NIH グラント SBC COBRE 1P20GM121310-01 によってサポートされています。

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ワイオミング大学のによって承認されています。電気生理学的記録を含めたすべての処理は、部屋の温度、およそ 23 ° c. で実施されてここで説明したすべてのメソッドは、発達段階 42 と 49 (Neiuwkoop、フェイバーの15によると上演) 間オタマジャクシからの視蓋ニューロンを記録するために最適化されています。
1体内の準備。
<ol><li>タドポールを麻酔します。<ol>
<li>0.01% スタインバーグのソリューションを含む小さなシャーレにタドポール MS-222 約 5 分。 注: MS-222 別名"Tricaine"は一般的な魚と両生類の麻酔です。オタマジャクシは mM でスタインバーグのソリューションで発生します: 0.067 倍 4.9 HEPES 5.8 NaCl、KCl、0.034 Ca (3)2•4H2O, 0.083 MgSO4•7H2O。</li>
		<li>タドポールは手順 2 に進む前に、深くハイパーカプニア (応答がない、もはや水泳) を確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>解剖記録/料理の床に冠水したシリコーン ブロック麻酔下のオタマジャクシを保護します。<ol>
<li>使い捨て可能な移動のピペットを使用して外部録音ソリューションを含んでいる解剖/記録皿にハイパーカプニアのオタマジャクシを移動 (115 mM nacl、KCl の 2 mM CaCl2の 3 mM、MgCl2の 3 mM、5 mM HEPES、ブドウ糖; の 1 mM の pH 調整 7.25 を使用するには10 N naoh、浸透圧 255 mOsm)。<ol>
<li>自発的な筋肉を最小限に抑えるためのけいれん、アセチルコリン受容体拮抗薬、ツボクラリン (100 μ M) 外部のソリューションに追加します。(通常、これは、外部溶液 10 mL に 10 mM ツボクラリン株式の 100 μ L を追加する 200 μ L ピペットを使用して)。</li>
		</ol>
</li>
		<li>おたまじゃくし、背側、シリコーン ・ エラストマーの湛水ブロックに固定昆虫ピンを使用する (Sylgard 184 など詳細については表を参照してください、) を解剖皿床に接着されています。 注意: ピンの配置は重要です: 目からそのプロジェクト脳、RGC の求心性軸索を刺しを避けるために十分に尾の両側にそれらを配置し、ちょうど前方視蓋 (図 1A) 脳を入力してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>牛フィレ肉の正中線に沿って脳。<ol>
<li>脳のクリアな視界、滅菌 25 G 針を使用して正中線に沿って表面的な切開することによって脳を覆う皮膚を削除します。</li>
		<li>神経管に針を挿入して (背側) チューブの背の部分 (切断) の床の板がそのまま (図 1B) を残しながらカットがきれいにそのような物を引いてそっと上向きに同じ正中線軸に沿って脳を切り身。 注: 求心性感覚フロア プレートを介して蓋を入力するので、神経管の底板がそのまま残ってことが重要です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>蓋ニューロンを覆う透明な心室膜を削除します。<ol>
<li>電気生理学のリグに記録皿を移動し、壊れたガラスのピペット チップを使用して蓋ニューロンの細胞体を覆う心室膜を削除します。軽く繊細なタスク ワイパーの間でドラッグすることで先端を破る。</li>
		<li>ピペット ホルダーにピペットをネジし、マニピュレーターを介して視蓋にそれを下げます。</li>
		<li>壊れたピペットを使用して、蓋から心室膜を剥離します。 注: 全体の蓋; から膜を削除する必要はありません。小さなウィンドウは十分で、ニューロンの多くへのアクセスを提供します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>パッチ ・ クランプ記録セル全体を取得します。 注意: このポイント前方からのアプローチ Segevらに従ってマウス脳切片からセル全体パッチ クランプ録音実施と同様です。16(図 1C)。</li>
	<li>蓋ニューロン全体フィールド フラッシュ光を網膜上に投影のレスポンスを記録します。<ol>
<li>網膜上に光のフィールド全体のフラッシュに、幼生の目に隣接する光ファイバーを配置します。光ファイバーのもう一方の端を制御できる光の輝度は、可変抵抗器に沿った LED です。アンプのデジタル出力で LED をトリガーします。この方法では、光の強度変化の点滅がすることができます全体のフィールドは、(図 4A) を記録しました。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 全脳の準備
<ol><li>1.1 から 1.3 の手順に従います。 注: この準備のための外部のソリューションでツボクラリンの必要はありません。</li>
	<li>脳を分離します。<ol>
<li>後脳 (図 2A) を断つに 25 G 針を使用します。</li>
		<li>タドポールから全脳を分離、そっと尾側吻側方向すべての側面と腹側の結合組織と神経線維を断つことで、脳の下に針を実行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>シリコーン ・ エラストマーのブロックには、脳を保護します。<ol>
<li>一度完全に解放された, 嗅球のいずれかを 1 つピンと後脳 (図 2B) を別のピンを配置することによってシリコーン ・ エラストマーのブロックには、脳を保護します。これの視蓋ニューロンから記録に最適な構成です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>電気生理学のリグに切り裂くスコープから固定された全脳の準備を含んでいる皿を移動します。1.4 の手順で説明するように壊れたガラス ピペットを使用して心室膜を削除します。</li>
	<li>双極刺激電極に配置視交叉 (中脳でそれぞれの眼から軸索路断面どこ) RGC 軸索を直接アクティブにします。<ol>
<li>吻側、および大きい中間心室にほぼ隣接する双極刺激電極を配置します。視交叉は大きい中間室 (図 2B) にすぐに吻側に位置しています。<ol>
<li>優しく下の刺激電極視交叉の上に小さなへこみが組織で形成されるように。バイポーラの電極は、正確に制御するために刺激の強度を可能にするパルス刺激によって駆動されます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Segev et al.による記述で全細胞パッチク ランプ記録 (図 2C) を実行します。16
</li>
</ol>3. 水平脳スライス標本
<ol><li>2.1 から 2.3 の手順に従います。</li>
	<li>消費税 1 つこまの 1 つの側面の最も外側 4 番目 (どの生体内で最も背側の 4 番目に対応) にかみそりの刃を使用します。図 3Aに示すように吻側尾側平面に平行に作られるこのカット。</li>
	<li>再、スライスとシリコーン ・ エラストマーの側に脳をピン側 (つまり、突起や神経は、記録のため直接アクセスできます) 上向きとシリコーンのエラストマー ブロック (図 3 から離れて直面して脳の心室の表面B) (つまり、バイポーラ電極は、視交叉に配置できます)。</li>
	<li>Segev et al.による記述で全細胞パッチク ランプまたはローカルの下に潜在的な記録 (図 3C) を実行します。16
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+neurodevelopmental+disorders+in+the+Xenopus+tadpole:+from+mechanisms+to+therapeutic+targets.">Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets.</a> Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).</li><li>Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+Order+in+Human+Neurological+Disorder+Using+a+Tadpole.">Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole.</a> Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).</li><li>Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+and+function+of+the+Xenopus+tadpole+retinotectal+circuit.">Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).</li><li>Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+regulation+of+voltage-gated+intrinsic+currents+in+the+developing+optic+tectum+of+the+Xenopus+tadpole.">Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole.</a> J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).</li><li>Pratt, K. G., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+regulation+of+intrinsic+excitability+and+synaptic+transmission+in+a+developing+visual+circuit.">Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit.</a> J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).</li><li>Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivariate+analysis+of+electrophysiological+diversity+of+Xenopus+visual+neurons+during+development+and+plasticity.">Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity.</a> Elife. 4, 11351 (2015).</li><li>Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visually+driven+regulation+of+intrinsic+neuronal+excitability+improves+stimulus+detection+in+vivo.">Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo.</a> Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).</li><li>Wu, G., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cline+H.T.+of+a+central+glutamatergic+synapse.">Cline H.T. of a central glutamatergic synapse.</a> Science. , 972-976 (1996).</li><li>Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory-evoked+spiking+behavior+emerges+via+an+experience-dependent+plasticity+mechanism.">Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism.</a> Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).</li><li>Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+transcription+of+BDNF+enhances+visual+acuity+during+development.">Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development.</a> Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).</li><li>Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+window+for+cooperation+and+competition+among+developing+retinotectal+synapses.">A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses.</a> Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).</li><li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain.">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J. Vis. Exp. (17), e705 (2008).</li><li>Dong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+avoidance+in+Xenopus+tadpoles+is+correlated+with+the+maturation+of+visual+responses+in+the+optic+tectum.">Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum.</a> J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).</li><li>Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+horizontal+brain+slice+preparation:+a+novel+approach+for+visualizing+and+recording+from+all+layers+of+the+tadpole+tectum.">The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum.</a> J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (112), e54024 (2016).</li><li>Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Relationships+Impact+Neuronal+Tuning+within+a+Phylogenetically+Ancient+Vertebrate+Brain+Structure.">Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure.</a> Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).</li><li>Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+and+inhibition+in+recurrent+networks+mediate+collision+avoidance+in+Xenopus+tadpoles.">Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles.</a> Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).</li><li>Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+to+see:+patterned+visual+activity+and+the+development+of+visual+function.">Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function.</a> Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).</li><li>Pratt, K. G., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisensory+integration+in+mesencephalic+trigeminal+neurons+in+Xenopus+tadpoles.">Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles.</a> J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

この作品に記載されているすべてのメソッドは、発達段階 42 と 49 (Neiuwkoop、フェイバーの15によると上演) 間オタマジャクシからの視蓋ニューロンの記録に最適です。ステージ 42、オタマジャクシが十分に大きく、十分に発達した昆虫ピンは生体内での録音のため、全脳解剖を遂行するための脳の両側に置くことができるようにします。以前の段階、オタマジャクシが本質的に二次元で (すなわち、フラット)、ここで説明したアプローチが最適ではないです。
視蓋ニューロンをアクセスしてセル全体構成に記録できる、使いやすさのため19を形成しながら、このモデルの回路が機能している - と機能中どのように神経回路形態について基本的な発見の温床しました。ここで、生体内でおたまじゃくし全脳の準備、別の記録の構成とデータの種類の例を実行する方法などの視蓋ニューロンからセル全体パッチ クランプ録音を取得する方法を説明しました。さて、強みのディスカッション ・高品質セル全体の録音を達成するためのヒントに続いて、各準備の制限です。
アフリカツメガエル幼生段階 47/48、約 7-8 日後受精3,13視覚回避行動を表示し始めます。つまり、開発のこれらの比較的初期の段階でも発達回路は機能と視覚刺激を処理することができます。発達と発達回路の可塑性に関する基本的な質問は直接蓋ニューロン網膜に投影される視覚刺激に対する反応を記録する生体内で準備を使用して対処されています。体内の録音、オタマジャクシでは比較的簡単です神経系、頭蓋骨の欠如の相対的なシンプルさのための哺乳類の相当の記録の構成と比較しています。特定のニューロンにシールとセル全体パッチ クランプ記録構成を達成するが全細胞パッチク ランプ齧歯動物のスライスで記録を遂行する本質的に等価個々 蓋ニューロンの細胞体は、生体内で可視化することができます、ので準備。オタマジャクシは通常 (心拍数を監視することによって容易に評価できます) リグの数時間生き残る。オタマジャクシの体内の準備の固有 1 つの制限はのみ視蓋の深い体のレイヤーに存在する視蓋ニューロンに、大型の中間室に隣接する層がアクセスできること (図 1 を記録するため).これは蓋の外側の体細胞層に存在する視蓋ニューロンが主として未踏査されていることを意味体内。
全脳準備の実験の利点は、それが目や皮膚、すべてスプリアス感覚主導の活動を排除することで末梢の感覚受容器から脳を隔離です。視覚刺激によって駆動されているは、もはや一方、蓋を対象とする RGC 軸索入力が今も脳全体準備の上に配置 (FHC) の双極刺激の電極を介して非常に制御された方法で直接有効することができます。RGC 軸索路の 2 つのセットが脳を入力する視交叉。全脳の準備の最初に報告された使用は、呉らによって重要な研究では、1996 年8、どの RGC の軸索は、著者らはシナプスの視蓋ニューロンに個々 の RGC 軸索の強度を定量化できたような双極刺激電極を使用してアクティブ化されたとしてので作ったの進行について基本的な発見シナプス成熟。体内の準備とは、全脳の準備は心室膜に隣接する深い層に存在するニューロンのみにアクセスをできます。
すべての前の電気生理学の研究が深層蓋ニューロンに焦点を当ててので視蓋が約 9 の17細胞体層で構成されるが、伝統的な全脳と体内の準備 (説明上) 深い層のニューロンにのみアクセスを許可します。RGC 軸索が蓋ニューロンの樹状突起とシナプスを形成する最も全体だけでなく、表面的に深い神経から、すべての体細胞層全体の視蓋ニューロンにアクセスするために"と呼ばれる変更された全脳の準備を開発しました。水平脳スライス標本」(図 314)。全脳準備水平脳スライス標本を維持して脳内 RGC 軸索と視交叉の双極刺激電極を配置することによって制御できます。
全体的にみて、準備はの可視化とセル全体パッチ ・ クランプ記録を行う蓋ニューロンの突起へのアクセスを最適化するために設計されています。直接、相馬へのアクセスは品質全体セル パッチ クランプ録音に欠かせない: ニューロンの内部へのアクセスの非常に強力な形成が必要です (> 1 × 109 Ω) ピペットと直接必要とするニューロンの細胞膜との間をシールその膜上にピペット チップの接触。したがって、心室膜の十分な除去は成功の記録のためのキーです。また、RGC 誘発の巧妙な録音のためのキーは、視交叉の上に双極刺激電極の適切な配置です。本質的にすべての視蓋ニューロンは、RGC 軸索から直接シナプス入力を受け取る。RGC 誘発応答が観測されない場合、バイポーラ電極の位置が不適切のためほとんど視交叉およびない視神経への連絡ではないことなど。これは、単に刺激電極を再配置することで修正できます。それを意味できるバイポーラ電極の再配置後 RGC 軸索投射 RGC 誘発を観察する失敗は、解剖時に誤って切断されました。この場合、新しい準備をやり直す必要があります。最後に、一般的な蓋神経細胞ではない細胞から記録 RGC 誘発応答を観察する失敗可能性があります。例えば、通常、グリア、視蓋ニューロンによって表示された通常の RGC 誘発のシナプス応答は表示されず、こま20在住、非常に低い数字ではあるが発見されている大規模な中脳路核ニューロンをしません。これらの非蓋のセルの 1 つからの録音の可能性はの視蓋ニューロンの数が膨大なため非常に低いです。もちろん、品質の録音も、視蓋ニューロンに健康であることが必要です。健康的な蓋ニューロンの特徴は明るい色、傷のないコンパクトな円形または楕円形の相馬です。静止膜電位、入力抵抗、容量など基本的な電気的特性を測定することにより全細胞記録構成が達成されるニューロンの健康が電気生理学的レベルでさらに評価されます。.発達段階 42 と 49 の間の健康な視蓋ニューロンの静止膜電位は約-45 約 1 GΩ の平均入力抵抗と静電容量 10 12 pF3,4,5mV。ニューロンのごく一部は心室膜の除去のためでない必然的に破損します。破損または不健康なニューロンの突起が粗く、肥大化や寄った。不健康なニューロンの例図 2Cのようです。ニューロンの大半が不健康な場合、これは外部録音ソリューションと間違って何かあるので、新鮮な外部録音ソリューションをお勧め反射かもしれない。健康表示、ほか記録の最高のニューロンは隔離されるのではなく、他のニューロンの多数に通常関連付けられます。また、簡単にアクセスされているセルを選択します。たとえば、押さないで組織損傷、組織または組織を移動し、場違い刺激電極をこのようにシフトこのため、セルにアクセスするも難しい。最後に、録音が吻尾軸4,8にわたって存在する発達勾配による潜在的な違いを避けるために蓋 (図 2B) の中央 3 分の 1 に制限されるべき場合を除き、もちろん、実験の焦点は、前述の発達勾配です。適切な蓋は、増殖帯の吻側と尾側大きな中間室の尾の端の領域です。
全細胞パッチク ランプ記録法は、その制限ないわけです。一般的に、一度に 1 つのニューロンを記録記録のこのスタイルが含まれます。これは GCaMP6 カルシウム指示薬スライス標本とin vivoで同時にイメージを作成するニューロンの大規模な集団の活動を可能にする新世代の画像処理を伴うアプローチとは対照的です。
全セル電圧クランプ録音に固有の別の欠点は、制限電圧4の時間的制御空間クランプ エラー (、相馬を超えて更に多くの電圧を制御する無力)、です。全体的にみて、比較的小さなサイズ、ささやかな樹状 arborizations および哺乳類の神経細胞と比較して比較的小さいと低速の流れのためしかし、視蓋ニューロンから記録するとき、これらの電圧クランプの問題は最小限に抑えています。視蓋ニューロンのこれらの特性はそれらを多くのパラメーターの測定と個々 のニューロン5,6のプロファイルの建設記録電圧クランプ用特に従順レンダリングします。
今後の方向性には、生体内で水平脳スライス標本視覚刺激の処理の外側の層のニューロンの機能を特徴付けるための最適化が含まれます。

発達回路は、両生類の視覚系の主要なコンポーネントです。それは、どのプロジェクトの視蓋ニューロンにシナプスとシナプス結合を形成するための軸索の目、Rgc ので構成されます。アフリカツメガエル幼生発達回路は、神経回路形成と機能を研究する人気発達モデルです。強力な実験的モデル1,2,3レンダリングこの幼生の発達回路の多くの属性があります。1 つの主要な属性と、この資料の焦点はからの視蓋ニューロンの生体内や脳全体準備を使用してセル全体パッチ クランプ録音を遂行する能力。電圧と電流クランプの記録モードをサポートしているアンプが備わっています電気生理学リグ、セル全体パッチ クランプ録音が高解像度で特徴付けられるニューロンの電気生理学できます。その結果、発達回路形成の主要な段階間の視蓋ニューロンからセル全体パッチ クランプ録音が開発の詳細かつ包括的理解と本質的な4、5の可塑性を提供しています。,6,7とシナプス8,9,10,11プロパティ。セル全体パッチ クランプ蓋ニューロン録音を組み合わせ、遺伝子またはこれらのニューロンの12、および確立された視覚的回避テスト13を介して視覚的なガイド付き動作を評価する方法への関心の morpholinos を表現する能力を促進する、分子、回路機能と行動間のリンクの id。
セル全体パッチ クランプ録音から得られるデータは不可能遺伝的カルシウム インジケーター、GCaMP6 など新しいイメージング手法を用いた高解像度型カルシウム指示薬を使用することが許可されていますイメージングが重要です。カルシウムのニューロンの大規模な集団全体のダイナミクス、同時には直接またはある明白な方法は、いつつ、デルタの蛍光を測定することにより特定の電気パラメーターを取得でき、電圧に逃げ道はないクランプ測定するニューロン電流-電圧特性。明らかにこれらの 2 つの異なるアプローチ、電気生理学的記録、カルシウム イメージング、非重複の強みを持っている、異なる種類のデータを生成します。したがって、最善の方法は、対処されて特定の実験の質問に依存します。
ここでは、脳全体準備、生体内で製剤を用いたオタマジャクシの視蓋ニューロンからセル全体パッチ クランプ録音を獲得する手法について述べるし、新しい変更14 研究室で開発された脳全体準備.代表結果] セクションで、各準備と得ることができるデータの種類の実験の利点を示します。制限と異なる準備として、トラブルシューティングのためのヒントの強みは、ディスカッション セクションに含まれます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1012px;" width="1011">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Stemi Stereo 508</td>
			<td style="width:143px;">Zeiss</td>
			<td style="width:148px;">495009-0006-000&#160;</td>
			<td style="width:299px;">Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS-222 &#34;Tricane&#34;</td>
			<td>Finquel</td>
			<td>ARF5G</td>
			<td>Amphibian general anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>Used to prepare Stienberg&#39;s solution and external solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>Used to prepare Stienberg&#39;s solution and external solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-1KG</td>
			<td>Used to prepare Stienberg&#39;s solution and external solution</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)&#8226;4H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>237124-500G</td>
			<td>Used to prepare Stienberg&#39;s solution&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Magnesium Sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td>6066-04</td>
			<td>Used to prepare Steinberg&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td>Used to prepare external recording solution</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>2444-01</td>
			<td>Used to prepare external recording solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose Anhydrous</td>
			<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td>6066-04</td>
			<td>Used to prepare external recording solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubocurarine hydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2379</td>
			<td>Nicotinic acetylcholine receptor antagonist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>0.1mm diameter stainless steel pins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>761028</td>
			<td>Preweighed monomer and curing agent kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile Polystyrene Petri Dish - 60x15mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS4052</td>
			<td>Small petri dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td>Syringe needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1mL Slip Tip Tuberculin Syringe&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>Disposable, sterile syringes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate pipette glass</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-86-10HP</td>
			<td>Pulled to desired specifications using pipette pulling machine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Fabricates micropipettes for electrophysiology recording</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipes Kimtech wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34120</td>
			<td>Delicate task lint-free wipers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-CV-7B</td>
			<td>Current clamp and voltage clamp headstage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-285/T</td>
			<td>Control for headstage on electrophysiology rig</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber-Coupled LED (Green)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M530F2</td>
			<td>Fiber optic cable paired with green LED</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cluster Bipolar Electrode (25&#181;m diameter)</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30207</td>
			<td>Bipolar stimulating electrode</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ISO-Flex Stimulator</td>
			<td>A.M.P.I. (Israel)&#160;</td>
			<td>Contact manufacturer</td>
			<td>Flexible stimulus isolator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>2500-0157</td>
			<td>Amplifier for voltage- and current-clamp recording&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digidata 1322A digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>2500-135</td>
			<td>Data acquisition system for electrophysiology recording</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axio Examiner.A1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>491404-0001-000&#160;</td>
			<td>Microscope for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-g Lab Table</td>
			<td>TMC</td>
			<td>63-533</td>
			<td>Air table for electrophysiology microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit</td>
			<td>Dell</td>
			<td>D06D001</td>
			<td>Computer running electrophysiology software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">c2400 CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>70826-5</td>
			<td>Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7 O&#39;Clock Super Platinum Stainless Razorblades</td>
			<td>Gillette</td>
			<td>CMM01049</td>
			<td>Platinum-coated stainless razor blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td>Disposable Polyethylene transfer pipets</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparations and protocols for whole cell patch clamp recording of xenopus laevis tectal neurons

アフリカツメガエル幼生発達回路、形成するシナプスの視蓋ニューロンに直接眼での網膜神経節細胞 (Rgc) の構成がどのように神経回路を研究する人気モデル自己組み立てます。全体を遂行する能力パッチ クランプ録音どちらか体内の RGC 誘発の応答を記録しての視蓋ニューロンからの細胞または通常の基になるメカニズムについて高解像度データの大きいボディを生成している全脳製剤を用いた、・異常、回路形成、機能。ここで体内の準備、元全脳の準備を実行する方法について説明より最近の視蓋ニューロンからセル全体パッチ クランプ録音を求める水平脳スライス標本を開発しました。それぞれの準備には、ユニークな実験的利点があります。生体内で準備できますの視蓋ニューロンの目に投影される視覚刺激への直接反応の記録です。脳全体の準備は、高度に制御された方法でアクティブにする RGC 軸索と水平脳スライス標本蓋のすべてのレイヤーにわたってからの録音が可能します。

光誘発電位を記録するには、光のフィールド全体のフラッシュは、個々 の視蓋ニューロン (図 4A) から結果の応答を記録しながら網膜上に投影されます。この特定のプロトコルは両方 (「オン」の応答) をオン、オフに 15 光にニューロンの応答を測定するように設計「オフ応答」を測定するために後で s視蓋ニューロンは通常応答の内外で堅牢な展示 (示されているここに記録された電圧クランプ モード、ニューロンはシナプス電流 (図 4B) を測定するために - 60mV クランプ)。自発的なシナプス イベント (図 4C) を記録することによって任意の一つのニューロンによって受信されたシナプスのドライブ量を定量化することができます。電流-電圧特性 (I-v カーブ) を同じニューロンからニューロンをますます脱分極電位にステップによって生成され、"現在混合と呼ばれる結果電圧作動した Na+ K+の電流を記録することができます。録音"(図 4D, E)。それは十分に確立されているこれらの水陸両生動物のニューロンの Na+のピークし、ピーク時間と重複しない 1 つの別4,7ため混合現在録音を介して K+電流を定量化することができます。
シナプス前の RGC 軸索の視蓋ニューロンにシナプスとシナプス伝達を研究するためすべての上流の計算と、目で行われる視覚刺激の処理をバイパスでき、視交叉で RGC 軸索の活性化を直接その最も純粋な・還元型。Rgc 光あるいは直接 2 つのコンポーネントから成る双極刺激電極による刺激から RGC 活性化に蓋ニューロン応答が生成される: シナプス コンポーネント (活性 Rgc から直接シナプス入力) と、ヒヨココンポーネント (ローカル再発ネットワーク活動給餌記録されているニューロンに戻る)。光誘発の場合単シナプス及び多シナプスのコンポーネントがいくつかの不能の量によって互いにオーバー ラップします。この一時的な重複は、網膜視蓋とシナプス伝達について何を結論付けることができます制限します。全脳製剤を用いた、視交叉 (図 5A) に配置電極を介して直接 RGC 軸索路をアクティブにするは、ただし、モノと時間に重なっていない本質的には、シナプスのコンポーネントを生成します。バイポーラ電極の刺激の強さを調整できます。刺激強度を増加すると、RGC 軸索活性化 (図 5B) のより多くがあります。刺激の少ないプロトコルに個々 の蓋ニューロン; 各 RGC 軸索のシナプスの結合強度を決定します。最大刺激プロトコルでは、合計、またはすべて RGC 軸索結合 (図 5C) から最大、シナプス入力を反映しています。抑制への興奮性シナプス入力の適切な比率 (E: 私比) 個人によって受信された蓋ニューロンは正常な視覚機能18にとって重要です。図 5Dは、RGC 誘発興奮性と抑制性現在トレースの個々 の蓋ニューロンから記録された例を示しています。RGC シナプス前の軸索の端末から送信機の解放の確率は、対パルスの記録によって測定されます。これは、シナプスの蓋ニューロンが RGC 軸索は 50 ミリ秒間隔 (図 5E) で区切られたに引き続いて、活性化、シナプス電流を測定するための電圧クランプ モードで記録されます。
任意の体細胞層に存在する視蓋ニューロンからセル全体パッチ クランプ録音が行えます。全脳の準備と同様に、RGC の軸索は視交叉 (図 6A) に、バイポーラ電極を配置することによって有効にできます。全脳に備えて行わすべての録音は、この水平脳スライス標本を使用しても実行できます。図 6Bは、浅層のニューロンから記録された RGC 誘発応答の例トレースを示しています。この準備ができます RGC 蓋の樹状突起にシナプス入力の空間パターンを測定します。これは、RGC 誘発電位が記録されます (図 6C) 神経の内側外側の軸 (すなわち、近位遠位軸) に沿ってすべての 10 μ m。これは機能の RGC 入力のパターンの高解像度プロファイルを生成します。2 番目の空間微分14を計算することによって、フィールド電位の電流源密度に変換できますし、電流源密度は、イメージ プロットに変身することができます順番。図 6Cにイメージ プロットは、最強の RGC 入力対象、神経網のより遠位の領域があることを示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57465/57465fig1.jpg"> 図 1。生体内での準備手順です。(A) おたまじゃくしシリコーン ・ エラストマーの部分に釘付けに。ピンは、白い矢印で示されます。視索を刺しを避けるためにより尾側のピンの位置に注意してください。白破線は、正中線を示しています。全体の拡大表示 (B) 脳背側の正中線に沿って切断し、オーバーレイする皮膚を取り除くことの後。(C) 細胞パッチク ランプ記録生体内で。(L: 横。M: 内側。R: 吻側。C: 尾。D: 背側。V: 腹。OB: 嗅球。OT: こま。HB: 菱脳)。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57465/57465fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57465/57465fig2.jpg"> 図 2.全脳の準備手順です。(A) 脳は菱脳の正中線に沿ってフィレット後を切断します。(B) 全体の脳を解剖は、シリコーン ・ エラストマーを釘付けに。白の印は左の嗅球のピンです。赤いボックスは、蓋、すなわち録音の対象地域の中間を示します。(C) セル全体パッチ ・ クランプ記録全脳準備機能を使用します。黒アスタリスクは、細胞を記録のためアクセスできない非掻き心室膜の領域を示します。膜が正常に削除されている場合よりはっきりと定義されたいつつが表示されます。矢印は、不健康なニューロンを示します。(PZ: 増殖ゾーン。LMV: 大規模な内側心室。OB: 嗅球。OT: こま。HB: 菱脳。L: 横。M: 内側。R: 吻側。C: 尾。D: 背側。V: 腹)。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57465/57465fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57465/57465fig3.jpg"> 図 3.水平脳スライスの準備手順です。視蓋の一方の側の最も外側の部分 (A) (破線によって示される) スライスされる脳全体準備の後。シリコーン ・ エラストマーの側に釘付けにされた後 (B) 水平脳スライス標本。白の二本線は、視交叉に刺激電極を表しています。(C) 相馬レイヤーと水平脳スライス標本を用いた神経網の拡大表示。破線の曲線は、相馬レイヤーと神経の間の境界を示します。この図は、Hamodi、らから変更されています。14 (l: 横。M: 内側。R: 吻側。C: 尾。D: 背側。V: 腹。OB: 嗅球。OC: 視交叉。OT: こま。HB: 菱脳)。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57465/57465fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57465/57465fig4.jpg"> 図 4.生体内で準備から録音します。(A) 図体内の記録の典型的な構成。(B) 光は、光を含む応答と応答からの光を誘発しました。はめ込み式のトレース、ズームイン ビューの上のとオフの応答、それぞれ。(C) 自発性興奮性シナプス電流を記録しました。(D) Na+と電圧に対応で K+電流クランプ-60 から mV ~ 30 単一ニューロンから mV。(E) IV プロット トレースから (D) の中に生成されます。すべての録音は、-60 で開催されたニューロンで行われた mV を除く; IV プロットを生成する (D)ニューロンは、電位依存性電流をアクティブにするは、10 mV 単位でのますますより脱分極電位に歩んだ。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57465/57465fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57465/57465fig5.jpg"> 図 5.全脳の準備から録音します。視交叉に刺激電極を含む脳全体の記録の典型的な構成 (A) 図 (緑と赤の線は、RGC の軸索を表します)。(B) オーバーレイは、RGC RGC 刺激強度の変化に対するトレースします。(C) 最大刺激応答 (左) と最小刺激応答 (右)。(D) 単一ニューロンに興奮性および抑制を RGC 誘発で応答します。(E) 対パルス個々 のニューロンの RGC 誘発反応の促進。(OB: 嗅球。OC: 視交叉。OT: 視蓋)。-60 で開催されたニューロンのすべての録音が行われた (D) 興奮性および抑制性入力を測定するためを除いて mV: γ-アミノ酪酸 (GABA) の逆転の潜在性のニューロンを保持することによって興奮性の入力を記録-塩化物を介した電流 (-45 mv);α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic 酸 (AMPA) の逆転の潜在性のニューロンを保持することによって抑制性入力の電流 (+5 mv) を介する。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57465/57465fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57465/57465fig6.jpg"> 図 6.水平脳から録音スライス準備します。(A) 図水平脳スライス標本の構成。セルの水平脳スライス標本によって公開されるすべての蓋層今配置されている刺激的な電極のまま視交叉、記録ピペットであること注意してください。(B) 蓋の表層に存在するニューロンから RGC 応答。(C)、神経、変換された現在ソース (Csd) 示される密度イメージ プロット ヒート マップによって電位を記録します。(OC: 視交叉。OT: こま。HB: 菱脳)。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57465/57465fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

アフリカツメガエル幼生の発達回路を勉強するセル全体パッチ ・ クランプ記録の 3 脳剤について述べる。それぞれの準備を独自の特定の利点は、神経回路機能を研究するモデルとしてアフリカツメガエルのオタマジャクシの実験的少ないに貢献します。

準備やアフリカツメガエルの視蓋ニューロンの全体セル パッチ ・ クランプ記録のためのプロトコル

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

preparations-protocols-for-whole-cell-patch-clamp-recording-xenopus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

9.3K ビュー.  University of Wyoming. アフリカツメガエル幼生の発達回路を勉強するセル全体パッチ ・ クランプ記録の 3 脳剤について述べる。それぞれの準備を独自の特定の利点は、神経回路機能を研究するモデルとしてアフリカツメガエルのオタマジャクシの実験的少ないに貢献します。

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Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

からの神経外植文化<em&gt;アフリカツメガエル</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

神経科学

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

の解離、文化、および分析<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚性網膜組織

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

赤外線神経刺激のメカニズムを調査するための全細胞パッチクランプ

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

の感覚ニューロンの分離<em&gt;アメフラシカリフォルニ</em&gt;グルタミン酸作動電流のパッチクランプ記録のために

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Morphologically-と神経化学的に特定し海馬介在ニューロンからホールセルパッチクランプ記録

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

パッチクランプ技術を用いたダーク適応、マウス網膜スライス標本におけるニューロンにおける記録光誘発シナプス後応答

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

無傷の神経上皮におけるマウス嗅細胞の穿孔パッチクランプ記録：同定された嗅覚受容体を発現するニューロンの機能解析

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

の嗅球にカルシウム変化をモニタリングを通じて温度によって誘発される神経活動を記録<em&gt;アフリカツメガエル</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

準備やアフリカツメガエルの視蓋ニューロンの全体セル パッチ ・ クランプ記録のためのプロトコル

準備やアフリカツメガエルの視蓋ニューロンの全体セルパッチ・クランプ記録のためのプロトコル