אל endplate (3 x 3 ב לוחית אלומיניום) באמצעות קליפים קלסר על שמאל ובצד ימין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון שלנתרן ציטרט 100 מ&quot;מ / 30 מ&quot;מ EDTA (מימית נתרן ציטרט, מימית מלח tetrasodium חומצה ethylenediaminetetraacetic) במים סטריליים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר ג&#39;לים של אוכלוסיות תאים רצויות (בדוגמא זו, שני דיסקים עם hMSCs) מהתקשורת בצלחת, והמקום לתוך בארות &quot;חיתוך עובש&quot;. ג&#39;ל כל צריך להתאים בנוחות לתוך הבארות עם מחצית ג&#39;ל בולטת מעל התבנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל, לחתוך את הג&#39;ל על פני השטח של עובש (זה יקצץ הידרוג&#39;ל לשניים). תהפוך את החצי העליון של ג&#39;ל ולמקם אותו לתוך באר עובש פתוח. החצי של הג&#39;ל צריך גם להתאים בנוחות לתוך התבנית היטב, אבל עכשיו הוא ג&#39;לי חצי צריכים להיות בגובה של העובש עם המשטח הפנימי לחתוך גלוי. חזור עם ג&#39;ל שני. הערה: אזהרה: רק משטחי החתך הפנימיים יהוו דיסקים שכבתיים. שימוש המשטחים החיצוניים תגרום הפרדה חצאים. על פי החשד, מרקם מן הקרום microsieve מועברים על גבי משטח ג&#39;ל למנועהצלחה של תהליך החישול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פיסת קרום microsieve תא יבש על גבי בארות, ולוודא כי הממברנה microsieve נמצא בקשר עם כל חצאי ג&#39;ל להיות מרותק ומכסה אותם לגמרי. מניחים נייר פילטר עבה על גבי קרום microsieve, והקפד לכסות את הג&#39;לים לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה פתרון של נתרן ציטרט 100 מ&quot;מ / 30 מ&quot;מ EDTA (מימית נתרן ציטרט, מימית מלח tetrasodium חומצה Ethylenediaminetetraacetic) על נייר הסינון עבה עד שהוא רווי. כ 750 μl מספיק במשך ארבע בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ג &#39;לים 1 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להסיר את קרום התא microsieve ונייר מסנן עבה וזורק אותן. הסר את הסרטונים קלסר ופתח את התבנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל ג&#39;ל annealed, להעביר נתרן ציטרט אחד / חצי שטופלו EDTA של הידרוג&#39;ל אל &quot;עובש חישול&quot; מוכן עם המשטח החתוך כלפי מעלה. זה יהיה מחצית אחת const annealedruct. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מרית, להרים ולמקם וחצי-ג&#39;ל נתרן ציטרט השני / שטופלו EDTA (עשוי להכיל סוג תא אחר) על ג&#39;ל כבר &quot;עובש חישול&quot;, מרפרף-ג&#39;ל במחצית השנייה זה כך את פני השטח חתך נמצא במגע עם פני שטח החתך של ג&#39;ל כבר &quot;עובש החישול&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצו בעדינות על שני ג&#39;לים בעזרת מרית כדי להסיר בועות כלשהו בין שני הג&#39;לים. כמו כן, למקם את הג&#39;לים לפי הצורך לוודא כי הם ישירות על גבי זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם בעדינות את &quot;עובש חישול&quot; לצלול אותו באמבט כלוריד סידן 102 מ&quot;מ במשך 30 דקות. אין לכסות את הבארות עם endplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה 30 דקות, להסיר את &quot;עובש חישול&quot; והנח אותו על מגבות נייר. הסר את הסרטונים קלסר ולהפריד את התבנית מן endplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מרית, לאסוף את הג&#39;לים annealed ומניחים אותם לתוך בופר פוספט של 1x Dulbecco עם כלוריד סידן מאמבטיה כלוריד agnesium לשטוף את הג&#39;לים. בהמשך לכך, להעביר הידרוג מרותק אל תקשורת תרבית תאים בצלחת רצויה (למשל., 6-גם צלחת) לתרבות. </li></ol>

<ol>
	<li>Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Basic+Science+of+Articular+Cartilage.">The Basic Science of Articular Cartilage.</a> Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).</li><li>Neidlinger-Wilke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+loading+of+the+intervertebral+disc:+from+the+macroscopic+to+the+cellular+level.">Mechanical loading of the intervertebral disc: from the macroscopic to the cellular level.</a> Eur. Spine J. 23 (3), 333-343 (2013).</li><li>Klein, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+of+stratified+articular+cartilage+from+chondrocyte+subpopulations.">Tissue engineering of stratified articular cartilage from chondrocyte subpopulations.</a> Osteoarth. Cartilage. 11 (8), 595-602 (2003).</li><li>Han, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+Grafts+for+Articular+Cartilage+Defects.">Scaffold-free Grafts for Articular Cartilage Defects.</a> Clin. Orthop. Relat. R. 466 (8), 1912-1920 (2008).</li><li>Ng, K. W., Ateshian, G. A., Hung, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zonal+chondrocytes+seeded+in+a+layered+agarose+hydrogel+create+engineered+cartilage+with+depth-dependent+cellular+and+mechanical+inhomogeneity.">Zonal chondrocytes seeded in a layered agarose hydrogel create engineered cartilage with depth-dependent cellular and mechanical inhomogeneity.</a> Tissue Eng. A. 15 (9), 2315-2324 (2009).</li><li>Ng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+layered+agarose+approach+to+fabricate+depth-dependent+inhomogeneity+in+chondrocyte-seeded+constructs.">A layered agarose approach to fabricate depth-dependent inhomogeneity in chondrocyte-seeded constructs.</a> J. Orthop. Res. 23 (1), 134-141 (2005).</li><li>Nguyen, L. H., Kudva, A. K., Saxena, N. S., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+articular+cartilage+with+spatially-varying+matrix+composition+and+mechanical+properties+from+a+single+stem+cell+population+using+a+multi-layered+hydrogel.">Engineering articular cartilage with spatially-varying matrix composition and mechanical properties from a single stem cell population using a multi-layered hydrogel.</a> Biomaterials. 32 (29), 6946-6952 (2011).</li><li>Leone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+multilayered+composite+hydrogel+as+osteochondral+substitute.">Continuous multilayered composite hydrogel as osteochondral substitute.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 103 (8), 2521-2530 (2015).</li><li>Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+catalyze+cartilage+formation+by+neonatal+articular+chondrocytes+in+3D+biomimetic+hydrogels.">Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels.</a> Sci. Rep. 3, (2013).</li><li>Vigf&#250;sd&#242;ttir, &. #. 1. 9. 3. ;. T., Pasrija, C., Thakore, P. I., Schmidt, R. B., Hsieh, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Pericellular+Matrix+in+Mesenchymal+Stem+Cell+Deformation+during+Chondrogenic+Differentiation.">Role of Pericellular Matrix in Mesenchymal Stem Cell Deformation during Chondrogenic Differentiation.</a> Cell. Mol. Bioeng. 3 (4), 387-397 (2010).</li><li>Lee, C. S. D., Gleghorn, J. P., Won Choi, N., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+layered+chondrocyte-seeded+alginate+hydrogel+scaffolds.">Integration of layered chondrocyte-seeded alginate hydrogel scaffolds.</a> Biomaterials. 28 (19), 2987-2993 (2007).</li><li>Gleghorn, J. P., Lee, C. S. D., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+properties+of+laminated+alginate+gels+for+tissue+engineering+of+layered+structures.">Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 85 (3), 611-618 (2008).</li><li>Gharravi, A. M., Orazizadeh, M., Ansari-Asl, K., Banoni, S., Izadi, S., Hashemitabar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Fabrication+of+Anatomical+Bioreactor+Systems+Containing+Alginate+Scaffolds+for+Cartilage+Tissue+Engineering.">Design and Fabrication of Anatomical Bioreactor Systems Containing Alginate Scaffolds for Cartilage Tissue Engineering.</a> Avicenna J. Med. Biotechnol. 4 (2), 65-74 (2012).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Three-Dimensional+Alginate+Gels.">Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells in Three-Dimensional Alginate Gels.</a> Tissue Eng. A. 14 (5), 667-680 (2008).</li><li>Yeatts, A. B., Gordon, C. N., Fisher, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+an+aggregated+alginate+construct+in+a+tubular+perfusion+system.">Formation of an aggregated alginate construct in a tubular perfusion system.</a> Tissue Eng. C, Methods. 17 (12), 1171-1178 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירת תקליטורי הידרוג&#39;ל אלגינט שכבתיים ללימוד שיתוף תרבויות של אוכלוסיות תאים מרובות, כגון אלה ברקמות שכבתיות פיסיולוגי, למשל, סחוס. מבנים שכבתיים, כגון פלטפורמת התרבות המתוארת, יכולים לשמש כדי לבחון את יחסי הגומלין בין שתי אוכלוסיות תאים מובחנות נתונות באותה סביבת התרבות או תחת עומס. אלגינט הוא פוליסכריד ליניארי anionic כי כבר מצא להיות ביולוגיים שמש בהצלחה למחקר הנדסת ביולוגית סחוס ורקמות 12,14. הידרוג אלגינט נוצר באמצעות קטיונים divalent עבור crosslinking, למשל., יוני סידן. Crosslinks אלה ניתן לבטל על ידי הסרת קטיונים באמצעות chelator, כגון נתרן ציטרט או EDTA, ותהליך זה כבר השתמשו בעבר כדי לבודד chondrocytes כי כבר מתורבת בג&#39;לים 3,4,12. באופן דומה, אותו העיקרוןגם יושם בהצלחה לדבוק גליונות אלגינט ב bilayers או אפילו אשכולות של חרוזים אלגינט ביחד 11,12,15. הפלטפורמה המתוארת כאן מסתמכת על אותו התהליך, אבל משמשת ליצירת הידרוג שכבתית בצורת דיסק קטנה. זהו תהליך דו-שלבי שבו ראשון, דיסקים אלגינט נוצרים באמצעות תבניות שקועות בתוך אמבט עשיר בסידן. אלו מכן פרוס לשניים מטופלים עם פתרון chelating סידן מקומית לשחרר את יוני סידן מן אלגינט crosslinked. על ידי הצבת מטופלים אלה משטחים יחד מחדש טבילת הדיסקים בתמיסה עשירה בסידן, crosslinks הוא רפורמה, מה שהופך מבנים דו-שכבתיים. ג&#39;לים השכבתי הקטן אלה לבטל את צורך אגרופי ביופסיה כדי ליצור וקלות תרבות דגימות תואמות מבחנים וניסויים כגון בדיקות מכאניות, כפי שמוצג באיור 4, ובכך לצמצם בזבוז של תאים יקרים לעתים קרובות כמו גם חומרי ייצור. כפי שניתן לראותאיור 3, תהליך זה של יצירת שכבות הידרוג הביא כדאיויות גבוהות באופן דומה כמו השליטה או הידרוג&#39;ל בתפזורת המציין כי הליך זה אינו מפרך מדי לאוכלוסיית התא למרות האורך והיעדר חומרים מזינים חידוש. חוסר אזור חופפים ראשוני בתוך הג&#39;ל מאפשר הפרדה פיזית במהלך שיתוף התרבות ראשונית ואת היכולת להתבונן שינויים בממשק כי לאורך זמן. מחקרים הראו כי לאורך תקופות תרבות ארוכות ממשק זה עלול לאבד הגדרה בשל-חדיר צלב הסלולר בתצהיר תאי מטריקס 11. כשהדיסק השכבתי הראשוני אינו מכיל מולקולות דבקות, כפי מופקדים תאי מטריקס, יש גם פוטנציאל חוקר את ההתמזגות של אוכלוסיות תאים ואת ממשק השינוי בין השכבות. דיסקים דו-שכבתי אלה יכולים לשמש בקלות לגירוי דחיסה דינמית. הצלחנו לאשר thes<html> הידרוג דואר לעמוד דחיסה דינמית ללא הפרדה של שתי המחציות. עם זאת, במהלך תהליך זה, עומס שיא הוצג על ידי הידרוג השכבתי במהלך הדחיסה המחזורית ארבע השעות נמצאו להיות שונה באופן מהותי מן הלא-השכבתית, בתפזורת, הידרוג&#39;ל. תוצאה זו מרמזת העברת זן מורכבת, שאינה ליניארי בין השכבות וחושפות צורך ג&#39;ל שליטת שכבות פיזית, למשל., דו-שכבתי הידרוג&#39;ל עם תא אוכלוסייה / מצב זהה בכל שכבה, פרט חשוב לציין בעת תכנון עיצוב ניסיוני עבור מחקרים שכללו העמסה מכנית. הבנה טובה יותר של ההבדלים שנצפו יכולה להיות מושגת באמצעות מודלים חישוביים של מכניקת מרחבים בתוך ג&#39;ל אלו. לא זו בלבד שניתוח כזה הוא לעזור להבהיר את חלוקת המתח והעביר בין השכבות, אבל זה גם יהיה אינסטרומנטלי לפירוש התנהגות הסלולר ג&#39;ל השכבתית אלה, במיוחד עם שכבות של משתנה תכונות מכאניות. = &quot;Jove_content&quot;&gt; זוהי מערכת התרבות צדדי, שניתן להשתמש בהם עבור הפרדה פיזית של אוכלוסיות תאים במהלך שיתוף התרבות כמתואר. בנוסף, הוא יכול גם לשמש כמבנה בסיס להמשך פיתוח. שינויים במבנה הקיים יכולים לכלול הגדלת מספר השכבות, לשנות את הגדלים או נוקשות היחסיות של השכבות, ושילוב רכיבים תאים מטריקס נוסף לתוך אחד או יותר של השכבות. עם זאת, הרחבות אלה ידרשו הערכה זהירה. בנוסף לשינויים בחלוקת הכוחות ברחבי הדיסקים, הגדלת הגודל ומספר השכבות יכולות להוביל לירידות כדאי תא במרכז הג&#39;לים וחוסר היציבות פיזית במהלך גירוי מכאני. יתר על כן, תוספות גדולות של תאי מטריקס ומגרתי חלבונים או שינויים אל אלגינט לספק moieties הדבקה עלול להפריע לתהליכי היווצרות חישול ג&#39;ל. ווה פלטפורמת תרבות זושעות שפותחו עבור יישומי מחקר על חקירת היחסים בין אוכלוסיות תאים שונות בתרבות 3D. לפיכך, הוא מוגבל על ידי חוסר של הרחבה עבור יישומים קליניים. שיטות חלופיות ליצירת הידרוג שכבתית, כגון הדפסת 3D, עשויות בסופו של דבר להיות יותר רלוונטי מבחינה קלינית בשל התקדמות מדרגיות עתידית צפויה, שליטה על מייקרו בפנים הדיסק, ואת ההתאמה אישית של תכונות גיאומטריות macroscale. עבור יישומי מחקר, כפי שהוצג כאן, את הדיסקים אלגינט אינם מספקים moieties הדבקה באופן עצמאי עבור תאים, אשר יכולה להגביל את תחולתו סוגי תאים אחרים. החלופה להשוות אלגינט כאשר בוחנים קלות השימוש היא agarose, הסובלת ממגבלות דומות. יתר על כן, זה מחייב שימוש של אנזימים לשחרר תאים לניתוח במורד הזרם, תוך crosslinks אלגינט להיות יכול להסיר בבטחה באמצעות סוכני chelating סידן. בראש ובראשונה, פלטפורמת תרבות זו תסייע בשיפור understanding של יחסים בין אוכלוסיות תאים הידרוג ואפשרות את ההשפעות של גירוי מכני של שיתוף תרבויות אלה. הבנה זו מכן תודיע בפיתוח שיטות ריפוי רקמות הטרוגנית, במיוחד טעינת רקמות נושאות כגון סחוס במפרק או לדיסקים.

לטעון דחיסת נושאות ברקמות כגון סחוס במפרק או לדיסקים מורכבות אזורי רקמות הטרוגנית כי הם קריטיים עבור שניהם הפונקציה ביומכנית ו-התמר mechano המתאים בתוך הרקמה. לא רק ארגון הסלולר לתפקד ברור באזורים שונים, אך המטריצות התאיות (ECM) הן מגוונים גם בהרכב וארגון. לדוגמא, סחוס במפרק מורכב משלושה אזורים עיקריים עם מורפולוגיה תאים שונה, פונקציה מכאנית, ECM. הבדלים בעופרת ECM שלהם דיפרנציאלי אחריות נושאי העומס; השכבה השטחית מעורבת בעיקר לצורך מתן המענה המתיח לטעון, בעוד האזורים באמצע והעמוקים אחראים בעיקר בתגובת הדחיסה 1. בדומה לכך, הדיסק הבין חולייתי, pulposus גרעין דמוי ג&#39;ל מוקף סיסטיק שבשבת annulus והתאים בתוך שני אלה תחומים ברורים לחוות סוגים שונים של גירויים biophysical2. בסוגים אלה של רקמות, תאים ואת המטריצות התאיות בתוך שכבות הרקמה לתקשר אחד עם השני כמו הרקמה עוברת ומגיבה כוחות מכאניים. חזרה על מבנים רקמות הטרוגנית כזה עדיין מהווה אתגר בהנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית, ואת הבנתנו המשמעות הביולוגית שלהם מוגבל. יש צורך culturing פלטפורמות לניתוח רקמות מרובדת כמו גם שיתוף תרבויות של אוכלוסיות שונות של תאים בתוך מבנה אחד. בהנדסת רקמות סחוס במפרק, פיגום פחות שכבתי מבנים נבנו על ידי רתימת היכולת של כונדרוציטים אזורים להפקיד ECM המגוונת לחקות את השכבות השונות של רקמה זו 3,4. עם זאת, בונת הידרוג&#39;ל שכבתית לספק הזדמנות לחקור את האינטראקציה של סוגים שונים של אוכלוסיות תאים חסרות היכולת ליצור רקמות חזקות באופן עצמאי. לדוגמה, פופ שונהulations של בתאי גזע mesenchymal יכול להיות שיתוף תרבותי בתוך מבנים שכבתיים. פיגומים שכבתיים כאלה שמשו בשני chondrocytes ומבדל בתאי גזע mesenchymal עבור הנדסת רקמות משופרת 5. לא רק יכולים אוכלוסיות תאים שונות להיות שיתוף תרבותי בשכבות הידרוג&#39;ל דומות, אבל סוג תא בודד יכול גם להיות מתורבת בתוך שכבות כי נפלו קורבן למניפולציות יש קשיחות משתנית או תוכן ביוכימיים לעורר תגובות שונות מתאי 6,7. הידרוג ביולוגי שונה רב שנוצל שכבת אוכלוסיות תאים עבור הנדסת רקמות סחוס כגון אלה באמצעות פוליאתילן גליקול או בסיסים ויניל אלכוהול פולי 7-9. עם זאת, הידרוג אלגינט אחד biomaterials הפשוטה שממנו ניתן ליצור פיגומים שכבתיים ללימוד אוכלוסיות תאי הטרוגנית שיתוף התרבות. בעוד הידרוג agarose גם נוצר בקלות, הידרוג אלגינט יש ערך המוסף של שמאפשר קלolation של תאים מן המבנה 3-D לניתוח של תאים בודדים, כמו תוארה בעבר 10. במחקרים קודמים, הידרוג אלגינט דו-שכבתי נוצר בסדינים דקים מגיליונות אלה, סעיפים היו פרוסים (למשל., באמצעות אגרוף ביופסיה) עבור יישומים מסוימים כגון ניתוח התוכן ביוכימיים או נכסי גזירת interfacial 11,12. שיטה נוספת להרכבת גליונות אלגינט דק תוארה עם פוטנציאל ריבוד לתוך שכבות מרובות, אך עדיין ידרוש שינוי אל הידרוג&#39;ל לשימוש לבדיקות מכניות 13. כאן, אנו מציגים שיטה ליצירת reproducibly דו-שכבתי דיסקים הידרוג&#39;ל אלגינט לשימוש באוכלוסיות שונות-culturing שיתוף של תאים. פלטפורמת דיסק אלגינט זה הוא בעל מספר יתרונות. בראש ובראשונה, את הצורה לשחזור וגודל קטן הוא מסיע עבור גירוי מכני של תאים משובצים ללא צורך בביופסיה puNCH ​​או שינוי פיזי אחר אל הידרוג&#39;ל עבור יישומים רבים. בנוסף, כדאיויות תא נותרות גבוהות במהלך תהליך השכבות, ולאחר היווצרות קריש הפרדה ברורה של שתי אוכלוסיות התאים בתוך הג&#39;ל גלויה ללא באזור חופפים ראשוני.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="808">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Alginic Acid sodium salt</td>
			<td style="width:180px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1112</td>
			<td style="width:295px;">Solution made in wt% using DPBS (-/-)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">1x Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (-/-)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">1x Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (+/+)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11965</td>
			<td>Example. Use desired medium type</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Syringe Filters (0.02um Nylon)</td>
			<td style="width:180px;">FisherBrand</td>
			<td style="width:119px;">0979C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">BP510</td>
			<td>Prepare solution in sterile water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Criterion Blotter Filter Paper</td>
			<td style="width:180px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1704085</td>
			<td>Cut to size of endplates for mold formation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Cell Microsieve Membrane (10um pore size)</td>
			<td style="width:180px;">Biodesign Inc of New York</td>
			<td style="width:119px;">N10R</td>
			<td>Cut to size of endplates for mold formation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">0.25% Trypsin-EDTA (1x), phenol red</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">25200</td>
			<td>Thaw in 37&#7506;C water bath</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium citrate dihydrate</td>
			<td style="width:180px;">FisherScience</td>
			<td style="width:119px;">S93364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td style="width:180px;">FisherBioreagent</td>
			<td style="width:119px;">BP121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">26140</td>
			<td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Penicilin/Streptomycin (10000 U/ml)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">15140</td>
			<td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">L-Glutamine (200mM)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Non-essential Amino Acids (100x)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11140050</td>
			<td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

layered alginate constructs: a platform for co-culture of heterogeneous cell populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

איור 1 מתאר את היווצרות שכבות של הידרוג אלגינט. הושלם דו-שכבתי ג&#39;לים להפגין הפרדה ראשונית מלאה של אוכלוסיות תאים כפי שמוצג באיור 2. כדאיויות תא של אדם בתאי גזע mesenchymal) מוטבעות בתוך הידרוג אלה שכבתיות נותרת גבוהות להשוות את הידרוג בתפזורת כפי שמוצג באיור 3. הכדאיות הוערכה לאחר חישול, חיתוך הג&#39;לים אנכי כדי לגשת למרכז ולאחר מכן מכתים תאי החיים בג&#39;לים annealed עם גשש תא חי, CMFDA (ירוק) לבין התאים המתים (אדום) עם Ethidium homodimer-1 באמצעות הוראות היצרן. Z-ערימות Confocal נלקחו של משטח לחתוך באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כ 100 מיקרומטר לתוך הג&#39;ל. תמונות אלה הוקרנו לתמונת 2D אחד. תאי חיים ומתים היו אז לכמת באמצעות תכונת מנתח החלקיקים בתוכנת ImageJ. <p<html> Class = &quot;jove_content&quot; FO: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; רצינו לוודא הידרוג השכבתית אלה, חסרי תאים, תהיה מסוגל לעמוד דחיסה מחזורית, בדומה לזאת שצריכה על מנת לעורר תגובת chondrogenic. מצאנו כי הידרוג&#39;ל נשאר ללא פגע לאחר שבעה ימים בתרבות ודחיסה מחזורית unconfined עוקבת עבור 4 שעות ב 1 רץ מן 0 - 10% זן. עם זאת, לאחר לבודד את לחץ השיא מכל מחזור וניתוח המגמות לאורך הגירוי של ארבע שעות, נתוני המגמה מלמדת כי הידרוג&#39;ל השכבתית יש תגובה שונה הדחיסה המחזורית לעומת בתפזורת, הלא-השכבתי, הידרוג&#39;ל. דחיסה מחזורית יותר מארבע שעות הביאו מגמות מתח שיא שונות (p = 0.03) באופן משמעותי בין ג&#39;לים השכבתי והלא-שכבתי (איור 4). סטטיסטיקה הושלמה באמצעות מבחן t (אלפא = 0.05). jpg &quot;/&gt; איור 1:. סכמטי של גיבוש הידרוג&#39;ל Layered א תמונה של העובש המוערם עבור התוספת של אלגינט 2% + תא תערובת עם תיאור של סדר הערימה עבור החצאים העובש התחתונים ועליונים. ב סכמטי המתאר נוהל שכבות של ג&#39;ל. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54380/54380fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54380/54380fig2.jpg" /> איור 2:. הפרדת נציג של אוכלוסיות תאי Layered הידרוג&#39;ל שורת תאי דגם 293FT HEK תאים הוכתמו גם עם CMFDA גשש תא חי (ירוק) או CMTPX (אדום). כל אחת מקבוצות תאים אלה היו משובצים 2% (w / v) דיסקים אלגינט, ולאחר מכן חצאי הדיסקים האלה היו בשכבות יחד. חתיכת נחתך מצד CMTPX לזהות אותו במהלך הדמיה. סרגל קנה מידה = 100 &amp; #181;. מ &#39; <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54380/54380fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54380/54380fig3.jpg" /> איור 3:. כדאיות התא גבוהה תוך הידרוג&#39;ל Layered לאחר Layering שהתהליך יושלם בתאי גזע mesenchymal האדם מוטבע הידרוג בכמויות דו-שכבתית הוכתמו תא חי (ירוק) גשש CMFDA ותאים מתים (אדום) הוכתמו homodimer-1 Ethidium . כדאיות נותרת גבוהה בשתי קבוצות הידרוג&#39;ל לאחר תהליך השכבות. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54380/54380fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54380/54380fig4.jpg" /> Figur. ה 4: מגמות שינויים משמעותית, של Layered הידרוג&#39;ל מחזור דחיסת התגובה מחזורית דחיסת הידרוג הודגרו באינקובטור תרבית תאים במשך שבעה ימים ו נתונה ובהמשך ל 0 - 10% דחיסה מחזורית unconfined במשך ארבע שעות 1 רץ. מדגיש שיא (± SEM) לכל מחזור בודד את המגמות לאורך תקופת הטעינה מנותחת. מגמות תחת דחיסה מחזורית unconfined מן 0 - 10% זן עבור שכבתית (n = 9) וחומרי תפזורת (n = 8) ג&#39;לים שונים באופן משמעותי (p = 0.03). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54380/54380fig4large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations at JoVE.com

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

בונה אלגינט Layered: פלטפורמה עבור Co-תרבות של אוכלוסיות תאים הטרוגניות

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

layered-alginate-constructs-platform-for-co-culture-heterogeneous

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.8K Views.  University of Maryland. Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct. 

Video: Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

אלגינט microcapsule כפלטפורמה 3D עבור ריבוי והתמיינות של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) כדי שושלות שונות

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

דפוסי שיתוף תרבות נייד באמצעות מערכות מימיות שני שלבים

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (&ge;105) in milliliter-scale volumes (&ge;0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 - 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 - 20 &mu;l). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries ("cell perfusion chambers"), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with "transfer" microcapillaries ("central hub"), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.

We have developed an automated cell culture and interrogation platform for micro-scale cell stimulation experiments. The platform offers simple, versatile, and precise control in cultivating and stimulating small populations of cells, and recovering lysates for molecular analyses. The platform is well suited to studies that use precious cells and/or reagents.

פלטפורמה אוטומטית צדדי לניסויים בגירוי תא מיקרו בקנה מידה

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

הנדסת רקמות: בנייה תאית 3D פיגום למשלוח גיליונות סלולריים שכבות

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have contributed dramatically to the understanding of basic mechanobiology. These techniques have been extensively used to demonstrate how the onset and progression of various diseases are heavily influenced by mechanical cues. This article presents a multi-functional biaxial stretching (BAXS) platform that can either mechanically stimulate single cells or quantify the mechanical stiffness of tissues. The BAXS platform consists of four voice coil motors that can be controlled independently. Single cells can be cultured on a flexible substrate that can be attached to the motors allowing one to expose the cells to complex, dynamic, and spatially varying strain fields. Conversely, by incorporating a force load cell, one can also quantify the mechanical properties of primary tissues as they are exposed to deformation cycles. In both cases, a proper set of clamps must be designed and mounted to the BAXS platform motors in order to firmly hold the flexible substrate or the tissue of interest. The BAXS platform can be mounted on an inverted microscope to perform simultaneous transmitted light and/or fluorescence imaging to examine the structural or biochemical response of the sample during stretching experiments. This article provides experimental details of the design and usage of the BAXS platform and presents results for single cell and whole tissue studies. The BAXS platform was used to measure the deformation of nuclei in single mouse myoblast cells in response to substrate strain and to measure the stiffness of isolated mouse aortas. The BAXS platform is a versatile tool that can be combined with various optical microscopies in order to provide novel mechanobiological insights at the sub-cellular, cellular and whole tissue levels.

We present in this article a novel stretching platform that can be used to investigate single cell responses to complex anisotropic biaxial mechanical deformation and quantify the mechanical properties of biological tissues.

פלטפורמה חדשני מתיחה עבור יישומים בתאים והרקמות mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

כדאיות של מבנים ניידים Bioprinted באמצעות מדפסת הקרטזיאני Dispenser שלוש

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

We describe a set of protocols that together provide a tissue-mimicking hydrogel bioink with which functional and viable 3-D tissue constructs can be bioprinted for use in in vitro screening applications.

Bioprinting Cellularized בונה בעזרת רקמות ספציפיות הידרוג&#39;ל Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet encapsulation has been studied extensively as a means to increase islet survival in allogeneic or xenogeneic transplants. Alginate encapsulation is commonly achieved by nozzle extrusion and external gelation. Using this method, cell-containing alginate droplets formed at the tip of nozzles fall into a solution containing divalent cations that cause ionotropic alginate gelation as they diffuse into the droplets. The requirement for droplet formation at the nozzle tip limits the volumetric throughput and alginate concentration that can be achieved. This video describes a scalable emulsification method to encapsulate mammalian cells in 0.5% to 10% alginate with 70% to 90% cell survival. By this alternative method, alginate droplets containing cells and calcium carbonate are emulsified in mineral oil, followed by a decrease in pH leading to internal calcium release and ionotropic alginate gelation. The current method allows the production of alginate beads within 20 min of emulsification. The equipment required for the encapsulation step consists in simple stirred vessels available to most laboratories.

This video and manuscript describe an emulsion-based method to encapsulate mammalian cells in 0.5% to 10% alginate beads which can be produced in large batches using a simple stirred vessel. The encapsulated cells can be cultured in vitro or transplanted for cellular therapy applications.