המחברים בתודה להכיר במימון הסוכנות הפחתת האיום הביטחון (DTRA) תחת שטח וחיל הים Warfare מערכות מרכז השקט (PACIFIC SSC) חוזה מס N6601-13-C-2027. פרסום חומר זה אינו מהווה אישור על ידי הממשלה של ממצאים או מסקנות בזאת.

1. פורמולציות Bioink הידרוג&#39;ל והכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לספק פרופילים ביוכימיות רקמות ספציפיות, להכין רקמות ספציפיות ECM לעכל פתרונות כפי שתוארו לעיל עבור כבד. 20 הערה: באופן כללי, זה ECM לעכל יהוו 40% מנפח bioink הידרוג&#39;ל הסופי כי הוא מועסק. כמה מאות מיליליטרים של פתרון ECM לעכל יכול להיות מוכן, aliquoted, קפוא ב -80 ° C לשימוש עתידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הידרוג&#39;ל ניסוח, להמיס photoinitiator, 2-הידרוקסי-4 &#39;- (2-hydroxyethoxy) -2-methylpropiophenone, במים ברמה של 0.1% w / v. הערה: כרכים בטווח 50-100 מ&quot;ל ניתן להכין מראש ולאחסן מוגן מפני אור על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור bioinks הידרוג&#39;ל, ראשון לפרק את מרכיבי חומר בסיס מן החומצה ההיאלורונית הערכות הידרוג&#39;ל (HA) בפתרון המים photoinitiator. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את הג&#39;לטין HA ו thiolated thiolated בנפרד במים-pפתרון hotoinitiator (שלב 1.2) לעשות 2% w / פתרונות v. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים diacrylate פוליאתילן גליקול (PEGDA), את crosslinker ב ערכות הידרוג&#39;ל, בתמיסה במים photoinitiator (שלב 1.2) כדי להפוך פתרון 8% w / v. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממסי פוליאתילן גליקול (PEG) אלקין 8-Arm (10 kDa MW) בתמיסת מי photoinitiator (שלב 1.2) כדי להפוך פתרון 8% w / v. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן כללי, ליצור הידרוג באמצעות הסכימה הבאה, אם כי התאמה אישית נוספת אפשרית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 4 חלקים 2% thiolated HA, 4 חלקים ג&#39;לטין 2% thiolated, 1 חלק crosslinker 1, 1 חלק crosslinker 2 עם פתרון ECM 8 חלקים רקמות התקשורת והתרבות 2 חלקים hepatocyte (HCM) (או 10 חלקים מים כמו-רקמות שאינן גנריות הידרוג&#39;ל -specific). הערה: נוסף ללא שינוי HA או ג&#39;לטין ניתן להוסיף כדי להפוך את extrude bioink בצורה חלקה יותר. זה מתואר להלן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס את התערובת וכתוצאה מכך על גבוהה (מהירות 10 מתוך 10) במשך 10 שניות כדי לערבב לפני השימוש. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש הידרוג&#39;ל bioink <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור שחול או בדיקות bioprinting, להעביר את התערובת לתוך מחסנית מזרק או מדפסת ולאפשר לו crosslink ספונטני למשך 30 דקות (crosslinking שלב 1) על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מדידות rheological, להעביר את התערובת לתוך צלחת פטרי 35 מ&quot;מ ולאפשר לו crosslink למשך 30 דקות. הערה: התערובת מייד מתחילה crosslink דרך היווצרות קשר תיאול-acrylate תתחיל להגדיל צמיגות. התערובת צריכה להיות מועברת מזרק, מחסנית הדפסה, או מיקום היעד בתוך 10 דקות כדי למנוע סתימת פיפטה או מזרק במהלך העברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר crosslinking המשנית (שלב 2) היא רצויה, מקרין את הבמה 1-crosslinked הג&#39;לי עם אור אולטרה סגול (365 ננומטר, 18 W / 2 סנטימטר) ליזום תגובת פילמור אלקין-תיאול. הערה: משך ההקרנה תלוי שטח הפנים של החומר. באופן כללי, סנטימטר מרובע של חומר רק דורש 12 שניות של חשיפה UV בהספק UV זה. </li></ol></li></ol> 2. בדיקת תאימות מדפסת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני בדיקות אינטגרציה עם מכשירי bioprinting, מאפייני שחול מבחן על ספסל המעבדה עם בדיקות שחול פשוטות באמצעות מזרקים סטנדרטיים טיפי מחט מד קטנים (20-30 מד). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחוף את bioink באמצעות מזרק סטנדרטי להשיג חוטים מעוקמים בצורה חלקה של הידרוג&#39;ל עם מעט או ללא בליטות. לשיחול של קווים או דפוסים פשוטים מספיק כדי לקבוע את מידת ההצלחה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשילוב bioprinter, לטעון bioink ההכנות ידי pipetting אותם לתוך דיו למדפסת, ולאפשר 30 דקות עבור bioink לעבור crosslinking שלב 1 ספונטנית בתוך המחסנית. הערה: נפח של bioink תלוי ביישום הספציפי צריך להיקבע על ידי המשתמש. מחסניות מדפסת עשויות להיות דומות או להיות מזרקים התואמים את מכשיר bioprinter. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת תאימות שחולעבור bioprinting ידי הדפסת דפוס פשוט באמצעות bioink. לדוגמה, להדפיס דפוס 7 x 7 מ&quot;מ המורכב של קווים מקבילים. החל הלחץ (למשל, 20 kPa לחץ פנאומטי) ואילו ראש ההדפסה זז במישור XY במהירות של כ 300 מ&quot;מ / דקה. הערה: בקטרי זרבובית ראש הדפסה בגדלים שונים ניתן להשתמש, אך חרירי חרוטים עם פתחים בקוטר 400-500 מיקרומטר הם אופטימליים עבור הדפסת spheroids בטווח 250-350 מיקרומטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם החומרים מעוקמים הם גבשושיים או לא סדירים, ראה שלב 2.4, או להפחית את כמות PEGDA כדי לרכך את חומר crosslinked שלב 1. כראוי ניסוחי bioink מוכנים extrude חלק, המאפשרים בתצהיר מדויק בדפוסים רצויים או ארכיטקטורות. הערה: ההליכים bioprinting והשימוש בו המתוארים מכשיר מותאם אישית 3-D bioprinting נועד בבית במיוחד עבור רקמות לבנות הדפסה 32 כפרמטרים הדפסה כגון, הספציפיים משתנים באופן דרמטי עבור כל סוג של מכשיר ודורשים כיול.g על ידי המשתמש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשפר את תכונות שחול, להשלים ללא שינוי HA ו ג&#39;לטין אל bioinks (1.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו -30 מ&quot;ג / מ&quot;ל, בהתאמה). </li></ol> 3. אימות ידי Bioprinting עם בונה כבדה ראשונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 3-D spheroids הכבד תא ראשוני בתליית שיטות ירידה כמרכיב הסלולר 33 הערה: Bioprinting יכול להתבצע ללא spheroids, אבל במקום עם תאים בודדים המרחפים bioinks הידרוג&#39;ל גם כן. Spheroids מועסקים כאן כדי להאיץ אינטראקציות תאים תאים ולבנות פונקציונליות. מספר spheroids או התאים מועסקים תלוי ביישום הספציפי צריך להיקבע על ידי המשתמש. פעולות אלה אמורות להתבצע בתנאים סטריליים, באמצעות אספקה ​​סטרילית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן HCM על ידי הוספת התוכן המופשר של ערכת רכיב תוספת HCM לתקשורת הבזליים hepatocyte (HBM) וסינון סטרילי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשרת un רכיבי תוספתtil נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את הרכיבים תוספת (חומצה אסקורבית, 0.5 מ&quot;ל; אלבומין בסרום שור [חומצות השומן החופשיות], 10 מ&quot;ל; גנטמיצין B סולפט / amphotericin, 0.5 מ&quot;ל; הידרוקורטיזון 21-hemisuccinate, 0.5 מ&quot;ל; אינסולין, 0.5 מ&quot;ל; גורם הגדילה באפידרמיס אנושי רקומביננטי , 0.5 מ&quot;ל; העברת, 0.5 מ&quot;ל) ל -500 מ&quot;ל HBM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינון סטרילי דרך פילטר מיקרומטר 0.45 מיקרומטר או 0.22 באמצעות יחידת מסנן בקבוק העליונה או מסנן קצה המזרק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את צפיפות התאים של hepatocytes אדם מן המעלה הראשונה, תאים Kupffer, ותאי stellate ידי ספירת על hemocytometer לאחר כל סוג תא הופשר פי הוראות היצרנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב hepatocytes אדם מן המעלה הראשונה, תאים Kupffer, ותאי stellate המאופיינים ביחס 80:10:10 על ידי מספר הסלולרי במדיה HCM כי כבר חימם עד 37 מעלות צלזיוס צינור חרוטי. הערה: היקף בתקשורת לשמש תלוי את מספר הסלולרי הכולל ספציפי לבקשה צריך להיקבע על ידי הדואר אלקטרוני למשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה השעית התא במשך 5 דקות ב 520 XG ב 20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant, משאירים מאחור את התא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה בתקשורת HCM להניב ההשעיה תא המכיל 1,000 תאים לכל 40 מדיה μl. הנפח הכולל תלוי במספר spheroids שיופק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה תא צלחות Drop Hanging בפורמט 96-היטב. להוסיף סך של כ 1,000 תאים לכל היטב HCM ולשמור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 3 ימים שבמהלכה יוצר spheroids רב-תאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף spheroids הכבד מהצלחת Drop Hanging באמצעות pipettor. מעבירים צינור חרוטי 15 מ&quot;ל סטרילי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> spheroids הכבד Bioprint ב bioink הידרוג&#39;ל הכבד ספציפי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן גיבוש bioink הידרוג&#39;ל ECM המכיל כבד כמתואר שלב 1, העסקת 8% PEGDA ו -8% 8-Arm אלקין PEG כפי crosslinkers. השתמש השילוב הזה עבור היכולת שלה resulting בתוך הידרוג&#39;ל קרוב מודולוס אלסטיות גזירת רקמת כבד ילידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן spheroids ליישב לתחתית של צינור החרוטים שבו הם הונחו שלב 3.1.7. זה משתנה בהתאם לגודל וצפיפות אליפטית, אך בדרך כלל מתרחש בתוך 1-2 דקות. הסר את כל התקשורת על ידי aspirating או עם pipettor בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את העוצמה הרצויה של פתרון הידרוג&#39;ל bioink מוכן טרי אל צינור חרוטי המכיל את spheroids. באופן כללי, נפח מתאים הוא 10% -25% יותר מאשר הנפח של לבנות 3-D המיועד להדפסה. בזהירות פיפטה מעלה ומטה כדי resuspend הספרואידים בפתרון הידרוג&#39;ל bioink. מעבירים מחסנית bioprinter באמצעות pipettor או פיפטה סרולוגיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך המחסנית bioprinter, לאפשר הפתרון לעבור לשלב crosslinking הראשון (התגובה תיאול-acrylate) למשך 30 דקות. הערה: בהתאם לגודל אליפטית, המחסנית ייתכן שתהיה צורך לאט לסובב או התוכן ייתכן שיהיה צורך מהולמרית סטרילי כדי לשמור על spheroids מופצים ברחבי bioink במהלך crosslinking שלב 1. זהו פחות של הכרח bioinks מוכן עם תאים מושעים במקום spheroids. הערה: בעקבות crosslinking שלב 1, למשתמשים יש חלון הפעלה של כמה שעות. עם זאת, מומלץ לבצע את תהליך bioprinting במהירות כדי לשפר את כדאיות התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות crosslinking שלב 1, השתמש בהתקן bioprinting ליצור מבנים הידרוג&#39;ל רצויים המכילים את spheroids הכבד הראשוני (או תאים אחרים). הערה: טכנולוגיה זו מספקת מערכת biofabricating מגוון רחב של מבנים. פרמטרים כגון נפח הכולל, מספר התאים או spheroids, גיאומטרית המבנה המודפסת, ואת מצע שעליו בונה מודפסות הם תלויים במידה רבה על המטרות של המשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בתצהיר לתוך התצורה המבוקשת, לנהל אור UV למשך 2-4 שניות כדי להפעיל את מנגנון crosslinking המשני, ייצוב השיתוףnstructs וקשיחות הגדלה לרמה הרצויה. הערה: ריכוז-אלקין PEG, ובכך צפיפות crosslinking הסופית הכוללת, בעיקר שולטת קשיחות המבנה הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 3.2.4 ו 3.2.5 כדי ליצור מבנים רבים-שכבתיים. </li></ol></li></ol>

המחברים אין לחשוף.

ישנם מספר מרכיבים חיוניים שכדאי להביא בחשבון כאשר מנסים biofabricate בונה רקמות 3-D, לשימוש עתידי בבני אדם או עבור יישומים ההקרנה חוץ גופית. העסקת מרכיבים תאיים המתאים קובע את הפונקציונליות הפוטנציאל בסופו של דבר, כאשר המכשיר biofabrication עצמו קובע את המתודולוגיה הכללית להשגת מבנה סוף. המרכיב השלישי, ביולוגי, חשוב לא פחות, כפי שהוא משמש תפקיד כפול. באופן ספציפי, המרכיב הביולוגי חייב להיות תואם הוא את חומרת biofabrication (כלומר, bioprinters) וגם לתמוך רכיבי תא ביולוגיים פוטנציאלי שבריר. אופטימיזציה בשתי הדרישות האלה יכולים להיות קשות, כחומרי bioprintable צריך לפגוש פרמטרים מרכזיים: 1) להחזיק את הכימי המתאים, תכונות מכאניות, ובזמן כדי להקל הדפסה יעילה משוחררת; 2) כדאיויות תא תמיכה בשלבי ההכנה bioprinהליך טינג; 3) ולספק סביבה מסבירה בצורה הטובה ביותר משפרת כדאיויות תא ותפקוד מבנה רקמות סופיים בעקבות bioprinting. אנו מעסיקים את מערכת מודולרית הידרוג&#39;ל bioink מתוארת המתודולוגיה המתוארת כאן כדי לענות על הדרישות הללו. ראשית, על ידי שילוב גורמי גדילה, collagens, בדיחות, ו elastins נגזר ECM של סוג רקמה מסוים, אנחנו יכולים להשיג פרופיל בתחום הביוכימיה מזכיר את סוג רקמת היעד. שנית, על ידי העסקת 2 תגובות crosslinking דומות, אך עצמאיות אנו מסוגלים להשיג חומר extrudable רך אשר תואם ביותר מבוסס שחול, אשר ניתן לשנות עוד יותר עם צעד crosslinking השני להגיע מודולוס אלסטיות חומר נחוש תואמת יעד רקמה של בחירה. 34 המאפיין הקריטי של מערכת זו שעושה את זה שימושי הוא היכולת לתמוך תגובות כימיות מרובות ניתן לרתום כדי לתפעל את פולימרייםקינטיקה rization תכונות מכניות של מערכת bioink. על ידי העסקת 2 סוגי תגובה עצמאיים, תיאול-acrylate ו תיאול-אלקין, נשיג את היכולת לבצע תגובת תיאול-acrylate שלב 1 שתוצאתו חומר רך שניתן הנמתח דרך מכשיר מזרק או bioprinting, וכן תיאול שלב 2 תגובת -alkyne, אשר יזמה רק בחשיפת UV בנוכחות של photoinitiator, אשר קובע את מודולוס האלסטיות של לבנות bioprinted הסופי. שלבים מרובים אלה לגרום חומר bioprintable. ככזה, על מנת להשיג bioink יציב התומך שחול והתאמה אישית מודולוס עוקבת אלסטי, שמירת סוגי התגובה הנפרדות אלה חשובים. ההגרלה הראשית באמצעות המערכה biofabrication היא קלות להתאמה אישית, אשר נעשתה באמצעות מניפולציה או מודולוס סוף אלסטי דרך crosslinker המשנית, או באמצעות הכללת חומרי ECM רקמות נגזרות שונות<html> או קוקטיילי גורם גדילה. ה ECM ברקמות מכילה מגוון של גורמי גדילה וציטוקינים אחרים, אשר לעתים קרובות להשתנות בחלוקה הכוללת בין סוגי רקמות. אנו מאמינים כי הגורמים הללו הם חלק בלתי נפרדים לשמירה על תפקוד של סוגי תאים מסוימים, כגון hepatocytes אדם מן המעלה הראשונה. יישום תפיסה זו באה לידי ביטוי בעבר להגדיל הכדאיות ותפקוד של hepatocytes אדם מן המעלה הראשונה בתרבויות כריך חומצה heparinized היאלורונית. 20 על ידי שילוב שרשראות הפרין הידרוג עם גורמי גדילה מחייב הפרין, כמו גם רכיבים אחרים ECM מהכבד ECM, הצלחנו להציג פרופיל ביוכימיים בכבד ספציפי זה hepatocytes אדם מן המעלה הראשונה, שמירה על כדאיות ותפקוד במבחנה במשך תקופה ארוכה של זמן. גישה זו ניתן להרחיב בקלות לסוגי רקמות אחרות, ומאפשר לחוקרים להשיג חזרה על גורמי רקמות ספציפיות אלה על ידי decellularizing ו solubilizing ברקמות אחרות. אוהל &quot;&gt; משתמשים צריכים להיות מודעים לכך ואילו רכיבי הבסיס של מערכת bioink זה יושמו bioprinting בעבר, 10,12,17 אבל בפחות ניואנסים, גישות רקמות ספציפיות, כמו גם מגוון רחב של יישומים ברפואת רגנרטיבית אחרים, 35- 45 biofabrication לא נוסה לכל סוגי הרקמות. ככזה, ייתכנו כמה התפתחות נוספת ופתרון בעיות הנדרשת כדי ליצור מבני רקמות נוספים כאלה. עם זאת, מערכת מודולרית כמו זו המתוארת כאן עשויה להיות טובה מאוד וישימה. פוטנציאלי אחרת מגבלות כוללות קרבה טבעית שחלק סוגי התא יכולים להיות כלפי biomaterials הספציפי. באופן כללי, מצאנו כי חומצה היאלורונית, ג&#39;לטין, ורכיבי בסיס המבוססים PEG של תמיכה במערכת הידרוג&#39;ל זה תרבויות קיימא של מגוון רחב של סוגי תאים, ובכל זאת יש ייתכן שיש כמה סוגים של תאי המתפקדות טובות בסביבות מהונדסות של רכבים שונים, כגון קולגן, אשר יש סיבי טמון נהture, או ואלסטין, שהיא מטבעה יותר אלסטי. ככזה, בתמורת החומר האופטימלי עבור סוג רקמה נתון יישום בסופו של דבר חשוב, ואת מערכת הידרוג&#39;ל bioink המתוארת כאן לא יכולה להיות מתאימה לכל השימושים. בנוסף, חשוב לשקול את התנאים הסביבתיים בהם bioprinting מתבצע. במהלך הפיתוח של פרוטוקול זה, עברנו מן הסביבה ליד (בטמפרטורת חדר) תנאי שימוש bioinks ללא כל תקשורת תא, אשר להוביל כדאיות עניה אם הזמן הכנה והדפסה נמשך יותר מדי ללב, ליותר מהירי פרוטוקולים תחת 37 מעלות צלזיוס באמצעות bioinks עם מרכיב התקשורת, שהגדילה כדאיות התא באופן דרמטי. עד לאחרונה, כמה חומרים או מערכות חומר פותחו במיוחד כדי להתממשק עם מערכות bioprinting. כתוצאה מכך, רוב החומרים הם פשטניים, מינוף או המאפיינים הביולוגיים שלהם לתמוך תאים, או, אם הם תואמים biofabricationחוּמרָה. חומרים מעטים הם אופטימליים בתחומי שניהם. המערכת המתוארת מתודולוגיה זו מפרידה מאפיינים אלה, ובכך לאפשר התאמה אישית של אפיון ביולוגי, בד בבד עם אפשור תכונות מכניות הדרושים bioprinting שחול. הבחנה נוספת של מערכת bioink הידרוג&#39;ל זו היא כי ניתן לחקות הן פרמטרים ביוכימיים ופיזיים של רקמות היעד הוא משמש biofabricating. זו תומכת רמת מרשימה של גמישות, המאפשר חזרה על אותה הגורמים ביוכימיים של כמעט כל רקמות, כמו גם התאמת מודולוס האלסטיות של כל רקמות רכות. תשומת הלב להיבטים הם אלה של רקמות נדירות נחקרה במקביל. טבעו המודולרי של טכנולוגיה זו פותחת פתח גמישות תיושם במגוון רחב של יישומים. היכולת לחקות סוגי רקמות שונים מספק את היכולת biofabricate לא רק בונה הכבד משמש כדוגמה בעבודה זו, אך קוןהמבנים המייצגים רבים של רקמות אחרות בגוף. אולי היישום הרחב הברור ביותר שימוש בפרמטרים הוא היכולת להתאים הן היבטי רקמה מסוימת כדי לשפר את תפקודי סוף הבונה מהונדסת עבור יישומים אמיתיים כגון השתלת איברים או סמי הקרנת רעלים. בעוד דור של רקמות אנושיות בגודל להשתלה בחולים הוא המטרה הסופית עבור חוקרים רבים, בשל מכשולים רגולטוריים, מקור תא, ומגבלות על היכולת להמציא כלי דם פונקציונליים לאיברי רקמות מהונדסות, מטרה תנעל זה תחייב פיתוח נוסף וביצוע זמן להתממש. עם זאת, טכנולוגיות כגון המתודולוגיה המתוארת כאן כרגע מתחילות להיות מיושם להפקה &quot;organoids&quot; לפלטפורמות במבחנה. צוות שלנו, כמו גם לאחרים, הוא כרגע ניצול organoid biofabrication ליצור מערכות מודל שבו מחקרי רעלים מבוצעים. בנוסף, יכול להיות מועסק organoids כזהללמוד פתולוגיות והתקדמות המחלה, כגון סרטן, 46 ולבדוק לטיפולים פוטנציאליים. לבסוף, מערכת זו תומכת גם שימוש חשוב נוסף. על ידי מניפולציה הפרמטרים הללו באופן עצמאי, החוקרים יכולים לבצע ניסויים מדעיים בסיסיים כדי לקבוע את החשיבות היחסית של ביוכימיים מול גורמים מכניים.

בשנים האחרונות, במגוון טכנולוגיות הפך זמין מתייחס לצורך המקורות חלופיים של איברים ורקמות תפקודיים על ידי המבקש לייצר, או biofabricate, אותם. Bioprinting התפתחה כאחד המבטיחים ביותר של טכנולוגיות אלה. Bioprinting יכול להיחשב כסוג של ייצור כתוסף רובוטית של חלקים ביולוגי, שניתן להשתמש בהם כדי לבנות או מבנים איבר דמוי או מרקמה דמוית דפוס קיימא ב 3 מימדים. 1 ברוב המקרים, bioprinting מעסיקה 3-ממדי (3 -D) תקן ההדפסה כי היא נוהלה על ידי מחשב להפקיד תאים וחומרים ביולוגיים לעמדות מדויקות, ובכך משחזרים ארכיטקטורות פיסיולוגיות-מחק אנטומית. 2 התקנים אלה להדפיס &quot;bioink&quot;, אשר יכול ללבוש הצורה של אגרגטים תא, תאים גלומים הידרוג או ונוזלים צמיגים, או microcarriers תא זרע, כמו גם פולימרים ללא תאים המספקים מבנה מכאני או לפעול PLA תא ללאceholders. 3,4 בעקבות תהליך bioprinting, המבנה וכתוצאה מכך ניתן התבגר לתוך מבנים רקמה או איבר פונקציונלי, ומשמש ליישום הסוף המיועד. 5,6 עד כה, איבר אנושי בגודל תפקודי מלא לגמרי לא הודפס, אבל זה נשאר המטרה ארוכת הטווח העיקרית של bioprinting מחקר ופיתוח. 2 עם זאת, בקנה מידה קטן &quot;organoid&quot; בונה רקמות מיושמים כיום מספר יישומים, כולל מודלים פתולוגיה, פיתוח תרופות, והקרנת טוקסיקולוגיה. אחד המכשולים העיקריים כי חוקרים נתקלו ביישום טכנולוגית bioprinting הוא כי חומרים מעטים פותחו לצורך bioprinting המפורש. כדי להצליח ביעילות bioprinting, ביולוגי חייבים לעמוד 4 דרישות בסיסיות. ביולוגי צריך להיות 1) תכונות מכניות שראוי לאפשר בתצהיר (אם זה שחול דרך נחיר כג&#39;ל או אניnkjet כמו טיפה), 2) את היכולת להחזיק את צורתו כמרכיב של מבנה 3-D לאחר בתצהיר, 3) את היכולת למשתמש שליטה של ​​2 המאפיינים המוקדמים, ו 4) סביבה ידידותית ותומכת תא בכלל שלבי הליך bioprinting. 7 הסטוריים, bioprinting עבודה ניסו לעתים קרובות להעסיק biomaterials המסורתי קיים במכשירי bioprinting ללא תמורה עבור התאימות שלהם, במקום בעיצוב ביולוגי יש את המאפיינים דרושים bioprinting ויישומים שלאחר ההדפסה הבאות. מגוון bioinks פותח לאחרונה ממשק טוב יותר עם החומרה בתצהיר ייצור. מערכות הידרוג&#39;ל תקן מציבות בעיות משמעותיות משום שהם קיימים בדרך כלל כמו גם מבשרים פתרונות נוזלים עם תכונות מכאניות מספיק, או הידרוג&#39;ל polymerized שאם מודפס יכול לסתום פיות או להיות שבור על תהליך שהחול. הצוות שלנו, כמו גם וטיהורrs, בחן ניסוחים הידרוג&#39;ל שונים כדי לטפל בבעיות bioprinting אלה, כולל הדפסת אליפטית תא לתוך מצעים הידרוג&#39;ל, 5,8 תא נימת הידרוג&#39;ל שחל משפופרות microcapillary, 9-11 חומצה היאלורונית extrudable (HA) הידרוג ננו-חלקיקי -gold עם תכונות crosslinking דינמיות , 12 שליטה זמנית של קשיחות הידרוג&#39;ל באמצעות photopolymerizable methacrylated HA ו ג&#39;לטין, 13 crosslinking פיברינוגן מבוסס-תרומבין, 14,15 ג&#39;ל אלגינט-קולגן חליפין יוניים, 16 ואור אולטרה הסגול polymerizing המהירה לאחרונה (UV) crosslinking -initiated, 17 דוגמאות אלה להוכיח את ההיתכנות של חומרים ליצירה שיכולה ידי bioprinted ביעילות. עם זאת, בנוסף לאינטגרציה עם חומרה, כדי ליצור קיימא ופונקציונלי 3-D רקמה בונה בהצלחה, בביו-חומרים חייבים לכלול רמזי ביוכימיים מכנים מסייעות בשמירה הסלולרכדאיות ותפקוד. גורמים נוספים אלה, פרופילי ביוכימיות מכאניים, יכולים להיות השפעה משמעותית על התפקוד המוצלח של מבני רקמות bioprinted. שני התאים ואת תאי מטריקס הילידים (ECM) אחראי הצגת מגוון רחב של מולקולות איתות כגון גורמי גדילה וציטוקינים אחרים לתאים אחרים. השילוב של אותות אלה משתנה בין רקמה לרקמה, אבל יכול להיות מאוד חזק ובעל השפעה בויסות התנהגות תאים ורקמות. 18 העסקת רכיבי ECM ספציפי רקמות מאיברים שונים ויישום בתור הידרוג&#39;ל או כחלק הידרוג&#39;ל נחקר עם הצלחה. 19-21 גישה זו, אשר מורכבת decellularizing רקמה נתון, מפוררת את זה, ואת פירוקה, שניתן להשתמש בהם כדי לייצר אותות ביוכימיים רקמות ספציפיות מכל רקמות ניתן לשלב בונה הידרוג&#39;ל 3-D. 22 בנוסף,שהיא מתועדת בהרחבה כי ורקמות בגוף לכבוש מגוון רחב של stiffnesses. 23 ככזה, את היכולת לכוון את התכונות המכאניות של חומרים ביולוגיים, כגון E מודולוס אלסטיות &#39;או ז מודולוס אלסטיות גזירה&#39;, הוא כלי שימושי בהנדסת רקמות . כפי שתואר לעיל, שליטה על תכונות מכאניות bioink מאפשרת biofabrication שחול מבוסס באמצעות ג&#39;ל רך, אז מה שיכול להשפיע עוד יותר על ידי crosslinking המשנית בשלב מאוחר יותר, שבו רמות מודולוס אלסטיות ניתן להשיג שתואמות מן סוג איבר המטרה. לדוגמא, חומרים ביולוגיים יכולים להיות מותאמים אישית כדי להתאים נוקשות של 5-10 kPa כמו כבד ילידים, 23 או להתאים נוקשות של 10-15 kPa כמו ברקמת לב ילידים, 24,25 בתאורית הגדלת היכולת של organoids אלה לתפקד באופן דומה עמיתיהם רקמות מולדתם. ההשפעה של קשיחות הסביבה על פנוטיפ התא כבר explored בשנים האחרונות, במיוחד ביחס לתאי גזע. אנגלר et al. מפגין גמישות המצע כי סייעה נהיגה בתאי גזע mesenchymal (MSC) כלפי שושלות עם גמישות רקמת ההתאמה של המצע. 25 רעיון זה נחקר נוסף לבידול לתוך שריר, תפקוד לב, פנוטיפ הכבד, התפשטות תאי גזע hematopoietic , ותחזוקה של פוטנציאל הטיפולי של תאי גזע. 24,26-29 יכולת לכוון הידרוג&#39;ל כדי moduli אלסטי השונה היא תכונה חשובה של ביולוגי אשר ישמש כדי biofabricate בונה רקמות. 30 כאן אנו מתארים פרוטוקול מייצג גישה תכליתית המשמשת במעבדה שלנו לגבש מערכת הידרוג&#39;ל שניתן שחול bioprinted, והוא מותאם אישית כדי 1) מכיל את הפרופיל הביוכימי של סוג רקמה מסוים ו -2) לחקות את מודולוס האלסטיות מסוג זה רקמה . על ידי טיפול בדרישות אלה, אנו שואפים provide חומר שיכול לשחזר את מאפייני physiochemical וביולוגיים של in vivo רקמה. 31 המערכת מרוכבי הידרוג&#39;ל מודולרית המתוארת כאן מנצלת בגישה רבה-crosslinking להניב bioinks extrudable, ומאפשרת crosslinking משני לייצב ומגבירה את הנוקשות של מוצרי קצה להתאים מגוון של סוגי רקמות. התאמה אישית ביוכימיים מתקיימת באמצעות רכיבי ECM רקמות ספציפיות. כמו הפגנה, אנו מעסיקים מגוון כבד ספציפית של מערכת הידרוג&#39;ל זה bioprint בונה organoid כבד פונקציונלי. הפרוטוקול המתואר משתמש במכשיר bioprinting מותאם אישית 3-D. באופן כללי, פרוטוקול זה ניתן להתאים רוב המדפסות מבוססות שחול, פרמטרי הדפסה ספציפיים להשתנות באופן דראמטי עבור כל סוג של מכשיר ודורשים בדיקה על ידי המשתמש.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="903">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hyaluronic acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">53747</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Gelatin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G6144</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">410896</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:340px;">Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP)</td>
			<td style="width:108px;">ESI-BIO</td>
			<td style="width:119px;">GS315</td>
			<td style="width:336px;">Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa</td>
			<td style="width:108px;">Creative PEGWorks</td>
			<td>PSB-887</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Primary human hepatocytes</td>
			<td style="width:108px;">Triangle Research Labs</td>
			<td>HUCPM6</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Primary human liver stellate cells</td>
			<td style="width:108px;">ScienCell</td>
			<td style="width:119px;">5300</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Primary human Kupffer cells</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">HUKCCS</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hepatocyte Basal Media (HBM)</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3199</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:340px;">Hepatocyte Media Supplement Kit</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3198</td>
			<td style="width:336px;">HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5mL; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 mL; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5mL; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 mL; insulin, 0.5 mL; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 mL; transferring, 0.5 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td style="width:336px;">Other manufacturers are ok.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Ammonium hydroxide</td>
			<td style="width:108px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A669</td>
			<td style="width:336px;">Other manufacturers are ok.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Fresh porcine cadaver tissue</td>
			<td style="width:108px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Lyophilizer</td>
			<td style="width:108px;">any</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Freezer mill</td>
			<td style="width:108px;">any</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:340px;">Bioprinter</td>
			<td style="width:108px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;">The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hanging drop cell culture plate</td>
			<td style="width:108px;">InSphero</td>
			<td>CS-06-001</td>
			<td style="width:336px;">InSphero GravityPlus 3D Culture Platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

כאשר ההליכים המתוארים לעיל הוא אחריו בצורה נכונה, הידרוג צריך להכיל פרופיל ביוכימיים ספציפי לסוג רקמת היעד, 20 לאפשר רמה גבוהה של שליטה על bioprinting מודולוס אלסטיות סופי, 34 ולתמוך תאים פונקציונליים קיימא בונת רקמות. התאמה אישית הידרוג&#39;ל כדי כבד היליד לחקות טובים ביותר, bioink הידרוג&#39;ל נוסף פתרונות ECM כבדים מערך גורם גדילה, 20 פתרונות ECM מכילים מגוון רחב של גורמי גדילה וציטוקינים (מוצג pg / ml, איור 1 א). אלה כוללים גורם נוירוטרופי שמופק מהמוח (BDNF), bFGF, עצם המוךפו&quot;גנטי שהולך חלבון 5 (BMP-5), FGF-4, חלבון מחייב גורם גדילה דמוי אינסולין 2 (IGFBP-2), TGF- B1, BMP-7, EGF , FGF-7, הורמון גדילה (GH), גורם הגדילה EGF דמויי מחייב הפרין (HB-EGF), HGF ו neurotrophin 3 (NT-3). בנוסף, פתרונות ECM מכילים רכיבים מבניים נוספים, אשר מנותחות על ידי מבחני colorimetric. 20 עבור פתרונות ECM הכבד, תוכן קולגן הכולל של פתרונות ECM הכבד היה 91.33 ± 0.58 מ&quot;ג / מ&quot;ל, את תכולת האלסטין היה 189.33 ± 48.40 מ&quot;ג / מ&quot;ל, ואת glycosaminoglycan (GAG) תוכן היה 86.00 ± 53.45 מ&quot;ג / מ&quot;ל (איור 1B). הידרוג&#39;ל bioink תכונות מכניות ניתן לאפיין באמצעות מבחן לטאטא מאמץ הגזירה (0.6-10 אבא, תדירות תנודה 1 הרץ) על rheometer. 10,12,13,34 בכך שהוא מאפשר כימיה תיאול-acrylate ספונטנית בשלב 1 להתרחש ב- pH נייטרלי, הידרוג רך עם G &#39;של 113.66 ± 22.59 Pa נוצר. לאחר תחילת crosslinking תיאול-אלקין בשלב 2 על ידי UV photopolymerization, עליות &#39;G לכ -10 kPa (10,637 ± 113.83 אבא, figuמחדש 1C), מחק גמישות רקמת כבד. מניפולציה נוספת של הריכוזי, משקלות מולקולריים, גיאומטריות של crosslinkers יכולה להשיג מגוון רחב של הערכים &quot;שלב 2 G. 34 איכות הידרוג&#39;ל bioprinted האסטרטגיה כימית ויישום שלב 1 ו crosslinking שלב 2 של bioinks הידרוג&#39;ל מתואר באיור 2. באופן כללי, crosslinkers כגון Extralink, אשר מבוססים על פולימרים PEG acrylated, ספונטני להגיב עם קבוצות תיאול על HA ורשתות ג&#39;לטין ב נייטרלי pH (שלב 1) בנוכחות של תאים כדי ליצור הידרוג&#39;ל extrudable רך. הידרוג&#39;ל רך זה ניתן bioprinted בתור bioink, שלאחריו אור UV משמש לביצוע photopolymerization של thiols unreacted ואת crosslinkers המשנה על-פי פולימרים PEG-modified אלקין. המשקלים הגיאומטריים המולקולריים המסוימים של crosslinkers ללכתורן הקשיח הסוף לבנות bioprinted. דפוס מ&quot;מ 7 x 7 יושם למטרות בדיקה (איור 3 א). בדיקות ראשוניות הראו כי הניסוחים הראשוניים היו extrudable, אבל הופיעו סדיר בכבדות במהלך ואחרי שהחול (איור 3 ב). כדי לשפר את תכונות שחול, ללא שינוי HA ו ג&#39;לטין נוספה אל bioinks (1.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו -30 מ&quot;ג / מ&quot;ל). המבנה השתפר מודפס חלקה מוצג באיור 3C. כדאיות ואת הפונקציה בסיסית של מבנים כבדים אנושיים העיקריים bioprinted באמצעות 3-D bioprinter bioink הידרוג&#39;ל הכבד ספציפי ביו שימש לתמצת להפקיד spheroids הכבד האנושי העיקרי, הכין בעבר בתלייה תרבויות ירידה, על coverslips פלסטיק. המודפס על coverslips הפלסטיק מותר לטיפול חזק ולהעביר במגוון סביבות תרבית תאים. לאחר bioprinting, הייכדאיויות תא GH ב המבנים הכבדים נצפו לאחר מכתים כדאיות חי / מת / cytotoxicity ו מיקרוסקופיה confocal (איור 4 א). בתנאים סביבתיים אופטימליים כדאיים צריכים להיות מעל 85%. hepatocytes אדם מן המעלה הראשון נחשב רגיש בדרך כלל מדגיש מכאניות וכימי, שחייב אופטימיזציה כמה משתנים סביבתיים. בעקבות bioprinting ואימות של כדאיות, בונה כבדה נוספת אשר ממוקמות בתרבות ניתן להעריך עבור פונקציונליות ידי ניתוח aliquots התקשורת סיר ביום 3, יום 7, יום 10, יום ו 14 לניתוח של אוריאה ואלבומין מופרשים. מבחני colorimetric האוריאה לחשוף ברמה יחסית עקבית של הפרשת אוריאה מן המבנים הכבדים במשך הזמן של 14 יום, שנותר בין 15 ל -20 ng / ml (איור 4B). רמות האוריאה זוהו לא היו שונות משמעותי זה מזה בזמן השונהנקודות. את assay ELISA אלבומין האדם מגלה כי ייצור אלבומין מן המבנים גם נשאר יחסית עקבי לאורך זמן, יציבות בין 125 לבין 140 ng / ml (איור 4C). בנוסף, כאשר מוכתמים עבור סמנים המעידים על רקמת כבד, ביטוי החיובי של אלבומין התאי, CYP3A4 (א איזופורם ציטוכרום P450 המעורב על חילוף חומרים), E-cadherin (חלבון הידבקות תאי תאי אפיתל), ו dipeptidyl peptidase-4 (חלבון הביע מאוד כבד) הם נצפו (איור 4D-F). יחדיו, כדאיות זה ונתונים פונקציונליים מראים כי עזרי bioink הידרוג&#39;ל ספציפי רקמות שמירה על כדאיויות ותפקוד של מבנים כבדים מבוסס תאים ראשוניים bioprinted. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53606/53606fig1.jpg" /> באיור 1. אפיון רכיב הידרוג&#39;ל והערכה נוקשות. א) גורם צמיחהלניתוח ציטוקינים על ידי מערכי פרוטאומיקה עבור פתרונות ECM מוכן מהכבד. B) כימות assay מדד-צבע של קולגן, glycosaminoglycan, ואת תכולת האלסטין בפתרונות ECM הכבד. C) הפגנה של יכולת לשלוט נוקשות bioink. לאחר crosslinking שלב 1, הג&#39;ל הוא יחסית רך ומסוגלים להיות נמתח חלק. לאחר crosslinking בשלב 2 על ידי אור UV, עליות מודולוס אלסטיות על ידי יותר מ סדר הגודל, מחקו רקמת כבד מודולוס אלסטיות. ברי שגיאה מצביעים סטיית התקן. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53606/53606fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53606/53606fig2.jpg" /> איור 2. העסקת crosslinkers PEG מבוסס מרובה עבור שחול bioprinting ושליטה על רקמות לבנות תכונות מכאניות. Strategy גיבוש bioinks להדפסה מורכב crosslinkers מבוסס acrylate (crosslinker 1), crosslinkers מבוסס אלקין (crosslinker 2), thiolated HA, ג&#39;לטין thiolated, חומרי ECM רקמות, שלא עבר כל שינוי HA ו ג&#39;לטין. ניסוח bioink ערוך Crosslinks הספונטני דרך-acrylate תיאול מחייב, וכתוצאה מכך חומר רך, extrudable. Bioprinting מתבצע. לבסוף, שכבות bioprinted מתמזגות, התייצב, והובא מודולוס הכבד אלסטי. תהליך זה ניתן לחזור לייצר מבנים רבים-שכבתיים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53606/53606fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53606/53606fig3.jpg" /> בדיקות איור 3. Bioprinting של bioinks. א) דפוס מתפתל מ&quot;מ 7 x 7 שימש מבחן שחול bioinking ב bioprinter. B) הניסוח הראשוני של PEGDA ו bioink אלקין PEG 8 זרוע הביא בתצהיר לא סדיר. ג) הוספת HA גלם ומשופר ג&#39;לטין שחול, וכתוצאה מכך שחול חלקה של bioink. סרגל קנה מידה -. 1 מ&quot;מ <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53606/53606fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53606/53606fig4.jpg" /> הפגנת איור 4. ויכולת קיום של פונקציה של spheroids הכבד bioprinted ב bioink הידרוג&#39;ל ספציפי הכבד. א) יישום של כבד bioink עבור bioprinting, הביאה בונה כדאית גבוהה. גרין - calcein AM מוכתם תאי קיימא; Homodimer מוכתם Ethidium תאים מתים B) אוריאה ו- C) אלבומין מופרש בונה כבדה מעל 14 ד - האדום.ays בתרבות, לכמת ידי מבחני colorimetric ו ELISA, בהתאמה. ברי שגיאה מצביעים סטיית התקן. Immunostaining של סמנים הקשורים רקמת הכבד: D) CYP3A4, E) אלבומין תאיים, ו- F) DPP4 ו- E-cadherin. ירוק או אדום - הצביע כתם; כחול -. DAPI <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53606/53606fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink at JoVE.com

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized בונה בעזרת רקמות ספציפיות הידרוג&#39;ל Bioink

אנו מתארים קבוצה של פרוטוקולים שמאפשרים bioink הידרוג&#39;ל המחקים רקמות שבה פונקציונלי קיימא בונה רקמות 3-D ניתן bioprinted לשימוש ביישומי הקרנה במבחנה.

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

bioprinting-cellularized-constructs-using-tissue-specific-hydrogel

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.6K Views.  Wake Forest Univeristy Health Sciences.  אנו מתארים קבוצה של פרוטוקולים שמאפשרים bioink הידרוג'ל המחקים רקמות שבה פונקציונלי קיימא בונה רקמות 3-D ניתן bioprinted לשימוש ביישומי הקרנה במבחנה. 

Video: Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of this hydrogel are two protein block-copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. A highly hydrophilic random coil is inserted into one of the block-copolymers for water retention. Mixing of the two protein block copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit with crosslinkers at either end that rapidly self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is very stable under both acidic and basic conditions, at temperatures up to 50 &#176;C, and in organic solvents. The hydrogel rapidly reforms after shear-induced rupture. Incorporation of a &#34;docking station peptide&#34; into the hydrogel building block enables convenient incorporation of &#34;docking protein&#34;-tagged target proteins. The hydrogel is compatible with tissue culture growth media, supports the diffusion of 20 kDa molecules, and enables the immobilization of bioactive globular proteins. The application of the intein-mediated protein hydrogel as an organic-solvent-compatible biocatalyst was demonstrated by encapsulating the horseradish peroxidase enzyme and corroborating its activity.

We present the synthesis of a split-intein-mediated protein hydrogel. The building blocks of this hydrogel are two protein copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. Mixing of the two protein copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit that self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is highly pH- and temperature-stable, compatible with organic solvents, and easily incorporates functional globular proteins.

סינתזה של חלבון מלאכותי בתיווך intein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

הנדסת ג&#39;ל קולגן Cellularized 3D לשחזור רקמות וכלי דם

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

כדאיות של מבנים ניידים Bioprinted באמצעות מדפסת הקרטזיאני Dispenser שלוש

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using an automated robotic dispensing system. The particular bioink was selected as it allows cells to sediment towards and sense the features. The dispensing system bioprints viable cells in hydrogel bioinks using a backpressure assisted print head. However, by replacing the print head with a sharpened stylus or scalpel, the dispensing system can also be employed to create topographical cues through surface etching. The stylus movement can be programmed in steps of 10 &#181;m in the X, Y and Z directions. The patterned grooves were able to orientate mesenchymal stem cells, influencing them to adopt an elongated morphology in alignment with the grooves&#39; direction. The patterning could be designed using plotting software in straight lines, concentric circles, and sinusoidal waves. In a subsequent procedure, fibroblasts and mesenchymal stem cells were suspended in a 2% gelatin bioink, for bioprinting in a backpressure driven extrusion printhead. The cell bearing bioink was then printed using the same programmed coordinates used for the etching. The bioprinted cells were able to sense and react to the etched features as demonstrated by their elongated orientation along the direction of the etched grooves.

This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

טכניקת Dispensing רובוטיות אוטומטית להכוון משטחים Bioprinting של תאים

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

יצירת רקמת הלב מציגה שילוב מכני של Spheroids באמצעות 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting של הסחוס, תחליפי רקמת העור ניצול פסיבים הרומן ערבוב טכניקה יחידה עבור Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Design of an Open-Source, Low-Cost Bioink and Food Melt Extrusion 3D Printer

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling costs. This increasing popularity is partly driven by falling barriers to entry such as system set-up costs and ease of operation. The following protocol presents the design and construction of an Additive Manufacturing Melt Extrusion (ADDME) 3D printer for the fabrication of custom parts and components. ADDME has been designed with a combination of 3D-printed, laser-cut, and online-sourced components. The protocol is arranged into easy-to-follow sections, with detailed diagrams and parts lists under the headings of framing, y-axis and bed, x-axis, extrusion, electronics, and software. The performance of ADDME is evaluated through extrusion testing and 3D printing of complex objects using viscous cream, chocolate, and Pluronic F-127 (a model for bioinks). The results indicate that ADDME is a capable platform for the fabrication of materials and constructs for use in a wide range of industries. The combination of detailed diagrams and video content facilitates access to low-cost, easy-to-operate equipment for individuals interested in 3D printing of complex objects from a wide range of materials.

The aim of this work is to design and construct a reservoir-based melt extrusion three-dimensional printer made from open-source and low-cost components for applications in the biomedical and food printing industries.

עיצוב של מקור פתוח, ביודיו בעלות נמוכה ומזון נמס ההבלטה מדפסת תלת-ממד

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

רקמת הלבלב הנגזר מטריקס Bioink עבור הדפסת 3D Cell לאדן רקמות הלבלב בנייה

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed from mammal collagen. Thus, the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequences and target motifs of matrix metalloproteinase (MMP) remain on the molecular chains, which help achieve cell attachment and degradation. Furthermore, formation properties of GelMA are versatile. The methacrylamide groups allow a material to become rapidly crosslinked under light irradiation in the presence of a photoinitiator. Therefore, it makes great sense to establish suitable methods for synthesizing three-dimensional (3D) structures with this promising material. However, its low viscosity restricts GelMA's printability. Presented here are methods to carry out 3D bioprinting of GelMA hydrogels, namely the fabrication of GelMA microspheres, GelMA fibers, GelMA complex structures, and GelMA-based microfluidic chips. The resulting structures and biocompatibility of the materials as well as the printing methods are discussed. It is believed that this protocol may serve as a bridge between previously applied biomaterials and GelMA as well as contribute to the establishment of GelMA-based 3D architectures for biomedical applications.

Presented here is a method for the 3D bioprinting of gelatin methacryloyl.

פרוטוקולים של 3D ביוריטינג ג'לטין הידרוג'ל מבוסס-דיו

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by shear stress and improve the survival of the encapsulated cells. However, rapid gravity-driven cell sedimentation in the reservoir could lead to an inhomogeneous cell distribution in bioprinted structures and therefore hinder the application of liquid-like bioinks. Here, we developed a novel multilayered modified strategy for liquid-like bioinks (e.g., gelatin methacryloyl with low viscosity) to prevent the sedimentation of encapsulated cells. Multiple liquid interfaces were manipulated in the multilayered bioink to provide interfacial retention. Consequently, the cell sedimentation action going across adjacent layers in the multilayered system was retarded in the bioink reservoir. It was found that the interfacial retention was much higher than the sedimental pull of cells, demonstrating a critical role of the interfacial retention in preventing cell sedimentation and promoting a more homogeneous dispersion of cells in the multilayered bioink.

Here, we developed a novel multilayered modified strategy for liquid-like bioinks (gelatin methacryloyl with low viscosity) to prevent the sedimentation of encapsulated cells.

שימוש בביודיו מרובה שכבות ביוריטינג תלת מימדי להפצת תאים הומוגניות

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by ...