葉ラボは、米国癌協会の制度研究助成（IRG-97-219-14）国防総省の助成金から研究資金により、MUSCでHollingsがんセンターに授与（W81XWH-11-2-から研究資金によってサポートされています0229） MUSCで、と懸念（ESY）は財団から賞を受賞することによって。

プロトコルは、サウスカロライナ医科大学（MUSC）とその施設内動物管理使用委員会（IACUC）のガイドラインや動物のケアの標準に準拠しています。 1.肺解剖<ol><li>乳腺腫瘍解剖（オプションの研究の目標にし、原発腫瘍の解析または尾静脈注射が行われたかどうかによって異なります）。 <ol><li> IACUCと大学の規則に従ってイソフルラン麻酔の致死量を使用して、マウスを安楽死させます。外科的脱臼により安楽死を確認してください。 </li><li>発泡ボード、手足の広がりとその背中にマウスを置くことによって解剖ピンとピンの。 </li><li> 70％エタノールでマウスをスプレーします。 </li><li>ピンセットを使用して、中央の動物の下部をつかみ。 </li><li>はさみを使用して、マウスの腹腔に穴を開けないように注意しながら、皮膚を介して首に向かって上方にカット。 </li><li>腫瘍組織を明らかにするために手足の皮膚をカットバック。 </li><li>腫瘍組織とPRを解剖そのような（このプロトコルでさらに議論されていない）、さらなる分析のために凍結または固定、などの好適な方法によってESERVE。 </li></ol></li><li>肺組織切開。 <ol><li>前述のように腫瘍組織を採取した場合は、余分な皮膚を突き止めます。 </li><li>鉗子を使用して、動物の下端に腹膜をつかみ、首の付け根に向かって上向きに切断開始。 </li><li>慎重に胸腔内に出血する可能性のある血管を切断ないように注意しながら胸郭の左右両側に沿って切断。左と右胸郭の振動板と上部を切断することにより、肋骨の骨を削除します。 </li><li>鉗子を使用すると、マウスの気管をつかみ、前方に引き出します。 </li><li>解剖ハサミで気管を切断し、マウスから肺を削除します。 注意：心臓は肺に付着したままであってもよいです。この問題が発生した場合、慎重にすべての5つの葉を収集するように注意して肺から離れて心を解剖（ 図1を参照してください </stroNG&gt;）。 </li><li>過剰血液を除去するためにPBSで穏やかに洗浄します。 </li></ol></li><li>肺組織の肉眼評価。 <ol><li>オプション1：in vivoイメージング 。 <ol><li>ルシフェラーゼイメージング、撮像前に〜10分のために、動物に腹腔内（ip）注射によるルシフェリン150mgの/ kgの用量を与えます。麻酔した動物や解剖後の除去（ 図2）5時の生体内での画像の肺。 </li></ol></li><li>オプション2：総評価。 <ol><li>腫瘍結節を視覚化するために実体顕微鏡下肺を調べます。注意：細胞は、GFP標識されている場合は、GFPを検出する（510分の470 nm付近など ）、適切な励起/発光極大を有する光キューブを含むことが可能な蛍光実体は、処理の前に蛍光を立体的に肺を調べるために使用することができます。 </li></ol></li><li>肺は直ちに分析する場合は、「RNAの単離」セクションに進んでください。それ以外の場合は、liquを使用して凍結組織をスナップID窒素やドライアイス。 -80℃で保存してください。 </li></ol></li></ol> 2. RNAの単離注意：代表的な分析のために、RNAは、RNA単離キット（材料リストを参照）を用いて単離しました。現在の分析は、ある特定のメーカーの製品を使用していますが、単離キットの様々ないくつかの評判のベンダーから入手できます。さらに、非キットベースの遠心分離法も選択肢です。 cDNAを、標準曲線分析のために、そのような細胞株またはプラスミドとして、陽性対照RNAサンプルから調製されるべきです。あるいは、プライマープローブセットに特異的な陽性対照は、（材料のリストを参照）を購入することができます。 <ol><li>以前に凍結組織を使用する場合は、ドライアイス上で凍結組織を収集します。 </li><li>など、次の方法のいずれかを使用して組織をホモジナイズ：液体窒素中で組織を凍結した後、ドライアイスの上に手で行わ研削乳鉢と乳棒を。組織ホモジナイザーまたは機械的解離デバイスメーカーの提案につき、超音波処理、または他の好適な方法。 注意：代表的な分析のために、均質化の好ましい方法は、超音波処理です。 <ol><li> 図3に示す分析のために、溶解緩衝液の各1 mlのために20μlの2-メルカプトエタノールの割合で溶解（RNA単離キットで提供される）バッファ及び2-メルカプトエタノールを調製します。 30％の振幅に設定ソニケーターで10秒のための組織と超音波処理の各30グラムのために2-メルカプトエタノールを補充した300μlの溶解緩衝液中で再懸濁組織。 </li><li>乳鉢と乳棒を使用した場合、粉砕後、300μlの溶解緩衝液中で粉砕組織を再懸濁します。 </li></ol></li><li> 590μlのTEバッファー（; 1mMのEDTA、10mMのトリス-HCl、pH8.0）に10μlのProteinase Kを追加します。組織の（ すなわちすべての30mgのための）すべての300μlに600μlのProteinase K溶液を追加します。 RTで10分間インキュベートします。 注意：消化時間が異なる場合があります。 </li><li> ≥1で遠心サンプル破片を除去するために10分間3000グラム。 </li><li>新しいチューブに上清を移します。 </li><li> RNAを沈殿させ、上清の各900μlの450μlのエタノール（96％-100％）を追加します。 </li><li>カラムにライセート/エタノール混合物の700μlのを転送します。 </li><li> 1分間≥13,000gで遠心分離サンプルがカラムにRNAに結合します。 </li><li>液体廃棄物を捨て、カラムに残りの上清を追加し、再びスピン。 </li><li>すべての溶解液がカラムを回転させた後、30秒間≥13,000グラムでカラムと遠心サンプルの上部に洗浄緩衝液1の350μlを添加します。 </li><li>カラムから液体を破棄し、上部を交換してください。 </li><li> 10倍DNアーゼの5μlのサンプルあたりのDNase / RNaseを含まない水（50μL/サンプルの総容積）の40μlのDNアーゼI酵素の5単位を混合することにより、DNアーゼを準備します。 </li><li>各列にDNアーゼミックス50μLを加え、室温で15分間インキュベートします。 </li><li>カラムと遠心SAMに洗浄緩衝液1の350μLを追加30秒間≥13,000gでples。 </li><li>カラムから液体を破棄し、上部を交換してください。 </li><li>カラムに洗浄バッファー2の600μlを添加し≥13,000gで30秒スピン。 </li><li>カラムから液体を破棄し、上部を交換してください。 </li><li> ≥13,000gで2分間の洗浄バッファー2と遠心250μlのを追加します。 </li><li>新しいコレクションチューブにカラムの一部を入れて、古いコレクションチューブを捨てます。 </li><li>カラムにRNアーゼ/​​ DNアーゼフリーの水の50〜100μl添加し、1分間インキュベートします。 </li><li> ≥13,000gで1分間スピン。 </li><li>再実行したRNAの収量を増加させるためにカラムに通して回収した溶出液を。 </li><li>すぐに使用するために、氷上でサンプルを維持し、定量化に進みます。後で使用するために、ドライアイスや液体窒素の凍結スナップ。 -80℃の冷凍庫で保存が必要になるまで。 </li></ol> 3.ファーストストランドの合成注意：代表的な分析のために、逆転写酵素（RT）反応を行ったFQRT-PCRのために設計されIRSTストランドcDNA合成キット（材料リストを参照してください）​​。 <ol><li>サンプルは、以前に収集された場合には、氷の上にチューブを解凍。 </li><li>分光光度計を用いてRNAの量を測定します。 </li><li>トータルRNAの0.5~2μgのを使用して、cDNAのストックを生成するために逆転写酵素を用いて第一鎖合成を行います。 <ol><li>無菌の、RNアーゼ/ DNアーゼフリーPCRチューブ/プレートに、反応混合物（ 表1）を調製します 。穏やかに混合し、遠心します。標準的なPCR機（ 表2）をプログラム 。 </li></ol></li><li>無菌のヌクレアーゼフリー水を使用して所望の体積（一般的に50〜100μL）に完成した反応を希釈します。 </li></ol> 4.リアルタイムPCR 注意：代表的な分析のために、SYBRグリーンを使用しました。しかし、任意の好適な方法は、ユーザーの裁量で置換することができます。 <ol><li>陽性コントロールのcDNAを用いて、各プライマーセットのための標準曲線を設定します。 <ol><li>私が示した分析についてN図3は 、陽性コントロールのcDNAを推奨メーカーを使用して、 ヒト HER2のための標準曲線を作成（材料リストを参照してください）。マウスGAPDHについて、標準曲線を生成するために、陰性対照肺のcDNAを使用しています。 5基準を生成するために、4：各プローブについては、連続的cDNAの1に希釈。 </li></ol></li><li>標準曲線と実験試料を含めるべきで、総サンプル数を計算します。 注：ここで説明する分析のために、サンプルあたり2~3実験の反復を分析しました。標準曲線解析は、最終的な正規化された量を計算するために、HER2とサンプルあたりGAPDHの相対量を決定するために適用することができる単純な線形回帰モデルを生成するために実施しました。この分析はまた、プライマー効率が手元に分析するために十分であることを保証します。 </li><li>滅菌、RNアーゼ/ DNアーゼフリーのチューブでは、マスターミックス（ 表3）を調製 。 <ol><li>マスターミックスをamoun計算サンプルあたりトン。複数のサンプルのためにスケールアップ。関心の各実験の遺伝子だけでなく、GAPDHなど内部統制のためのマスターミックスを使用してください。 200nmの最終濃度でGAPDHのためのプライマーを使用してください。 注意：ヒトおよびマウス細胞由来を区別しようとしたときに内部統制は特に便利です。 注意：HER2のためのプライマー濃度が最適化され、製造業者によって決定されました。 </li></ol></li><li>各標準または実験サンプルに対応した1μlのcDNAを含有する試験プレートを準備します。各プライマープローブについても、少なくとも1 cDNAサンプル/を割り当てます。各プライマープローブにウェルあたりマスターミックス19μLを追加します。 注： 図3の代表的なデータのために、cDNAサンプルは、各プライマープローブの二重に分析し、2つのサンプルの平均値としてグラフ化。 </li><li>推奨または以前のPCRプロトコルを使用してテストQRT-PCR機で反応を実行します。 表4を参照してください </s図3と図4の代表的なデータのために使用されるPCRプロトコルのtrong&gt;。 </li></ol>

<ol>
	<li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+building+a+framework.">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li><li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metastasis+in+the+mouse.">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li><li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis.">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li><li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse.">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li><li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+tumor+metastasis.">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li><li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis.">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li><li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours.">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li><li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li><li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models.">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li></ol>

ESYおよびMAAはFirstStringリサーチ社で採用されていないと利害関係を持たないようにしてください。 FirstStringリサーチ社は、この原稿に提示されたルシフェラーゼ撮像データを提供します。 GSGはFirstStringリサーチの社長兼最高経営責任者（CEO）です。 CLGはFirstString研究の従業員です。 GSGとCLGはFirstStringリサーチが発行したストック・オプションを持っています。

このプロトコルは、異種移植マウスモデルを使用して肺に乳腺腫瘍細胞の転移を評価するために、QRT-PCRの使用を記載しています。それは、生物発光イメージングを含む他の技術は、利用可能であり、また、自分の価値観と限界を持つにもかかわらず、転移を検出するために有効であることが認められています。提示されたデータは、QRT-PCRは、総転移の定量のための肺組織内の腫瘍由来のmRNAを検出するための有効な手段を提供することを示唆しています。これは、QRT-PCR分析を補完することができ、またはこれらの画像化技術の代わりに行うことも、二次の方法を提供することが提案されています。この技術は、機器の特定のタイプまたは転移性の負担の特定の利害関係はなく、詳細なメカニズムの研究と研究グループのためのアクセスが制限された研究環境に最適かもしれません。 有益ながら、ここで説明QRT-PCR分析には限界があります。これは、下流の追加を行うことができません免疫組織化学（IHC）又は免疫蛍光（IF）は、全肺組織をRNA単離のために使用されるため、染色などの分析。 インビボイメージング技術と対になった場合は、肺組織は、分析のこの二種類を実行するためのポストイメージングを単離することができます。マルチプレップ単離キットは、肺組織を調製するために使用されていない場合にも、この技術は、mRNAを検出するので、タンパク質分析に限られていることは不可能です。 IHC / IFは、ユーザーがに基づいて、マウス組織で見られる染色から腫瘍組織で染色したタンパク質を描写することを可能にする一方、タンパク質の結果の分析はまだ、すべての1で腫瘍および肺組織を含み、総タンパク質ミックスを評価することに限定されていますIHC / IF染色を可視化します。転移は、肺の一部で識別され番目されていない場合に有益であり得るような組織構造のような他の分析のための肺組織の半分を維持することが、矛盾の発見の危険性が、肺全体を使用する代わりに他の電子。 変更およびトラブルシューティングのいくつかのポイントが推奨されています。 QRT-PCRデータの精度は、転写産物の定量のための適切な標準曲線分析の使用を含む推奨されるアッセイおよびプローブの最適化のために選択されたプライマーのプローブに依存します。加えて、単離されるRNAの品質を評価することが重要です。過消化プロテイナーゼKで組織のは、RNAの品質を低下させることができるので、最適化は、金利およびRNA調製の方法の特定の組織に基づいて推奨されます。適切なハウスキーピングリファレンス遺伝子を選択することも重要です。 GAPDHは、一般的に使用される参照遺伝子であるが、全ての遺伝子が原因の実験条件に変更することができる細胞内の正常な機能を提供していますので、代替選択肢（ホスト、遺伝子ノックアウトなどの動物の、すなわち遺伝子組換え）が有用です。ユビキタスExpressを有することが報告されているいくつかの一般的な参照遺伝子量のイオンと低変動は、TATAボックス結合タンパク質（TBP）、網膜色素変性症をコードする遺伝子である2 （RP2）、アクチン様タンパク質（ 法 ）、およびタビー二分転写因子（ タブ ）11。また、正確な分析を保証する重要なステップは、肺（ステップ1.2.2-1.2.6）の正確な解剖と洗濯が含まれ、 QRT-PCRのセットアップ（ステップ4.4）中の単離された全RNA（ステップ3.2）、および正確なピペット操作の正確な定量。反復ピペッターを使用することは、このプロセスを助けることができます。 要約すると、このプロトコルは、QRT-PCRは、肺転移を識別するための定量化可能な方法であることを実証することを目指しています。正の値と制限の両方が、この手順を使用して識別され、それが最良の分析の二方法とペアにされるのに適してもよいです。しかし、この方法では、これらの研究研究所の定量まっすぐ進む手順可能性があり具体的な研究の必要性または転移を調査する大規模な設備の欠如とIES。 。この方法の将来のアプリケーションは、転移の他の一般的な部位である、このようなリンパ節や脳などの肺を越えて標的臓器への転移、探すために修正が含まれています。

QRT-PCR分析は、腫瘍の転移を評価する方法として提案されています。この方法は、転移の評価に興味を持っているが、このようなin vivoイメージング機器や蛍光できるステレオスコープのような特定の機器へのアクセス権を持っていない可能性があり、ユーザーのための代替として提案されています。一般的に使用される方法の議論は、QRT-PCR分析は、分離してまたは転移を評価するためのコンパニオン方法としても使用することができる方法を実証するために続いて提示されます。この手順は、転移性負荷の定量的な分析を提供する可能性を有します。 実体顕微鏡下での肺の可視化だけでなく、肺組織のヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色を行った連続切片を含む総分析の標準的な方法は、定量化可能であるが、2-5をカウントするためのユーザー定義のパラメータに大きく依存しています。実体顕微鏡を用いて全肺を評価する際に、唯一の大きな表面転移がVISIですBLEと分析は、転移性病変を構成するものを決定するために、肺の解剖学的構造の合理的な知識を持っている研究者を必要とします。例えば、GFP（例えば、GFPのための510分の470 nm付近）適切な励起/発光極大を持つ光キューブが含まれている実体顕微鏡の使用などのマーカーによる腫瘍細胞の蛍光標識、このプロセスを支援するが、表面だけの腫瘍結節が検出可能です。さらに、GFPと同じパラメータの下に表示されている血液汚染からの蛍光は、可能な転移病変の偽の身分証明書につながる可能性があります。 肺転移を可視化するために、H＆E染色に続いて肺の切片は、微小転移および免疫細胞の浸潤を含む他の微細なプロセスを評価するための有用な方法であるが、多くの場合、肺全体のパラフィン包埋のための組織、切片、および染色手順を使用する必要があります。そのため、下流の手順は、このメト次理想的ではありませんD。定量化が、この手順では、分析は、肺の全体の三次元構造を考慮していることを確認するために、動物あたり染色した肺切片の多数を評価するために研究者が必要となります。その結果、検査のこのタイプは時間がかかり、エラーをカウントにつながることができ、解析は研究者の裁量に大きく依存しています。 イメージング技術（例えば、MRI、PET、SPECT）は、現在、実験的なげっ歯類モデル8の生物学的プロセスを実行またはテストするために使用され、インビボでのいくつかの。 インビボでの生物発光イメージングは、転移9の全体のビューを取得するために使用される一般的な方法です。この技術は、一般に、腫瘍細胞移植後の乳腺および自然転移の際に肺のような特定の器官に存在するルシフェラーゼ応答エレメントを含むように操作された腫瘍細胞の蓄積を、ルシフェラーゼレポーター活性の存在を評価するために適用されます10。ルシフェラーゼレポーター活性の可視化は、ルシフェリン基質（D-ルシフェリン）の存在によって誘導されます。ルシフェラーゼは、生物発光を生成するオキシルシフェリンするD-ルシフェリンの酸化的脱炭酸を触媒します。有益ながら、この方法は、基板の安定性（ すなわち、短い半減期）、それが実験動物に送達されるかに依存して、基板の適切な分布、および検出9の低い感度を含むいくつかの要因によって制限されます。この手法の主な利点は、それが非侵襲性であるということである生きた動物に対して行うことができ、通常は解剖9,10で収穫されていない可能性があり、複数の臓器における腫瘍細胞の転移の検出をもたらすことができます。 インビボイメージング技術の一つの正の側面は、肺組織をQRT-PCR分析を、パラフィン包埋のような二次的処置のために、またはここに提示させること乱されることです。しかし、QRT-PCRはtheoreticaあるためLLY検出のより感度の高い測定、総評価は、肺に存在する腫瘍細胞の低い数字を明らかにしないことがあります。有用であるが、上述の画像化技術は、現在記載QRT-PCR法を用いて、置換または補充することができます。 QRT-PCRは、肺内の腫瘍由来のmRNAの高感度測定を提供する可能性を有します。

<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP176-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet RNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5121&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25636&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25716&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gapdh Primer Sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr

転移性疾患は、遠隔臓器への癌原発部位から悪性腫瘍細胞の広がりであり、癌関連死1の主な原因です。転移拡散の一般的な部位は、肺、リンパ節、脳、および骨2が含まれます 。転移を駆動機構は癌研究の激しい領域です。その結果、転移の離れた部位に転移性の負担を測定するための効果的なアッセイは、癌研究のために尽力しています。乳房腫瘍モデルにおける肺転移の評価は、一般的に解剖後の肺組織の肉眼定性的観察することによって行われます。転移を評価する定量的方法は、現在、 エキソビボおよびユーザ定義のパラメータを必要とするインビボイメージングに基づく技術に限定されています。これらの技術の多くは、生物全体のレベルではなく、細胞レベル3-6です。多光子顕微鏡法を利用し、新しい画像形成方法は、メタ情報を評価することが可能であるが細胞レベル7でtasis、これらの非常にエレガントな手順は、普及のメカニズムではなく、転移性負荷の定量的評価を評価するのにより適しています。ここでは、定量的に転移を評価するための簡単なインビトロ方法が提供されます。腫瘍細胞特異的mRNAは、マウスの肺組織内で検出することができ、定量的リアルタイムPCR（QRT-PCR）を使用。

それは、インビボの腫瘍の分析で一、実験動物へと行った場合に、腫瘍細胞の最初の接種を行うために要する時間を超えて、組織採取、RNA単離、およびQRT-PCR分析（図1）1-2日間の手順であります。 総分析の例は、肺組織内の腫瘍細胞を評価するための生物発光イメージングです。ここでは、乳腺腫瘍形成実験をACT1と呼ばれるギャップ結合タンパク質コネキシン43を標的とする治験薬は、肺への4T1-LUC乳腺腫瘍細胞の自然転移を損なうかどうかを評価するために行きました。処置の数週間後、プラセボまたは試験薬剤を受けた動物は、ルシフェリンを注射し、屠殺しました。解剖時に、肺を、ルシフェラーゼ生物発光のために可視化しました。代表画像から、薬剤からその肺を表示されます処置した動物には腫瘍細胞がACT1処理（ 図2A）の後に転移の阻害を示唆し、肺に存在しないことを示してルシフェラーゼ活性について陰性です。これらの代表的な画像の主な目的は、生物発光イメージングは​​、転移の検出の適切な方法であることを実証することです。しかし、ACT1で処置した動物からの肺のH＆E切片の詳細な調査の際に、微小転移は、おそらく撮影のこのタイプは、腫瘍の少数を検出するために十分な感度ではないかもしれないことを示唆し、ルシフェラーゼイメージング（ 図2B）によって照射されなかったことが確認されました肺の中に埋め込まれた細胞。理想的には、QRT-PCRのためのコンパニオン解析は、これらの結果を確認するために実行されます。 ここで提示QRT-PCR分析は、HER2 + JIMT-1細胞からの肺におけるヒト腫瘍細胞を検出するために、ヒトHER2ためのプローブを使用して、特定もともと、宿主動物の乳房脂肪パッド（ 図3）に移植しました。転移は、腫瘍の発生後に自然に発生しました。解剖時には、実体顕微鏡下で見たときに、何もひどく目に見える転移が肺のいずれにも認められませんでした。しかし、 図3に矢印で示された動物保有転移を有する腫瘍から採取した11の肺の二つは、可視化によって検出されなかった腫瘍細胞が存在することを示唆していると思われる後続のQRT-PCR解析に基づきます。 JIMT-1由来の腫瘍の断片に由来するcDNAは、陰性対照として使用した腫瘍細胞を注射しなかったHER2発現 （ 図3、（+））およびマウスからの肺のための陽性対照として使用した（ 図図3に示すように、（ - ））。マウスGAPDHに特異的なプローブは、全マウスの肺組織へのヒト腫瘍細胞の割合を決定するための内部対照として使用しました。陽性対照サンプルは、基準として制御肺からのGAPDHレベルに対して正規化しました。別の正規化戦略は対照サンプルのためのより一貫性の正規化レベルを取得するために、すべての肺サンプルを横切って、GAPDHの量を平均化することであろう。例えば、GFPのような非マウスおよび非ヒト遺伝子のための別のプローブは、マウスへの導入の前に、それに応じて標識されている腫瘍細胞を検出するために置き換えることができます。 二次分析は、肺の中に存在する全腫瘍細胞数の相対的定量化を提供するために行きました。これらの結果を図4に示す 。ここでは、標準曲線の分析は、細胞数の直列にマウス肺GAPDHに対して正規化HER2の量を決定するために調製しました。理論的には、これは、研究者が1×10 6の HER2の相対量を決定することを可能にする1×10 5、1×10 4、1×10 <sup<html> &gt; 3、1×10 2、および10の細胞。結果は、QRT-PCRプローブおよび分析は、10細胞（ 図4A）という低いレベルでHER2を検出するのに十分に感受性で行うことを示しています。得られた計算されたHER2値は対数スケールでプロットし、単純な線形回帰分析は、各肺サンプル中の相対的な細胞数、ならびに陽性および陰性対照を決定するために使用しました。 図4（b）に示すように 、セル数の特定の値は、実験サンプルのために生成されました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53329/53329fig1.jpg" /> 肺の解剖と分析の図1模式図挿入図拡大図で示すように、マウスの肺は、5ローブが含まれています。解剖から分析にQRT-PCR法は、一般的に完了するまでに1-2日かかります。ge.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53329/53329fig2.jpg" /> 転移の2グロス分析図。 （A）4T1-LUC細胞を注射し、プラセボまたはギャップ結合タンパク質、コネキシン43を標的に治験薬と呼ばれるACT1のいずれかで処理した動物からの肺の代表的な生物発光画像。（B）。中の微小転移の代表的なH＆EセクションACT1で処理した4T1腫瘍を持つ動物の肺。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53329/53329fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53329/53329fig3.jpg" /> 図3.代表的QRT-PCR分析。バーグラフヒトHER2、JIMT-1ヒト乳癌細胞株に存在する遺伝子のQRT-PCR分析からの定量データを示します。肺におけるヒトHER2レベルがマウスGAPDHに正規化されます。 （+）陽性対照を表します。 （ - ）陰性対照を表します。結果は、対数スケールでプロットされている。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53329/53329fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53329/53329fig4.jpg" /> 細胞数の分析から、図4の代表的なQRT-PCR分析を示す。（A）1×10 6個の細胞からJIMT-1細胞の細胞数の量に関連するHER2のレベルを表すグラフから定量データを表す（B）棒グラフヒト HER2のQRT-PCR解析、JIMT-1ヒト乳房に存在する遺伝子できますCER細胞株。肺におけるヒトHER2レベルがマウスGAPDHに正規化されます。 （+）陽性対照を表します。 （ - ）陰性対照を表します。結果は、対数スケールでプロットされている。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53329/53329fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="1" width="296"><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;">テンプレートRNA </td><td> 0.5〜2μgの</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> iScriptスーパーミックス</td><td> 4μL/サンプル</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;">ヌクレアーゼフリー水</td><td> 20μL/サンプルまで</td></tr></tbody></table> 表1.ファーストストランド合成反応ミックスコンポーネント（ステップ3.3.1）。 <table border="0" c<html> ellpadding = &quot;0&quot; CELLSPACING = &quot;0&quot; FO：キープtogether.withinページ= &quot;1&quot;幅= &quot;397&quot;&gt; <tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;">ステップ1：25℃ </td><td> 5分</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;">ステップ2：42℃ </td><td> 30分</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;">ステップ3：85℃（終了） </td><td> 5分</td></tr></tbody></table> ファーストストランドの合成のために、表2のPCR条件（ステップ3.3.3）。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="1" width="295"><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> iTAQマスターミックス</td><td> 10μL/サンプル</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;">プライマーミックス</td><td> 1μL/サンプル</td></tr><tr height="20">&quot;&gt;ヌクレアーゼフリー水</td><td> 20μL/サンプルまで</td></tr></tbody></table> 表3.リアルタイムPCR反応ミックスコンポーネント（ステップ4.3）。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="1" width="576"><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;">ステップ1 </td><td>アクティベーション</td><td> 95°C </td><td> 2分</td><td> 1サイクル</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;">ステップ2 </td><td>変性</td><td> 95°C </td><td> 5秒</td><td> 40サイクル</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"></td><td>アニーリング/伸長</td><td> 60°C </td><td> 30秒</td><td></td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;">ステップ3 </td><td>溶融曲線（オプション） </td><td> 65〜95℃の（0.5刻み） </td><td> 5秒/ステップ&lt;/ TD&gt; <td></td></tr></tbody></table> 表4.リアルタイムPCR条件（ステップ4.5）。

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR at JoVE.com

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

このプロトコルは、マウスの肺組織内の転移を示す腫瘍細胞特異的mRNAを検出するための定量的リアルタイムPCR（QRT-PCR）を使用する方法について説明します。

定量的リアルタイムPCRによるマウス乳腺腫瘍モデルにおける肺転移の評価

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

evaluation-lung-metastasis-mouse-mammary-tumor-models-quantitative

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

9.8K ビュー.  Medical University of South Carolina. このプロトコルは、マウスの肺組織内の転移を示す腫瘍細胞特異的mRNAを検出するための定量的リアルタイムPCR（QRT-PCR）を使用する方法について説明します。 

ビデオ: Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

生体内イメージングを使ってリアルタイムで腫瘍におけるナノ粒子の取り込みの評価

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

医学

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

マウスモデルにおける乳がんの脳転移の腫瘍の低酸素動態の in vivo生物発光イメージングに

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

定量的リアルタイムPCR（定量PCR）による前立腺腫瘍におけるマイクロRNAの検出

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

骨転移モデル

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

乳癌のマウスモデルにおいて腫瘍微小環境における薬剤応答のイメージングを生きる

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

競争力のあるマウス骨髄移植モデルにおけるドナー細胞の生着を​​決定するために、定量的リアルタイムPCRを用いて

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

マウス肺挿管の簡単な方法

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

乳癌の新規トランスジェニックマウスモデル：アデノ-Creを持つ乳管上皮の標的とすることにより、転移性乳癌の開始

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

定量リアルタイムPCRを用いて脳脊髄液マイクロRNAプロファイリング

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

原発腫瘍と肺転移を研究するためのMEF細胞の単離

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...