Os autores agradecem o financiamento pela Agência de Redução de defesa contra ameaças (DTRA) sob Space and Naval Warfare Center Sistemas Pacífico (SSC Pacífico) Contrato nº N6601-13-C-2027. A publicação deste material não constitui uma aprovação pelo governo dos achados ou conclusões aqui.

1. Formulações de hidrogel Bioink e Preparação <ol><li> A fim de proporcionar perfis bioquímicos específicos do tecido, preparar-tecido específico ECM digerir soluções como previamente descrito para o fígado. 20 Nota: Em geral, este ECM Digest irá compreender 40% do volume bioink hidrogel final que é empregue. Várias centenas de mililitros de solução de ECM digestão pode ser preparado, aliquotas, e congelado a -80 ° C para uso futuro. </li><li> Antes da formulação de hidrogel, dissolver um fotoiniciador, 2-hidroxi-4 &#39;- (2-hidroxietoxi) -2-metilpropiofenona, em água a 0,1% w / v. NOTA: Os volumes no intervalo de 50-100 ml pode ser preparado com antecedência e guardadas protegida da luz a 4 ° C durante vários meses. </li><li> Para formar bioinks hidrogel, dissolver primeiro os componentes de material de base a partir do ácido hialurónico (HA), kits de hidrogel na solução de água-fotoiniciador. <ol><li> Dissolver a gelatina tiolada HA e tiolado separadamente em água-psolução hotoinitiator (passo 1.2) para fazer 2% w / v soluções. </li><li> Dissolve-se diacrilato de polietileno glicol (PEGDA), o agente de reticulação nos kits de hidrogel, em solução de água-fotoiniciador (passo 1.2) para fazer uma solução a 8% w / v. </li><li> Dissolve-se polietileno glicol (PEG) de 8 braços alcino (10 kDa MW) em solução de água-fotoiniciador (passo 1.2) para fazer uma solução a 8% w / v. </li></ol></li><li> Em geral, formam hidrogeles utilizando o seguinte esquema, embora personalização adicional é possível. <ol><li> Combine 4 partes de 2% tiolados HA, 4 partes de 2% de gelatina tiolado, 1 parte de agente de reticulação 1, 1 parte de agente de ligação cruzada 2 com 8 partes de solução ECM tecidos e 2 partes de meios de cultura de hepatócitos (HCM) (ou 10 partes de água como um não-tecido genérico hidrogel especï¿½ico). Nota: adicional de HA não modificada ou gelatina podem ser adicionados para fazer a extrusão bioink mais suavemente. Isto é descrito abaixo. </li></ol></li><li> Vortex-se a mistura resultante em alta (velocidade 10 de 10) durante 10 segundos para misturar antes de usar. &lt;/ Li&gt; <li> Uso de hidrogel bioink <ol><li> Para extrusão ou ensaios bioprinting, transferir a mistura em um cartucho de seringa ou impressora e permitir que a ligação cruzada de forma espontânea, durante 30 minutos (etapa 1 de reticulação) a 37 ° C. </li><li> Para medições reológicas, transferir a mistura numa placa de Petri de 35 milímetros e permitir que ele para reticular durante 30 min. Nota: A mistura imediatamente começa a reticular por meio de formação da ligação tiol-acrilato e começará a aumentar em viscosidade. A mistura deve ser transferido para uma seringa, cartucho de impressão, ou local alvo dentro de 10 minutos para evitar o entupimento de uma pipeta ou uma seringa durante a transferência. </li><li> Quando é desejada reticulação secundária (fase 2), a fase de irradiar um geles reticulados com luz ultravioleta (365 nm, 18 W / cm2) para se iniciar uma reacção de polimerização tiol-alcino. Nota: A duração da irradiação é dependente da área da superfície do material. Em geral, um centímetro quadrado de material requer apenas 1-2 segundos de exposição de UV a esta fonte de UV. </li></ol></li></ol> Teste de Compatibilidade 2. Printer <ol><li> Antes de testes de integração com dispositivos bioprinting, características de teste de extrusão sobre a bancada de laboratório com testes de extrusão simples usando seringas padrão e pontas de agulha de pequeno calibre (20-30 bitola). <ol><li> Empurre a bioink através de uma seringa padrão para alcançar filamentos suavemente extrudados de hidrogel com poucos ou sem solavancos. Extrusão de linhas ou padrões simples é suficiente para determinar o sucesso. </li></ol></li><li> Para a integração bioprinter, carregar bioink preparações pipetando-los em cartuchos de impressora, e permitir 30 min para o bioink se submeter espontânea estágio 1 de reticulação dentro do cartucho. Nota: O volume de bioink depende da aplicação específica e deve ser determinada pelo utilizador. Cartuchos de impressora podem assemelhar-se ou ser seringas que são compatíveis com o dispositivo bioprinter. </li><li> Avaliar a compatibilidade de extrusãopara bioprinting imprimindo um padrão simples usando o bioink. Por exemplo, imprimir um padrão de 7 x 7 milímetros composta de linhas paralelas. Aplicar pressão (pressão pneumática por exemplo, 20 kPa), enquanto a cabeça de impressão se desloca no plano XY a uma velocidade de cerca de 300 mm / min. Nota: os diâmetros de bicos da cabeça de impressão de diferentes tamanhos podem ser usados, mas os bicos cónicos com aberturas de 400-500 um de diâmetro são óptimas para a impressão de esferóides no intervalo de 250-350 um. <ol><li> Se os materiais extrudados são irregulares ou irregulares, consulte o passo 2.4, ou reduzir a quantidade de PEGDA para amolecer o material reticulado estágio 1. formulações bioink devidamente preparados expulsar sem problemas, permitindo a deposição precisa em padrões ou arquiteturas desejados. Nota: Os procedimentos bioprinting uso descrito um costume 3-D dispositivo bioprinting projetado em casa especificamente para o tecido construir a impressão 32 Como tal, os parâmetros de impressão específicas variam drasticamente para cada tipo de dispositivo e requerem testin.g pelo utilizador. </li></ol></li><li> Para melhorar as propriedades de extrusão, complementar não modificada HA e gelatina para os bioinks (1,5 mg / ml e 30 mg / ml, respectivamente). </li></ol> 3. Validação por bioprinting com construções de fígado primário <ol><li> Prepare 3-D esferóides fígado célula primária por enforcamento métodos de queda como o componente celular 33 Nota: bioprinting pode ser realizada sem esferóides, mas em vez disso com as células individuais em suspensão nas bioinks hidrogel bem. Os esferóides são empregues aqui para acelerar as interacções célula-célula e construir funcionalidade. O número de esferóides ou células empregues depende da aplicação específica e deve ser determinada pelo utilizador. Estes passos devem ser realizados sob condições estéreis, utilizando fontes estéreis. <ol><li> Prepare HCM, adicionando o conteúdo descongelados do kit de componentes suplemento HCM para a mídia de hepatócitos basal (HBM) e filtragem estéril. <ol><li> Descongelar o componentes do suplemento until líquido. </li><li> Adicionar os componentes do suplemento (ácido ascórbico, 0,5 ml; albumina de soro bovino [ácido gordo livre], 10 ml; gentamicina / sulfato de anfotericina B, 0,5 ml; hidrocortisona 21-hemissuccinato, 0,5 ml; insulina, 0,5 ml; factor de crescimento epidérmico humano recombinante , 0,5 ml; transferindo, 0,5 mL) à 500 ml HBM. </li><li> Filtrar em condições estéreis através de um ou de 0,45 um filtro de 0,22 uM utilizando uma unidade de filtro de topo de garrafa ou de um filtro de ponta de seringa. </li></ol></li><li> Determinar a densidade celular de hepatócitos humanos primários, células de Kupffer e células estreladas por contagem em um hemocitómetro após cada tipo de célula foi descongelado de acordo com as instruções dos fabricantes. </li><li> Combinar hepatócitos humanos primários, células de Kupffer e células estreladas numa razão 80:10:10 pelo número de células em meios de CMH, que foi aquecido a 37 ° C num tubo cónico. Nota: O volume do material a ser usado depende do número total da célula específica para a aplicação e deve ser determinada por The usuário. </li><li> Centrifugar a suspensão de células durante 5 min a 520 xg a 20 ° C. </li><li> Aspirar o sobrenadante, deixando para trás o sedimento celular. </li><li> Ressuspender o sedimento de células em meio de HCM, para se obter uma suspensão de células contendo 1000 células por meios 40 ul. O volume total é dependente do número de esferóides a ser produzido. </li><li> Transferir a suspensão de células a placas de 96 poços gota formato de suspensão. Adicionar um total de cerca de 1000 células para cada poço na CMH e manter a 37 ° C, em 5% de CO 2 durante 3 dias, durante o qual esferóides multicelulares formam. </li><li> Recolhe esferóides fígado a partir do prato de gota suspensa usando um pipetador. Transfira para um tubo de 15 ml estéril. </li></ol></li><li> esferóides fígado Bioprint em bioink hidrogel específico do fígado <ol><li> Prepara-se uma formulação de fígado contendo ECM bioink hidrogel tal como descrito no Passo 1, utilizando 8% PEGDA e 8% de PEG com 8 braços alcino como agentes de reticulação. Use esta combinação para a sua capacidade em resulting em um hidrogel de perto no módulo de elasticidade ao corte de tecido do fígado nativo. </li><li> Deixe os esferóides se depositam no fundo do tubo cónico em que foram colocados no passo 3.1.7. Isso varia de acordo com o tamanho e densidade esferóide, mas geralmente ocorre dentro de 1-2 min. Remova toda a mídia com cuidado aspiração ou com uma pipeta. </li><li> Transferir o volume desejado de solução de hidrogel bioink preparada de fresco ao tubo cónico contendo os esferóides. Geralmente, é adequado um volume de 10% -25% maior do que o volume da construção 3-D a ser impresso. Cuidadosamente pipeta cima e para baixo para voltar a suspender os esferóides na solução de hidrogel bioink. Transferir para um cartucho bioprinter usando uma pipeta ou pipeta serológica. </li><li> No interior do cartucho de bioprinter, permitir que a solução submetida à primeira fase de reticulação (reacção tiol-acrilato) durante 30 min. Nota: Dependendo do tamanho do esferóide, o cartucho pode ter de ser rodado lentamente ou o conteúdo pode ter de ser misturada comuma espátula estéril para manter os esferóides distribuídos por todo o bioink durante a fase de uma reticulação. Isto é menos de uma necessidade para bioinks preparados com células em suspensão em vez de esferóides. Nota: Após a fase 1 de reticulação, os usuários têm uma janela de funcionamento de várias horas. No entanto, recomenda-se realizar o processo de bioprinting rapidamente para melhorar a viabilidade celular. </li><li> Após uma fase de reticulação, utilizar um dispositivo bioprinting para criar estruturas de hidrogel desejados contendo os esferóides hepáticos primários (ou outras células). Nota: Esta tecnologia proporciona um sistema para biofabricating uma ampla variedade de estruturas. Parâmetros tais como o volume total, o número de células ou esferóides, a geometria da estrutura de impresso, e o substrato sobre o qual são impressas as construções são altamente dependentes dos objectivos do utilizador. </li><li> Após a deposição para a configuração desejada, administrar luz UV durante 2-4 segundos para iniciar o mecanismo de reticulação secundária, estabilizando a constructs e aumento da rigidez para o nível desejado. Nota: A concentração de PEG-alcino, e, assim, a densidade global de reticulação final, controla principalmente a rigidez construção final. </li><li> Repetir o 3.2.4 e 3.2.5 passos, a fim de criar estruturas de várias camadas. </li></ol></li></ol>

Autores não têm nada a revelar.

Existem vários componentes que são essenciais para considerar quando se tenta biofabricate 3-D construções de tecido, para eventual utilização em humanos ou para aplicações de rastreio in vitro. Empregando os componentes celulares adequadas determina o fim funcionalidade potencial, enquanto o próprio dispositivo biofabrication determina a metodologia geral para atingir a construção final. O terceiro componente, o biomaterial, é igualmente importante, uma vez que serve duplo papel. Especificamente, o componente de biomaterial deve ser compatível tanto com o hardware biofabrication (isto é, bioprinters) e também suporta os componentes celulares biológicas potencialmente frágeis. Otimizando a esses requisitos pode ser difícil, como materiais bioprintable precisa cumprir vários parâmetros fundamentais: 1) possuem propriedades do produto químico apropriado, mecânicos, e temporais para facilitar a impressão eficiente e livre; 2) a viabilidade das células de suporte durante as fases de preparação e bioprinprocedimento ting; 3) e proporcionar um ambiente hospitaleiro que torna melhor a viabilidade celular e eventual função de construção de tecido após a bioprinting. Nós empregamos o sistema hidrogel bioink modular descrita na metodologia descrita aqui para atender a esses requisitos. Em primeiro lugar, através da incorporação de factores de crescimento, colagénio, glicosaminoglicanos, e elastinas derivados da ECM de um tipo de tecido particular, pode-se alcançar um perfil bioquímico que é uma reminiscência do tipo de tecido alvo. Em segundo lugar, através do emprego de 2 reacções de reticulação semelhantes, mas independentes que são capazes de conseguir um material extrudível mole, que é compatível com a maioria-extrusão com base, que pode ainda ser alterada com o segundo passo de reticulação para chegar a um material determinado módulo de elasticidade que corresponde a um alvo tecido de escolha. 34 A característica fundamental deste sistema que faz com que seja útil é a capacidade de suportar as reacções químicas múltiplas que pode ser aproveitada para manipular o polymecinética zação e propriedades mecânicas do sistema bioink. Com o emprego de 2 tipos de reacção independentes, tiol-acrilato e tiol-alcino, atingimos a capacidade de realizar uma reacção de tiol-acrilato de fase 1, que resulta num material que pode ser extrudido através de um dispositivo de seringa ou bioprinting, e um tiol fase dois -alkyne reacção, o que só é iniciada após exposição à radiação UV na presença de um fotoiniciador, o qual determina o módulo de elasticidade da construção bioprinted final. Estes múltiplos passos resultar num material bioprintable. Como tal, a fim de alcançar um bioink estável que suporta a extrusão e subsequente personalização módulo de elasticidade, mantendo estes tipos de reacção separados é importante. O sorteio principal a utilização do sistema para biofabrication é a sua facilidade para a personalização, que é feita quer através da manipulação do módulo de elasticidade final por meio do agente de reticulação secundária, ou através da inclusão de diferentes materiais ECM derivadas de tecido<html> ou cocktails de factores de crescimento. O ECM em tecidos contém uma variedade de factores de crescimento e outras citoquinas, que muitas vezes variam em geral de distribuição entre tipos de tecidos. Acreditamos que estes factores são essenciais para a manutenção da função de certos tipos de células, tais como hepatócitos humanos primários. A implementação deste conceito foi demonstrado anteriormente para aumentar a viabilidade e função de hepatócitos primários humanos em culturas sanduíche ácido hialurônico heparinizados. 20 Através da combinação de cadeias de heparina no hidrogel com factores de crescimento de ligação à heparina, bem como outros componentes da MEC de ECM fígado, pudemos para apresentar este perfil bioquímico específico do fígado para hepatócitos humanos primários, mantendo a viabilidade e função in vitro durante um período de tempo prolongado. Esta abordagem pode ser facilmente estendido para outros tipos de tecidos, permitindo que os investigadores para alcançar recapitulação desses fatores específicos de tecidos por descelularizante e solubilização de outros tecidos. tenda &quot;&gt; Os usuários devem estar cientes de que, enquanto os componentes de base deste sistema bioink têm sido implementadas em bioprinting anteriormente, 10,12,17 mas, abordagens específicas de tecidos menos nuances, bem como uma variedade de outras aplicações de medicina regenerativa, 35- 45 biofabrication não tem sido tentada para todos os tipos de tecidos. assim sendo, pode haver algum desenvolvimento adicional e solução de problemas necessária, a fim de criar tais construções de tecido adicionais. no entanto, um sistema modular tal como o aqui descrito pode muito bem ser adaptável. Outro potencial limitações incluem afinidades naturais que alguns tipos de células possa ter para biomateriais específicas. Em geral, verificou-se que os hialurónico componentes de base de ácido, com base em PEG gelatina, e deste suporte de sistema hidrogel culturas viáveis ​​de uma ampla variedade de tipos de células, mas há pode haver alguns tipos de células que apresentam melhor desempenho em ambientes de engenharia de diferentes composições, tais como o colagénio, que tem uma inerente fibroso ndtura, ou elastina, que é, por natureza, mais elástica. Como tal, a consideração para o material ideal para um determinado tipo de tecido e aplicação final é importante, e o sistema de hidrogel bioink descrito aqui pode não ser adequada para todos os usos. Além disso, é importante considerar as condições ambientais sob as quais bioprinting é realizada. Durante o desenvolvimento deste protocolo, a transição do ambiente próximo (temperatura ambiente) condições usando bioinks sem qualquer meio de comunicação celular, que levam a pouca viabilidade se o tempo de preparação e impressão foi muito prolongado, protocolos a mais rápidos com menos de 37 ° C usando bioinks com um componente de meios de comunicação, o que aumentou dramaticamente a viabilidade celular. Até recentemente, alguns materiais ou sistemas materiais foram desenvolvidos especificamente para a interface com sistemas bioprinting. Como resultado, a maioria dos materiais são simplistas, aproveitando, quer as suas características biológicas para suportar as células, ou, a sua compatibilidade com biofabricationhardware. Alguns materiais são ideais em ambos os reinos. O sistema descrito nesta metodologia desacopla estas características, permitindo assim personalização de caracterização biológica, facilitando ao mesmo tempo as propriedades mecânicas necessárias para bioprinting extrusão. Uma distinção adicional deste sistema hidrogel bioink é que ele pode imitar ambos os parâmetros bioquímicos e físicos dos tecidos alvo é utilizado para biofabricating. Isto suporta um impressionante nível de flexibilidade, permitindo recapitulação dos factores bioquímicos de quase qualquer tecido, bem como correspondentes do módulo de elasticidade de qualquer tecido mole. A atenção aos estes dois aspectos de um tecido raramente têm sido exploradas em tandem. A natureza modular do presente tecnologia proporciona uma flexibilidade de ser implementado numa vasta variedade de aplicações. A capacidade de imitar vários tipos de tecidos fornece a capacidade de biofabricate não apenas construções do fígado usados ​​como exemplo neste trabalho, mas conestruturas representativas de muitos dos outros tecidos do corpo. Talvez a mais óbvia ampla aplicação utilizando estes parâmetros, é a capacidade de combinar ambos os aspectos para um tecido particular, para optimizar a função final de construções de engenharia para aplicações reais, tais como implantes ou de drogas e rastreio de toxicologia. Enquanto geração de tecidos de tamanho humano para implante em pacientes é o objetivo final para muitos pesquisadores, devido a obstáculos regulatórios, de abastecimento de células e limitações sobre a capacidade de fabricar vasculatura funcional em engenharia de tecidos de órgãos, este objetivo elevado requer um aprofundamento e hora a ser realizado. No entanto, as tecnologias, tais como a metodologia descrita aqui está começando a ser implementada para gerar &quot;Organóides&quot; para plataformas in vitro. A nossa equipa, bem como os outros, está utilizando atualmente organï¿½de biofabrication para criar sistemas modelo em que estudos toxicológicos são realizados. Além disso, tais Organóides pode ser empregue paraestudar patologias e progressão da doença, como o câncer, 46 e testar potenciais tratamentos terapêuticos. Por último, este sistema também suporta um outro uso importante. Ao manipular esses parâmetros de forma independente, os pesquisadores podem realizar experimentos de ciência básica para determinar a importância relativa de bioquímica em relação aos factores mecânicos.

Nos últimos anos, uma grande variedade de tecnologias tornaram-se disponíveis, que aborda a necessidade de fontes alternativas de órgãos e tecidos funcionais através pretende fabricar, ou biofabricate, eles. Bioprinting emergiu como um dos mais promissores destas tecnologias. Bioprinting pode ser pensado como uma forma de fabrico aditivo robótico de partes biológicas, que podem ser usados ​​para construir ou de padrão viável estruturas de órgãos ou de tipo de tecido, como em 3 dimensões. 1 Na maior parte dos casos, bioprinting emprega um 3-dimensional (3 D) do dispositivo de impressão que é dirigido por um computador para depositar as células e biomateriais em posições precisas, recapitulando assim anatomicamente-imitando arquitecturas fisiológicas. 2 Estes dispositivos de impressão de um &quot;bioink&quot;, que podem assumir a forma de agregados de células, as células encapsuladas em hidrogéis ou fluidos viscosos, ou microtransportadores de células-semeado, bem como polímeros isentos de células que fornecem a estrutura mecânica ou agir como PLA isento de célulasceholders. 3,4 Na sequência do processo bioprinting, a estrutura resultante pode ser amadurecido em tecidos ou órgãos estruturas funcionais, e utilizado para a sua aplicação final pretendida. 5,6 Até à data, um órgão de tamanho humano totalmente funcional completa não foi impressa, mas continua a ser o principal objetivo de longo prazo de bioprinting pesquisa e desenvolvimento. 2 no entanto, em pequena escala &quot;organï¿½de&quot; construções de tecido estão actualmente a ser implementado em uma série de aplicações, incluindo modelagem de patologia, desenvolvimento de medicamentos e rastreio de toxicologia. Um dos principais obstáculos que os pesquisadores têm encontrado na aplicação de tecnologia bioprinting é que muito poucos materiais foram desenvolvidos para o propósito explícito de bioprinting. Para ter sucesso efetivamente em bioprinting, um biomaterial deve cumprir 4 requisitos básicos. O biomaterial tem de ter: 1) as propriedades mecânicas apropriadas para permitir a deposição (seja extrusão através de um bocal como um gel ou um inkjet como uma gota), 2) a capacidade de manter a sua forma como um componente de uma estrutura 3-D após a deposição, 3) a capacidade de controle do usuário sobre os 2 características anteriores, e 4) ambiente amigável e de suporte de uma célula em tudo as fases do processo bioprinting. 7 Historicamente, bioprinting trabalho tem muitas vezes tentou empregar biomateriais tradicionais existentes em dispositivos bioprinting sem consideração a sua compatibilidade, em vez de projetar um biomaterial para ter as propriedades necessárias para bioprinting e aplicações pós-impressão subseqüentes. Uma variedade de bioinks têm sido desenvolvidas recentemente para melhor interface com o equipamento de fabricação e deposição. sistemas de hidrogel padrão representar problemas significativos porque geralmente existem como um ou outro precursor de soluções de fluidos com propriedades mecânicas insuficientes, ou hidrogéis polimerizados que se impressos podem entupir bicos ou tornar-se dividido sobre o processo de extrusão. A nossa equipa, bem como others, têm explorado várias formulações de hidrogel para resolver estes problemas bioprinting, incluindo impressão esferóide célula em substratos de hidrogel, 5,8 celular e filamentos de hidrogel de extrusão de tubos microcapilares, 9-11 extrudable ácido hialurônico (AH) hidrogéis de nanopartículas -Gold com propriedades de reticulação dinâmicos , 12 controlo temporal da rigidez hidrogel utilizando fotopolimerizável metacrilado HA e gelatina, 13 de reticulação à base de fibrinogênio-trombina, 14,15 géis de alginato-colágeno troca iônica, 16 e recentemente rápida polimerização por luz ultravioleta (UV) reticulação -initiated, 17 Estes exemplos demonstram a viabilidade de materiais que geram que pode por bioprinted eficazmente. No entanto, para além de integração com o hardware, com sucesso para gerar construções de tecido 3-D viáveis ​​e funcionais, biomateriais deve conter sinais bioquímicos e mecânicos que ajuda na manutenção celularviabilidade e função. Estes factores adicionais, perfis bioquímicos e mecânicos, pode ter uma influência significativa sobre a função bem sucedida de construções de tecido bioprinted. Ambas as células e a matriz extracelular nativa (ECM) são responsáveis ​​por apresentar uma vasta gama de moléculas de sinalização, tais como factores de crescimento e outras citoquinas a outras células. A combinação destes sinais varia de tecido para tecido, mas pode ser extremamente potente e influente na regulação do comportamento celular e tecidual. 18 Empregando componentes ECM específicos de tecidos a partir de diferentes órgãos e execução como um hidrogel ou como parte de um hidrogel tem sido explorada com sucesso. 19-21 Esta abordagem, que é composta de descelularizante um dado tecido, pulverizando-o, e dissolvendo-o, pode ser utilizado para produzir sinais bioquímicos específicos de tecido a partir de qualquer tecido e pode ser incorporada em 3-D construções de hidrogel 22. Além disso,é amplamente documentado que os tecidos do corpo ocupam uma grande variedade de rigidezes 23 como tal., a capacidade para sintonizar as propriedades mecânicas de biomateriais, tais como o módulo de elasticidade E &#39;ou módulo de cisalhamento G elástica&#39;, é uma ferramenta útil em engenharia de tecidos . Como descrito acima, o controlo de propriedades mecânicas bioink permite biofabrication à base de extrusão usando um gel suave, o que pode, em seguida, ainda manipulado por reticulação secundário, a um ponto mais tarde, altura em que os níveis do módulo de elasticidade pode ser alcançada que coincidir com o tipo de órgão-alvo. Por exemplo, biomateriais pode ser personalizado para corresponder a uma rigidez de 5-10 kPa como um fígado nativo, 23, ou coincidir com uma rigidez de 10-15 kPa como o tecido cardíaco nativo, 24,25, em teoria, aumentar a capacidade destes para funcionar em Organóides um modo semelhante aos seus homólogos tecido nativo. A influência da rigidez do ambiente no fenótipo da célula tem sido explored nos últimos anos, particularmente em relação às células-tronco. Engler et ai. Demonstrou que a elasticidade do substrato auxiliado na condução células estaminais mesenquimais (MSC) no sentido de linhagens com a elasticidade do tecido correspondente ao do substrato. 25 Este conceito tem sido explorada para a diferenciação no músculo, a função cardíaca, fenótipo hepática, a proliferação de células-tronco hematopoiéticas e manutenção do potencial terapêutico das células estaminais. 24,26-29 ser capaz de sintonizar um hidrogel de diferentes módulos de elasticidade é uma característica importante de um biomaterial que vai ser utilizado para biofabricate construções de tecido 30. Descrevemos aqui um protocolo que representa uma abordagem versátil utilizado no nosso laboratório para formular um sistema de hidrogel que pode ser de extrusão bioprinted e personalizado para 1) contêm o perfil bioquímico de um tipo de tecido particular, e 2) imitar o módulo de elasticidade desse tipo de tecido . Ao abordar esses requisitos, pretendemos provide um material que pode recapitular as características físico-químicas e biológicas do tecido in vivo. 31 O sistema composto hidrogel modular aqui descrito tira vantagem de uma abordagem de reticulação multi-para se obter bioinks extrudiveis, e permite uma reticulação secundária para estabilizar e aumenta a rigidez da produtos finais para corresponder a uma gama de tipos de tecidos. personalização bioquímica é cumprida usando componentes da matriz extracelular de tecidos específicos. Como uma demonstração, nós empregamos uma variedade específica de fígado deste sistema hidrogel para bioprint fígado funcional construções organï¿½de. O protocolo descrito usa um personalizado 3-D dispositivo bioprinting. Em geral, este protocolo pode ser adaptado para a maioria das impressoras de extrusão, os parâmetros de impressão específicas variar drasticamente para cada tipo de dispositivo e exigir testes pelo utilizador.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="903">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hyaluronic acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">53747</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Gelatin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G6144</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">410896</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:340px;">Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP)</td>
			<td style="width:108px;">ESI-BIO</td>
			<td style="width:119px;">GS315</td>
			<td style="width:336px;">Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa</td>
			<td style="width:108px;">Creative PEGWorks</td>
			<td>PSB-887</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Primary human hepatocytes</td>
			<td style="width:108px;">Triangle Research Labs</td>
			<td>HUCPM6</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Primary human liver stellate cells</td>
			<td style="width:108px;">ScienCell</td>
			<td style="width:119px;">5300</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Primary human Kupffer cells</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">HUKCCS</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hepatocyte Basal Media (HBM)</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3199</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:340px;">Hepatocyte Media Supplement Kit</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3198</td>
			<td style="width:336px;">HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5mL; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 mL; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5mL; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 mL; insulin, 0.5 mL; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 mL; transferring, 0.5 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td style="width:336px;">Other manufacturers are ok.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Ammonium hydroxide</td>
			<td style="width:108px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A669</td>
			<td style="width:336px;">Other manufacturers are ok.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Fresh porcine cadaver tissue</td>
			<td style="width:108px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Lyophilizer</td>
			<td style="width:108px;">any</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Freezer mill</td>
			<td style="width:108px;">any</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:340px;">Bioprinter</td>
			<td style="width:108px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;">The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hanging drop cell culture plate</td>
			<td style="width:108px;">InSphero</td>
			<td>CS-06-001</td>
			<td style="width:336px;">InSphero GravityPlus 3D Culture Platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

Quando os processos acima descritos são seguidos correctamente, hidrogeles devem conter um perfil bioquímico específico para o tipo de tecido alvo, 20 para permitir um elevado grau de controlo sobre bioprinting e módulo de elasticidade final, e 34 suportam células viáveis ​​funcionais em construções de tecido. hidrogel Personalização Para melhor fígado nativo mímico, o bioink hidrogel foi completada por soluções de ECM do fígado e de uma matriz de factor de crescimento, 20 soluções de ECM conter uma ampla variedade de factores de crescimento e citocinas (apresentados em pg / mL, Figura 1A). Estes incluem o factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), o bFGF, a proteína morfogenética óssea 5 (BMP-5), FGF-4, proteínas de ligação ao factor de crescimento semelhante a insulina 2 (IGFBP-2), TGF-B1, BMP-7, EGF , o FGF-7, hormona de crescimento (GH), factor de crescimento semelhante a EGF de ligação a heparina (HB-EGF), o HGF e neurotrophin 3 (NT-3). Além disso, as soluções de ECM conter componentes estruturais adicionais, que são analisados ​​por meio de ensaios colorimétricos. 20 Para soluções de ECM fígado, teor total de colagénio de soluções de ECM hepáticas foi 91,33 ± 0,58 mg / ml, o teor de elastina era 189,33 ± 48,40 mg / ml, e o glicosaminoglicano conteúdo (GAG) foi 86,00 ± 53,45 mg / ml (Figura 1B). Hidrogel bioink propriedades mecânicas pode ser caracterizada usando um teste de tensão de cisalhamento de varredura (0,6-10 Pa, freqüência de oscilação 1 Hz) na rheometer. 10,12,13,34 Ao permitir espontânea estágio 1 tiol-acrilato de química para ocorrer em pH neutro, um hidrogel macio com um G &#39;de 113,66 ± 22,59 Pa é formado. Após o início da fase 2 de reticulação tiol-alcino por fotopolimerização UV, aumenta G &#39;para cerca de 10 kPa (10.637 ± 113,83 Pa, Figure 1C), imitando fígado elasticidade do tecido. A manipulação adicional das concentrações, pesos moleculares, e geometrias de agentes de reticulação pode atingir uma ampla gama de valores de fase 2 g »34. Qualidade de hidrogel bioprinted Estratégia química e execução de fase 1 e fase 2 reticulação das bioinks hidrogel é descrito na Figura 2. Em geral, os agentes de ligação cruzada tais como Extralink, que são baseadas em polímeros de PEG acrilados, reagem espontaneamente com grupos tiol sobre a HA e cadeias de gelatina com neutro pH (fase 1) em presença de células de modo a formar um hidrogel macio extrudível. Este hidrogel macia pode ser bioprinted como um bioink, após o que a luz UV é usada para iniciar a fotopolimerização de tióis não reagidos e os agentes de reticulação secundária à base de polímeros de PEG modificados com alcino. Os pesos moleculares específicos e geometrias dos reticuladores irvern a rigidez final da construção bioprinted. Um padrão mm x 7 7 foi aplicado para fins de teste (Figura 3A). Os testes iniciais mostraram que as formulações iniciais eram extrudível, mas apareceu irregular e agregada durante e após a extrusão (Figura 3B). Para melhorar as propriedades de extrusão, não modificado e gelatina HA foi completado para os bioinks (1,5 mg / ml e 30 mg / ml). A melhoria da estrutura lisa impresso é mostrado na Figura 3C. A viabilidade e função básica de constructos de fígado humano primárias bioprinted Usando o 3-D bioprinter o bioink hidrogel específico do fígado bioactivo foi utilizado para encapsular e depositar esferóides de fígado humano, primárias, previamente preparadas suspendendo culturas gota, em lamelas de plástico. Sendo impresso em lamelas de plástico permitidos para manuseamento e transferência robusta a uma variedade de ambientes de cultura de células. Após bioprinting, oia viabilidade celular GH nos constructos de fígado foi observada após a coloração de viabilidade INOPERANTE Live / / citotoxicidade e microscopia confocal (Figura 4A). Sob condições ambientais ótimas viabilidade deve estar acima de 85%. hepatócitos primários humanos são geralmente considerados sensíveis a tensões mecânicas e químicas, o que exigiu alguma otimização de variáveis ​​ambientais. Seguindo bioprinting e verificação de viabilidade, constructos de fígado adicionais que são colocados em cultura pode ser avaliada para a funcionalidade analisando materiais removidos alíquotas no dia 3, dia 7, dia 10, e dia 14 para análise da ureia e albumina segregada. Os ensaios de ureia colorimétrico revelam um nível relativamente consistente de secreção de ureia a partir dos construtos fígado ao longo do curso de tempo de 14 dias, mantendo-se entre 15 e 20 ng / ml (Figura 4B). níveis de ureia detectados não foram significativamente diferentes um do outro no momento diferentepontos. O ensaio ELISA de Albumina Humana revela que a produção de albumina a partir dos construtos também permanece relativamente consistente ao longo do tempo, mantendo-se estável entre 125 e 140 ng / ml (Figura 4C). Além disso, quando corados para marcadores indicativos de tecido do fígado, a expressão positiva de albumina intracelular, CYP3A4 (a isoforma do citocromo P450 envolvidas no metabolismo), a E-caderina (a proteína de adesão célula-célula epitelial), e inibidores da dipeptidil peptidase-4 (uma proteína expressa altamente no fígado) são observados (Figura 4D-F). Tomados em conjunto, esta viabilidade e dados funcionais sugerem que os auxiliares de hidrogel bioink específicos de tecidos na manutenção da viabilidade e função do fígado construções baseadas em células primárias bioprinted. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53606/53606fig1.jpg" /> Figura 1. Hidrogel componente caracterização e avaliação da rigidez. A) fator de crescimento eanálise de citocinas por proteómica matrizes de soluções ECM preparados a partir de fígado. B) quantificação ensaio colorimétrico de colágeno, glicosaminoglicanos, e conteúdo de elastina em soluções ECM fígado. C) Demonstração da capacidade de controlar a rigidez bioink. Após uma fase de reticulação, o gel é relativamente macio e capaz de ser extrudido sem problemas. Depois de fase 2 de reticulação por luz UV, do módulo de elasticidade aumenta em mais de uma ordem de magnitude, imitando tecido hepático módulo de elasticidade. As barras de erro indicam o desvio padrão. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53606/53606fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53606/53606fig2.jpg" /> Figura 2. Empregando vários agentes de reticulação à base de PEG para bioprinting extrusão e controle sobre o tecido construir propriedades mecânicas. SESTRATÉGIA de formulação de bioinks imprimíveis constituídos por agentes de ligação cruzada à base de acrilato (reticulante 1), agentes de reticulação à base de alcino (reticulante 2), tiolada HA, gelatina tiolada, materiais ECM tecido, e não modificado HA e gelatina. A formulação é preparada bioink espontaneamente e reticula-tiol através de acrilato de ligação, resultando em um material macio, susceptível de ser extrudida. Bioprinting é realizada. Por último, as camadas são fundidas bioprinted, estabilizada, e trazido para o módulo de elasticidade do fígado. Este processo pode ser repetido para gerar estruturas multi-camadas. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53606/53606fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53606/53606fig3.jpg" /> Figura 3. testes bioprinting de bioinks. A) A mm padrão de enrolamento 7 x 7 foi utilizado para o teste de extrusão bioinking no bioprinter. B) A formulação inicial de um PEGDA e 8-braço PEG bioink alcino resultou na deposição irregular. C) Adição de matéria-HA e gelatina melhorou extrusão, resultando em bom extrusão do bioink. Barra de escala -. 1 milímetro <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53606/53606fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53606/53606fig4.jpg" /> Figura 4. Demonstração da viabilidade e função de esferóides fígado bioprinted na bioink hidrogel específico do fígado. A) Implementação do bioink fígado para bioprinting, resultou em construções de alta viabilidade. Verde - calceína AM-coradas células viáveis; Vermelho - células mortas Ethidium homodímero-manchado B) ureia e C) de albumina segregada por construções do fígado mais de 14 d.ays em cultura, quantificados por ensaios colorimétricos e ELISA, respectivamente. As barras de erro indicam o desvio padrão. A imunocoloração dos marcadores associados com tecido de fígado: D) CYP3A4, E) albumina intracelular, e DPP4 F) e E-caderina. Verde ou vermelho - indicou mancha; Blue -. DAPI <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53606/53606fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink at JoVE.com

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting celularizado Constrói Usando um específico do tecido Hidrogel Bioink

Nós descrevemos um conjunto de protocolos que, juntos, oferecem uma bioink hidrogel que imita o tecido com o qual construções de tecido 3-D funcionais e viáveis ​​podem ser bioprinted para uso em aplicações in vitro de rastreio.

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

bioprinting-cellularized-constructs-using-tissue-specific-hydrogel

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.6K visualizações.  Wake Forest Univeristy Health Sciences.  Nós descrevemos um conjunto de protocolos que, juntos, oferecem uma bioink hidrogel que imita o tecido com o qual construções de tecido 3-D funcionais e viáveis ​​podem ser bioprinted para uso em aplicações in vitro de rastreio. 

Vídeo: Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of this hydrogel are two protein block-copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. A highly hydrophilic random coil is inserted into one of the block-copolymers for water retention. Mixing of the two protein block copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit with crosslinkers at either end that rapidly self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is very stable under both acidic and basic conditions, at temperatures up to 50 &#176;C, and in organic solvents. The hydrogel rapidly reforms after shear-induced rupture. Incorporation of a &#34;docking station peptide&#34; into the hydrogel building block enables convenient incorporation of &#34;docking protein&#34;-tagged target proteins. The hydrogel is compatible with tissue culture growth media, supports the diffusion of 20 kDa molecules, and enables the immobilization of bioactive globular proteins. The application of the intein-mediated protein hydrogel as an organic-solvent-compatible biocatalyst was demonstrated by encapsulating the horseradish peroxidase enzyme and corroborating its activity.

We present the synthesis of a split-intein-mediated protein hydrogel. The building blocks of this hydrogel are two protein copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. Mixing of the two protein copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit that self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is highly pH- and temperature-stable, compatible with organic solvents, and easily incorporates functional globular proteins.

Síntese de uma proteína artificial intein mediada Hidrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Bioengenharia

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engenharia 3D celularizados Colágeno Gel para Vascular Regeneração Tecidual

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

Viabilidade de Bioprinted celulares Construções Usando uma impressora cartesiano Dispenser Três

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using an automated robotic dispensing system. The particular bioink was selected as it allows cells to sediment towards and sense the features. The dispensing system bioprints viable cells in hydrogel bioinks using a backpressure assisted print head. However, by replacing the print head with a sharpened stylus or scalpel, the dispensing system can also be employed to create topographical cues through surface etching. The stylus movement can be programmed in steps of 10 &#181;m in the X, Y and Z directions. The patterned grooves were able to orientate mesenchymal stem cells, influencing them to adopt an elongated morphology in alignment with the grooves&#39; direction. The patterning could be designed using plotting software in straight lines, concentric circles, and sinusoidal waves. In a subsequent procedure, fibroblasts and mesenchymal stem cells were suspended in a 2% gelatin bioink, for bioprinting in a backpressure driven extrusion printhead. The cell bearing bioink was then printed using the same programmed coordinates used for the etching. The bioprinted cells were able to sense and react to the etched features as demonstrated by their elongated orientation along the direction of the etched grooves.

This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

Técnica Automated Robotic dispensação de Orientação da superfície e bioprinting de Células

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

Criação de tecido cardíaco exibindo integração mecânica de esferóides usando 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting da cartilagem e Analogs de tecido de pele utilizando um romance passiva unidade técnica de mistura para Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Design of an Open-Source, Low-Cost Bioink and Food Melt Extrusion 3D Printer

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling costs. This increasing popularity is partly driven by falling barriers to entry such as system set-up costs and ease of operation. The following protocol presents the design and construction of an Additive Manufacturing Melt Extrusion (ADDME) 3D printer for the fabrication of custom parts and components. ADDME has been designed with a combination of 3D-printed, laser-cut, and online-sourced components. The protocol is arranged into easy-to-follow sections, with detailed diagrams and parts lists under the headings of framing, y-axis and bed, x-axis, extrusion, electronics, and software. The performance of ADDME is evaluated through extrusion testing and 3D printing of complex objects using viscous cream, chocolate, and Pluronic F-127 (a model for bioinks). The results indicate that ADDME is a capable platform for the fabrication of materials and constructs for use in a wide range of industries. The combination of detailed diagrams and video content facilitates access to low-cost, easy-to-operate equipment for individuals interested in 3D printing of complex objects from a wide range of materials.

The aim of this work is to design and construct a reservoir-based melt extrusion three-dimensional printer made from open-source and low-cost components for applications in the biomedical and food printing industries.

Design de uma impressora 3D de origem aberta, bioink de baixo custo e derretimento de alimentos

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Bioink extracelular derivado da matriz de tecido sipâncreas para a impressão de construções de tecidopanpático 3D Carregadas de células

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed from mammal collagen. Thus, the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequences and target motifs of matrix metalloproteinase (MMP) remain on the molecular chains, which help achieve cell attachment and degradation. Furthermore, formation properties of GelMA are versatile. The methacrylamide groups allow a material to become rapidly crosslinked under light irradiation in the presence of a photoinitiator. Therefore, it makes great sense to establish suitable methods for synthesizing three-dimensional (3D) structures with this promising material. However, its low viscosity restricts GelMA's printability. Presented here are methods to carry out 3D bioprinting of GelMA hydrogels, namely the fabrication of GelMA microspheres, GelMA fibers, GelMA complex structures, and GelMA-based microfluidic chips. The resulting structures and biocompatibility of the materials as well as the printing methods are discussed. It is believed that this protocol may serve as a bridge between previously applied biomaterials and GelMA as well as contribute to the establishment of GelMA-based 3D architectures for biomedical applications.

Presented here is a method for the 3D bioprinting of gelatin methacryloyl.

Protocolos de bioimpressão 3D de bioinks baseados em hidrogel de gelatina

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by shear stress and improve the survival of the encapsulated cells. However, rapid gravity-driven cell sedimentation in the reservoir could lead to an inhomogeneous cell distribution in bioprinted structures and therefore hinder the application of liquid-like bioinks. Here, we developed a novel multilayered modified strategy for liquid-like bioinks (e.g., gelatin methacryloyl with low viscosity) to prevent the sedimentation of encapsulated cells. Multiple liquid interfaces were manipulated in the multilayered bioink to provide interfacial retention. Consequently, the cell sedimentation action going across adjacent layers in the multilayered system was retarded in the bioink reservoir. It was found that the interfacial retention was much higher than the sedimental pull of cells, demonstrating a critical role of the interfacial retention in preventing cell sedimentation and promoting a more homogeneous dispersion of cells in the multilayered bioink.

Here, we developed a novel multilayered modified strategy for liquid-like bioinks (gelatin methacryloyl with low viscosity) to prevent the sedimentation of encapsulated cells.

Usando bioink de hidrogel multicamadas em bioimpressão tridimensional para distribuição celular homogênea

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by ...