本研究は、国民の多数硬化の社会 (RG4591A1/2) および健康の国民の協会 (R03NS06740402) からの助成金によって支えられました。著者は、実験スペース、機器やアドバイスを提供するため博士イバン エルナンデスと彼の研究室のメンバーをありがとうございます。

本研究で使用されるマウスは、SUNY ダウンステート医療センター部門の研究室動物資源 (DLAR) プロトコル番号 15 10492 のガイドラインに従って介抱され。
注: プライマリ オリゴデンドロ サイトが新生児 (P5 P7 野生型 C57Bl/6 n) から分離されたマウス。この段階では、未熟な最小二乗法は、高細胞収量を確保する齧歯動物の白質の 80% 以上を構成します。すべてのバッファーと試薬組成材料のテーブルの末尾にあります。
1. Coverslips 準備
注: ポリ D リジン (PDL)/ラミニン コート coverslips OL 分離前に準備されるべきです。
<ol><li>場所 #1 ドイツ語 50 mL の円錐管に coverslips をガラスし、70% の 35 mL を追加しそれらをきれいに江藤。</li>
	<li>管を閉じてならびにミキサーに軽くロッキングしながら少なくとも 30 分間室温でインキュベートします。Coverslips は夜通し孵化することができます。</li>
	<li>70 %etoh を破棄します。</li>
	<li>脱イオン水で 3 回 coverslips を洗浄、真空吸引で毎回水を削除します。</li>
	<li>PDL 50 μ g/mL の 30-35 mL を 50 mL チューブに十分な coverslips をカバーする coverslips に追加します。</li>
	<li>ならびにミキサーに coverslips を含む 50 mL チューブを置き、穏やかに揺れる中、少なくとも 30 分間室温でインキュベートします。</li>
	<li>Coverslips 真空吸引で毎回水を除去、脱イオン水で 3 回洗います。</li>
	<li>脱イオン水を含む 60 mm のペトリ皿に、coverslips を転送します。</li>
	<li>P200 ピペット チップを使用すると、ペトリ皿の全体の表面を覆う層として、coverslips を配置できます。</li>
	<li>慎重に、真空吸引で皿から水を削除します。</li>
	<li>Coverslips 周りの水の過剰を削除し、蓋が開いたとフードの UV 光の下で一晩乾燥させます。 注: 歯根膜コーティング ガラス coverslips は滅菌シャーレに 4 ° C で最大 3 カ月保存できます。</li>
	<li>場所 1 つ好評につき、24 ウェル プレートに coverslips 微細鉗子を使用して。</li>
	<li>よく作るエッジは井戸の壁を触れないでくださいセンター、coverslips に移動します。</li>
	<li>B27NBMA で希釈した 10 μ G/ml ラミニンの 100 μ L を追加 (材料表参照) 各 coverslip の中心から開始し、すべての領域をカバーする円形のエッジに向かってファッションで移動します。 メモ: ラミニンが OL の保守に関係するが、成熟した最小二乗法への分化を促進するので、重要な OL 生存因子の in vitro培養41,42,43,44は。</li>
	<li>プレート 5% CO2で少なくとも 1 時間または、OLs はめっきの準備が整うまでの 37 ° C をインキュベーターで孵化させなさい。</li>
</ol>2. マウス脳皮質解離
<ol><li>以前、70% エタノールで洗浄ハサミでクイック斬首で生後 5-7 日の古い C57Bl/6 n マウスの子犬を犠牲に。 注: 5-6 新生児マウス子犬から大脳皮質のそれぞれの準備のため使用されました。平均すると、1 つのマウス脳 1 〜 1.5 x 106最小二乗法が得られます。</li>
	<li>小さな解剖はさみで正中線に沿って頭皮皮膚をカットし、頭蓋骨を公開する撤回します。</li>
	<li>前頭葉は、脳の損傷を避けるためにハサミを持ち上げに向かって頭の後ろに開口部から正中線に沿って慎重に頭蓋骨をカットします。その後、頭蓋骨の後ろに開口部を使用して各眼窩、頭蓋底に沿ってに向かってカット。</li>
	<li>優しく B27NBMA 7 mL を含んでいる 60 mm 培養皿に移して中脳から皮質をいじめるし微細鉗子を使用します。切り裂かれた野のプール、それぞれの脳の 2.4 から 2.2 の手順を繰り返します。</li>
	<li>5 mL の解離バッファーを含んでいる新しい 60 mm 培養皿に皮質を転送 (B27NBMA、20-30 U/mL パパインおよび 2,500 U DNase 私)。</li>
	<li>約 1 mm3 #15 メス刃を使用しての小さな断片に皮質をダイスし、37 ° C、5% CO2インキュベーターで 20 分間インキュベートします。</li>
	<li>牛の成長血清酵素反応を停止する (BGS) の 1 つの mL を追加します。</li>
	<li>解離メディアと一緒に野を 10 mL の血清ピペットを使用して 15 mL の円錐管に転送します。</li>
	<li>優しくゆっくりをピペッティングによる脳組織を分離する開始し、気泡を最小限に抑えるように注意 6-8 回は、10 mL の血清ピペットを使用して、ダウン。</li>
	<li>2 〜 3 分のために解決し新鮮なチューブに上清を転送組織塊を許可します。</li>
	<li>10% を含む B27NBMA の 3 mL を加える BGS/2500 U DNase I 組織ペレットします。</li>
	<li>5 mL の血清ピペットを使用して、優しく上下にピペッティングしながら脳組織を分離するに 6 〜 8 回。気泡を最小限に抑えるように注意します。</li>
	<li>2-3 分のために解決する組織塊を許可します。</li>
	<li>新鮮なチューブに上清を転送します。10% を含む B27NBMA の 3 mL を加える BGS/dn 組織にペレットします。</li>
	<li>優しくメディア ミックスをピペッティングしながら P1000 のピペット チップを使用して脳組織を切り離して、脳組織の上下。組織の大きな塊がなくなるまで、または B27NBMA までの手順 2.13 と 2.14 を繰り返します 10% を含む BGS/DNase 私は疲れている、いずれか早い方。気泡を最小限に抑えるように注意します。</li>
	<li>セル サスペンションはプール前の培養上清に。</li>
	<li>50 mL チューブに 70 μ m の細胞のストレーナーを配置します。70 μ m の細胞のストレーナーをそっとプールされた細胞懸濁液を通過 10 mL の血清ピペットを使用して。</li>
	<li>B27NBMA の 1 mL の 10% を含むを追加することによってセル ストレーナーを洗浄 BGS/DNase 私。</li>
	<li>セル ストレーナーを破棄します。30 - ml B27NBMA で 10% を含むボリュームをもたらす BGS/DNase 私。</li>
	<li>2 つの 15 mL コニカル チューブに細胞懸濁液を転送します。200 x g で 10 分間の細胞懸濁液を遠心します。</li>
	<li>空気にさらされるセルを離れることがなく上澄みを削除します。上清は細胞の残骸により曇りでしょう。10% を含む B27NBMA の 3 mL を追加しペレットに BGS。</li>
	<li>慎重に P1000 ピペットを使用して細胞ペレットを切り離して考えます。10% を含む B27NBMA と 15 の mL にボリュームをもたらす BGS.</li>
	<li>細胞懸濁液を 40 μ m の新鮮な細胞のストレーナー通過します。</li>
	<li>B27NBMA の 1 mL の 10% を含むを追加することによって細胞のストレーナーを洗う BGS.セル ストレーナーを破棄します。</li>
	<li>10% を含む B27NBMA と 30 の mL にボリュームをもたらす BGS.</li>
	<li>2 x 15 mL コニカル チューブに細胞懸濁液を転送します。200 x g で 10 分間の細胞懸濁液を遠心します。</li>
	<li>空気にさらされるセルを離れることがなく上澄みのほとんどを削除します。5 ml の氷冷磁気細胞 (MCS) バッファーの並べ替えの細胞ペレットを再懸濁します。</li>
</ol>3. 細胞数と生存率の定量
<ol><li>0.4% (w/v) で 1:5 希釈を達成するために 1.5 mL 遠心チューブにトリパン ブルー溶液 400 μ L での細胞懸濁液 100 μ L を希釈します。</li>
	<li>セル希釈 P10 ピペットを使用して、回避 10 μ L で 2 つの部屋いっぱいになる商工会議所検定と塗りつぶしの上カバー ガラスの中心します。ソリューションを毛管作用によってカバー ガラスの下通ります。</li>
	<li>顕微鏡ステージ上、検定を置き、40 倍の倍率を使用して、フォーカスを調整します。 注: セル数はそれぞれ 5 つの正方形 (4 つの角と一つの中心) の手持ちのカウンターを使用して記録されます。非実行可能なセルだけ染料を吸収し、ながらライブ、青で表示され、健康な細胞のラウンドと屈折を表示され、1 ミリリットルあたり現実的で総細胞数の決定を可能にする青色の色素を吸収しません。</li>
</ol>4. O4 の分離+オリゴデンドロ サイト
<ol><li>10 分間 200 x g で細胞懸濁液を遠心します。</li>
	<li>慎重に空気への細胞の露出を避け、真空吸引を使用して上澄みを廃棄します。</li>
	<li>MCS バッファー反 O4 ビーズ 1 x 10 の7セルごとの 10 μ l を添加した 1 x 107合計セルごとの 90 μ L でペレットを再懸濁します。</li>
	<li>優しく指で 15 mL の円錐管 4-5 回をフリックで細胞懸濁液やビーズをミックスします。</li>
	<li>素早く指で 15 mL の円錐管 4-5 timesevery、4 ° C で 15 分のミックスを孵化させなさい 5 分。</li>
	<li>優しくチューブに MCS バッファー 1 x 10 の7セルあたり 2 mL を追加してミックスを洗います。10 分間 200 x g でミックスを遠心します。</li>
	<li>慎重に空気への細胞の露出を避け、真空吸引を使用して上澄みを廃棄します。7すべて 1 x 10 のセルの MCS バッファーの 500 μ L の細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>磁気セパレーターを磁選機スタンドに取り付けます。磁選機付ける選択列、列の上に 40 μ m の細胞のストレーナーを配置します。15 mL の 2 つまたは 1 つ 50 mL の円錐管を通して流れを収集する分離カラムの下に配置します。</li>
	<li>プレ MCS バッファーの 3 mL で 40 μ m セル ストレーナーと分離列をすすぎ、乾燥させることがなく列を介して実行バッファー。</li>
	<li>セル ストレーナーと選択した列には、細胞懸濁液とビーズのミックスを追加します。</li>
	<li>1 mL の MCS バッファーと 40 μ m セル ストレーナーを洗浄します。</li>
	<li>セル ストレーナーを破棄し、セル、ビーズ、乾燥させることがなく列を介して実行バッファーのミックスを聞かせてください。</li>
	<li>3 mL の MCS バッファーで 3 回分離カラムと OL 増殖メディアで 1 回洗います。</li>
	<li>磁選機から分離カラムを削除、すぐに 15 mL の円錐管に配置し、すぐに 5 mL の OL 増殖培を追加します。</li>
	<li>15 mL の円錐管にラベル付きセルをフラッシュするプッシュしっかりと列の上にピストンを配置します。</li>
	<li>細胞数と 3 のセクションで示されているように、トリパン ブルーと検定を使用しての生存率を決定する細胞を懸濁液 100 μ L を削除します。 注: 細胞生存率 80% 以上が、OLs の文化を進める許容が、90% 以上の生存率は最適。</li>
</ol>5. 分離 O4 のめっき+オリゴデンドロ サイト
<ol><li>密度 (coverslip あたり 5 x 10 の5セル) をめっき欲求に細胞懸濁液を希釈 OL 増殖メディアを使用しています。 注: OL 播種密度は非常に重要なので、始める前に培養顕微鏡を用いた適切な細胞密度を確認すべき。播種密度 10,000 細胞/coverslips 以下悪い細胞の生存可能性があります。10,000、25,000、OL で密度をめっき形態分化は遅い45 です。我々 は細胞の生存を確保するため、少なくとも 50,000 セル/coverslips の播種密度最小二乗法をプレートします。</li>
	<li>Coverslips ティッシュ文化フードにインキュベーターからラミニンとコーティングを含む 24 ウェル プレートを移動します。</li>
	<li>各 coverslip からラミニンを削除し、OL 懸濁液 100 μ L でそれを置き換えます。</li>
	<li>最小二乗法を最大、coverslips に OL の接着を促進するために 45 分の 37 °C/5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。</li>
	<li>インキュベーション後、インキュベーターから 24 ウェル プレートを削除します。それぞれの洪水 OL 増殖メディアの 500 μ L で 24 ウェル プレートのも。</li>
	<li>さらに 24 時間の 37 °C/5% CO2インキュベーターに Ol を配置します。</li>
	<li>最小二乗法のめっき後 24 h は増殖メディアを取り出し、分化誘導 OL 分化メディアで代用します。</li>
	<li>インキュベーターに Ol を置き、セルは固定のため準備ができているまでは削除しないでください。 注: pH 変化は最小二乗法の有害なセル実行可能性の減少、従ってインキュベーターから OLs 文化の不必要な除去を避けるべき。</li>
</ol>6. 蛍光抗体染色
<ol><li>細胞の検出のため表面マーカー (NG2、O1、O4) は井戸からメディアを削除します。</li>
	<li>O1 (原液)13 O4 (原液)13に対する主な抗体を含むマウス ハイブリドーマ培養上清の 250 μ L を追加し、ウサギの NG2 に対するポリクローナル (B27NBMA で希釈 1: 150)。 注: 市販アンチ O1 とアンチ O4 抗体を使用する場合は、製造元が推奨希釈液を利用することをお勧めです。</li>
	<li>37 °C/5% CO2インキュベーターで最大 45 分間一次抗体と細胞を孵化させなさい。</li>
	<li>トゥイーン-20/1 × PBS 0.05% で二回洗います。4% のパラホルムアルデヒドとセルを修正 (4 %pfa) 室温で 10 分間。</li>
	<li>トゥイーン-20/1 × PBS 0.05% で各 5 分を 3 回洗います。</li>
	<li>アレクサ 488 標識ヤギ抗マウス igm 抗体または抗うさぎ igg 抗体二次抗体 (1: 400) B27NBMA で希釈します。</li>
	<li>Coverslips から 0.05% Tween 20/1 × PBS を削除します。暗闇の中で部屋の温度で 1 時間の二次抗体と細胞を孵化させなさい。</li>
	<li>トゥイーン-20/1 × PBS 0.05% で各 5 分を 3 回洗います。</li>
	<li>二重染色の内部マーカー (GFAP) の検出、室温で 15 分間ブロック/透過バッファーと 0.05% Tween 20/1 X PBS とブロック/permeabilize セルを削除します。それ以外の場合 6.17 の手順に進みます。</li>
	<li>ブロック/透過バッファーを削除し、250 μ L 鶏抗 GFAP (1: 100) ブロック/透過バッファーで希釈を追加します。</li>
	<li>室温で 1 時間抗 GFAP とセルを孵化させなさい。トゥイーン-20/1 × PBS 0.05% で各 5 分を 3 回洗います。</li>
	<li>Alexa 594 共役ヤギ抗にわとり igg 抗体二次抗体 (1: 400) B27NBMA で希釈します。</li>
	<li>Coverslips から 0.05% Tween 20/1 × PBS を削除します。暗闇の中で部屋の温度で 1 時間の二次抗体と細胞を孵化させなさい。</li>
	<li>トゥイーン-20/1 × PBS 0.05% で各 5 分を 3 回洗います。</li>
	<li>4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) と対比染色とセルを DAPI を含むメディアのマウント antifade マウントします。</li>
	<li>Coverslips が一晩室温で暗闇の中で硬化させてください。</li>
	<li>落射蛍光顕微鏡による染色の細胞をイメージします。 注: このプロトコルでセルは均一露光時間を使用して 40 倍の倍率でイメージしました。</li>
</ol>

著者の開示があります。

この通信は、高純度の未熟なマウス オリゴデンドロ サイト文化の効率的な分離法を提案する.以前に公開されたプロトコル39,40に比べると、このメソッドは、GFAP 陽性アストロ サイトの非常に低いレベルと他の非特徴の細胞の割合が非常に低い高い純度を得られました。オリゴデンドロ サイトの血統に既にコミット未熟な最小二乗法であることを指摘することが重要です。したがって、これらの細胞は、分化の初期段階の研究の役に立たないでしょう。
Dincman プロトコル40から変更の 1 つは、私たちの拡散メディアから塩基性繊維芽細胞成長因子 (bFGF) の除去だった。報告されているその体外bFGF の強い細胞増殖因子として機能分化から Opc を阻害するだけでなく、またプロセス46,47の数が減少します。さらに、bFGF はオリゴデンドロ サイト分化とオリゴデンドロ サイト系列48の継代細胞増殖を増加します。したがって、それは説得力のある、O4 の数が減少+細胞、増加数 A2B5+と NG2+文化の bFGF の効果による Dincman 研究40にみられる細胞があります。
O4 のバインディングを使用して、セルを分離するための方法として、にもかかわらずだけ 59% の細胞が O4+ 1DIV で。これらの結果、Dincman や同僚40分かった分離の O4 のバインディングを使用して、セルの 50% 弱 O4 人つー+ 1DIV で。PDGF 遅延によるポスト mitotic の開発で、示されている一過性に戻す O4+GalC- A2B5 の祖先+O4 PDGF の継続的な存在にもその後区別するため-前 progenitor のような細胞49したがって、それは、最初の日の in vitroにおける増殖プロセス中にいくつかの未熟な OLs は O4 から逆転を発生ことがあります可能性があります+NG2+ O4 に-NG2+、コミットまだ残り。オリゴデンドロ サイトの系譜。この仮説は、細胞の約 80% の分離後すぐに O4 をされた Dincman の検索40でサポートされて+。
3DIV でこのプロトコルはそれよりもやや高い OL 純度を生成する我々 は彼らの方法で頭に頭の比較を行っていないが、39,40を他人に説明。Dincmanらのプロトコルと比較してください。40、FGF 増殖メディアの不足のため、我々 の文化の GFAP 陽性細胞の数を減らす可能性があります。エメリーと Dugas のプロトコル39文化料理を通して細胞の連続通路に依存しています。アストロ サイトは文化料理50に簡単に接続することができます、immunopanning プロトコルの中にセルの各連続通過後引き継がれます可能性があります。提案手法はない私たちの浄化の画分に汚染アストロ サイトを紹介危険にさらします。
私たちの修正法を実行する約 4 時間を取って他の 2 つに比べて高速です。私たちは不必要なステップおよびその他のプロトコルによって組み込まれて試薬を排除することによってこれを達成します。たとえば、私たち両方の神経組織の解離のキットの使用と死んだ細胞を除去するラット抗マウス igm 抗体ビーズ OL 細胞懸濁液の培養を省略した 5 〜 6 時間を取る、Dincman プロトコル40と比較しています。代わりに、マウスの脳皮質パパインと死んだ細胞では低速遠心 (200 x g) を実行することによって削除されたの解離を行った。
約 9 時間を取る、エメリー プロトコル39からの主要な変更は immunopanning 選択の除去と使用済みティッシュの中にパパイン バッファーを平衡に直接 O2/CO2行の要件の削除消化。代わりに、CO2インキュベーターで免疫選択と直接培養マウス脳皮質とパパイン バッファーのミックスを使用しました。
本研究では直接ではなくテストがアンチ O4 マイクロ ビーズもラット、人間および遺伝子改変マウスの脳組織から最小二乗法を分離する使用できます。これはマウス以外のソースから最小二乗法での作業に興味がある研究所の恩恵を受ける可能性のある最小二乗法の分離のため複数のティッシュ ソースを使用する技法の多様性を強調表示します。
結論として、本研究で説明されている修正の OPC 分離法は、髄鞘形成と脱髄疾患の研究に適用でき、プライマリ マウス オリゴデンドロ サイトを取得迅速かつ特定の代替を提供します。

オリゴデンドロ サイト (OLs) は、中枢神経系 (CNS)1の髄の細胞です。分離と規制の厳しい環境でプライマリ オリゴデンドロ サイトの文化はオリゴデンドログリアの開発だけでなく、脱髄疾患多発性硬化症2 などの生物の生体外で研究のための貴重なツール.これは、効率的で堅牢なオリゴデンドロ サイト分離と培養法3を必要があります。本研究では迅速かつ具体的変更された分離手法を実装する、特徴的なオリゴデンドロ サイト細胞の表面マーカーの発現を利用をしました。
成熟オリゴデンドロ サイトの 4 つの明瞭な段階を識別されている、各各発育ステージ (図 1) 特徴的な細胞表面マーカーの発現が特徴します。これらの細胞の表面のマーカー抗体4、5、によって認識することができます、特定の段階で最小二乗法を分離する使用ことができます。最初の段階では、オリゴデンドロ サイト前駆細胞 (Opc) は増殖、移行、および具体的にはエクスプレス ・血小板由来成長因子受容体 (PDGF-Rα)6, ガングリオシド A2B5, プロテオグリカン NG27,8 能力を持っています。、ポリシアル酸神経細胞接着分子9および脂肪酸酸結合タンパク質 7 (FABP7)10。Opc 神経前駆細胞11の特徴である細胞体の反対の極から発せられるいくつかの短いプロセスとバイポーラの形態があります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57543/57543fig1v2.jpg"> 図 1: マウス オリゴデンドロ サイト開発時にセル表面のマーカーの表現。A2B5、GalC (O1)、NG2、O4、PDGF Rα は具体的には特定の抗体を使用して、特定の発達段階でオリゴデンドロ サイトを分離する使用ことができますよう、OLs セル表面のマーカーです。  <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57543/57543fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
第二段階で Opc preoligodendrocytes に上昇を与えるし、細胞膜で OPC マーカーだけでなく、O4 抗体12,13、14GPR17 蛋白質によって認識されるスルファチド (硫酸化 galactolipid)未熟なオリゴデンドロ サイト (OL) 段階まで主張します。この段階では、preoligodendrocytes は、多極短いプロセスを拡張します。Preoligodendrocytes 生後 2 (P2) で主要な段階の OL は未熟な最小二乗法15のマイナーな人口を持つラットおよびマウスの大脳白質します。
第 3 段階では、未熟な OLs 続行 O4 を表現し A2B5 と NG2 マーカーの発現を失う、galactocerebroside C16を表現し始めます。この段階で OLs は別個の系統にコミットしているし、長い分岐し枝17,18と分裂後の細胞になります。未熟な OL が P7 で齧歯動物の白質の 80% 以上を構成して、この時点で最初の MBP+細胞は15,19,20,21が観察されます。したがって、P7 で OLs の分離は、高細胞収量を確保できます。
OL 開発の最後、第 4 段階で成熟した OLs エクスプレス髄蛋白質 (ミエリン塩基性タンパク質 (MBP)、ミエリンプロテオリピドタンパク質 (PLP)、関連付けられているミエリン糖タンパク質 (MAG) とミエリン オリゴデンドロ サイト糖タンパク質 (モグ)22,23 ,24,25,26。この段階で成熟した最小二乗法は、軸索の周り鞘を enwrapping フォーム最適化される膜を拡張し、脳内を活性化することができます。これは、ラットやマウスの脳で MBP+細胞なる P1419,20,21ますます豊富な観察と一致します。
Immunopanning28,29,30, を含む Fewster と 1967年27で同僚のオリゴデンドロ サイトの最初の分離後 OLs の齧歯動物の中枢神経系からの分離のためのいくつかの方法を実施しています蛍光活性化細胞は、細胞表面抗原28,31, 微分勾配遠心法32,33,34,35 を利用 (FACS) を選別と異なる中枢神経系グリア36,37の差分の遵守に基づく振動法。ただし、現行の培養法には、純度、収量、38の手順の実行に要する時間の観点から特に制限があります。したがって、オリゴデンドロ サイトの効率的分離法が必要です。
本稿で提案する簡単な効率的な選択方法の免疫隔離のためステージ 3 O4+ preoligodendrocytes 細胞新生仔マウスの子犬。このメソッドは、エメリーらによって報告される技術の変更39と Dincmanら40し約 4 時間で 80% 以上のオリゴデンドロ サイト準備純度を提供します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10ml serological pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ml syringe Luer-Loc tip</td>
			<td>BD, Becton Dickinson</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40&#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22368547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml serological pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm tissue culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70&#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 goat anti-chicken IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-O4 beads- Anti-O4MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>6032-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>6032-1102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Growth Serum (BGS)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30541.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP-1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desoxyribonuclease I (DNAse I)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope with an Olympus DP70 camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Bx51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather disposable scalpels</td>
			<td>Andwin Scientific</td>
			<td>EF7281C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round</td>
			<td>NeuVitro</td>
			<td>GG-12-oz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12585-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator stand - MACS multistand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator-MiniMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex PES 0.22&#181;m filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLG033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media- Prolong Gold with DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-cysteine (NAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural mouse laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium A</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotrophin-3 (NT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG2 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-13A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection column-LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace elements B</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-000-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine (T3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27NBMA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>487.75 mL Neurobasal Medium A; 10 mL B27 Supplement; 1 mL Primocin; 1.25 mL Glutamax; Filter sterilize and store at 4 &#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27NBMA + 10% BGS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>27 mL B27NBMA; 3 mL Bovine growth serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF solution stock (10 &#181;g/ml; 1000X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Order from Peprotech (450-50). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to Manufacturer&#8217;s instruction (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80 &#176;C. 
			Working solution (10 &#181;g/ml, 1000X) 
			1. Make on 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in DPBS solution and filter sterilize. 
			2. Dilute master stock aliquot to 10&#181;g/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 
			3. Aliquot (20&#181;l/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 
			4. Store aliquots at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Biotin stock solution (50 &#181;g/ml; 5000X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Resuspend d-Biotin (Sigma-B4639) in double-distilled H2O at 50 &#181;g/ml (e.g. 2.5 mg in 50 ml of ddH2O). Resuspension might take fair amount of agitation/vortexing, or mild warming briefly at 37&#176;C. If the d-Biotin still will not solubilize, it is fine to make up a less concentrated (e.g. 10&#181;g/ml), and to add a higher volume to the B27NBMA (1/1000), instead of 1/5000). Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1. Dissolve at 12,500 U Deoxyribonuclease I / ml in HBSS chilled on ice. 
			2. Filter sterilize on ice 
			3. Aliquot at 200 &#181;l and freeze overnight at -20&#176;C. 
			4. Store aliquots at -20 to -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (w/o Ca2+ and Mg2+)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve pouch in 1 Liter of water to yield 1 liter of medium at 9.6 grams of powder per liter of medium. Store at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin stock solution (4.2 mg/ml; 1000X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1 ml of sterile DMSO to 50 mg Forskolin in bottle (Sigma-F6886) and pipette until resuspended. Transfer to a 15 ml centrifuge tube and add 11 ml of sterile DMSO to bring to 4.2 mg/ml. Aliquot (e.g. 20 &#181;l) and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salts (HBSS) (Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1. Measure 900 ml of water (temperature 15-20 &#176;C) in a cylinder and stir gently. 
			2. Add the power and stir until dissolved. 
			3. Rinse original package with a small amount of water to remove all traces of the powder. 
			4. Add to the solution in step 2. 
			5. Add 0.35 gr of sodium bicarbonate (7.5% w/v) for each liter of final volume. 
			6. Keep stirring until dissolved. 
			7. Adjust the pH of the buffer while stirring to 0.1-0.3 units below pH= 7.4 since it may rise during filtration. The use of 1N HCl or 1N NaOH is recommended to adjust the pH. 
			8. Add additional water to bring the final volume to 1L. 
			9. Sterilize by filtration using a membrane with a porosity of 0.22 microns. 
			10. Store at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin stock solution (4000 &#181;g/ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Thaw the bottle and aliquot 25 &#181;l per microcentrifuge tube and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Slowly thaw laminin in the cold (2&#176;C to 8&#176;C) to avoid gel formation. Then, aliquot into polypropylene tubes. Store at 5&#176; C to -20&#176; C in aliquots (e.g. 20 &#181;l) and do not freeze/thaw repeatedly. Laminin may be stored at these temperatures for up to six months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Cell Sorting (MCS) Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare the solution containing phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.2, and 0.5% bovine serum albumin (BSA), 0.5 mM EDTA, 5&#181;g/ml Insulin, 1 g/L Glucose. Sterilize and degas by filtration the buffer by passing it through a 0.22 &#181;m Millex filter. Store the buffer at 4&#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine (NAC) stock solution (5mg/ml; 1000X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve N-Acetyl-L-cysteine (Sigma-A8199) at 5 mg/ml in DMEM (e.g. 50 mg NAC in 10 ml B27NBMA). Filter sterilize and aliquot (e.g. 20 &#181;l). Store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT3 stock solution (1 &#181;g/ml; 1000X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Master stock: 
			Order from Peprotech (450-03). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer&#8217;s instructions (may vary from lot to lot), in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80&#176;C. 
			 
			Working stock (1&#181;g/ml; 1000X): 
			1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize. 
			2. Dilute master stock aliquot to 1 &#181;g/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 
			3. Aliquot (e.g. 20&#181;l/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 
			4. Store aliquots at -80&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF stock solution (10 &#181;g/ml; 1000X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Master stock: 
			Order from Peprotech (100-13A). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer&#8217;s instructions (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS) + 0.2% BSA). Store at -80&#176;C. 
			 
			Working stock (1&#181;g/ml; 1000X): 
			1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize. 
			2. Dilute master stock aliquot to 1&#181;g/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 
			3. Aliquot (e.g. 20&#181;l/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 
			4. Store aliquots at -80&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine (1mg/ml; 100X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Resuspend poly-D-lysine, molecular weight 70-150 kD (Sigma P6407) at 0.5mg/ml in 0.15M boric acid pH 8.4 (e.g. 50mg in 50ml borate buffer). Filter sterilize and aliquot (e.g. 100&#181;l/tube). Store at -20&#176;C. Prior to use, dilute the 100X stock (1mg/ml) to 50 &#181;g/ml in sterile water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligodendrocyte proliferation media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see Supplementary Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligodendrocyte differentiation media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see Supplementary Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sato supplement (100X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see Supplementary Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>References: the list of reagents and recipes were adopted from the protocols previously described by Emery et. al. 2013 (Emery, B. &#38; Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) and Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. &#38; Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and specific immunomagnetic isolation of mouse primary oligodendrocytes

効率的で堅牢な分離とプライマリ オリゴデンドロ サイト (OLs) の文化はオリゴデンドログリアの開発だけでなく、多発性硬化症などの疾患を脱髄の生物学の生体外で研究のための貴重なツールとPelizaeus メルツバッハー様疾患 (PMLD)。ここでは、単純な効率的な選択方法の免疫隔離のためステージ 3 O4+ preoligodendrocytes 細胞新生仔マウスの子犬。未熟な OL が、80% 以上の生後 7 日目で齧歯動物脳白質 (P7) この分離方法だけでなく細胞高利回りを保証も既に別個の系統にコミット OLs の特定の分離を構成するので減少、アストロ サイトなど汚染細胞とマウスの脳から他の細胞を分離することの可能性。このメソッドは、以前、報告方法の変更です、オリゴデンドロ サイト準備純度約 4 時間で 80% 以上を提供します。

本研究の目的は O4 の改善の分離法を確立、+プライマリ マウス オリゴデンドロ サイト ターゲット細胞の最低限の操作を必要とします。Coverslips のセルのめっきに子犬の安楽死から全体のプロシージャは約 4 時間、ここで表示されるデータを表す 3 つの独立した実験。組織解離後 4.3 ± 0.46 × 107セルの平均値が 91% ± 5.6% の生存率をそれぞれ独立した実験のため分離されました。アンチ O4 を使用して免疫隔離タグ マイクロ磁気ビーズ後 6.9 ± 0.38 x 106の平均最小二乗法が得られた (10 x 1 1.5 マウスあたり6 ) 16.2% である最初解離; 合計セルの ± 1.6%生存率 96.3% ± 3.5% であった。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57543/57543fig2.jpg"> 図 2: Immunomagnetically 分離 1DIV で OLs エクスプレス未熟なマーカー 。位相差顕微鏡を bi とトライ ポーラー形態の下には、最小二乗法を (A)。OLs エクスプレス NG2 (B) O4 (C) と O1 (D)。非常に少数のアストロ サイト 1DIV に存在していた (C、赤)、スケールバー = 50 μ m。 3 の独立した実験からデータが収集されました。<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57543/57543fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
Immunomagnetically 分離した細胞の抗原の表現型を調べる免疫蛍光染色され実行 24 h (1DIV) 72 h (3DIV) 細胞をメッキした後。1DIV、セル登場双や位相差顕微鏡 (図 2 aB) の下で三極 OLs (Opc または preoligodendrocytes) の増殖初期段階の特徴の特徴。NG2 ラベル (図 2 b)、これらの細胞の 66.1 ± 8.4%、58% ± 9.4% の細胞が O4 ラベル (図 2)。O1 (GalC)-ラベリング、オリゴデンドロ サイト系列のより成熟した細胞のマーカーははるかに少ない共通 (図 2 D7.4% ± 6.0%)。このマーカーのプロファイルは細胞の大半がこの時点で小さい割合未熟か成熟した oligos とおそらくいくつかオリゴデンドロ サイト前駆細胞 (Opc) 前オリゴデンドロ サイトを示唆しています。アストロ サイト, GFAP 染色、0.57 ± 1.0% (図 2) の構成によって証明されます。これらのデータは、修正技術で分離されたオリゴデンドロ サイトが高度に精製し、大半が未熟なオリゴデンドロ サイトの典型的なマーカーの表現パターンを表示をお勧めします。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57543/57543fig3.jpg"> 図 3: 3DIV で成熟した OLs マーカーの発現します。段階の対照の顕微鏡より複雑な形態を表示の下には、最小二乗法を (A)。3DIV、NG2 の式に (B) 減り、劇的に O4 (C) と O1 (D) 増加します。いくつかアストロ サイトが 3DIV で表示されます (C、赤)、スケールバー = 50 μ m。 3 の独立した実験からデータが収集されました。<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57543/57543fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
3DIV、オリゴデンドロ サイト形態登場 1DIV の細胞よりも複雑 (図 3 a)。この時点で初期のオリゴデンドロ サイト マーカー NG2 は NG2 ラベル セル 1 に比較してはるかに低い陽性細胞の頻度構成 31.2 ± 17.1% (対 1DIV、 tで 66.1 ± 8.4%-p をテスト < 0.0001、図 3 b、 図 4 a)。ここでは分析されません、1DIV と比較して 3DIV で NG2 陽性とみなされる細胞内染色の平均強度は低下しました。ほとんどの細胞 (81.9% ± 4.884%図 3) O4-ラベル、1DIV でより高く示した (58% ± 9.4%、 t-テスト p < 0.0001、図 4 b)。また、ほぼ半分の細胞 (47.2% ± 16.4%図 3 D) を示した O1 の染色 (GalC) セルはより成熟した表現に差別化を示唆より成熟オリゴデンドロ サイト系統のマーカー。O1 の増加+細胞 3DIV で、1DIV と比較しても有意 (7.4% ± 6.0%、 t-テスト p < 0.0001、図 4)。存在このアストロ サイト時間点極めて低い水準 (0.8% ± 1.5%図 3) と 1DIV と比較して有意差はなかった (0.57% ± 1.0%、重要ではない (ns)、図 4)。時間をかけて分離 immunomagnetically オリゴデンドロ サイトがアストロ サイトなど他の細胞型の汚染は極めて少ないと成熟の段階 3 に体外を区別することが示唆されました。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57543/57543fig4.jpg"> 図 4: 1DIV と 3DIV で OL マーカーの発現の定量化 (A-D).1DIV、細胞の 66% あった NG2+、58% の細胞が O4+、7% の細胞が O1+ 、0.5% の細胞 GFAP+。3DIV、細胞の 31% あった NG2+、81% の細胞が O4+、47% の細胞が O1+ 、0.7% の細胞 GFAP+。平均値 ± SD をご紹介、* * * p を示します < 0.0001、ns = 重要ではないです。3 の独立した実験からデータが収集されました。<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57543/57543fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

体外培養の細胞の迅速かつ特定の分離を可能にするプライマリ マウス オリゴデンドロ サイトの免疫隔離について述べる。

マウスの主なオリゴデンドロ サイトの特異的・迅速免疫分離

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

rapid-specific-immunomagnetic-isolation-mouse-primary

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.5K ビュー.  State University of New York Downstate Medical Center. 体外培養の細胞の迅速かつ特定の分離を可能にするプライマリ マウス オリゴデンドロ サイトの免疫隔離について述べる。

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Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofectionとマウス胎児海馬および皮質ニューロンの初代培養

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

神経科学

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

マウス大脳皮質アストロサイトの単離および培養

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

マウスドーパミン作動性ニューロンの初代培養

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis of primary cultures of neurons. We describe a set of procedures for: labeling newborn mice to be genotyped, rapid genotyping, and establishing low-density cultures of brain neurons from these mice. Individual mice are labeled by tattooing, which allows for long-term identification lasting into adulthood. Genotyping by the described protocol is fast and efficient, and allows for automated extraction of nucleic acid with good reliability. This is useful under circumstances where sufficient time for conventional genotyping is not available, e.g., in mice that suffer from neonatal lethality. Primary neuronal cultures are generated at low density, which enables imaging experiments at high spatial resolution. This culture method requires the preparation of glial feeder layers prior to neuronal plating. The protocol is applied in its entirety to a mouse model of the movement disorder DYT1 dystonia (&#916;E-torsinA knock-in mice), and neuronal cultures are prepared from the hippocampus, cerebral cortex and striatum of these mice. This protocol can be applied to mice with other genetic mutations, as well as to animals of other species. Furthermore, individual components of the protocol can be used for isolated sub-projects. Thus this protocol will have wide applications, not only in neuroscience but also in other fields of biological and medical sciences.

We describe procedures for labeling and genotyping newborn mice and generating primary neuronal cultures from them. The genotyping is rapid, efficient and reliable, and allows for automated nucleic-acid extraction. This is especially useful for neonatally lethal mice and their cultures that require prior completion of genotyping.

脳神経細胞の初代培養の確立が続く動物の急速なジェノタイピング

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

初代マウス脳微小血管内皮細胞の単離

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. Microglia are mesodermal cells that function similarly to macrophages in surveying inflammatory stress. The classical (M1-type) and alternative (M2-type) activations of macrophages have also been extended to microglia in an effort to better understand the underlying interplay these phenotypes have in neuroinflammatory conditions such as Parkinson&#39;s, Alzheimer&#39;s, and Huntington&#39;s Diseases. In vitro experimentation utilizing primary microglia offers rapid and reliable results that may be extended to the in vivo environment. Although this is a clear advantage over in vivo experimentation, isolating microglia while achieving adequate yields of optimal purity has been a challenge. Common methods currently in use either suffer from low recovery, low purity, or both. Herein, we demonstrate a refinement of the column-free CD11b magnetic separation method that achieves a high cell recovery and enhanced purity in half the amount of time. We propose this optimized method as a highly useful model of primary microglial isolation for the purposes of studying neuroinflammation and neurodegeneration.

Here, we present a protocol to isolate microglia from postnatal mouse pups (day 1) for in vitro experimentation. This improvised method of isolation generates both high yield and purity, a significant advantage over alternate methods that allows broad range experimentation for the purposes of elucidating microglial biology.

強化された純度と汎用性を持つ初代ミクログリアの迅速かつ洗練されたCD11b磁気分離

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

プライマリ マウス骨格筋の微小血管内皮細胞の分離

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

ドーサルルート神経節マクロファージの迅速な分離

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials through saltatory conduction. Moreover, an increasing number of reports suggest that oligodendrocytes interact with neurons beyond myelination, notably through the secretion of soluble factors. Here, we present a detailed protocol allowing purification of oligodendroglial lineage cells from glial cell cultures also containing astrocytes and microglial cells. The method relies on overnight shaking at 37 &#176;C, which allows selective detachment of the overlying oligodendroglial cells and microglial cells, and the elimination of microglia by differential adhesion. We then describe the culture of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium (OCM). We also provide the kinetics of OCM treatment or oligodendrocytes addition to purified hippocampal neurons in co-culture experiments, studying oligodendrocyte-neuron interactions.

Herein, we display an efficient method for the purification of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium that can be used for co-culture experiments.

共同培養実験のためのオリゴデンドロサイト及びオリゴデンドロサイト条件培地の生成

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

マウスの主なオリゴデンドロ サイトの特異的・迅速免疫分離

マウスの主なオリゴデンドロサイトの特異的・迅速免疫分離