Yazarlar minnetle Uzay ve Deniz Harp Sistemleri Merkezi Pasifik (SSC PASİFİK) Sözleşme No. N6601-13-C-2027 kapsamında Savunma Tehdit Azaltma Dairesi (DTRA) tarafından fon kabul. Bu malzemenin yayın buradaki bulgular veya sonuçların hükümet tarafından onaylanması anlamına gelmez.

1. Hidrojel Bioink Formülasyonlar ve Hazırlama İşlemi <ol><li> , Dokuya özel bir biyokimyasal profiller temin önce karaciğer için tarif edildiği gibi doku spesifik ECM çözümler sindirimi hazırlanması için. 20 Not: Genel olarak, bu ECM özeti kullanıldığında son hidrojel bioink hacminin% 40 ihtiva edecektir. ECM özeti çözeltisi birkaç yüz mililitre hazırlanabilir bölünmüştür ve ileride kullanılmak üzere -80 ° C&#39;de dondurulabilir. </li><li> bir foto-başlatıcı, 2-hidroksi-4 &#39;çözülür, formülasyonun hidrojel için -% 0.1 (2-hidroksietoksi) -2-methylpropiophenone, su içinde ağ / hac. Not: 50-100 mi aralığında hacimleri önceden hazırlanabilir ve birkaç ay boyunca 4 ° C&#39;de ışıktan korunmuş olarak saklanmıştır. </li><li> Hidrojel bioinks oluşturmak için, ilk olarak suda foto-başlatıcı çözeltisi içinde hiyalüronik asit (HA) hidrojel kitleri baz malzemesi bileşenleri çözülür. <ol><li> Su arıtımı ayrı HA tiolatlanmış ve tiolatlanmış jelatin çözülürhotoinitiator çözeltisi (aşama 1.2) hac çözeltiler / ağ% 2 olmak için. </li><li> % 8 ağırlık / hacim solüsyonu yapmak üzere, suda foto-başlatıcı çözeltisi (aşama 1.2) polietilen glikol diakrilat (PEGDA), hidrojel kitlerinde çapraz bağlayıcı, eritin. </li><li> % 8 ağırlık / hacim solüsyonu yapmak üzere, suda foto-başlatıcı çözeltisi (aşama 1.2) polietilen glikol (PEG), 8-kollu alkin (10 kDa MW) içinde çözülür. </li></ol></li><li> ek özelleştirme mümkün olmasına rağmen, genel olarak, aşağıdaki şema kullanılarak hidrojeller oluştururlar. <ol><li> genel olmayan doku olarak% 2 HA tiolatlanmış 4 parça, 4 parça% 2 tiolatlanmış jelatin, 1 kısım çapraz bağlayıcı 1, 1 kısım çapraz bağlayıcı 2 8 parça doku, ECM çözümü ve 2 parça hepatosit kültür ortamı (HKM) (ya da 10 parça su birleştirin e özgü hidrojel). Not: Ek modifiye edilmemiş HA ya da jelatin daha düzgün bioink ekstrüzyonunu yapmak için ilave edilebilir. Bu, aşağıda açıklanmaktadır. </li></ol></li><li> Kullanmadan önce karıştırmak için 10 saniye (10 üzerinden hız 10) yüksek üzerinde ortaya çıkan karışımın Vortex. &lt;/ Li&gt; <li> Hidrojel bioink kullanımı <ol><li> ekstrüzyon veya bioprinting testi için, bir şırınga ya da yazıcı kartuşu içine karışımı aktarın ve 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca (aşama 1 çapraz bağlama) için kendiliğinden çapraz bağ sağlar. </li><li> Reolojik ölçümler için, 35 mm Petri kabı içine karışımı aktarın ve 30 dakika boyunca çapraz sağlar. Not: Karışım hemen tiol akrilat bağı oluşumu yoluyla çapraz bağlanması için başlar ve viskozite artmaya başlar. Karışım transferi sırasında bir pipet veya şırınga tıkanmasını önlemek için 10 dakika içinde bir şırınga, baskı kartuşu, ya da hedef konuma transfer edilmelidir. </li><li> İkinci çapraz bağlama (Aşama 2) arzu edildiği zaman, bir tiol-alkin polimerizasyon reaksiyonunu başlatmak için evre ultraviyole ışığı (365 nm, 18 W / cm2) ile 1-çapraz bağlanmış jeller ışın tedavisi. Not: Işınlama süresi malzemenin yüzey alanına bağlıdır. Genel olarak, malzemenin bir santimetre karelik, ancak 1- gerektirirBu UV gücü UV maruz kalma 2 sn. </li></ol></li></ol> 2. Yazıcı Uyumluluk Testi <ol><li> Standart şırınga ve küçük iğne uçları (20-30 gauge) kullanılarak basit ekstrüzyon testleri ile laboratuvar tezgah üzerinde bioprinting cihazlar, deney ekstrüzyon özellikleri ile entegrasyon test öncesinde. <ol><li> az veya hiç darbe ile hidrojel sorunsuz haddelenmiş filamentler elde etmek için standart bir şırınga ile bioink itin. çizgiler veya basit desen ekstrüzyon başarısını belirlemek için yeterlidir. </li></ol></li><li> bioprinter entegrasyonu için yazıcı kartuşları içine pipetleme hazırlıklarını bioink yük ve bioink 30 dk kartuş içinde kendiliğinden aşama 1 çapraz bağlanmasının geçmesi için izin verir. Not: bioink hacmi uygulamaya bağlıdır ve kullanıcı tarafından belirlenmelidir. Yazıcı kartuşları benzer ya da bioprinter cihazla uyumlu şırınga olabilir. </li><li> ekstrüzyon uyumluluğu değerlendirmekbioink kullanarak basit bir desen yazdırarak bioprinting için. Örneğin, paralel çizgilerin oluşan 7 x 7 mm desenini yazdırmak. Baskı (örneğin, 20 kPa pnömatik basınç) uygulanır ise yaklaşık 300 mm / dakika bir hızda XY düzleminde yazıcı kafası hareket eder. Çeşitli büyüklüklerde kafası meme çapları kullanılabilir, ancak 400-500 mikron çapında delikleri olan konik püskürtme 250-350 um aralığında sferoidler baskı için uygun olunur. <ol><li> ekstrüde malzemeler pütürlü veya düzensiz ise, 2.4 adım bakın veya evre 1 çapraz malzemeyi yumuşatmak için PEGDA miktarını azaltır. Düzgün hazırlanmış bioink formülasyonlar istenilen desen veya mimarileri hassas birikimi sağlayan sorunsuz a&#39;ya. Cihazın her türü için önemli ölçüde bu tür özel baskı parametreleri gibi 32 tarif kullanım bioprinting prosedürleri, özellikle baskı oluşturmak doku için evde tasarlanmış özel bir 3-D bioprinting cihazı değişir ve testin gerektirir. NotKullanıcı tarafından örn. </li></ol></li><li> Ekstrüzyon özelliklerini geliştirmek bioinks değiştirilmemiş HA ve jelatin ek (1.5 mg / ml ve 30 mg / ml) ile. </li></ol> Primer Karaciğer Yapıları ile Bioprinting tarafından 3. Doğrulama <ol><li> Hücresel bileşen 33 olarak açılan yöntemleri asarak 3-D birincil hücre karaciğer parçacıklarının hazırlayın Not: Bioprinting da hidrojel bioinks içinde süspansiyon haline tek tek hücreler ile parçacıklarının olmadan gerçekleştirilir, ancak bunun yerine edilebilir. Sferoidler hücre-hücre etkileşimleri hızlandırmak ve işlevselliği oluşturmak için burada istihdam edilmektedir. Kullanılan sferoitlerin ve hücre sayısı, belirli uygulamaya bağlıdır ve kullanıcı tarafından belirlenmelidir. Bu adımlar, steril malzemeleri kullanarak, steril koşullar altında yapılmalıdır. <ol><li> hepatosit bazal ortamı (HBM) ve steril filtreleme HCM ek bileşen kiti çözülmüş içeriği ekleyerek HCM hazırlayın. <ol><li> ek bileşenleri un çözülmesıvı til. </li><li> gentamisin sülfat / amfoterisin B, 0.5 mi;, hidrokortizon 21-hemisüksinat, 0.5 mi, insülin, 0.5 mi, 10 mi, büyükbaş hayvan serum albümini [yağlı asit serbest]; 0.5 mi ek parçaları (askorbik asit ekleme insan rekombinan epidermal büyüme faktörü , 0.5 mi, 500 mi HBM&#39;ye), 0.5 ml aktarılması. </li><li> Bir şişe üstü filtre ünitesi veya bir şırınga ucu filtre kullanarak bir 0.45 mikron ya da 0.22 mikron filtre ile steril filtre. </li></ol></li><li> Her hücre tipi üreticinin talimatlarına göre çözüldükten sonra bir hemasitometre sayarak birincil insan hepatositlerin, Kupffer hücreleri ve stellat hücrelerin hücre yoğunluğu belirlemek. </li><li> konik bir tüp içinde 37 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı edilmiştir HCM ortam hücre sayısına göre bir 80:10:10 oranında primer insan hepatositleri, Kupffer hücreleri ve stellat hücreleri birleştirir. Not: kullanılan ortam hacmi genel hücre sayısı uygulamaya özel bağlıdır ve th belirlenmelidire kullanıcı. </li><li> 20 ° C&#39;de 520 x g&#39;de 5 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu santrifüj. </li><li> Hücre pelet geride bırakarak, süpernatant aspire. </li><li> 40 ul ortam 1.000 hücreleri ihtiva eden bir hücre süspansiyonu elde etmek için HCM medya hücre pelletini. sferoidler sayısı üretilen toplam hacim bağlıdır. </li><li> 96 göz formatındaki Asılı damla plakalar hücre süspansiyonu aktarın. Çok hücreli küreler oluşturan 3 gün boyunca% 5 CO2 içinde, hcm Her bir oyuğa, yaklaşık 1.000 hücre toplam ekleyin ve 37 ° C &#39;de muhafaza. </li><li> Bir pipet kullanarak asılı damla plaka karaciğer parçacıklarının toplayın. steril bir 15 ml konik tüp aktarın. </li></ol></li><li> karaciğere özgü hidrojel bioink olarak Bioprint karaciğer sferoidler <ol><li> çapraz bağlantı sağlayıcı olarak% 8 PEGDA ve% 8 8-kollu PEG alkin kullanılarak, Kademe 1 de tarif edildiği gibi, karaciğer ECM içeren hidrojel bioink bir formülasyonunun hazırlayın. resu onun yeteneği için bu arada kullanınyerli karaciğer dokusuna kayma elastik modülü yakın bir hidrojel sonuçtaki. </li><li> sferoidler onlar Adım 3.1.7 yerleştirildi olan konik tüpün dibine dinlendiriniz. Bu sfero büyüklüğü ve yoğunluğuna göre, ancak genellikle 1-2 dakika içinde gerçekleşir değişir. dikkatle aspire veya pipet ile tüm ortamları çıkarın. </li><li> küremsiler içeren konik tüp taze hazırlanmış hidrojel bioink çözeltisi istenilen hacmi aktarın. Genel olarak, uygun bir hacmi,% 10 basılacak 3-B yapısı hacminden% 25 daha fazladır. Dikkatle hidrojel bioink çözeltide parçacıklarının tekrar süspansiyon aşağı yukarı pipet ve. Bir pipet veya serolojik pipet kullanarak bir bioprinter kartuşa aktarın. </li><li> bioprinter kartuş içinde, çözelti, 30 dakika boyunca, ilk çapraz bağlama aşaması (tiyol-akrilat reaksiyonu) girmesine neden olurlar. Not: sfero boyutuna bağlı olarak, kartuş yavaş yavaş döndürüldüğünde gerekebilir ya da içerisinde karıştırılabilir gerekebilirsteril bir spatula kademe 1 çapraz bağlanma sırasında bioink boyunca dağılmış sferoidler tutmak. Bu süspansiyon hücreleri yerine parçacıklarının hazırlanan bioinks için bir gereklilik azdır. Not: Sahne 1 çapraz bağlama sonrasında, kullanıcıların birkaç saatlik bir çalışma penceresi var. Ancak, hücre canlılığını geliştirmek için hızlı bir şekilde bioprinting işlemini gerçekleştirmek tavsiye edilir. </li><li> evre 1 çapraz bağlama ardından, primer karaciğer parçacıklarının (veya diğer hücreleri) içeren istenen hidrojel yapıları oluşturmak için bir bioprinting aygıtı kullanın. Not: Bu teknoloji yapılarının çeşitli biofabricating için bir sistem sunmaktadır. yapıları baskılı edildiği gibi toplam hacmi, hücreler ya da küresel cisimler, basılı yapı geometri sayısı ve alt tabaka gibi parametreler kullanıcı hedeflerine büyük ölçüde bağlıdır. </li><li> arzu edilen konfigürasyona içine tevdiattan sonra, CO stabilize ikincil bir çapraz bağlama mekanizmasını başlatmak için 2-4 saniye UV ışığı tatbikistenen seviyeye nstructs ve artan sertlik. Not: PEG-alkin konsantrasyonu ve bu nedenle genel olarak nihai çapraz bağlama yoğunluğu, esas olarak Nihai yapının sertliğini kontrol eder. </li><li> çok katmanlı yapılar oluşturmak üzere adım 3.2.4 ve 3.2.5 tekrarlayın. </li></ol></li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

İnsanlarda ya da in vitro tarama uygulamaları için nihai kullanım için, 3-D doku yapıları biofabricate çalışırken dikkate kritik çeşitli bileşenler vardır. biofabrication cihazın kendisi son yapı ulaşmak için genel metodolojiyi belirler iken uygun hücresel bileşenleri kullanılarak, uç potansiyel işlevselliği belirler. o ikili rolleri hizmet olarak üçüncü bileşen, biyomalzeme, eşit derecede önemlidir. Özellikle, biyo materyal bileşeni biofabrication donanım (yani, bioprinters) ve aynı zamanda potansiyel olarak hassas biyolojik hücre bileşenleri desteklemek ile uyumlu olması gerekir. Bu gerekliliklerin her ikisi de en iyi duruma getirme bioprintable malzemeler birkaç anahtar parametreleri karşılamak gerekir olarak, zor olabilir: 1) verimli ve ipoteksiz baskı kolaylaştırmak için uygun kimyasal, mekanik ve zamansal özelliklere sahip; Hazırlık aşamaları ve bioprin sırasında 2) desteği hücre canlılığıting prosedürü; 3) ve en iyi hücre canlılığı ve bioprinting aşağıdaki nihai doku yapısı işlevini artırır misafirperver bir ortam sağlar. Biz bu gereksinimleri karşılamak için burada açıklanan metodoloji açıklanan modüler hidrojel bioink sistemini kullanır. İlk olarak, büyüme faktörleri, kollagenler, gags, ve belirli bir doku tipinin ECM türetilen elastinler dahil ederek, hedef doku tipine anımsatan bir biyokimyasal profil elde edebilirsiniz. İkinci olarak, 2 benzer şekilde, ancak bağımsız çapraz bağlama reaksiyonları kullanılarak ekstrüzyon bazlı, ayrıca ikinci bir çapraz bağlama aşaması ile değiştirilebilen bir hedef ile eşleşen bir tespit edildiği üzere malzemenin elastik modüle ulaşmak için en uygun olan yumuşak ekstrüde materyal elde edebiliyoruz seçim doku. 34 yararlı kılan bu sistemin kritik özelliği polimer işlemek için harnessed olabilir çoklu kimyasal reaksiyonları desteklemek yeteneğihaklara ait kinetik ve bioink sisteminin mekanik özellikleri. 2 bağımsız Reaksiyon türleri, tiol-akrilat ve tiol-alkin kullanılmasıyla, bir şırınga ya da bioprinting cihazı ekstrüde edilebilir bir yumuşak malzeme ile sonuçlanan bir Aşama 1 tiol akrilat reaksiyonu ve bir sahne 2 tiol gerçekleştirmek için yetenek sağlamak sadece son bioprinted yapının bir esneklik modülüne belirleyen bir foto-başlatıcı varlığında, UV&#39;ye maruz kalmadan sonra başlatılır -alkyne reaksiyon. Bu çoklu adımlar bioprintable malzeme ile sonuçlanır. Bu şekilde, bu ayrı bir tepkime türlerini muhafaza, ekstrüzyon ve daha sonra elastik modül özelleştirme destekler stabil bioink elde etmek için önemlidir. biofabrication için sistemini kullanarak birincil beraberlik ya ikincil çapraz bağlayıcı ile son elastik modülü manipüle veya farklı doku kökenli ECM malzemelerin eklenmesi ile aracılığıyla yapılır özelleştirme kolaylığı olduğunu<html> veya büyüme faktörü kokteyller. dokularda ECM büyüme faktörleri ve genellikle doku türleri arasında genel olarak dağıtım değişen başka sitokinlerin çeşitli içerir. Biz, bu faktörler primer insan hepatositleri gibi belli hücre tiplerinin, fonksiyonunu muhafaza etmek için yekparedir inanıyoruz. Bu kavramın uygulanması önceden heparin bağlayıcı büyüme faktörleri ile hidrojel yanı sıra karaciğer ECM diğer ECM bileşenleri heparin zincirleri birleştirerek canlılığı ve heparinize hyaluronik asit sandviç kültürlerinde birincil insan hepatositlerin işlevini. 20 artırmak için gösterilmiştir, biz başardık uzun bir zaman dönemi için, in vitro olarak canlılığı ve fonksiyonu muhafaza primer insan hepatositleri, bu karaciğere özgü biyokimyasal sunmaktır. Bu yaklaşım kolayca araştırmacılar decellularizing ve diğer dokular çözündürücü bu dokuya özel faktörler yeniden vücuda elde etmek için izin diğer doku türlerine uzatılabilir. tert &quot;&gt; Kullanıcılar farkında olmalıdır, bu bioink sisteminin baz bileşenleri, bioprinting uygulanmıştır ise, 10,12,17 ancak daha az nüanslı dokuya özgü yaklaşımlar, hem de diğer rejeneratif tıp uygulamalarında çeşitli, 35- 45 biofabrication Tüm doku türleri için teşebbüs edilmemiştir. bu nedenle, bu tür ek doku yapıları oluşturmak için gerekli olan bir miktar daha geliştirilmesi ve sorun olabilir. Bununla birlikte, bu burada tarif edilen gibi bir modüler sistem, çok iyi adapte olabilir. Diğer potansiyel sınırlamalar bazı hücre tipleri, özel biyo doğru olabilir, doğal afinitelere içerir. Genel olarak, örnekleme ile, bu hidrojel sistemi destek hiyalüronik asit, jelatin ve PEG-bazlı temel bileşen canlı hücre tipleri çok çeşitli kültürler, henüz bu tür bir doğal fibröz na sahip kolajen, farklı bileşimlerin işlenmiş ortamlarda daha iyi performans hücrelerin bazı türlerinde olabilirdaha fazla elastik doğası gereği Türe veya elastin. Bu şekilde, belirli bir doku tipine ve son uygulama için uygun malzeme göz önemlidir ve burada açıklanan hidrojel bioink sistemi tüm kullanımlar için yeterli olmayabilir. Buna ek olarak, bioprinting gerçekleştirilir altında çevre koşullarını dikkate alınması önemlidir. hazırlık ve baskı süresi çok 37 ° C kullanarak bioinks altında, daha hızlı protokoller çizilmiş olsaydı, bu protokolün geliştirilmesi sırasında, yakın çevre (oda sıcaklığı) kötü canlılığı neden herhangi bir hücre medya olmadan bioinks kullanarak şartlarından geçiş önemli ölçüde hücre canlılığı artan bir medya bileşiklerle hazırlanabilir. Yakın zamana kadar, birkaç malzeme veya malzeme sistemleri bioprinting sistemleriyle arayüz için özel olarak geliştirilmiştir. Bunun bir sonucu olarak, birçok malzeme, biofabrication ile uyumluluk hücrelerini desteklemek için biyolojik özelliklerini ya yararlanarak, basit, ya dadonanım. Birkaç malzemeler her iki alanda da en uygun olan. Bu metodoloji açıklanan sistem ekstrüzyon bioprinting için gerekli olan mekanik özellikleri kolaylaştırmak ederken böylece, biyolojik karakterizasyonu özelleştirme sağlayan, bu özellikleri decouples. Bu hidrojel bioink sisteminin bir başka fark, o biofabricating için kullanılan hedef dokuların hem biyokimyasal hem de fiziksel parametrelerin taklit edebilir olmasıdır. Bu neredeyse her doku biyokimyasal faktörlerin yeniden vücuda sağlayan, hem de herhangi bir yumuşak doku bir esneklik modülüne uyan, esneklik özellikle geniş destekler. Bir doku bu yönüyle hem dikkat nadiren tandem araştırılmıştır. Bu teknolojinin modüler doğası, geniş bir uygulama çeşitli uygulanacak bir esneklik elde edilir. çeşitli doku tiplerini taklit yeteneği, bu çalışmada örnek olarak kullanılan sadece karaciğer yapıları biofabricate yeteneği sağlar, ancak aleyhteyapılar vücuttaki diğer dokularda çok temsil eder. Belki de bu parametreleri kullanarak en bariz geniş uygulama gibi implantasyon veya ilaç ve toksikoloji tarama gibi gerçek uygulamalar için tasarlanmış yapıları bitiş fonksiyonunu optimize etmek için özel bir dokuya iki açıdan maç için yeteneğidir. hastalarda implantasyon için insan ölçekli dokuların nesil nedeniyle doku mühendisliği organlara fonksiyonel damarsal imal yeteneği üzerinde düzenleyici engeller, hücre kaynak ve sınırlamalar, birçok araştırmacının için nihai hedefi olsa da, bu yüce amaç daha da geliştirilmesi ve zaman gerektirecektir gerçekleştirilmesi. Ancak, bu tür burada açıklanan metodoloji gibi teknolojiler şu anda başlıyor in vitro platformları için &quot;organoids&quot; üretilmesi için uygulanacak. Ekibimiz, diğerlerinin yanı sıra, şu anda toksikoloji çalışmaları gerçekleştirildiği model sistemleri oluşturmak için biofabrication organoid kullanmaktadır. Ayrıca, bu tür organoids için kullanılabilirkanser, 46 olarak patolojileri ve hastalığın ilerlemesini, çalışma ve potansiyel terapötik tedavileri test edin. Son olarak, bu sistem, bir diğer önemli kullanımını destekler. bağımsız Bu parametreleri manipüle ederek, araştırmacılar, mekanik faktörlerin karşı biyokimyasal göreli önemini belirlemek için temel bilim deneyleri gerçekleştirebilirsiniz.

Son yıllarda, teknolojiler çeşitli bunları üretmek veya biofabricate isteyen fonksiyonel organ ve dokuların alternatif kaynaklar ihtiyacını giderir kullanılabilir hale gelmiştir. Bioprinting bu teknolojilerin en umut verici olarak ortaya çıkmıştır. Bioprinting 3 boyutlu desen uygulanabilir organı gibi veya doku benzeri yapılar oluşturmak veya kullanılabilir biyolojik parçaların robot ilave imalat biçimi olarak düşünülebilir. Çoğu durumda, 1, bioprinting 3 (3 boyutlu kullanmaktadır -D) bu suretle yansıtan, hassas pozisyonlarda içine hücreleri ve biyomalzemeleri yatırmak için bir bilgisayar tarafından yönlendirilir baskı cihazı fizyolojik mimariler anatomik taklit. 2 Bu cihazlar hücre agrega şeklini alabilir bir &quot;bioink&quot; yazdırmak, hidrojeller kapsüllü hücreleri veya yapışkan sıvılar veya hücre tohumlanır mikro taşıyıcılar, hem de hücresiz pla gibi mekanik yapı veya hareket sağlayan hücre içermeyen polimerlerceholders. 3,4 bioprinting işleminden sonra, elde edilen yapı, işlev doku ya da organ yapılarına olgunlaşmış ve amaçlanan son uygulama için de kullanılabilir. 5,6 Bugüne kadar, tam bir tam olarak işlevsel insan boyutunda organı baskılı edilmemiştir, ancak araştırma ve geliştirme bioprinting birincil uzun vadeli bir hedef olmaya devam etmektedir. 2 Bununla birlikte, &quot;organoid&quot; doku yapıları şu anda patoloji modelleme, ilaç geliştirme ve toksikoloji tarama dahil olmak üzere uygulamaların, bir dizi yürütülmektedir küçük ölçekli. Araştırmacılar bioprinting teknolojisini uygulayarak karşılaştığım en önemli engellerden biri çok az malzeme bioprinting açık amaç için geliştirilmiş olmasıdır. etkin bir bioprinting başarılı olabilmek için, bir biyomalzeme 4 temel gereksinimleri karşılaması gerekir. Biyo materyal birikimi sağlamak için 1), uygun mekanik özelliklere sahip olması gerekir (bir jel veya I gibi bir meme boyunca ekstrüzyonlaBir damlacık olarak nkjet) birikmeden sonra bir 3-D yapının bir bileşeni olarak şekli korumak için 2) yeteneği, 3) 2, önceki özelliklerinin kullanım kontrolü, ve 4), bir hücre için uygun ve destekleyici ortamda tüm yeteneği bioprinting prosedürünün aşamaları. 7 Tarihsel olarak, işi bioprinting yerine sıkça bioprinting ve sonraki baskı sonrası uygulamalar için gerekli özelliklere sahip bir biyo materyal tasarlama, onların uyumluluk için dikkate olmadan bioprinting cihazlarda mevcut geleneksel biyomalzemeleri istihdam etmeye çalıştı. bioinks çeşitli kaplama ve üretim donanımı ile daha iyi son zamanlarda geliştirilmiştir. genellikle iki habercisi olarak yetersiz mekanik özellikleri, ya da eğer memeleri yapışmasına neden olabilir basılı veya sıkma işlemi sırasında kırılmış olma polimerize hidrojeller ile sıvı çözümler bulunması nedeniyle standart hidrojel sistemleri önemli sorunlar oluşturmaktadır. Ekibimiz, hem de tasarımlarıyla olarakRS, hidrojel substratlar içine hücre sferoid baskı, Mikro kapiller tüpler 5,8 hücresi ve hidrojel filament ekstrüzyon dinamik çapraz bağlama özelliklerine sahip 9-11 ekstrüde hiyalüronik asit (HA) -Altın nanopartikül hidrojeller de dahil olmak üzere, bu bioprinting sorunları çözmek için çeşitli hidrojel formülasyonlar, araştırdık , fotopolimerleşebilen kullanarak hidrojel sertlik 12 zamansal kontrolü, 17 HA ve jelatin, 13 fibrinojen-trombin tabanlı çapraz bağlanmasını, 14,15 iyonik değişim aljinat-kolajen jelleri, 16 metakrile ve son zamanlarda hızla polimerize ultraviyole ışık (UV) -initiated çapraz Bu örnekler etkin bir bioprinted seçebilirsiniz üreten malzemelerin uygulanabilirliğini göstermek. Ancak, donanım ile entegre ek olarak, başarılı bir şekilde, sürekli ve işlevsel 3 boyutlu doku yapıları oluşturmak için, biyo materyaller hücre korumada yardımın biyokimyasal ve mekanik ipuçları içermelidircanlılığı ve işlevi. Bu ek faktörler, biyokimyasal ve mekanik profiller, bioprinted doku yapıları başarılı fonksiyonu üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Her iki hücre ve doğal hücre-dışı matrisi (ECM) gibi büyüme faktörleri ve diğer hücrelere diğer sitokinler gibi sinyal molekülleri geniş yelpazeli sorumludur. Bu sinyallerin birleşimi dokudan dokuya değişir, ancak, hücre ve doku davranışını düzenleyen son derece kuvvetli ve etkili olabilir. 18, araştırılmış olan farklı organlardan doku spesifik ECM bileşenleri kullanan ve bir hidrojel olarak veya bir hidrojel bir parçası olarak uygulanması başarısı. 19-21, belirli bir doku decellularizing o ince öğütme ve eriterek oluşan bu yaklaşım, bir dokudan dokuya özel biyokimyasal sinyallerin üretilmesi için 3-D hidrojel yapılarında dahil edilebilir kullanılabilir. 22 Buna ek olarak,yaygın vücuttaki dokular katılıkları geniş bir yelpazede işgal olduğu belgelenmiştir. Bu nedenle 23, ayarlamak için yeteneği gibi elastik modülü E &#39;veya kesme elastik modülü G&#39; olarak biyomateryaller, mekanik özellikleri, doku mühendisliğinde yararlı bir araçtır . Yukarıda tarif edildiği gibi, bioink mekanik özellikler üzerinde kontrol hedef organ Çeşidi ile aynı olduğu daha sonra elastik modül seviyesi elde edilebildiği de daha sonraki bir noktada, ikincil çapraz bağlama ile manipüle yumuşak bir jel kullanılarak ekstrüzyon bazlı biofabrication sağlar. Örneğin, biyomalzemeler çalışması için bu organoids yeteneği artan teoride 24,25, yerli karaciğer gibi 23 5-10 kPa sertliğine uyum veya yerel kalp dokusu gibi 10-15 kPa sertliği maç için özelleştirilmiş olabilir kendi ana doku meslektaşları benzer bir şekilde. hücre fenotipinde çevresel sertlik etkisi Exp olmuşturÖzellikle kök hücreleri ile ilgili olarak, son yıllarda lored. Engler ve ark., Doku elastikiyeti substrat olduğunu eşleşen soylar karşı mezenkimal kök hücreleri (MSC) sürüş destekli bu alt tabaka esnekliğini göstermiştir. 25 Bu kavram daha kas içine farklılaşma, kalp fonksiyonu, karaciğer fenotip, hematopoetik kök hücre çoğalması için araştırılmaktadır ve kök hücre tedavi potansiyelinin bakım. 24,26-29 ayarlamak için güçlü olmak farklı elastik modülünün bir hidrojel doku yapıları biofabricate için kullanılacak biyomalzeme önemli bir özelliğidir. 30 Burada ekstrüzyon bioprinted edilebilir bir hidrojel sistemi formüle etmek bizim laboratuvarda kullanılan çok yönlü bir yaklaşımı temsil eder ve belirli bir doku tipi biyokimyasal profil içeren ve 2) doku Çeşidi elastik modülü taklit) 1 özelleştirilmiş bir protokol tarif . Bu gereksinimleri ele alarak, biz p hedefliyoruzin vivo fizikokimyasal ve biyolojik özelliklerini özetlemek bir malzeme rovide dokusudur. 31. Burada tarif edilen modüler hidrojel bileşik sistem ekstrüde bioinks üretmek üzere bir çok çapraz bağlama yaklaşım yararlanır ve stabilize etmek için ikinci bir çapraz bağlanma sağlar ve sertliğini artırır son ürünlerin doku tiplerinin aralığında uyum sağlamak. Biyokimyasal özelleştirme doku spesifik ECM bileşenleri kullanarak karşılanmaktadır. bir göstergesi olarak, fonksiyonel karaciğer organoid yapıları bioprint bu hidrojel sisteminin bir karaciğere özgü çeşitli kullanır. açıklanan protokol, özel bir 3-D bioprinting cihazı kullanır. Genel olarak, bu protokol çoğu ekstrüzyon tabanlı yazıcılara adapte edilebilir, özel baskı parametreleri cihazın her türü için önemli ölçüde değişir ve kullanıcı tarafından test gerektirir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="903">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hyaluronic acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">53747</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Gelatin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G6144</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">410896</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:340px;">Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP)</td>
			<td style="width:108px;">ESI-BIO</td>
			<td style="width:119px;">GS315</td>
			<td style="width:336px;">Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa</td>
			<td style="width:108px;">Creative PEGWorks</td>
			<td>PSB-887</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Primary human hepatocytes</td>
			<td style="width:108px;">Triangle Research Labs</td>
			<td>HUCPM6</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Primary human liver stellate cells</td>
			<td style="width:108px;">ScienCell</td>
			<td style="width:119px;">5300</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Primary human Kupffer cells</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">HUKCCS</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hepatocyte Basal Media (HBM)</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3199</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:340px;">Hepatocyte Media Supplement Kit</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3198</td>
			<td style="width:336px;">HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5mL; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 mL; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5mL; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 mL; insulin, 0.5 mL; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 mL; transferring, 0.5 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td style="width:336px;">Other manufacturers are ok.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Ammonium hydroxide</td>
			<td style="width:108px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A669</td>
			<td style="width:336px;">Other manufacturers are ok.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Fresh porcine cadaver tissue</td>
			<td style="width:108px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Lyophilizer</td>
			<td style="width:108px;">any</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Freezer mill</td>
			<td style="width:108px;">any</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:340px;">Bioprinter</td>
			<td style="width:108px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;">The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hanging drop cell culture plate</td>
			<td style="width:108px;">InSphero</td>
			<td>CS-06-001</td>
			<td style="width:336px;">InSphero GravityPlus 3D Culture Platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

Yukarıda açıklanan prosedürler doğru takip edildiğinde, hidrojeller hedef doku tipine özgü bir biyokimyasal profil içermelidir, 20 bioprinting ve nihai elastik modülü, 34 üzerinde kontrol yüksek derecede izin ve doku yapılarında yaşayabilir işlevsel hücreleri destekler. hidrojel Özelleştirme En iyi taklit ana karaciğer, hidrojel bioink karaciğer ECM çözümleri ve bir büyüme faktöründen dizisi ile takviye edilmiştir, 20 ECM çözeltiler (pg / ml, Şekil 1a&#39;da gösterilmektedir), büyüme faktörleri ve sitokinler çok çeşitli içerir. Bu, beyin-türevi nörotrofik faktör (BDNF), bFGF, kemik morfogenetik protein, 5 (BMP-5), FGF-4, insülin benzeri büyüme faktörü bağlayıcı protein 2 (IGFBP-2), TGF-B1, BMP-7, EGF, FGF&#39;ler FGF-7, büyüme hormonu (GH), heparin-bağlayıcı EGF-benzeri büyüme faktörü (HB-EGF), HGF ve neurotrophin 3 (NT-3). Buna ek olarak, ECM&#39;nin çözeltiler kolorimetrik analiz ile incelendiğinde ilave yapısal bileşenler, ihtiva etmektedir. 20, karaciğer, ECM çözeltiler, karaciğer ECM solüsyonlarının toplam kolajen içeriği olan 91,33 ± 0,58 mg / ml, elastin içeriği olan 189,33 ± 48.40 mg / ml, ve glikozaminoglikan (GAG) içeriği 86.00 ± 53.45 mg / ml (Şekil 1b). Hidrojel, spontan evre 1 tiyol-akrilat kimyası nötr pH meydana izin vererek mekanik özellikleri bir kayma gerilmesi süpürme testini reometre üzerinde (0,6-10 Pa, salınım frekansı 1 Hz). 10,12,13,34 kullanılarak karakterize edilebilir bioink 113.66 ± 22,59 Pa bir G &#39;sahip bir yumuşak hidrojel oluşturulmuştur. UV fotopolimerizasyonu ile Aşama 2 tiol alkin çapraz bağlama başlandıktan sonra, yaklaşık 10 kPa (10.637 ± 113.83 Pa, figu G &#39;artar1C yeniden), karaciğer doku elastikiyetini taklit. Konsantrasyonları, moleküler ağırlıklarda ve çapraz bağlayıcıların geometrilerinin ek işleme aşaması 2 G &#39;değerleri geniş bir sağlayabilir. 34 Bioprinted hidrojel Kalitesi Kimyasal strateji ve hidrojel bioinks 1. Aşama ve 2. Aşama çapraz bağlama uygulaması Şekil 2&#39;de tarif edilmiştir. Genel olarak, akrilatlı PEG polimerlere dayanan örneğin Extralink gibi çapraz bağlayıcılar, kendiliğinden doğal HA tiol grupları ve jelatin zincirleri ile reaksiyona hücrelerin varlığında pH (aşama 1) yumuşak ekstrüde hidrojel oluşturmak üzere. Bu yumuşak hidrojel UV ışığı alkin-modifıye edilmiş bir PEG polimer bazlı reaksiyona girmemiş tiol ve ikinci çapraz bağlayıcı ışıkla polimerizasyonunu başlatmak için kullanılır ve bundan sonra, bir bioink olarak bioprinted edilebilir. çapraz bağlayıcı özellikle moleküler ağırlıkları ve geometrileri gitmekVern bioprinted yapının uç sertliği. A 7 x 7 mm model test amaçlı (Şekil 3A) için uygulanmıştır. İlk testler ilk formülasyonlar sıkılabilir olduğunu gösterdi, ancak sırasında ve ekstrüzyon (Şekil 3B) sonra düzensiz ve clumped çıktı. çekme özelliklerini geliştirmek için, modifiye edilmemiş HA ve jelatin bioinks (1.5 mg / ml ve 30 mg / ml) ilave edildi. Geliştirilmiş yumuşak baskılı yapısı Şekil 3C gösterilmiştir. Canlılık ve bioprinted birincil insan karaciğer yapılarının temel işlevi biyoaktif karaciğere özgü hidrojel bioink saklanması ve daha önce plastik lamelleri üzerine, damla kültürleri asarak hazırlanan primer insan karaciğer sferoidler, mevduat kullanılan bioprinter 3-D kullanarak. Hücre kültürü ortamlarında çeşitli sağlam kullanım ve transfer için izin verilen plastik lamelleri üzerinde yazılı olan. bioprinting sonra, merhabaKaraciğer yapılarda gh hücre canlılığı CANLI / DEAD canlılığı / sitotoksisite boyama ve konfokal mikroskopi (Şekil 4A) sonra gözlenmiştir. uygun çevre koşulları altında yaşayabilirliği% 85&#39;in üzerinde olmalıdır. Primer insan hepatositler genellikle çevresel değişkenlerin bazı optimizasyon gerekli mekanik ve kimyasal etkinin, duyarlı kabul edilir. bioprinting ve canlılık doğrulanmasını takiben, kültür içinde yer alan ek karaciğer yapıları salgılanmış üre ve albümin analizi için 3. gün, 7. gün, 10. gün ve 14. günde çıkarılır ortam alikotları analiz ederek işlevler için değerlendirilebilir. Üre kolorimetrik tahlilleri, 15 ve 20 ng / ml (Şekil 4B) arasında kalan, 14 günlük bir süre boyunca, karaciğer yapılardan üre salgılaması nispeten tutarlı bir düzeyde ortaya koymaktadır. Algılandı üre düzeyleri farklı zamanlarda birbirinden anlamlı olarak farklı değildiişaret eder. İnsan Albümin ELISA deneyi yapılardan albümin üretimi de 125 ve 140 ng / ml (Şekil 4C) ile sabit kaldığı zaman içinde nispeten tutarlı kalmasını göstermektedir. karaciğer dokusu, hücre içi albümin pozitif ifadesi, CYP3A4 (metabolizmasına katılan bir sitokrom P450 izoformu), E-kadherin (bir epitel hücre-hücre yapışma proteini), ve dipeptidil göstergesidir belirteçleri için boyandı Ayrıca, peptidaz-4 (bir protein olarak ifade büyük oranda karaciğerde) (Şekil 4D-F) gözlenir. Birlikte ele alındığında, bu canlılığı ve fonksiyonel veriler, canlılığı ve bioprinted primer hücre bazlı karaciğer yapıların işlevi muhafaza dokuya özel hidrojel bioink yardımcı olur. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53606/53606fig1.jpg" /> Şekil 1. Hidrojel bileşeni karakterizasyonu ve sertlik değerlendirmesi. A) Büyüme faktörü veKaraciğer. B&#39;den hazırlanan ECM çözümleri) kolajen, glukozaminglikanın kolorimetrik tahlil ölçümü ve karaciğer ECM çözümleri elastin içeriği için proteomik dizileri tarafından sitokin analizi. C) bioink sertliği kontrol yeteneğinin gösterilmesi. 1. aşama çapraz bağlama sonrası, jel, nispeten yumuşak ve düzgün bir şekilde ekstrüde edilmesi mümkündür. UV ışığı, karaciğer dokusu, esneklik katsayısı taklit fazla bir büyüklük sırasına göre göre elastik modül artar, 2. aşama çapraz bağlama sonrası. Hata çubukları standart sapmayı göstermektedir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53606/53606fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53606/53606fig2.jpg" /> Doku üzerinde ekstrüzyon bioprinting ve kontrol için birden çok PEG-bazlı çapraz bağlayıcılar istihdam Şekil 2. mekanik özellikleri yaparız. Sakrilat bazlı çapraz bağlayıcı (çapraz bağlayıcı 1), alkin tabanlı ıslatma maddelerinin (çapraz bağlayıcı 2) oluşan yazdırılabilir bioinks formülasyon trategy, tiollenmiş jelatin, doku ECM maddeleri ve modifiye edilmemiş HA ve jelatin HA tiollenmiş. bioink formülasyonu ve kendiliğinden yumuşak, ekstrüde edilebilir malzeme elde bağlayıcı tiol akrilat ile çapraz bağlanmaktadır edilir. Bioprinting gerçekleştirilir. Son olarak, bioprinted katmanlar kaynaşmış, stabilize ve karaciğer elastik modülü getirdi. Bu süreç çok katmanlı yapıların üretilmesi için tekrar edilebilir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53606/53606fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53606/53606fig3.jpg" /> Bioinks Şekil 3. Bioprinting testi. A) 7 x 7 mm sarım şeması bioink ekstrüzyon test için kullanıldıbioprinter ing. B) PEGDA ve 8 kollu PEG alkin bioink ilk formülasyonu ham HA ekleme) düzensiz birikimi. C sonuçlandı ve jelatin bioink düzgün ekstrüzyon sonuçlanan ekstrüzyon düzeldi. Ölçek çubuğu -. 1 mm <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53606/53606fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53606/53606fig4.jpg" /> Canlılığı ve karaciğere özgü hidrojel bioink. A) bioprinting için karaciğer bioink uygulanması halinde bioprinted karaciğer sferoidler fonksiyonu Şekil 4. Gösteri, yüksek canlılık yapıları sonuçlandı. Yeşil - kalsein canlı hücre AM-lekeli; Kırmızı - Etidyum homodimer lekeli ölü hücreler B) Üre ve C) 14 d üzerinde karaciğer yapıları tarafından salgılanan albümin.sırasıyla, kolorimetrik ve ELISA tahlilleri ile nicelleştirilmiştir kültürde ays. Hata çubukları standart sapmayı belirtir. D) CYP3A4, E) Hücre içi albümin, ve F) DPP4 ve E-kaderin: Karaciğer dokusu ile ilişkili markörlerde immün. Yeşil ya da kırmızı - leke belirtilen; Mavi -. DAPI <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53606/53606fig4large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink at JoVE.com

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting cellularized dokuya özel Hidrojel Bioink kullanılarak dahil edilmesi

Birlikte işlevsel ve uygun bir 3-D doku yapıları in vitro tarama uygulamalarında kullanılmak üzere bioprinted edilebildiği bir doku taklit hidrojel bioink sağlayan bir protokol kümesi tarif eder.

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

bioprinting-cellularized-constructs-using-tissue-specific-hydrogel

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.6K Görüntüleme.  Wake Forest Univeristy Health Sciences.  Birlikte işlevsel ve uygun bir 3-D doku yapıları in vitro tarama uygulamalarında kullanılmak üzere bioprinted edilebildiği bir doku taklit hidrojel bioink sağlayan bir protokol kümesi tarif eder. 

Video: Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of this hydrogel are two protein block-copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. A highly hydrophilic random coil is inserted into one of the block-copolymers for water retention. Mixing of the two protein block copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit with crosslinkers at either end that rapidly self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is very stable under both acidic and basic conditions, at temperatures up to 50 &#176;C, and in organic solvents. The hydrogel rapidly reforms after shear-induced rupture. Incorporation of a &#34;docking station peptide&#34; into the hydrogel building block enables convenient incorporation of &#34;docking protein&#34;-tagged target proteins. The hydrogel is compatible with tissue culture growth media, supports the diffusion of 20 kDa molecules, and enables the immobilization of bioactive globular proteins. The application of the intein-mediated protein hydrogel as an organic-solvent-compatible biocatalyst was demonstrated by encapsulating the horseradish peroxidase enzyme and corroborating its activity.

We present the synthesis of a split-intein-mediated protein hydrogel. The building blocks of this hydrogel are two protein copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. Mixing of the two protein copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit that self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is highly pH- and temperature-stable, compatible with organic solvents, and easily incorporates functional globular proteins.

Bir Intein aracılı yapay protein Hidrojel sentezi

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Biyomühendislik

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Vasküler Doku Rejenerasyon için Mühendislik 3D cellularized Kollajen jeller

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

Üç Verici Kartezyen Yazıcı Kullanımı Bioprinted Hücresel Yapıların Canlılık

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using an automated robotic dispensing system. The particular bioink was selected as it allows cells to sediment towards and sense the features. The dispensing system bioprints viable cells in hydrogel bioinks using a backpressure assisted print head. However, by replacing the print head with a sharpened stylus or scalpel, the dispensing system can also be employed to create topographical cues through surface etching. The stylus movement can be programmed in steps of 10 &#181;m in the X, Y and Z directions. The patterned grooves were able to orientate mesenchymal stem cells, influencing them to adopt an elongated morphology in alignment with the grooves&#39; direction. The patterning could be designed using plotting software in straight lines, concentric circles, and sinusoidal waves. In a subsequent procedure, fibroblasts and mesenchymal stem cells were suspended in a 2% gelatin bioink, for bioprinting in a backpressure driven extrusion printhead. The cell bearing bioink was then printed using the same programmed coordinates used for the etching. The bioprinted cells were able to sense and react to the etched features as demonstrated by their elongated orientation along the direction of the etched grooves.

This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

Hücre Yüzey Rehberlik ve Bioprinting için Otomatik Robotik Dağıtım Tekniği

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

3D Bioprinting&#39;i Kullanan Sferoidlerin Mekanik Entegrasyonu Sergileyen Kalp Doku Oluşturma

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting kıkırdak ve cilt doku analogları bir roman pasif birimi teknik Bioink Precellularization için karıştırma kullanmak

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Design of an Open-Source, Low-Cost Bioink and Food Melt Extrusion 3D Printer

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling costs. This increasing popularity is partly driven by falling barriers to entry such as system set-up costs and ease of operation. The following protocol presents the design and construction of an Additive Manufacturing Melt Extrusion (ADDME) 3D printer for the fabrication of custom parts and components. ADDME has been designed with a combination of 3D-printed, laser-cut, and online-sourced components. The protocol is arranged into easy-to-follow sections, with detailed diagrams and parts lists under the headings of framing, y-axis and bed, x-axis, extrusion, electronics, and software. The performance of ADDME is evaluated through extrusion testing and 3D printing of complex objects using viscous cream, chocolate, and Pluronic F-127 (a model for bioinks). The results indicate that ADDME is a capable platform for the fabrication of materials and constructs for use in a wide range of industries. The combination of detailed diagrams and video content facilitates access to low-cost, easy-to-operate equipment for individuals interested in 3D printing of complex objects from a wide range of materials.

The aim of this work is to design and construct a reservoir-based melt extrusion three-dimensional printer made from open-source and low-cost components for applications in the biomedical and food printing industries.

Bir Açık Kaynak Tasarımı, Düşük Maliyetli Bioink ve Gıda Melt Extrusion 3D Yazıcı

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

3D Hücre Yüklü Pankreas Dokusu Yapıları Baskı için Pankreas Doku Türetilmiş Ekstrasellüler Matrix Bioink

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed from mammal collagen. Thus, the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequences and target motifs of matrix metalloproteinase (MMP) remain on the molecular chains, which help achieve cell attachment and degradation. Furthermore, formation properties of GelMA are versatile. The methacrylamide groups allow a material to become rapidly crosslinked under light irradiation in the presence of a photoinitiator. Therefore, it makes great sense to establish suitable methods for synthesizing three-dimensional (3D) structures with this promising material. However, its low viscosity restricts GelMA's printability. Presented here are methods to carry out 3D bioprinting of GelMA hydrogels, namely the fabrication of GelMA microspheres, GelMA fibers, GelMA complex structures, and GelMA-based microfluidic chips. The resulting structures and biocompatibility of the materials as well as the printing methods are discussed. It is believed that this protocol may serve as a bridge between previously applied biomaterials and GelMA as well as contribute to the establishment of GelMA-based 3D architectures for biomedical applications.

Presented here is a method for the 3D bioprinting of gelatin methacryloyl.

Jelatin Metacryloyl Hidrojel Bazlı Bioinks 3D Biyobaskı Protokolleri

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by shear stress and improve the survival of the encapsulated cells. However, rapid gravity-driven cell sedimentation in the reservoir could lead to an inhomogeneous cell distribution in bioprinted structures and therefore hinder the application of liquid-like bioinks. Here, we developed a novel multilayered modified strategy for liquid-like bioinks (e.g., gelatin methacryloyl with low viscosity) to prevent the sedimentation of encapsulated cells. Multiple liquid interfaces were manipulated in the multilayered bioink to provide interfacial retention. Consequently, the cell sedimentation action going across adjacent layers in the multilayered system was retarded in the bioink reservoir. It was found that the interfacial retention was much higher than the sedimental pull of cells, demonstrating a critical role of the interfacial retention in preventing cell sedimentation and promoting a more homogeneous dispersion of cells in the multilayered bioink.

Here, we developed a novel multilayered modified strategy for liquid-like bioinks (gelatin methacryloyl with low viscosity) to prevent the sedimentation of encapsulated cells.

Homojen Hücre Dağılımı için Üç Boyutlu Biyobaskıda Çok Katmanlı Hidrojel Bioink'in Kullanılması

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by ...