ロシア科学財団によってサポートされていたこの作品は、無許可します。 14-50-00060およびLLC RUSCHEMBIO。この作品は、また、（CJ）は294083（AVTへ）、およびNIH助成金RO1 DK47700によって付与アメリカのCrohn`sと大腸炎財団によってサポートされていました。

動物研究は、健康ガイドラインの国立研究所に従って行われ、動物実験によって承認されたとトルドー研究所の委員会を使用しています。 8-12週齢のC57BL / 6マウスを研究に使用しました。 外科1.準備<ol><li>準備と手術器具を滅菌します。 </li><li>ノーズコーン、および加熱パッドでイソフルランベースの麻酔システムを準備します。加熱されたパッドが（&lt;39ºC）を過熱されていないことを確認してください。 </li><li>イソフルランガス掃気キャニスターがブロックされたり、任意の方法で閉塞されていないキャニスターの底部に排気口を確保するために正しく配置されていることを確認してください。キャニスター上の手続きや書類の重量の前に掃気キャニスターを計量。キャニスターの重量が累積重量（〜12時間）の50グラムを超えたときにキャニスターを捨てます。 </li></ol> 2.麻酔<ol><li>誘導室中の3％イソフルランでマウスを麻酔（1 L /分O 2）。 <ol><li>意図的な随意運動、瞬目反射の消失、筋弛緩、および反射刺激（事務所の圧力でつま先や尾ピンチ）に対する応答の損失の直立し、損失を維持することができないことによって麻酔深度を評価します。 </li><li>胸壁と腹部の動きを観察することによって、呼吸速度およびパターンを評価します。最適な麻酔下、呼吸数は、毎分〜55-65呼吸でなければなりません。 </li><li>誘導チャンバーからマウスを外し、すぐにマウスの腹部領域を剃ります。 </li></ol></li><li>角膜の乾燥を防ぐために、目に当たり障りのない眼軟膏を配置します。 </li><li>加熱されたパッドの上にマウスを置き、麻酔システムにノーズコーンを介して接続します。ラテックスノーズコーンの膜がしっかりとマウスの頭の上にフィットし、イソフルランのない漏れがないことを確認してください。 </li><li> 1.5パーセントにイソフルラン率を低下させ、ブプレノルフィン（0.1ミリグラム/キログラム）と痛み-カスケードのワインドアップを防止するために、ケタミン（10mg / kgの）皮下注射します。 </li><li>目を拭きベタジン外科的な解決策を染み込ませた滅菌綿棒で操作エリアのEの皮膚を70％エタノールに続きます。 </li></ol> 3.手術<ol><li>オペレーティングハサミで正中線3〜5センチメートル開腹術を行います。生理食塩水で湿らせた無菌の非接着パッドで操作エリアをカバーしています。盲腸および回腸を分離し、食塩水で湿らせた綿棒を使用して、上腸間膜動脈を露出させます。 </li><li>適用するクリップを容易にするために、優しくドレッシング鉗子で腸を高め、目的のクリップ位置（ 図で上腸間膜動脈の両側に腸間膜をカットし、微細なアイリスを使用して、上腸間膜動脈の周囲の腸間膜の小さなニックはこれを行うscissors.To作ります1A）。その後、クリップを適用する前に、目的のクリップ位置の領域に滅菌生理食塩水を数滴を追加します。 注：偽手術を実行するには、3.2のステップに外科手術をフォローアップ。クリップを適用しないでください。その代わりに、追加された暖かいsが湿った組織を維持1時間3.6で説明したようにアリーン。その後、4.1に進み、 </li><li>盲腸（ 図1B）に隣接した虚血性回腸5-7センチの領域を作成するために、クリップアプライヤーを使用して、微小血管クリップ（70グラム力）と上腸間膜動脈の一次枝を閉塞します。血管の位置は保守的ではあるが、（ 図1上の例を参照）マウスとの間にわずかな変動があるかもしれません。したがって、2または3クリップが通常必要とされている（ 図1A、D、E、黒矢印上のクリップの位置を参照）。 注意：高品質の容器クリップを使用してください。高圧クリップは、血管を損傷し、完全に血液の流れを遮断しないことがあり、低圧クリップ（&lt;30グラム）に対し、再生を防ぐことができます。 </li><li>虚血性腸の領域（ 図1）マーキングを解除、船舶全体で2微小血管クリップを用いて腸（40グラムの力）を介して側副血流を遮断します。側副血管の閉塞をすることが要求されます隣接する血管から血液供給を防止する（ 図1A、D、E、緑の矢印上のクリップの位置を参照）。 </li><li>オプション：血液凝固を防止するためにヘパリン溶液（6 USP単位/ ml）を、追加します。滴下は、単離された腸にヘパリン溶液の0.5ミリリットルを追加します。 </li><li>生理食塩水で湿った無菌の非接着パッド繊細なワイプは、37℃にあらかじめ温め、手術領域に適用されます。ワイプは、全手順の間に濡れたままであることを確認してください。 </li><li>全体で1から1.5パーセントイソフルラン麻酔を使用して、60分間の虚血を維持します。虚血手順が正しく実行されている場合は、虚血領域は、約30分間で色がワインレッドに変わります。成功した閉塞を示す虚血（ 図1、右パネル）の間に拡大されたクリップの位置から遠位その血管に注意してください。 </li><li>密接に虚血段階でマウスを監視します。手術部位をカバーする非接着パッドに食塩水を適用し続けます。 </li><li>マーク組織にGill`s 3ヘマトキシリン20μlのをピペットにより虚血領域のエッジが（ 図1E、右パネル）を比較のために同じマウスからの虚血組織と隣接する健康な組織を採取容易にします。 </li></ol> 4.再灌流ステー​​ジ<ol><li>虚血の終わりにクリップ領域に生理食塩水を数滴を追加し、静かにクリップアプライヤーで微小血管クリップを削除します。そして、静かに生理食塩水湿らせた綿のヒントを使用して戻って腹腔への腸を押してください。非接着パッドを取り外し、9ミリメートルのステンレス鋼創傷クリップを使用して腹壁と皮膚を閉じます。再灌流を3時間よりも長く実行された場合は、皮膚に創傷クリップを適用する前に、腹壁を閉じるには、吸収性ビクリル縫合糸を使用しています。 </li><li>再灌流相の所望の時間（30分、60分、120分、または180分）のために加熱された清潔なケージにマウスを維持します。 </li><li>動物に安定性を確保するために、少なくとも30分ごとに確認してください。 </li></ol><pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 5。剖検および小腸の収穫<ol><li>再灌流後所望の時間に頸椎脱臼に続いてCO 2過剰投与によりマウスを安楽死させます。 </li><li>腹腔を開き、さらなる分析のために、虚血性腸組織を収集します。傷害に任意の全身反応のためのアカウントへの内部コントロールとして、傷害を受けた組織に隣接ハーベスト健康で正常な組織。 注：このコントロールは、偽手術マウスは、IR誘導性の損傷に対する全身反応を受けないため、偽の対照マウスを操作するよりも、より適切です。 </li><li>生理食塩水で満たされ、その後、縦方向に腸を切っ添付胃管栄養針を30ミリリットルの注射器を使用して、腸の内容物を洗浄します。腸のサンプルを遺伝子発現分析に必要とされる場合は、縦方向に1.5ミリメートルの断片を切断し、組織学的分析のために残りの部分を使用します。 </li><li>組織学的分析のために、INTESTをロールピンセットを使ってロールケーキを準備INE。 </li><li>ロール状を維持するために、組織カセット（ 図2）に生検フォームパッド間の腸のピースを置きます。 10％緩衝ホルマリン中にカセットを置きます。 </li><li>少なくとも24時間ホルマリンで組織を修正しました。さらに24時間、70％エタノールでホルマリンを交換してください。室温で無期限の70％エタノールに保管組織。 </li><li>パラフィンに埋め込 ​​み、5μmの切片を切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンは、標準的なプロトコル（図3）を用いて染色。 </li></ol> 6.得点<ol><li> 表2にまとめたように、マウス虚血-再灌流傷害のスコア。適切な採点方法を選択します。 </li><li>オプション：損傷の重症度は、セクション全体で変化するため、4つのセクションに視野を分割します。 </li><li>盲目的に得られたスコアから各セクションの平均等級を計算します。 </li><li>例と対照との間だけでなく、目に損傷組織のグレードを比較eはダンの多重比較検定に続いてクラスカル・ウォリステストを、使用して組織を無傷。 </li></ol>

The authors declare no conflict of interest

腸IR傷害のマウスモデルの開発は非常に組織損傷のメカニズムの理解を改善し、組織損傷7,9,11,34を最小限にするために潜在的な治療戦略の開発を支援しています。このプロトコルの重要なステップは、微小血管クリップの適切な位置決め、IR傷害の虚血と適切な組織学的評価の正しいタイミングです。 虚血の持続時間は、その後の上皮傷害のために重要です。実験用マウスの罹患率と死亡率なしで再現可能なIR傷害を誘導するのに必要な典型的な時間は2-3時間の再灌流に続いて45-60分です。虚血の延長期間もよい上皮および死亡率の増加の完全な喪失をもたらします。 120分間の閉塞は絨毛上皮35の完全な喪失につながったのに対し、例えば、空腸の虚血のブタモデルでは、60分間の閉塞は、ヴィラ上皮の部分的な喪失をもたらしました。私mportantly、無菌および遺伝子操作したマウスは、IR傷害に対する感受性の増加を表示することができるため、虚血および再灌流の最適な時間は、予備実験で最適化する必要があるかもしれません。再灌流後の組織損傷を評価するための典型的な時間は2~3時間、より長い時間（12時間）であるが、腸の幹細胞動員36の分析に必要とされます。また、共生細菌叢の変化やTLR / NOD-媒介性のシグナル伝達が大幅IRの損傷4,8,37-39の結果に影響を与えることができます。 微小血管クリップの正しい位置も再現可能なIR傷害のために重要です。ここでは、マウス回腸遠位部のIR傷害のモデルを記述します。腸の異なる部分は、IR傷害に対して異なる感受性を示すことが知られています。例えば、空腸回腸及び結腸9,34,40よりIR傷害に対してより敏感です。実際には、空腸の虚血 - 再灌流モデルシングルでSMAを閉塞することにより、クリップは、一般的にIR傷害のメカニズムを研究するために使用されている（参考文献を参照してください。9匹の動物におけるIR傷害の異なる方法の包括的な見直しのため）。しかし、クリップの正確な位置および腸の異なる部分の分析、ならびに麻酔の異なる方法がある （ 表1を参照のこと ）が困難に再現すること、これらの研究の間で変化します。 SMAのルートに近い血管クリップの位置が腸の広い領域への血液供給に影響を与えるので、空腸のIR傷害の追加の合併症は、高い死亡率です。したがって、現在の研究では、我々は再現することが容易である回腸末端の一貫したIR傷害を誘導するためのプロトコルを開発しました。回腸の再現性のIR傷害を誘導するために、血管クリップの適切な位置は重要です。これは、IR傷害の上腸間膜artery.The度の末梢および担保の枝を閉塞することによって達成されるが、元のチウ/パーを使用して、ヘマトキシリン​​およびエオシンセクションの評価によって評価することができますKまたは修正されたスコアシステム11,18,34,41,42。さらに、組織損傷の評価は、断片化したDNAの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼビオチン-dUTPニック末端標識（TUNEL）染色、または活性カスパーゼ3の免疫組織化学的染色、ミエロペルオキシダーゼ活性またはGrとを用いて、好中球の免疫組織化学的評価を測定することによって好中球の分析を使用して行うことができます-1、またはLy6G抗体染色7,11。このようなIL-1B、炎症性サイトカインおよびケモカインは、TNF、IL-6、CXCL1、CXCL2、CCL2は、リアルタイムPCR 2,4,8によって評価することができます。炎症性サイトカイン発現の分析の例を図4に示されています。 上腸間膜動脈9の部分的閉塞で特に慢性疾患状態および条件で、回腸のIR傷害の高い再現性とアクセシビリティにもかかわらず、このモデルは、ヒト疾患のすべての臨床徴候を反映していない可能性があることに留意することが重要です</SUP&gt;。マウスとヒトとの間の絨毛の微小血管系の相違、ならびにキサンチンオキシダーゼ、IR傷害9,43の間に活性酸素種の産生を媒介する重要な酵素のレベルもあります。したがって、例えば、ブタなどの大型動物を用いたモデルは、9,44を開発されています。研究されている人間の条件に応じて、動物モデルの慎重な選択が重要です。要約すると、我々は、上皮損傷および再生の細胞および分子メカニズムを研究するために利用することができる、腸IR傷害の簡単かつ堅牢なモデルを説明します。

腸は、虚血及び上皮損傷の原因となる血流の遮断に非常に敏感です。虚血後再灌流は、組織の再酸素化を提供し、さらに病状を促進することができます。したがって、腸管虚血および再灌流傷害は、壊死性腸炎、小腸移植における同種移植片拒絶反応、腹部大動脈瘤手術、心肺バイパス、および炎症性腸疾患1,2の合併症を含む病態の広範な、関連付けられています。腸IR傷害、特に急性腸間膜虚血は、罹患率および死亡率3で ​​得られた生命を脅かす状態です。 十分に理解するが、腸の虚血再灌流（IR）傷害は、腸内微生物叢ならびに活性酸素種と、炎症性サイトカインおよびケモカイン1,4-6の生産における変化と関連すると考えられています。これは、両方の活性化につながりますネイト炎症および組織損傷の1,7,8を促進適応免疫機構。 彼らは簡単にgain-と機能喪失の遺伝的実験を可能にするように動物モデルは、IR傷害のメカニズムを理解するために重要です。 IRのいくつかの動物モデルは、完全な血管閉塞、低流量虚血を含むが開発、および（最近の包括的なレビュー9にまとめた）血管閉塞をセグメント化されています。上腸間膜動脈（SMA）の完全な血管閉塞によって引き起こされる腸管虚血は、大型動物やげっ歯類9-11のIRの簡単で一般的に使用されるモデルです。しかし、腸の異なる領域は、損傷に対して異なる感受性を持っています。また、麻酔薬、鎮痛薬、動脈閉塞技術、ならびに傷害の可変度における虚血性損傷と回復結果の期間における矛盾の多様な範囲は、複数のstudie全体のIRの生物学の我々の理解を混乱させるsである。 表1は、ネズミのIR研究におけるこれらの不整合を示しています。短い虚血時間（30-45分）を使用してからの最大の欠点は、症例と対照の間に識別可能な差異が観察できる時に回復のウィンドウをターゲットにしています。上皮の軽度の損傷は、再灌流後の時間を解決することができるので、専門の病理学的指標は、上皮反発の違いを見つけることが必要になることがあります。対照的に、過度の損傷は、虚血性傷害の100分から見た死亡率、および回復時間を増大させる、復元がもはや不可能である上皮の完全denudementもたらし得ます。そこで、ここでは私たちのフィールド全体でこの技術の標準化を促進するために死亡することなく、再現性の傷害をもたらすマウスにおける腸IRの詳細な手順を説明します。腸IR傷害のこのモデルは、損傷および再生の細胞および分子メカニズムを研究するために利用することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1160">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Heated Pad</td>
			<td style="width:191px;">Sunbeam</td>
			<td style="width:249px;">E12107-819</td>
			<td style="width:379px;">Alternative: Braintree Scientific heated pad</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Table top research anesthesia Machine</td>
			<td>Vasco</td>
			<td>UCAP 0001-0000171</td>
			<td>Alternative: Parkland Scientific, V3000PS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nose Cone</td>
			<td>Parkland Scientific</td>
			<td>ARES500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scavenger canister and replacement cartridge</td>
			<td>Parkland Scientific</td>
			<td>80000, 80120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Induction Chamber</td>
			<td>Surgivet</td>
			<td>V711802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td>Piramal Healthcare</td>
			<td>NDC 66794-013-10</td>
			<td>Controlled substance, contact IACUC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Animal clipper&#160;</td>
			<td>Oster&#160;</td>
			<td>Oster Golden A5 078005-050-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ophthalmic ointment</td>
			<td>Webster</td>
			<td>8804604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buprenorphine</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>562766</td>
			<td>Controlled substance,contact IACUC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketaset (Ketamine HCl)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>NADA 45-290</td>
			<td>Controlled substance, contact IACUC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cotton tips</td>
			<td>Puritan medical products</td>
			<td>806-WC</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Betadine</td>
			<td>Purdue Products</td>
			<td>67618-150-17</td>
			<td>10% Povidone-Iodine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile saline solution</td>
			<td>Aspen</td>
			<td>46066-807-60</td>
			<td>Adjust to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile cotton gauze pad</td>
			<td>Fisher Healthcare</td>
			<td>22-415-468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-adherent pad prepack</td>
			<td>Telfa</td>
			<td>1238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IR rodent thermometer</td>
			<td>BIOSEB</td>
			<td>BIO-IRB153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro vascular clips, 70g</td>
			<td>Roboz Surgical&#160;</td>
			<td>RS5424, RS5435</td>
			<td>Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro vascular clips, 40g</td>
			<td>Roboz Surgical&#160;</td>
			<td>RS6472</td>
			<td>Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clip applying forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14189</td>
			<td>Alternative: Roboz #RS-5410 or&#160; #RS-5440</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gill&#39;s 3 hematoxylin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14-390-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgical staples, Reflex 9 mm</td>
			<td>Cell Point Scientific</td>
			<td>201-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autoclip applier</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>427630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Byopsy foam pad</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M476-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue cassette</td>
			<td>Fisher Healthcare</td>
			<td>15182701A</td>
			<td>Histosette II combination lid and base</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10% buffered formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>245-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgical iris scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501263-G SC</td>
			<td>Alternative: Roboz RS6816</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Operating scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501219-G</td>
			<td>Alternative: Roboz RS6814</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dressing forceps</td>
			<td>Roboz Surgical&#160;</td>
			<td>RS-5228, RS-8122</td>
			<td>Alternative: World Precision Instruments 1519-G</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50mg</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:343px;">Reflex wound clip removing forceps</td>
			<td>Roboz Surgical&#160;</td>
			<td>RS-9263</td>
			<td>Alternative: World Precision Instruments: 500347</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mice C57BL/6J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No 0664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Telfa non-adherent dressings, 3x4, sterile</td>
			<td>Coviden</td>
			<td>1050</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury

腸管虚血は、アテローム性動脈硬化症、血栓症、低血圧、壊死性腸炎、腸移植、外傷および慢性炎症などの臨床症状の広い範囲に関連した生命を脅かす状態です。腸管虚血再灌流（IR）傷害は、腸の損傷をもたらす、腸間膜血管を介して不十分な血流によって引き起こされる、急性腸間膜虚血の結果です。再灌流後の虚血は、さらに腸の損傷を悪化させることができます。 IR損傷のメカニズムは複雑であり、十分に理解されています。したがって、実験小動物モデルは、IR傷害の病態生理学及び新規治療法の開発を理解するために重要です。 ここでは、死亡することなく、小腸の再現可能な損傷を与える急性腸IR傷害のマウスモデルを記述しています。これは、時間的にオクルディンによって回腸遠位部の領域における虚血を誘導することによって達成されます。グラム微小血管クリップを使用して、60分間の上腸間膜動脈の末梢と端末側副枝。 1時間の再灌流、または組織学的分析によって調べ腸の再現可能な損傷で傷害の結果の後に2時間。微小血管クリップの適切な位置は、手続きのために重要です。したがって、ビデオクリップは、この技術の詳細な視覚的なステップバイステップの説明を提供します。腸IR傷害のこのモデルは、損傷および再生の細胞および分子メカニズムを研究するために利用することができます。

我々は、マウスにおける回腸の再現性のIR誘導性の傷害を得るために、IR手術の実験プロトコルを最適化しました。代表的な結果は、このセクションで実証されています。 図1は、回腸の虚血を誘導するために、微小血管クリップ位置の例を示しています。黒の矢印は、上腸間膜動脈の一次枝を閉塞メインクリップの位置を示しています。緑の矢印は、側副血管からの血液供給を遮断するための追加のクリップの位置を示しています。クリップの位置とintestinteの虚血領域の色の変化に対して遠位閉塞した血管のサイズの増加に注意してください。虚血血管の端部でクリップを除去した後の血流を回復し、通常のサイズに戻します。 図2は、詐欺から調製されたスイスロールを含む組織カセットの例を示しています再灌流の1時間に続いて、虚血の1時間後トロールと回腸の虚血性領域を、。脾臓片を処理し、染色中に制御及びIR腸の位置決めを容易にするために含めました。コントロールと虚血組織との間の色の違いに注意してください。 図3は、制御および虚血の1時間後に回腸、または再灌流の2時間、続いて、虚血の1時間の虚血性領域の代表的なヘマトキシリンおよびエオシン染色を示します。出血性絨毛、陰窩の切除を完了するために、部分的で上皮denudement、および免疫細胞の浸潤（アスタリスク）を特徴と虚血の1時間後の上皮の重大な損傷に注意してください。再灌流絨毛の損傷および炎症の2時間後（アスタリスク）持続しますが、何の組織の出血はありません。 図4は、炎症CYの分析の一例を示しています虚血性およびコントロール腸における虚血再灌流後の1時間、2時間でtokines式。虚血再灌流は、健康な組織を制御するために比較して1時間後と2時間後にTNF、IL-1bは、IL-6およびCXCL2のmRNA発現のアップレギュレーションに注意してください。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53881/53881fig1.jpg" /> 図1：盲腸および回腸を含む腸の血管クリップを使用して、虚血の誘導 （A）単離されたエリア。上腸間膜動脈の周囲の腸間膜の小さなカットをクリップアプリケーションを容易にするために作られています。 （B）クリップアプライヤを用いて微小血管クリップアプリケーション。 （C）虚血を誘導する上腸間膜動脈上の微小血管クリップの位置。 （D、E）。別のマウスでは血管系の構造とクリップの位置の例。矢印は、ヘマトキシリン​​でマークされた回腸の虚血領域を示しています。 &lt;href = &quot;https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53881/53881fig1large.jpg&quot;ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53881/53881fig2.jpg" /> 図2：。。組織学的分析のための組織調製虚血の1時間は、再灌流の1時間続いた後に回腸の虚血性および制御の領域から調製したスイスロールを含む組織カセット<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53881/53881fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53881/53881fig3.jpg" /> 図3：虚血ヘマトキシリンおよびエオシン虚血の1時間後の制御および回腸の虚血性領域の染色、または虚血の1時間後に回腸のヘマトキシリンおよびエオシン染色再灌流の2時間が続きます。バー= 500μmの（上パネル）、200ミクロン（下のパネル）。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53881/53881fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53881/53881fig4.jpg" /> 図4：虚血再灌流中の炎症性サイトカインの発現 CXCL2、TNF、IL-6の発現は、IL-1bは虚血組織（IR）における虚血再灌流および正常対照組織（C）の後1時間及び2時間で測定しました。リアルタイムPCRによる虚血性領域に隣接します。 n = 3 - グループ当たり8匹のマウス、*はp &lt;0.05; ** P &lt;0.01。 *** P &lt;0.001。エラーバーはSEMを表す<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53881/53881fig4large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-ページ= &quot;常に&quot;&gt; <tbody><tr><td> マウス種 </td><td colspan="2"> 麻酔/鎮痛 </td><td colspan="3"> 動脈閉塞方法 </td><td> 虚血時間 </td><td> 再灌流後の時間 </td><td> 参照 </td></tr><tr><td> Sprague-Dawleyラット</td><td colspan="2">ペントバルビタールナトリウム</td><td colspan="3"> SMAおよび腹腔動脈の閉塞動脈瘤クリップやクランプを使用して、 </td><td> 45分</td><td> 2時間</td><td> 12 </td></tr><tr><td> C57Bl6 / 129 </td><td colspan="2"> 2％ハロタン</td><td colspan="3">腸間膜動脈の閉塞、及び虚血組織の近位および遠位部分。 </td><td> 30から130分</td><td> 6時間</td><td> 13 </td></tr><tr><td> C57BL / 6 </td><td colspan="2">ケタミン、イソフルラン</td><td colspan="3">動脈瘤クリップを使用してSMAの閉塞。担保CIRCULの閉塞近位および遠位の領域でエーション。 </td><td> 1時間</td><td> 1.5時間</td><td> 4,8,11 </td></tr><tr><td> C3H / HEJ </td><td colspan="2">ペントバルビタールナトリウム</td><td colspan="3">動脈瘤クリップやクランプを使用してオクルージョン</td><td> 40分</td><td> 6時間</td><td> 14 </td></tr><tr><td> C56BL / 6 </td><td colspan="2">イソフルレン</td><td colspan="3"> SMAおよび回結腸動脈の閉塞動脈瘤クリップやクランプを使用して、 </td><td> 100分</td><td> 1、2、4、24時間</td><td> 15 </td></tr><tr><td> C57BL / 6 </td><td colspan="2">ウレタン</td><td colspan="3">動脈瘤クリップやクランプを使用してオクルージョン</td><td> 45分</td><td> 60分</td><td> 16 </td></tr></tbody></table> 表1：マウス腸IR誘発性傷害における方法論の変化 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspaN = &quot;3&quot;&gt; 組織学スコアリングシステム </td><td> 参照 </td></tr><tr><td colspan="3">グレード0：正常粘膜</td><td rowspan="9"> 13,17,18 </td></tr><tr><td colspan="3">グレード1：絨毛先端の上皮下のスペース</td></tr><tr><td colspan="3">グレード2：その他の拡張上皮下のスペース</td></tr><tr><td colspan="3">グレード3：絨毛側面に沿って上皮リフティング</td></tr><tr><td colspan="3">グレード4：剥皮絨毛</td></tr><tr><td colspan="3">グレード5：絨毛組織の損失</td></tr><tr><td colspan="3">グレード6：墓所層梗塞</td></tr><tr><td colspan="3">グレード7：経粘膜梗塞</td></tr><tr><td colspan="3">グレード8：貫壁性梗塞</td></tr><tr><td colspan="3">グレード0：正常粘膜</td><td rowspan="5"> 4,8,11,19-21 </td></tr><tr><td colspan="3">グレード1：絨毛先端に細胞の脱落</td></tr><tr><td colスパン= &quot;3&quot;&gt;グレード2：ミッド絨毛損傷</td></tr><tr><td colspan="3">グレード3：絨毛が存在しなかったが、陰窩は依然として容易に検出可能でした</td></tr><tr><td colspan="3">グレード4：上皮構造の完全な欠如と貫壊死</td></tr><tr><td colspan="3">グレード0：正常絨毛</td><td rowspan="7"> 6,22-31 </td></tr><tr><td colspan="3">グレード1：絨毛先端歪み</td></tr><tr><td colspan="3">グレード2：ゴブレット細胞とGugenheims「スペースが不足しています</td></tr><tr><td colspan="3">グレード3：絨毛上皮細胞の斑状破壊を有します</td></tr><tr><td colspan="3">グレード4：露出したと絨毛が、上皮細胞の脱落無傷粘膜固有層</td></tr><tr><td colspan="3">グレード5：固有層が滲出されます</td></tr><tr><td colspan="3">グレード6：絨毛裸にされている絨毛への表示出血または</td></tr><tr><td colspan="3">グレード0：正常組織学</TD&gt; <td rowspan="5"> 32,33 </td></tr><tr><td colspan="3">グレード1：表面上皮のわずかな乱れ</td></tr><tr><td colspan="3">グレード2：絨毛先端の上皮細胞の喪失傷害</td></tr><tr><td colspan="3">グレード3：粘膜充血、出血、および絨毛の半分以下の損失と巣状壊死</td></tr><tr><td colspan="3">グレード4：ダメージは絨毛の半分以上に伸びます</td></tr></tbody></table> 表2：マウス腸IR誘導性の傷害で組織学スコアリングシステム

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Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

腸管虚血 - 再灌流傷害のマウスモデル

ここでは、フィールド全体でこの技術の標準化を促進するために死亡することなく、再現性の傷害をもたらすマウスにおける腸管虚血再灌流の詳細な手順を説明します。腸管虚血再灌流障害のこのモデルは、損傷および再生の細胞および分子メカニズムを研究するために利用することができます。

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

murine-model-of-intestinal-ischemia-reperfusion-injury

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

19.4K ビュー.  Trudeau Institute. ここでは、フィールド全体でこの技術の標準化を促進するために死亡することなく、再現性の傷害をもたらすマウスにおける腸管虚血再灌流の詳細な手順を説明します。腸管虚血再灌流障害のこのモデルは、損傷および再生の細胞および分子メカニズムを研究するために利用することができます。 

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Normothermic Cardiac Arrest and Cardiopulmonary Resuscitation: A Mouse Model of Ischemia-Reperfusion Injury

Acute Kidney Injury (AKI) is a common, highly lethal, complication of critical illness which has a high mortality1-4 and which is most 
frequently caused by whole-body hypoperfusion.5,6 Successful reproduction of whole-body hypoperfusion in rodent models has been fraught with 
difficulty.7-9,9,10 Models which employ focal ischemia have repeatedly demonstrated results which do not translate to the clinical setting, and larger 
animal models which allow for whole body hypoperfusion lack access to the full toolset of genetic manipulation possible in the mouse.11,12 However, in recent 
years a mouse model of cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation has emerged which can be adapted to model AKI.13 This model reliably reproduces 
physiologic, functional, anatomic, and histologic outcomes seen in clinical AKI, is rapidly repeatable, and offers all of the significant advantages of a murine surgical 
model, including access to genetic manipulative techniques, low cost relative to large animals, and ease of use. Our group has developed extensive experience 
with use of this model to assess a number of organ-specific outcomes in AKI.14,15

A powerful model for perioperative and critical care related acute kidney injury is presented. Using whole body hypoperfusion induced by cardiac arrest it is possible to nearly replicate the histologic and functional changes of clinical AKI.

正常体温心停止と心肺蘇生法：虚血再灌流障害のマウスモデル

Acute Kidney Injury (AKI) is a common, highly lethal, complication of critical illness which has a high mortality1-4 and which is most 
frequently caused ...

医学

Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often unreported mortality rates that may confound analyses. Bilateral renal pedicle clamping is commonly used to induce IR-AKI, but differences between effective clamp pressures and/or renal responses to ischemia between kidneys often lead to more variable results. In addition, shorter clamp times are known to induce more variable tubular injury, and while mice undergoing bilateral injury with longer clamp times develop more consistent tubular injury, they often die within the first 3 days after injury due to severe renal insufficiency. To improve post-injury survival and obtain more consistent and predictable results, we have developed two models of unilateral ischemia-reperfusion injury followed by contralateral nephrectomy. Both surgeries are performed using a dorsal approach, reducing surgical stress resulting from ventral laparotomy, commonly used for mouse IR-AKI surgeries. For induction of moderate injury BALB/c mice undergo unilateral clamping of the renal pedicle for 26 min and also undergo simultaneous contralateral nephrectomy. Using this approach, 50-60% of mice develop moderate AKI 24 hr after injury but 90-100% of mice survive. To induce more severe AKI, BALB/c mice undergo renal pedicle clamping for 30 min followed by contralateral nephrectomy 8 days after injury. This allows functional assessment of renal recovery after injury with 90-100% survival. Early post-injury tubular damage as well as post injury fibrosis are highly consistent using this model.

We describe models of moderate and severe ischemia-reperfusion-induced kidney injury in which the mice undergo unilateral renal pedicle clamping followed by simultaneous or delayed contralateral nephrectomy, respectively. These models consistently give rise to renal dysfunction and post-injury fibrosis, but injury severity and survival are dependent on mouse background, age and surgical equipment.

マウスにおける急性腎障害とポスト傷害線維の虚血再灌流モデル

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms at work during MI and developing effective therapeutic approaches requires methodology to reproducibly simulate the clinical incidence and reflect the pathophysiological changes associated with MI. Here, we describe a surgical method to induce MI in mouse models that can be used for short-term ischemia-reperfusion (I/R) injury as well as permanent ligation. The major advantage of this method is to facilitate location of the left anterior descending artery (LAD) to allow for accurate ligation of this artery to induce ischemia in the left ventricle of the mouse heart. Accurate positioning of the ligature on the LAD increases reproducibility of infarct size and thus produces more reliable results. Greater precision in placement of the ligature will improve the standard surgical approaches to simulate MI in mice, thus reducing the number of experimental animals necessary for statistically relevant studies and improving our understanding of the mechanisms producing cardiac dysfunction following MI. This mouse model of MI is also useful for the preclinical testing of treatments targeting myocardial damage following MI.

We introduce a surgical method to induce experimental ischemia/reperfusion (I/R) injury to simulate myocardial infarction (MI) in mouse models that allows for more clarity in positioning of the ligation on the left anterior descending artery (LAD) to increase the reproducibility of MI experiments in mice.

左前下の動脈の結紮を通して心筋虚血再灌流傷害のマウスモデル

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

A Mouse Model of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury Through Elevation of Intraocular Pressure

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, diabetic retinopathy, and retinal vascular occlusions. Rodent models of I/R injury are providing significant insights into mechanisms and treatment strategies for human I/R injury, especially with regard to neurodegenerative damage in the retinal neurovascular unit. Presented here is a protocol for inducing retinal I/R injury in mice through elevation of intraocular pressure (IOP). In this protocol, the ocular anterior chamber is cannulated with a needle, through which flows the drip of an elevated saline reservoir. Using this drip to raise IOP above systolic arterial blood pressure, a practitioner temporarily halts inner retinal blood flow (ischemia). When circulation is reinstated (reperfusion) by removal of the cannula, severe cellular damage ensues, resulting ultimately in retinal neurodegeneration. Recent studies demonstrate inflammation, vascular permeability, and capillary degeneration as additional elements of this model. Compared to alternative retinal I/R methodologies, such as retinal arterial ligation, retinal I/R injury by elevated IOP offers advantages in its&#160;anatomical specificity, experimental tractability, and technical accessibility, presenting itself as a valuable tool for examining neuronal pathogenesis and therapy in the retinal neurovascular unit.

This article describes a procedure for inducing retinal ischemia-reperfusion injury by elevated intraocular pressure in mice. Retinal ischemia-reperfusion injury by elevated intraocular pressure serves to model human pathologies characterized by compromised oxygen and nutrient delivery in the retina, enabling researchers to examine potential cellular mechanisms and treatments for human diseases of the retinal neurovascular unit.

眼圧の上昇を通じて、網膜虚血再灌流障害のマウスモデル

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, ...

Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via recanalization of the coronary artery is the most effective strategy for reducing the size of ischemic myocardium. The coronary microvasculature cannot be visualized and imaged&#160;in vivo, but there are several invasive and noninvasive techniques that can be used to assess parameters which depend directly on coronary microvascular function. The endothelial function after ischemia reperfusion can be assessed also at the level of the coronary circulation via the coronary flow reserve (CFR).&#160;In this study, peak velocity of left anterior descending (LAD) coronary arteries was measured in rats in vivo via Transthoracic Doppler Echocardiography during resting and stress challenge (induced by Dobutamine). A normal heart can increase its coronary blood flow up to four times above the resting values during stress induction. Following ischemia reperfusion, we found a significantly diminished CFR, which can be used as a marker of coronary microvascular dysfunction. CFR has opened a window on the importance of microvascular dysfunction and has been shown to predict cardiovascular risk independent of whether the severe obstructive disease is present.

Coronary flow reserve (CFR), is defined as the ratio of maximal coronary blood flow to the resting coronary blood flow. We present a protocol for evaluating CFR in rats via ultrasound, which offers the opportunity to predict cardiovascular risk factors in the absence of obstructive coronary disease.

ラットにおける心筋虚血再灌流後の冠動脈流量の評価

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via ...

A Pre-clinical Rat Model for the Study of Ischemia-reperfusion Injury in Reconstructive Microsurgery

Ischemia-reperfusion injury is the main cause of flap failure in reconstructive microsurgery. The rat is the preferred preclinical animal model in many areas of biomedical research due to its cost-effectiveness and its translation to humans. This protocol describes a method to create a preclinical free skin flap model in rats with ischemia-reperfusion injury. The described 3 cm x 6 cm rat free skin flap model is easily obtained after the placement of several vascular ligatures and the section of the vascular pedicle. Then, 8 h after the ischemic insult and completion of the microsurgical anastomosis, the free skin flap develops the tissue damage. These ischemia-reperfusion injury-related damages can be studied in this model, making it a suitable model for evaluating therapeutic agents to address this pathophysiological process. Furthermore, two main monitoring techniques are described in the protocol for the assessment of this animal model: transit-time ultrasound technology and laser speckle contrast analysis.

Here, we describe a pre-clinical animal model for studying the pathophysiology of ischemia-reperfusion injury in reconstructive microsurgery. This free skin flap model based on the superficial caudal epigastric vessels in the rat may also allow for the evaluation of different therapies and compounds to counteract ischemia-reperfusion injury-related damage.

再建微小外科における虚血再灌流損傷の研究のための前臨床ラットモデル

Ischemia-reperfusion injury is the main cause of flap failure in reconstructive microsurgery. The rat is the preferred preclinical animal model in many ...

Delayed Intramyocardial Delivery of Stem Cells after Ischemia Reperfusion Injury in a Murine Model

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, cardiac stem cell therapy is studied by delivering SCs concurrently with the induction of myocardial injury. However, this approach presents two significant limitations: the early hostile pro-inflammatory ischemic environment may affect the survival of transplanted SCs, and it does not represent the subacute infarction scenario where SCs will likely be used. Here we describe a two-part series of surgical procedures for the induction of ischemia-reperfusion injury and delivery of mesenchymal stem cells (MSCs). This method of stem cell administration may allow for the longer viability and retention around damaged tissue by circumventing the initial immune response. A model of ischemia reperfusion injury was induced in mice accompanied by the delivery of mesenchymal stem cells (3.0 x 105), stably expressing the reporter gene firefly luciferase under the constitutively expressed CMV promoter, intramyocardially 7 days later. The animals were imaged via ultrasound and bioluminescent imaging for confirmation of injury and injection of cells, respectively. Importantly, there was no added complication rate when performing this two-procedure approach for SC delivery. This method of stem cell administration, collectively with the utilization of state-of-the-art reporter genes, may allow for the in vivo study of viability and retention of transplanted SCs in a situation of chronic ischemia commonly seen clinically, while also circumventing the initial pro-inflammatory response. In summary, we established a protocol for the delayed delivery of stem cells into the myocardium, which can be used as a potential new approach in promoting regeneration of the damaged tissue.

Stems cells are continuously investigated as potential treatments for individuals with myocardial damage, however, their decreased viability and retention within injured tissue can impact their long-term efficacy. In this manuscript we describe an alternative method for stem cell delivery in a murine model of ischemia reperfusion injury.

マウスモデルにおける虚血再灌流損傷後の幹細胞の筋内内出産の遅延

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, ...

Organ Ischemia-Reperfusion Injury by Simulating Hemodynamic Changes in Rat Liver Transplant Model

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, including ischemia-reperfusion injury (IRI) of extrahepatic organs. This model requires numerous experiments and devices. The duration of anhepatic phase is closely related to the time to develop IRI after transplantation. In this experiment, we used hemodynamic changes to induce extrahepatic organ damage in rats and determined the maximum tolerance time. The time until the most severe organ injury varied for different organs. This method can easily be replicated and can also be used to study IRI of the extrahepatic organs after liver transplantation.

This paper provides a detailed description of how to build an animal model of the anhepatic phase (liver ischemia) in rats to facilitate basic research into ischemia-reperfusion injury after liver transplantation.

ラット肝移植モデルにおける血球力学的変化をシミュレートすることによる臓器虚血再灌流損傷

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, ...

A Rat Lung Transplantation Model of Warm Ischemia/Reperfusion Injury: Optimizations to Improve Outcomes

From our experience with rat lung transplantation, we have found several areas for improvement. Information in the existing literature regarding methods for choosing appropriate cuff sizes for the pulmonary vein (PV), pulmonary artery (PA), or bronchus (Br) are varied, thus making the determination of proper cuff size during rat lung transplantation an exercise of trial and error. By standardizing the cuffing technique to use the smallest effective cuff appropriate for the size of the vessel or bronchus, one can make the transplantation procedure safer, faster, and more successful. Since diameters of the PV, PA, and Br are related to the body weight of the rat, we present a strategy to choosing an appropriate size using a weight-based guide. Since lung volume is also related to body weight, we recommend that this relationship should also be considered when choosing the proper volume of air for donor lung inflation during warm ischemia as well as for the proper volume of PBS to be instilled during bronchoalveolar lavage (BAL) fluid collection. We also describe methods for 4th intercostal space dissection, wound closure, and sample collection from both the native and transplanted lobes.

Here, we present optimizations to a rat lung transplantation model that serve to improve outcomes. We provide a size guide for cuffs based on body weight, a measurement strategy to ascertain the 4th intercostal space, and methods of wound closure and BAL (bronchoalveolar lavage) fluid and tissue collection.

温虚血/再灌流損傷のラット肺移植モデル:転帰を改善するための最適化

From our experience with rat lung transplantation, we have found several areas for improvement. Information in the existing literature regarding methods ...

An Effective Mouse Model of Unilateral Renal Ischemia-Reperfusion Injury

Ischemia-reperfusion injury (IRI) is the leading cause of acute renal failure and is a significant contributor to delayed graft function. Animal models are the only available resources that mimic the complexities of the IRI-associated damage encountered in vivo. This paper describes an effective mouse model of unilateral renal IRI that delivers highly reproducible data. Ischemia is induced by occluding the right renal pedicle for 30 min followed by reperfusion. In addition to the surgical procedure, a sequential overview of the expected physiological and histopathological changes following renal IRI will be provided by comparing data from seven different reperfusion times (4 h, 8 h, 16 h, 1 day, 2 days, 4 days, and 7 days). Critical data for planning experiments ahead, such as mean surgical time, average anesthetic consumption, and body weight changes over time, will be shared. This work will help researchers implement a reliable renal IRI model and select the appropriate reperfusion time that aligns with their intended investigative goals.

Renal ischemia-reperfusion injury is associated with high morbidity and mortality in hospitalized patients. Here, we present a simple and effective mouse model of unilateral renal ischemia-reperfusion injury and provide a sequential overview of representative pathological changes observed in the kidney.

片側性腎虚血再灌流傷害の有効マウスモデル

Ischemia-reperfusion injury (IRI) is the leading cause of acute renal failure and is a significant contributor to delayed graft function. Animal models ...