Yeh laboratuvar, bir Amerikan Kanser Derneği Kurumsal Araştırma Bursu (IRG-97-219-14) Bir Savunma Bakanlığı hibe araştırma fonları tarafından, musc at Hollings Kanser Merkezi&#39;nde verilen (W81XWH-11-2- araştırma fonları tarafından desteklenen 0229) musc at ve endişe (Esy kadar) Vakıf bir ödül ile.

Protokol kurallarına ve South Carolina (MUSC) ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Tıp Üniversitesi (IACUC) hayvan bakım standartlarını izler. 1. Akciğer Diseksiyon <ol><li> Meme tümör diseksiyonu (opsiyonel çalışma hedeflerine ve primer tümör analiz veya kuyruk ven enjeksiyon yapıldı mı bağlı). <ol><li> IACUC ve üniversite yönetmeliğine göre izofluran anestezisi bir öldürücü doz kullanarak fare Euthanize. Cerrahi dislokasyon euthanization onaylayın. </li><li> Köpük tahta, bacaklarda yayılması ile sırtında fare koyarak diseksiyon iğneleri ile pim üzerinde. </li><li> % 70 etanol ile fare püskürtün. </li><li> Forseps kullanarak, merkezde hayvan alt kısmını kavramak. </li><li> Makas kullanarak, fare periton boşluğuna delmek için dikkatli olmak, deri yoluyla boyun doğru yukarı kesti. </li><li> Tümör dokusu ortaya çıkarmak için bacaklarda cildi kesin. </li><li> Tümör dokusu ve pr parçalara ayırDaha fazla analiz için (değil bu protokolde ayrıca tartışılacaktır), bu tür donma veya fiksasyonu gibi, tercih edilen yöntem ile eserve. </li></ol></li><li> Akciğer doku diseksiyonu. <ol><li> Yukarıda açıklandığı gibi tümör dokusu hasat ise, herhangi bir aşırı cilt aşağı pin. </li><li> Forseps kullanarak, hayvanın alt ucunda periton kavramak ve boyun tabanına doğru yukarı kesme başlar. </li><li> Dikkatle göğüs boşluğuna kanama olabilir herhangi bir kan damarlarını kesmekle önlemek için dikkatli olmak kaburga kafesinin sağ ve sol kenarlarında kesilmiş. Sol ve sağ kaburga kafesinin diyafram ve üst kısımları keserek kaburga kemikleri çıkarın. </li><li> Forseps kullanarak fare trakea kavramak ve ileri çekin. </li><li> Diseksiyon makas ile trakea Sever ve fare akciğerleri kaldırmak. Not: Kalp akciğer takılı kalabilir. Bu durum ortaya çıkarsa, dikkatli beş lobları toplamak için dikkatli olmak akciğerlere uzak kalbini incelemek (bakınız Şekil 1 </strong&gt;). </li><li> Aşırı kan çıkarmak için PBS ile hafifçe yıkayın. </li></ol></li><li> Akciğer dokusunda Brüt değerlendirilmesi. <ol><li> Seçenek 1: In vivo görüntüleme. <ol><li> Lusiferaz görüntüleme için, ~ 10 dakika önce görüntüleme, hayvanlara intraperitonal (ip) enjeksiyonu ile luciferase bir 150 mg / kg doz vermek. Anestezi altındaki hayvanlarda veya diseksiyon (Şekil 2) 5 sonra kaldırılması üzerine in vivo Görüntü akciğerler. </li></ol></li><li> Seçenek 2: Brüt değerlendirme. <ol><li> Tümör nodüller görselleştirmek için stereo mikroskop altında akciğerleri inceleyin. Not: hücreler, etiketli GFP ise, GFP tespit etmek için (470/510 nm civarındaki gibi) uygun bir uyarım / emisyon maksimum ile ışık küp ihtiva eden bir floresan yeteneğine stereomikroskop işleme öncesinde floresan stereoskopik akciğerlere incelemek için kullanılabilir. </li></ol></li><li> Akciğerler derhal analiz edilecek ise, &#39;RNA izolasyonu&#39; bölümüne geçin. Aksi takdirde, Sıvı sabun kullanılarak dondurularak doku ekid azot veya kuru buz. -80 ° C saklayın. </li></ol></li></ol> 2. RNA İzolasyon Not: Örnek analizinde, RNA, bir RNA izolasyon kiti (Malzeme listesi) kullanılarak izole edilmiştir. Geçerli analiz belirli bir üreticinin ürettiği kullanırken, izolasyon kitleri çeşitli birçok saygın satıcılardan temin edilebilir. Ayrıca, sigara kit tabanlı santrifüj yöntemleri de bir seçenek vardır. cDNA, standart eğrisi analizi için bir hücre hattı veya plazmid olarak, bir pozitif kontrol RNA numunesinden hazırlanmalıdır. Alternatif olarak, primer prob seti için belirli bir pozitif kontrol satın alınabilir (Malzeme Listesi&#39;ne bakın). <ol><li> Önceden dondurulmuş doku kullanıyorsanız, kuru buz dondurulmuş doku toplamak. </li><li> Örneğin aşağıdaki yöntemlerden biri kullanılarak doku homojenize: havan ve tokmak doku sıvı nitrojen içerisinde dondurulduktan sonra, kuru buz üzerine el ile yapılan öğütme; Doku homojenizatörü veya mekanik ayrışma cihazıÜreticinin öneri başına; sonikasyon veya diğer tercih edilen yöntem. Not: temsilci analizi için homojenizasyon tercih edilen yöntemdir sonikasyonudur. <ol><li> Şekil 3 sunulan analizi için, bir oranda parçalama (RNA izolasyon kiti sağlanan) tampon ve 2-merkaptoetanol hazırlanması 20 ul 2-merkaptoetanol lisis tamponu, her 1 ml. Süspanse dokusu 300 ul liziz tamponu içinde% 30 genlik ayarlanmış sonikatör 10 sn için doku ve sonikasyon, her 30 g 2-merkaptoetanol ile takviye edilmiştir. </li><li> Öğütme sonrası 300 ul liziz tamponu içinde tekrar süspansiyon temel doku, harç ve havan tokmağı kullanılarak edin. </li></ol></li><li> 590 ul TE tampon maddesi (1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0) 10 ul proteinaz K ilave. Doku (yani her 30 mg) her 300 ul 600 ul proteinaz K çözüm ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Not: Sindirim süresi değişebilir. </li><li> ≥1 örnekleri Santrifüj10 dakika boyunca 3000 gr enkaz kaldırmak için. </li><li> Yeni tüplere süpernatant aktarın. </li><li> RNA çöktürmek için süpernatan, her 900 ul için 450 ul etanol (% 96 -100%) ekleyin. </li><li> Kolona lizat / etanol karışımı 700 ul aktarın. </li><li> 1 dakika boyunca ≥13,000 g&#39;de santrifüjleyin örnekleri kolona RNA bağlama. </li><li> Sıvı atık atın ve sütun kalan süpernatant ekleyin ve tekrar döndürün. </li><li> Tüm lisatı kolonu boyunca bükülmüş bir kez, 30 saniye süre ile ≥13,000 g kolonu ve santrifüj örnekleri üst kısmına Yıkama Tamponu 1 350 ul ilave edin. </li><li> Sütundan sıvıyı atın ve üst kısmı değiştirin. </li><li> Ben 10x DNaz 5 ul ve numune başına DNaz / RNaz ücretsiz su 40 ul (50 ul / numune toplam hacim) ile enzim DNaz 5 birim karıştırılarak DNaz hazırlayın. </li><li> DNase 50 ul, her sütun için karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe ekleyin. </li><li> Kolon ve santrifüj sam ile Yıkama Tamponu 1 350 ul ekleyinples 30 sn için ≥13,000 g. </li><li> Sütundan sıvıyı atın ve üst kısmı değiştirin. </li><li> Kolonuna Yıkama Tamponu 2 600 ul ilave edin ve ≥13,000 g&#39;de 30 saniye dönerler. </li><li> Sütundan sıvıyı atın ve üst kısmı değiştirin. </li><li> ≥13,000 g&#39;de 2 dakika süre ile 250 Yıkama Tamponu 2 ul ve santrifüj ekleyin. </li><li> Yeni koleksiyon tüpüne sütunun kısmını koyun ve eski toplama tüpü atın. </li><li> Sütuna RNaz / DNaz serbest su 50-100 ul ilave edin ve 1 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> ≥13,000 g 1 dakika boyunca dönerler. </li><li> Yeniden çalıştırın RNA verimi artırmak için kolon boyunca toplanan eluatın. </li><li> Acil kullanım için, buz üzerinde örnekleri tutmak ve kantitatif geçin. Daha sonra kullanmak için, kuru buz veya sıvı azot üzerinde dondurma ek. -80 ° C derin dondurucuda saklayın de ihtiyaç kadar. </li></ol> 3. içine First Strand Synthesis Not: temsilci analizi için, ters transkriptaz (RT) reaksiyonu, bir F gerçekleştirildi(Malzeme Listesi&#39;ne bakınız) QRT-PCR için tasarlanmış irst Strand cDNA sentez kiti. <ol><li> Numuneler daha önceden toplanmış olsaydı, buz üzerinde tüpler çözülme. </li><li> Bir spektrofotometre kullanılarak RNA miktarını ölçün. </li><li> Toplam RNA&#39;nın 0,5-2 ug kullanılarak cDNA stokunun oluşturulması için ters transkriptaz kullanılarak birinci sarmal sentezi gerçekleştirmek. <ol><li> Steril, RNaz / DNaz içermeyen PCR tüpleri / levha, reaksiyon karışımı (Tablo 1) hazırlanması. Yavaşça ve santrifüj karıştırın. Standart bir PCR makinesi (Tablo 2) programlayın. </li></ol></li><li> Steril nükleaz içermeyen su kullanılarak istenen hacme (genellikle 50-100 ul) bitmiş reaksiyonu sulandırmak. </li></ol> 4. Real-time PCR Not: temsilci analizi için, SYBR yeşil kullanılmıştır. Ancak, herhangi bir tercih edilen yöntem, kullanıcının takdirine bağlı olarak ikame edilebilir. <ol><li> Bir pozitif kontrol cDNA kullanılarak, her bir primer grubu için bir standart eğri ayarlayın. <ol><li> Analiz i gösterilen İçinn Şekil 3, pozitif kontrol cDNA tavsiye üreticisi kullanarak insan HER2 için standart eğri hazırlamak (Malzeme Listesi&#39;ne bakın). Fare GAPDH için, bir standart eğri oluşturmak için negatif kontrol akciğer cDNA&#39;nın kullanılmasıdır. 5 standartları üretmek için 4: her bir prob için, seri cDNA 1 seyreltin. </li></ol></li><li> Standart eğri ve deneysel örnekleri içermelidir toplam örnek sayısını, hesaplayın. Not: Analiz burada açıklanan için numune başına 2-3 deneysel çoğaltır analiz edildi. Standart eğri analizi son normalleştirilmiş miktarını hesaplamak için, numune başına göre HER2 miktarı ve GAPDH belirlemek için uygulanabilecek bir basit doğrusal regresyon modeli oluşturmak için gerçekleştirilmiştir. Bu analiz aynı zamanda astar verimliliği eldeki analiz için yeterli olmasını sağlayacaktır. </li><li> Steril, RNaz / DNaz ücretsiz tüp içinde, ana karışımı (Tablo 3) hazırlar. <ol><li> Ana karışımı Amoun hesaplayınNumune başına t. Birden fazla örnek için büyütmek. Çevrede oluşturduğu her bir deney geni, hem de GAPDH gibi bir iç kontrol için bir ana karışımı kullanın. 200 nM&#39;lik bir nihai konsantrasyonda GAPDH için primerler kullanarak. Not: İnsan ve fare hücre kökenli ayırt çalışırken iç kontrol özellikle yararlıdır. Not: HER2 için primer konsantrasyonu optimize edilmiş ve üretici tarafından belirlenmiştir. </li></ol></li><li> Her standart veya numune deney tekabül eden 1 ul cDNA&#39;lan ihtiva eden test plakası hazırlanır. Her bir primer prob için en az 1 cDNA örnek / ayırın. Her primer prob için kuyu başına ana karışımı 19 ul ekleyin. Not: Şekil 3 temsili veriler için, alınan cDNA, her bir primer prob için iki kopya halinde analiz edilmiştir ve iki numune ortalaması olarak grafik haline. </li><li> QRT-PCR makinesinde çalıştırın reaksiyon tavsiye veya önceden PCR protokolü test kullanarak. Tablo 4 görün </sŞekil 3 ve Şekil 4&#39;te temsili veriler için kullanılan PCR protokolü için trong&gt;. </li></ol>

<ol>
	<li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+building+a+framework.">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li><li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metastasis+in+the+mouse.">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li><li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis.">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li><li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse.">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li><li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+tumor+metastasis.">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li><li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis.">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li><li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours.">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li><li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li><li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models.">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li></ol>

Esy ve MAA FirstString Araştırma A.Ş. tarafından istihdam edilmeyen ve şirketin herhangi bir finansal çıkarı tutmayın. FirstString Research Inc. Bu yazıda sunuldu lusiferaz görüntüleme verileri sağlamıştır. GSG FirstString Araştırma başkanı ve CEO&#39;su. CLG FirstString Araştırma bir çalışanıdır. GSG ve CLG FirstString Research tarafından yayınlanan hisse senedi opsiyonları vardır.

Bu protokol, ksenograft fare modeli kullanarak, akciğer, meme tümör hücresi metastazının değerlendirmek için QRT-PCR kullanımını tarif etmektedir. Bu bioluminescent görüntüleme dahil olmak üzere diğer teknikler mevcuttur ve ayrıca kendi değerlerini ve sınırlamalar olmasına rağmen metastaz saptanması için etkili olduğu kabul edilmektedir. Sunulan veriler QRT-PCR Toplam metastaz ölçülmesi için, akciğer dokusu içindeki tümör kaynaklı mRNA tespit etkili bir ölçüsü temin ettiğine işaret etmektedir. Bu QRT-PCR analizi tamamlayıcı olabilir veya bu görüntüleme teknikleri yerine gerçekleştirilebilir ikinci yöntem temin önerilmiştir. Bu teknik en iyi ekipman veya metastatik yükünün belirli çıkarları ile araştırma grupları için belirli türleri sınırlı erişimi olan araştırma ortamları için uygundur, ancak mekanik çalışmalar ayrıntılı değil olabilir. Bilgilendirici olsa da, burada açıklanan QRT-PCR analizi sınırlamaları vardır. Bu aşağı doğru ek gerçekleştirmek mümkün değildirimmünhistokimyasal (İHK) veya tüm akciğer dokusu RNA izolasyonu için kullanılır, çünkü immünofloresan (IF) boyanma dahil analizi. Bir in vivo görüntüleme tekniğiyle eşleştirilmiş Ancak, akciğer dokusu analiz Bu ikinci tip gerçekleştirmek sonrası görüntüleme izole edilebilir. Çok-prep izolasyon kiti akciğer dokusunun hazırlanması için kullanılan sürece Ayrıca, bu teknik, böylece protein analizi mRNA&#39;yı tespit etmek ve sınırlıdır mümkün değildir. Oluşan protein analizi hâlâ İHK / IF dayalı fare dokusunda bulunan lekeleme tümör dokusunda lekeli proteinleri tanımlamak için izin verir, oysa her birinde tümör ve akciğer dokusu içeren toplam protein karışımı, değerlendirmek zorunda sınırlıdır İHK / IF boyanma görselleştirme. Metastaz akciğer bir kısım halinde tanımlanır ve inci takdirde yararlı olabilir örneğin histoloji gibi diğer analiz için akciğer dokusunun yarısı muhafaza edilmesi, ancak çelişkili bulgular riskini bütün akciğer kullanmanın alternatife diğer. Modifikasyon ve sorun giderme Birkaç noktalar tavsiye edilir. QRT-PCR verilerin doğruluğu transkript miktarının belirlenmesi için uygun bir standart eğri analizinin kullanımı da dahil olmak üzere önerilmektedir tahlili ve sondaların optimizasyonu için seçilen primer sondası bağlıdır. Buna ek olarak, izole edilmektedir RNA kalitesini ölçmek için önemlidir. Aşırı sindirim proteinaz ile doku K RNA kalitesini düşürebilir ve bu şekilde optimizasyonu RNA hazırlama ilgi ve yöntemin özel dokuya bağlı olarak tavsiye edilir. Uygun bir temizlik referans gen seçimi de önemlidir. GAPDH yaygın olarak kullanılan bir referans gen olmakla birlikte, her bir gen, deneysel koşullar değişmiş olabilir hücrede normal bir fonksiyon ve bu nedenle, alternatif seçenekler yararlıdır (ana bilgisayar, gen nakavt hayvanların örneğin genetik değişimine) vermektedir. Bildirilen bazı ortak referans genler yerde express variyon ve miktar düşük varyasyon protein (TBP) bağlayıcı TATA kutusu, retinitis pigmentosa 2 kodlayan genler vardır (Rp2), Aktin benzeri protein (Kanun) ve Tubby ikili transkripsiyon faktörü (Küvet) 11. Ayrıca, doğru analiz sağlamak kritik adımlar, akciğer (adım 1.2.2-1.2.6) doğru diseksiyonu ve yıkama dahil QRT-PCR kurulum (adım 4.4) sırasında izole edilen total RNA doğru kantitatif (3.2 adım), ve doğru pipetleme. Tekrar pipet kullanılması, bu işlemde yardımcı olabilir. Özetle, bu protokol QRT-PCR akciğer metastazı tespit etmek ölçülebilir bir yöntem olduğunu ortaya koymayı amaçlamaktadır. Pozitif bir değer ve sınırlamalar Hem bu prosedürün kullanımı ile tespit edilir ve en iyi bir analiz ikincil yöntem ile eşleştirilmesi için uygun olabilir. Ancak bu yöntem, bu araştırma LABORATOR için kantitatif bir yalındır prosedürü olabilirözel araştırma ihtiyaçları veya kapsamlı ekipman eksikliği ler metastazı araştırmak. . Bu yöntemin gelecekteki uygulamalar metastaz diğer ortak siteleri gibi lenf nodu ya da beyin gibi akciğer ötesinde hedef organlarda metastaz, bakmak için değişiklik yer alıyor.

QRT-PCR analizi, tümör metastazı değerlendirmek için bir yöntem olarak önerilmektedir. Bu yöntem metastazı değerlendirilmesinde ilgilenen ancak in vivo görüntüleme ekipmanı ya da bir floresan yetenekli Stereoskop gibi belirli ekipmana erişimi olmayan kullanıcılar için bir alternatif olarak önerilmiştir. Yaygın olarak kullanılan yöntemlerin bir tartışma QRT-PCR analizi, ayrı olarak ya da metastaz değerlendirmek için eşlik eden bir yöntem olarak da kullanılabilir nasıl bir gösteri ardından sunulmuştur. Bu prosedür metastatik yükünün kantitatif analiz sağlama potansiyeline sahiptir. Bir stereomikroskop altında akciğerlerin görüntülenmesi yanı sıra hematoksilen ve eozin ardından seri kesit olmak üzere brüt analiz standart yöntemler, akciğer dokusunun (H &amp; E) boyama, ölçülebilir ancak 2-5 sayılması için kullanıcı tanımlı parametrelere dayanmaktadır. Stereomikroskopta kullanarak tüm akciğerleri değerlendirirken, sadece geniş yüzey metastazları visi vardırble ve analiz metastatik lezyon neyin belirlemek için akciğer anatomik yapının makul bilgiye sahip araştırmacı gerektirir. GFP ve ilgili uyarım / emisyon maksimumları (GFP örneğin yakınındaki 470/510 nm) ile bir ışık küp içeren bir stereomikroskop kullanımı gibi, bir işaretleyici ile tümör hücrelerinin floresan etiketleme bu işlemde yardımcı ancak yüzey tümör nodülleri saptanabilir . Buna ek olarak, GFP ile aynı parametreleri altında görünür kan kontaminasyonu, floresan, mümkün olan metastatik yanlış tanımlanmasına yol açabilir. Akciğer metastazı görselleştirmek için H &amp; E boyama ile takip akciğerin Kesit mikrometastazları ve bağışıklık hücre infiltrasyonu dahil olmak üzere diğer mikroskobik süreçleri değerlendirmek için yararlı bir yöntemdir ancak genellikle parafine, kesit ve boyama işlemleri için tüm akciğer dokusunun kullanılmasını gerektirir. Bu nedenle, mansap işlemleri bu metho aşağıdaki ideal değildird. Ölçülebilir, ancak bu işlem analizi akciğer tüm 3D yapısı oluşturan sağlamak için hayvan başına lekeli akciğer bölümlerinin büyük sayısını değerlendirmek için araştırmacı gerektirir. Sonuç olarak, bu tür muayeneler hatasını sayma yol açabilir, zaman tüketen ve analiz araştırmacı takdirine dayanır. (MR, PET, SPECT gibi) şu anda gerçekleştirmek veya deneysel kemirgen modellerinde 8 biyolojik süreçleri test etmek için kullanılan in vivo görüntüleme teknikleri Çeşitli. In vivo bioluminescent görüntüleme metastazı 9 brüt görünüm elde etmek için kullanılan yaygın bir yöntemdir. Bu teknik genellikle nedeniyle tümör hücresi implantasyonundan sonra meme bezi ve spontan metastaz sırasında akciğer gibi belirli organların ikamet bir lusiferaz cevap veren bir eleman ihtiva edecek şekilde tümör hücreleri, birikimine lusiferaz raportör etkinliği varlığını değerlendirmek uygulanır 1Lusiferaz raportör etkinliği 0. Görselleştirme lusiferin substratının (D-lusiferin) mevcudiyetinde tarafından indüklenir. Lusiferaz biyolüminesans üreten oksilusiferin D-luciferase oksidatif dekarboksilasyonunu katalize eder. Bilgilendirici olmakla birlikte, bu yöntem, alt-tabaka stabilite (örneğin, kısa yarı-ömür), deney hayvanlarına verilir bağlıdır alt-tabakanın yeterli bir dağılımı ve algılama 9 düşük hassasiyeti de dahil olmak üzere birçok faktör tarafından sınırlanır. Bu tekniğe Bir ana hak o, non-invaziv bir canlı hayvan üzerinde yapılabilir ve normalde diseksiyon 9,10 hasat edilmemiş olabilir birden organlarda tümör hücre metastazı saptanması yol açabilir olmasıdır. In vivo görüntüleme tekniklerinden biri olumlu yönü akciğer dokusu parafine gibi ikincil işlemler için izin dönülmelidir ya da burada sunulan, QRT-PCR analizi olmasıdır. Bununla birlikte, QRT-PCR Teorik olduğully tespiti daha hassas bir ölçümü, brüt değerlendirme akciğer tümör hücrelerinin mevcut düşük sayıda görülmemelidir. Yararlı ise, yukarıda tarif edilen görüntüleme teknikleri yer değiştirmiş olabilir veya şu anda tarif QRT-PCR yöntemi ile takviye edilmiştir. QRT-PCR akciğer içinde tümör kaynaklı mRNA duyarlı bir ölçüsünü sağlamak için potansiyele sahiptir.

<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP176-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet RNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5121&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25636&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25716&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gapdh Primer Sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr

Metastatik hastalık uzak organ primer kanser sitesinden habis tümör hücrelerinin yayılması ve kanserle ilişkili ölüm 1 birincil nedenidir. Metastatik yayılım Ortak siteleri akciğer, lenf nodu, beyin ve kemik 2 sayılabilir. Metastazı sürücü mekanizmalar kanser araştırmaları yoğun alanlardır. Metastaz uzak siteler kanser araştırmaları için enstrümantal şunlardır Sonuç olarak, tahliller metastatik yükünü ölçmek için. Meme tümörü modellerinde akciğer metastazlarının değerlendirilmesi, genel olarak, aşağıdaki akciğer dokusunun diseksiyon brüt niteliksel gözlem ile gerçekleştirilir. Metastazı değerlendirilmesinde nicel yöntemler şu anda ex vivo ve kullanıcı tanımlı parametre gerektiren vivo görüntüleme bazlı teknikler sınırlıdır. Bu tekniklerin çoğu oldukça hücresel düzeyde 3-6 den bütün organizma düzeyinde bulunmaktadır. Çoklu foton mikroskopi kullanılarak yeni görüntüleme yöntemleri metalar değerlendirebilecektir rağmenhücresel düzeyde 7&#39;de tasis, bu son derece zarif prosedürleri yayılma mekanizmaları yerine metastatik yükünün kantitatif değerlendirmesini değerlendirmek için daha uygundur. Burada, kantitatif metastaz değerlendirmek için basit bir in vitro yöntem sunulmaktadır. Kantitatif gerçek zamanlı PCR kullanılarak (QRT-PCR), tümör hücresi spesifik mRNA fare akciğer dokusu içinde tespit edilebilir.

Zaman ötesinde deneysel hayvana ve gerekirse, tümör hücrelerinin ilk aşılama gerçekleştirmek için gereken performans, in vivo tümör analizi, doku hasat, RNA izolasyonu ve QRT-PCR analizi birincil bir 1-2 günlük bir işlemdir (Şekil 1) . Brüt analizinin bir örneği, akciğer dokusu içindeki tümör hücrelerini değerlendirmek için bir biyoışıldama görüntülemedir. Burada, bir meme tümör oluşumu deneyi ACT1 denilen gap junction protein connexin43, hedefleyen bir araştırma ajan, akciğer 4T1-luc meme tümör hücrelerinin spontan metastaz zarar edip değerlendirmek amacıyla yapılmıştır. Tedavi, plasebo veya test maddesi almış olan hayvanların birkaç hafta sonra lusiferin ile enjekte edildi ve kurban edildi. Diseksiyon sonra, akciğerler lusiferaz biyoluminesans için görüntülendi. Temsili görüntülerde itibaren ilaçtan olduğunu akciğerlere görünüyortedavi edilen hayvanlar hiçbir tümör hücreleri ACT1 tedavisi (Şekil 2A) metastazı inhibisyonu gösteren, akciğer içinde mevcut olduğuna işaret lusiferaz aktivitesi için negatiftir. Bu temsili görüntüleri temel amacı, biyolojik olarak ışık veren görüntüleme metastazı tespit uygun bir yöntem olduğunu göstermektir. Ancak ACT1 ile tedavi edilen hayvanlardan elde akciğerlerin H &amp; E bölümlerinin detaylı inceleme üzerine, mikrometastazlar belki görüntüleme bu tür tümörün az sayıda algılayacak kadar hassas olmayabilir düşündüren, lusiferaz görüntüleme (Şekil 2B) tarafından aydınlatılan olmadığını tespit edildi Hücreler akciğer içinde gömülü. İdeal olarak, QRT-PCR için bir arkadaşı analizi bu sonuçları doğrulamak için yapılabilir olacaktır. Burada sunulan QRT-PCR analizi, HER2 + JIMT-1 hücrelerinden akciğer insan tümör hücreleri tespit etmek için, insan HER2 için bir prob spesifik kullandığıBaşlangıçta konak hayvanların meme yağ pedi (Şekil 3) içerisine nakledildi. Metastaz tümör gelişiminde sonra kendiliğinden oluştu. Diseksiyon üzerine, bir stereo mikroskop altında bakıldığı zaman, herhangi bir kötü görünebilen metastaz akciğer herhangi gözlendi. Ancak, sonraki QRT-PCR analizine dayalı bu görselleştirme tarafından algılanmayan olduğunu tümör hücrelerini düşündüren Şekil 3&#39;te oklarla gösterilen metastaz harboured tümör taşıyan hayvanların hasat onbir akciğerler, iki mevcut olduğu anlaşılmaktadır. JIMT-1-türevi tümör parçasından türetilen cDNA, bir negatif kontrol olarak kullanılmıştır, tümör hücreleri enjekte edilmiş değildi HER2 ekspresyonu (Şekil 3, (+)) ve bir fare, bir akciğer için bir pozitif kontrol olarak kullanılmıştır (Şekil 3, (-)). GAPDH bir fare spesifik prob total fare akciğer dokusuna insan tümör hücrelerinin oranını saptamak için bir iç kontrol olarak kullanıldı. Pozitif kontrolÖrnek bir referans olarak, kontrol akciğerden GAPDH seviyelerine normalleştirilmiştir. Alternatif normalleşme stratejisi kontrol örnekleri için daha tutarlı normalleşme seviyelerini elde etmek için tüm akciğer örneklerinin karşısında GAPDH miktarını ortalama olacaktır. GFP gibi fare olmayan ve insan olmayan genler için alternatif sondalar önce fare sokulmadan, buna göre etiketlendi tümör hücrelerini tespit etmek için ikame edilebilir. Ikinci bir analiz de akciğerde toplam tümör hücre sayısı mevcut bir nispi niceliğini sağlamak için yapıldı. Bu sonuçlar, Şekil 4&#39;te gösterilmektedir. Burada, standart bir eğri analizi, bir hücre numarası seri fare akciğer GAPDH normalize HER2 miktarını belirlemek için hazırlanmıştır. Teorik olarak, bu araştırmacı, 1x10 6 1x10 5, 1x10 4 1x10 HER2 göreceli miktarını belirlemek için izin verir <sup<html> &gt; 3, 1x10 2 ve 10 hücreleri. Sonuçlar QRT-PCR prob ve analiz gibi düşük 10 olarak hücreler (Şekil 4A) HER2 seviyelerini tespit etmek kadar hassas olduğunu gerçekleştirilen olduğunu göstermektedir. Elde edilen hesaplanan HER2 değerleri log-ölçekte çizilmiş, basit bir doğrusal regresyon analizi, her akciğer numune nispi hücre sayısı, hem de pozitif ve negatif kontroller belirlemek için kullanılmıştır. Şekil 4B&#39;de gösterildiği gibi, hücre sayısı, belirli değerler deneysel örnekler için elde edilmiştir. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53329/53329fig1.jpg" /> Içerlek büyütülmüş çizimde belirtildiği gibi Şekil akciğer diseksiyon ve analiz 1. şematik. Fare akciğer, 5 loblar içerir. Diseksiyonu analize QRT-PCR prosedür genellikle tamamlamak için 1-2 gün sürer.ge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53329/53329fig2.jpg" /> Metastaz 2. Brüt analizi Şekil. (A), 4T1-luc hücreleri enjekte edilmiş ve plasebo veya bir boşluk birleşim proteini connexin43 hedefleyen bir araştırma ilacı olarak adlandırılan ACT1 biri ile tedavi edilmiş hayvanların gelen akciğer Örnek biyolojik olarak ışık veren ve görüntüler. (B). Bir mikrometastazın Örnek H &amp; E bölümü ACT1 ile işlendi bir 4T1 tümörlü bir hayvanın akciğer. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53329/53329fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53329/53329fig3.jpg" /> Şekil 3. Temsilcisi QRT-PCR analizi. Çubuk grafikİnsan HER2, JIMT-1 insan meme kanseri hücre çizgisinde bir gen mevcut QRT-PCR analizi ile miktarı belirlenmiştir verileri temsil eden. Akciğer insan HER2 seviyeleri farenin GAPDH normalleştirilir. (+) Pozitif kontrol gösterir. (-) Negatif kontrol gösterir. Sonuçlar bir günlük ölçekte çizilir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53329/53329fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53329/53329fig4.jpg" /> Hücre sayısı analizi ile Şekil 4. Örnek QRT-PCR analizi (A). 1x10 6 ila 10 hücrelerinden JIMT-1 hücrelerinin hücre sayısı miktarı ile ilişkili olarak HER2 seviyeyi temsil eden grafik. Gelen miktarı belirlenmiştir verileri temsil eden (B) bir bar grafiktir İnsan HER2&#39;nin QRT-PCR analizi, JIMT-1 insan meme bir gen mevcut olabilircer hücre çizgisi. Akciğer insan HER2 seviyeleri farenin GAPDH normalleştirilir. (+) Pozitif kontrol gösterir. (-) Negatif kontrol gösterir. Sonuçlar bir günlük ölçekte çizilir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53329/53329fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="1" width="296"><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Şablon RNA </td><td> 0.5-2 mg </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> iScript Supermix </td><td> 4 ul / numune </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Nukleazsız su </td><td> 20 ul / numune kadar </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Birinci Strand Sentez reaksiyonu karışımı bileşenleri (adım 3.3.1). <table border="0" c<html> ellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot; fo: keep-together.within sayfa = &quot;1&quot; width = &quot;397&quot;&gt; <tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Aşama 1: 25 ° C </td><td> 5 dakika </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Aşama 2: 42 ° C </td><td> 30 dakika </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> 3. Adım: 85 ° C (sonlandırma) </td><td> 5 dakika </td></tr></tbody></table> First Strand Sentezi (adım 3.3.3) Tablo 2. PCR koşulları. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="1" width="295"><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> iTAQ Master Mix </td><td> 10 ul / numune </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Primer karışımı </td><td> 1 ul / numune </td></tr><tr height="20">&quot;&gt; Nükleazlar ücretsiz su </td><td> 20 ul / numune kadar </td></tr></tbody></table> Tablo 3. Real-time PCR reaksiyonu karışımı bileşenleri (adım 4.3). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="1" width="576"><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Adım 1 </td><td> Aktivasyon </td><td> 95 ° C </td><td> 2 dakika </td><td> 1 döngü </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> 2. Adım </td><td> Denatürasyon </td><td> 95 ° C </td><td> 5 sn </td><td> 40 devir </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"></td><td> Tavlama / Uzatma </td><td> 60 ° C </td><td> 30 sn </td><td></td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Aşama 3 </td><td> Eğri eritin (isteğe bağlı) </td><td> 65-95 ° C (0.5 artışlarla) </td><td> 5 sn / adım &lt;/ td&gt; <td></td></tr></tbody></table> Tablo 4. Gerçek zamanlı PCR koşulları (adım 4.5).

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR at JoVE.com

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Bu protokol fare akciğer dokusu içindeki metastazı temsil tümör hücre spesifik mRNA tespit etmek için kantitatif gerçek zamanlı PCR (QRT-PCR) nasıl kullanılacağı açıklanır.

Kantitatif gerçek zamanlı PCR ile fare meme tümör modellerinde akciğer metastazı Değerlendirilmesi

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

evaluation-lung-metastasis-mouse-mammary-tumor-models-quantitative

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

9.8K Görüntüleme.  Medical University of South Carolina.  Bu protokol fare akciğer dokusu içindeki metastazı temsil tümör hücre spesifik mRNA tespit etmek için kantitatif gerçek zamanlı PCR (QRT-PCR) nasıl kullanılacağı açıklanır. 

Video: Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Intravital Görüntüleme Gerçek Zamanlı tümörler Nanopartikül Alımı Değerlendirme

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Tıp

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

Meme Kanseri Beyin metastaz tümör Hipoksi Dynamics in vivo Biyoparlaklık Görüntüleme Fare Modeli

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) tarafından Prostat tümörlerinde mikroRNA Algılama

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

Kemik Metastaz Modelleri

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

Meme Kanseri Fare Modelleri Tümör Mikroçevre İlaç Yanıtlarının Görüntüleme Canlı

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

Rekabetçi bir mürin Kemik İliği Transplantasyon Modelinde Donör Hücre Aşı belirleme Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR kullanarak

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

Fare Akciğer Entübasyonun Basit Bir Yöntem

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Meme Kanseri Bir Roman Transgenik Fare Modeli: Adenovirüs-Kretasedekine ile epiteli Hedefleme ile Metastatik Meme Kanseri Başlatma

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Kantitatif Real Time PCR kullanarak Beyin Omurilik Sıvısı MicroRNA Profil

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Primer Tümör ve Akciğer Metastazı Eğitim için MEF Hücre İzolasyonu

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...