Name: generation of discriminative human monoclonal antibodies from rare antigen-specific b cells circulating in blood
Uploaded: 2018-02-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
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専門的な技術支援ありがとうフローサイトメトリー施設"CytoCell"(SFR 健康、Biogenouest、ナント)。彼らのテクニカル サポートもすべてのスタッフが組換えタンパク質の生産 (P2R) とプラットフォームの影響 (INSERM 1232、SFR 健康、Biogenouest、ナント) にありがちましょう。原稿の建設的なコメント、エマニュエル Scotet とリチャード ・ ブレスナックに感謝します。この仕事財政的に、IHU セスタス プロジェクトで、フランス国立研究機関 (ANR) (ANR-10-IBHU-005) を管理する «Investissements d'Avenir» フランス政府プログラムによって資金を供給によって支えられました。IHU セスタス プロジェクトはナントとペイ ・ ド ・ ラ ・ ロワール地方でもサポートされます。この作品は、将来プログラム ANR-11-LABX-0016-01 の投資を通して国立研究機関によってサポートされて LabEX 囲碁プログラムのコンテキストで実現しました。

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著者が明らかに何もありません。

提案プロトコルは血で循環 Ag 特定の B 細胞から直接人間の抗体の生成のための強力な方法です。それは 3 つの重要な側面を組み合わせた: (i)、四量体関連磁気濃縮、まれな Ag-結合 B 細胞の前のヴィヴォ分離ができるの使用(cytometry 流れによって、BCR に関する必要な Ag; を発現する B 細胞のみを分離する 3 つの異なる蛍光色素で標識 3 つの Ag テトラマー (2 つの関連するものと無関係なものを 1 つ) を使用して ii) のゲートの戦略(iii) RT-PCR 単一セルのレベルで人間の細胞の Cdna の発現によって対応する組み換え mAb Cdna の再建。
以前の研究は、1 つまたは 2 つの蛍光関連抗原を使用して分離された B セル6,7,8から Mab の並べ替えおよびそれ以降の生産の前に人間の B 細胞をラベルする.関節リウマチ患者の 1 つの分析と自己免疫マウス モデルで 1 つは、自己反応性 B 細胞の特徴し、その周波数10,11を決定する無関係な蛍光抗原を関連付けられています。私たちが知っている限りでは、2 つの蛍光関連抗原テトラマーの組み合わせを使用し、1 つの無関係な抗原の四量体が完全ひと抗体の生産のため、使用前に特定の B 細胞の濃縮のため以前記載されていません。この最適化手法により、一ヶ月ほどで取得する完全に人間差別 Mab とナイーブ B 細胞レパートリーの中から始まる場合でも正常に実行できます。したがって、それはバクテリオファージの表示、ヒト B 細胞の不死化の主要な欠点のどれもまたは他前述の mAb の分子生物学的再建術。
このセルソーター戦略 Ag 固有人間 Mab の高収量の回復で起因します。単一の隔離された B セルの重鎖および軽鎖セグメントのペアは約 50% の成功率で増幅されます。軽鎖セグメントがほとんど常に増幅され、しかし、これは重鎖セグメントの場合ではないです。RT-PCR の効率は、次の点を尊重するのに大きく依存: 私) 並べ替えられた単一 B 細胞を限り早く冷凍する必要がありますii) RNase 阻害剤と B 細胞を取り出し、冷凍庫と RT の反作用を進水間の時間を最小限に抑えることの 30 単位を追加します。iii) 融解氷; すべてプライマーiv) 決して凍結/融解プライマー 3 倍以上。v) ストッキング最長 1 年のためのプライマー。
必要な特異性に対応する組換え抗体の生産効率に関する pMHC 特定の抗体のためのケースの約 30-40% です。特定クローンのモノクローナル抗体、ペプチドとはかなり厳しい、MHC 分子を認識する、我々 は以前より従来の抗原に対して指示される特定の Mab の回復の全体的な収率が 100% を優れているに、Β-ガラクトシダーゼの抗原9。それは無関係な四量体の適切な Ag の選択は生産モノクローナル抗体の特異性を上げることは重要ことを強調する必要があります。
本稿で説明した抗 HLA-A2/Pp65 モノクローナル抗体 (PC1.02) の親和性は比較的低い、約 7 × 10-6 M、TCR のアフィニティに類似。B 細胞の分離は素朴なドナーから行われたように、この結果は予想されました。ほとんどの四量体+ B 細胞は IgM+IgG-、良い Ag バインダーの取得の確率を減らす.それにもかかわらず、このメソッドすることも可能な並べ替え交差反応性メモリ B から素朴なドナーから必要な Ag に対する細胞免疫学的過去個人12のため。また、このメソッドは、ワクチン接種や感染の患者または免疫ヒト動物に簡単に適用できる9の説明に従って体内親和性成熟が約 1 × 10-9結果モノクローナル抗体の親和性を増やすことができます m. 様々 な手順は、モノクローナル抗体の in vitro、特にを通じて再現体性 hypermutation (文献13) 抗体を発現する細胞での親和性を改善するためにも記載されています。
結論としては、素朴なワクチン接種ドナーまたは自己免疫疾患に苦しむ患者個々 の状況の様々 なタイプで使用できる高い弁別 Mab 生産のため汎用性の高い戦略を提案する.目的エピトープに対してこの方法で生成された完全ひと抗体は、免疫療法の基礎研究とも役に立つ可能性があります。

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The Affiliations section was corrected from:
Marie-Claire Devilder1,2,&#160;M&#233;linda Moyon1,2,&#160;Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1 
1Centre R&#233;gional de Recherche en Canc&#233;rologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Universit&#233; de Nantes 
2CHU Nantes
to:
Marie-Claire Devilder1,2,3,&#160;M&#233;linda Moyon1,2,3,&#160;Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2&#160; 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Universit&#233; d&#39;Angers, Universit&#233; de Nantes 
2LabEx IGO, &#34;Immunotherapy, Graft, Oncology&#34; 
3CHU, Nantes, France

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Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

ここで説明する方法は、目的の抗原 (Ag) に対するモノクローナル抗体 (Mab) を完全に人間の迅速かつ汎用性の高い生産を可能します。Mab は、多くの基礎研究アプリケーションin vitroとin vivoで不可欠なツール: たとえばフローサイトメトリー、組織学、西部のしみを付けおよびブロックの実験の流れ。さらに、自己免疫疾患、がん、治療し、移植拒絶反応1を制御する Mab をより多くに医学で使用されています。たとえば、反 ctla の条項 4、抗 PD 1 (またはアンチ PD L1) Mab は最近がん治療2免疫チェックポイント阻害剤として使用されました。
免疫グロブリン (Ig) で作り出された最初のモノクローナル抗体-免疫マウスまたはラットの脾臓細胞から得られたハイブリドーマを分泌します。ただし、マウスまたはラット モノクローナル抗体と強い免疫反応は、その急速なクリアランスと過敏反応3のありそうな誘導のための人間の彼らの治療上の使用を妨げます。この問題に取り組むため、Mab の動物性タンパク質シーケンス部分的に取って代わられましたいわゆるキメラ マウス ヒトやヒト化抗体を生成する人間の物。ただし、この戦略は部分的にしかコストと生産時間規模の両方を大幅に増加させながら、免疫原性を減少します。よい解決策はヒト B 細胞から直接人間の抗体を生成する、このためのいくつかの戦略があります。それらの 1 つは、ファージや酵母のディスプレイの使用です。これは含まランダム人間 Ig 重のコンビナトリアル ライブラリから可変領域を表示し、光チェイン ファージや酵母と興味の特定の抗原を用いた選択のステップを実施します。この方法の主な欠点は、重く、軽鎖がランダムに関連付けられ、生成された抗体の多様性の非常に大きな増加につながることです。抗体は特定 Ag に対する自然免疫応答から生じるだろっているものに対応しています。また、人間のタンパク質の折りたたみおよびポスト翻訳の修正、複製は、体系的に原核生物や酵母。2 番目の人間 mAb 生産方法は、エプスタイン ‐ バーウイルス感染や抗アポトーシス因子 BCL 6 および BCL-XL4発現によって自然の人間の B 細胞の不死化です。ただし、このメソッドは、メモリー B 細胞にのみ適用され、多数 mAb 生産不死化 B 細胞が目的の抗原特異性と (もしあれば) いくつかの mAb のクローンを識別するためにスクリーニングを必要とする、効率的ではありません。メソッドはこのように高価な時間のかかるです。
新しいプロトコルは、隔離された単一 B 細胞5から人間の抗体の生産の最近記載されています。最適化された単一セル逆転写-ポリメラーゼの連鎖反応 (RT-PCR) の増幅の両方、重と光-鎖のセグメントを単一の並べ替えられた B 細胞からのエンコードを依存しています。真核生物発現系、完全に人間の mAb の再構築をできるように、クローニングと発現のこれらのセグメントのこの続きますです。このプロトコルは、ワクチン接種ドナーからの B 細胞から正常に使用されています。セルを目的の Ag に対して指示される B 細胞の高い周波数を取得し、6をスクリーニングするために必要な時間を制限するワクチン接種後数週間収穫されました。他の完全ひと抗体は、HIV+ (ひと免疫不全ウイルス) 感染患者7と黒色腫患者8から生産されています。これらの進歩にもかかわらずプロシージャがないまだ利用可能メモリ表現型や頻度の独立した Ag 固有の B 細胞の分離ができます。
手順ここで効率的な前のヴィヴォ完全ひと抗原特異的モノクローナル抗体低上映時間と高収率で生産が続く、BCR 特異性に基づいて人間の循環 B 細胞の分離につながる。メソッドは、メモリー B 細胞や抗体産生 B 細胞免疫反応を誘導する制限されていないが、人間ナイーブ B 細胞レパートリーにも適用することができます。Ag 特定 B 細胞は非常に低い周波数で存在からでも動作する、効率の良い指標です。法の原理は次のように: 末梢血単核細胞 (PBMC) は興味の抗原を提示 2 テトラマーと汚れる、それぞれ異なる蛍光色素 (例えば、フィコエ リスリン (PE)、アロフィコシアニン (APC))、というラベルの付いた密接に関連抗原提示第 3 四量体共役 3 蛍光色素 (例えば、ブリリアント バイオレット 421 (BV421))。抗原結合セルの豊かにする細胞は、抗 PE をコートしたビーズと孵化させると反 APC Abs、細胞分離カラムでソートします。PE+ APC+細胞画分が選択されます種類 PBMC 細胞 B 細胞の同定を許可するために特定の抗体の様々 なステンド グラスと受ける流れ cytometry 細胞選別します。PE+と APC+、鮮やかなバイオレット-、しかしである B 細胞は分離されています。この手順は、カウンター B 細胞ではないまたは tetramerized の抗原にはバインドしませんが、PE/APC (PE+ APC-または PE- APC+これらの細胞になる) または使用されるテトラマー (これらの非抗原部分にバインドを行うセルを選択しますセルになります BV421+)。B 細胞の高い関心のエピトープに固有ではないがこのステップでも反選択されます (これらの細胞に BV421 なるも+)。したがって、このメソッドは、表現する B 細胞受容体 (BCRs) 2 つの非常に密接に関連抗原の間で区別することができる非常に特定の B 細胞を浄化できます。チューブに収集され、単一の特定の B 細胞と、Ig の PCR 増幅 Cdna (相補的デオキシリボ核酸) を複製し、分泌された IgG 抗体としてのひと細胞ラインで表現。
概念の証拠としてこの調査は記述するペプチドが提示主要な組織適合性の複雑なクラスによって認識される人間の抗体の効率的な生成 (MHC-私) 分子とを区別することができますこのペプチドと同じで読み込まれる他のペプチドMHC-私の対立遺伝子。このメソッドは (i) に Ag 固有 Mab; の高収量回復を可能この Ag の複雑さのレベルは重要ですが、(ii) 構造的に 2 つを区別することができるモノクローナル抗体の生産は、Ags を閉じます。このアプローチは、プロトコルのままには、ワクチン接種や感染患者に拡張することができます、ヒト化ラット システム9にもすでに、正常に実装されています。したがって、本研究は基礎研究と免疫療法で使用することができます完全ひと抗体を生成する汎用性と効率的なアプローチについて説明します。

<table><tbody><tr><td>HEK 293A cell line</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1X) Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco by life technologies</td><td>21969-035</td><td>(+) 4,5g/L D-Glucose&lt;br/&gt; 0,11g/L Sodium Pyruvate&lt;br/&gt; (-) L-Glutmine</td></tr><tr><td>RPMI medium1640 (1X)</td><td>Gibco by life technologies</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td><td>PAA</td><td>K45-001</td><td></td></tr><tr><td>Nutridoma-SP</td><td>Roche</td><td>11011375001</td><td>100X Conc</td></tr><tr><td>PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8</td><td>Invitrogen by Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine serum (FBS)</td><td>Dominique Dutscher</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll - lymphocytes separation medium</td><td>EuroBio</td><td>CMSMSL01-01</td><td>density 1,0777+/-0,001</td></tr><tr><td>streptavidin R-phycoerythrin conjugate</td><td>Invitrogen by Life Technologies</td><td>S21388</td><td>premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide</td></tr><tr><td>Streptavidin, allophycocyanin conjugate</td><td>Invitrogen by thermoFisher scientific</td><td>S32362</td><td>1mg/ml&lt;br/&gt; 2mM azide premium grade</td></tr><tr><td>Brilliant violet 421 streptavidin</td><td>Biolegend</td><td>405225</td><td>conc : 0,5mg/ml</td></tr><tr><td>Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACs or QuadroMACS separotor</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302/130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>CD3 BV510 BD horizon</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>563109</td><td>Used dilution 1:20</td></tr><tr><td>CD19 FITC</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>345788</td><td>Used dilution 1:20</td></tr><tr><td>CD14 PerCPCy5.5</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>561116</td><td>Used dilution 1:50</td></tr><tr><td>CD16 PerCPCy5.5</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>338440</td><td>Used dilution 1:50</td></tr><tr><td>7AAD</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>51-68981E (559925)</td><td>Used dilution 1:1000</td></tr><tr><td>FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-strip PCR tubes</td><td>Axygen</td><td>321-10-061</td><td></td></tr><tr><td>Racks for 96 microtubes</td><td>Dominique Dutscher</td><td>45476</td><td></td></tr><tr><td>RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant)</td><td>Invitrogen by thermoFisher scientific</td><td>10777-019</td><td>qty:5000U (40U/ul)</td></tr><tr><td>Distilled Water Dnase/Rnase Free</td><td>Gibco</td><td>10977-035</td><td></td></tr><tr><td>Oligod(T)18 mRNA Primer</td><td>New England BioLabs</td><td>S1316S</td><td>5.0 A260unit</td></tr><tr><td>Random hexamers</td><td>Invitrogen by thermoFisher scientific</td><td>N8080127</td><td>qty : 50uM, 5nmoles</td></tr><tr><td>Superscript III Reverse transcriptase</td><td>Invitrogen by thermoFisher scientific</td><td>18080-044</td><td>qty : 10000U (200U/ul)</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA polymerase</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set, Molecular biology grade</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0182</td><td>4*100umol</td></tr><tr><td>5LVH1</td><td>Eurofins</td><td>ACAGGTGCCCACT&lt;br/&gt; CCCAGGTGCAG</td><td>First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers</td></tr><tr><td>5LVH3</td><td>Eurofins</td><td>AAGGTGTCCAGTG&lt;br/&gt; TGARGTGCAG</td><td>First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers</td></tr><tr><td>5LVL4_6</td><td>Eurofins</td><td>CCCAGATGGGTCC&lt;br/&gt; TGTCCCAGGTGCAG</td><td>First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers</td></tr><tr><td>5LVH5</td><td>Eurofins</td><td>CAAGGAGTCTGTT&lt;br/&gt; CCGAGGTGCAG</td><td>First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers</td></tr><tr><td>3HuIgG_const_anti</td><td>Eurofins</td><td>TCTTGTCCACCTT&lt;br/&gt; GGTGTTGCT</td><td>First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening</td></tr><tr><td>3CuCH1</td><td>Eurofins</td><td>GGGAATTCTCACA&lt;br/&gt; GGAGACGA</td><td>First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_5_7</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC&lt;br/&gt; GAGGTGCAGCTGGTGCAG</td><td>Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5AgeIVH3</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT&lt;br/&gt; GAGGTGCAGCTGGTGGAG</td><td>Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5AgeIVH3_23</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT&lt;br/&gt; GAGGTGCAGCTGTTGGAG</td><td>Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5AgeIVH4</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC&lt;br/&gt; CAGGTGCAGCTGCAGGAG</td><td>Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5AgeIVH4_34</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC&lt;br/&gt; CAGGTGCAGCTACAGCAGTG</td><td>Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_18</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC&lt;br/&gt; CAGGTTCAGCTGGTGCAG</td><td>Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_24</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC&lt;br/&gt; CAGGTCCAGCTGGTACAG</td><td>Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5AgeIVH3__9_30_33</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT&lt;br/&gt; GAAGTGCAGCTGGTGGAG</td><td>Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5AgeIVH6_1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC&lt;br/&gt; CAGGTACAGCTGCAGCAG</td><td>Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers</td></tr><tr><td>3SalIJH1_2_4_5</td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG&lt;br/&gt; CTGAGGAGACGGTGACCAG</td><td>Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers</td></tr><tr><td>3SalIJH3</td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG&lt;br/&gt; CTGAAGAGACGGTGACCATTG</td><td>Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers</td></tr><tr><td>3SalIJH6</td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG&lt;br/&gt; CTGAGGAGACGGTGACCGTG</td><td>Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers</td></tr><tr><td>5&#039;LVk1_2</td><td>Eurofins</td><td>ATGAGGSTCCCYG&lt;br/&gt; CTCAGCTGCTGG</td><td>First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5&#039;LVk3</td><td>Eurofins</td><td>CTCTTCCTCCTGC&lt;br/&gt; TACTCTGGCTCCCAG</td><td>First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5&#039;LVk4</td><td>Eurofins</td><td>ATTTCTCTGTTGC&lt;br/&gt; TCTGGATCTCTG</td><td>First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers</td></tr><tr><td>3&#039;Ck543_566</td><td>Eurofins</td><td>GTTTCTCGTAGTC&lt;br/&gt; TGCTTTGCTCA</td><td>First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening</td></tr><tr><td>5&#039;AgeIVk1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT&lt;br/&gt; GACATCCAGATGACCCAGTC</td><td>Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5&#039;AgeIVk1_9_1&amp;ndash;13</td><td>Eurofins</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC&lt;br/&gt; ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT</td><td>Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5&#039;AgeIVk1D_43_1_8</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTGT&lt;br/&gt; GCCATCCGGATGACCCAGTC</td><td>Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5&#039;AgeIVk2</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATGGG&lt;br/&gt; GATATTGTGATGACCCAGAC</td><td>Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5&#039;AgeIVk2_28_2_30</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATGGG&lt;br/&gt; GATATTGTGATGACTCAGTC</td><td>Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5&#039;AgeVk3_11_3D_11</td><td>Eurofins</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC&lt;br/&gt; ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC</td><td>Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5&#039;AgeVk3_15_3D_15</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCA&lt;br/&gt; GAAATAGTGATGACGCAGTC</td><td>Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5&#039;AgeVk3_20_3D_20</td><td>Eurofins</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC&lt;br/&gt; ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT</td><td>Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5&#039;AgeVk4_1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCG&lt;br/&gt; GACATCGTGATGACCCAGTC</td><td>Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers</td></tr><tr><td>3&#039;BsiWIJk1_2_4</td><td>Eurofins</td><td>GCCACCGTACGTT&lt;br/&gt; TGATYTCCACCTTGGTC</td><td>Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers</td></tr><tr><td>3&#039;BsiWIJk3</td><td>Eurofins</td><td>GCCACCGTACGTT&lt;br/&gt; TGATATCCACTTTGGTC</td><td>Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers</td></tr><tr><td>3&#039;BsiWIJk5</td><td>Eurofins</td><td>GCCACCGTACGTT&lt;br/&gt; TAATCTCCAGTCGTGTC</td><td>Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5&#039;LVl1</td><td>Eurofins</td><td>GGTCCTGGGCCCA&lt;br/&gt; GTCTGTGCTG</td><td>First round of PCR - Amplification of light chains &amp;lambda; - Outer primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5&#039;LVl2</td><td>Eurofins</td><td>GGTCCTGGGCCCA&lt;br/&gt; GTCTGCCCTG</td><td>First round of PCR - Amplification of light chains &amp;lambda; - Outer primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5&#039;LVl3</td><td>Eurofins</td><td>GCTCTGTGACCTC&lt;br/&gt; CTATGAGCTG</td><td>First round of PCR - Amplification of light chains &amp;lambda; - Outer primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5&#039;LVl4_5</td><td>Eurofins</td><td>GGTCTCTCTCSCA&lt;br/&gt; GCYTGTGCTG</td><td>First round of PCR - Amplification of light chains &amp;lambda; - Outer primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5&#039;LVl6</td><td>Eurofins</td><td>GTTCTTGGGCCAA&lt;br/&gt; TTTTATGCTG</td><td>First round of PCR - Amplification of light chains &amp;lambda; - Outer primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5&#039;LVl7</td><td>Eurofins</td><td>GGTCCAATTCYCA&lt;br/&gt; GGCTGTGGTG</td><td>First round of PCR - Amplification of light chains &amp;lambda; - Outer primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5LVl8</td><td>Eurofins</td><td>GAGTGGATTCTCA&lt;br/&gt; GACTGTGGTG</td><td>First round of PCR - Amplification of light chains &amp;lambda; - Outer primers -Forward primers</td></tr><tr><td>3&#039;Cl</td><td>Eurofins</td><td>CACCAGTGTGGCC&lt;br/&gt; TTGTTGGCTTG</td><td>First round of PCR - Amplification of light chains &amp;lambda; - Outer primers -Forward primers</td></tr><tr><td>5&#039;AgeIVl1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCCTGGGCC&lt;br/&gt; CAGTCTGTGCTGACKCAG</td><td>Second round of PCR - Amplification of light chains &amp;lambda; - Inner primers -forward primers</td></tr><tr><td>5&#039;AgeIVl2</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCCTGGGCC&lt;br/&gt; CAGTCTGCCCTGACTCAG</td><td>Second round of PCR - Amplification of light chains &amp;lambda; - Inner primers -forward primers</td></tr><tr><td>5&#039;AgeIVl3</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCTGTGACC&lt;br/&gt; TCCTATGAGCTGACWCAG</td><td>Second round of PCR - Amplification of light chains &amp;lambda; - Inner primers -forward primers</td></tr><tr><td>5&#039;AgeIVl4_5</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCTCTCTCS&lt;br/&gt; CAGCYTGTGCTGACTCA</td><td>Second round of PCR - Amplification of light chains &amp;lambda; - Inner primers -forward primers</td></tr><tr><td>5&#039;AgeIVl6</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCTTGGGCC&lt;br/&gt; AATTTTATGCTGACTCAG</td><td>Second round of PCR - Amplification of light chains &amp;lambda; - Inner primers -forward primers</td></tr><tr><td>5&#039;AgeIVl8</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCCAATTCY&lt;br/&gt; CAGRCTGTGGTGACYCAG</td><td>Second round of PCR - Amplification of light chains &amp;lambda; - Inner primers -forward primers</td></tr><tr><td>3&#039;XhoICl</td><td>Eurofins</td><td>CTCCTCACTCGAG&lt;br/&gt; GGYGGGAACAGAGTG</td><td>Second round of PCR - Amplification of light chains &amp;lambda; - Inner primers -Reverse primers - Bacteria PCR screening</td></tr><tr><td>Ab-vec-sense</td><td>Eurofins</td><td>GCTTCGTTAGAAC&lt;br/&gt; GCGGCTAC</td><td>Bacteria PCR screening</td></tr><tr><td>QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade</td><td>MP Bio</td><td>AGAH0500</td><td></td></tr><tr><td>NucleoFast 96 PCR Plate</td><td>Macherey Nagel</td><td>743.100.100</td><td></td></tr><tr><td>Enzyme Age I HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3552L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>Enzyme SalI HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3138L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>Enzyme Xho I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>Enzyme BSIWI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0553L</td><td>10000U/ml</td></tr><tr><td>HCg1 (Genbank accession number FJ475055)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LCk (Genbank accession number FJ475056 )</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LCl (Genbank accession number FJ517647)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>Invitrogen by thermoFisher scientific</td><td>15224.017</td><td>100U (1U/ul)</td></tr><tr><td>2X YT medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1003-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10835242001</td><td></td></tr><tr><td>LB (Luria Bertani) Broth (Lennox)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022-250G</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification</td><td>Macherey Nagel</td><td>740588.250</td><td></td></tr><tr><td>Jet PEI DNA transfection reagent</td><td>PolyPlus</td><td>101-40</td><td></td></tr><tr><td>Flat bottom96-well plate</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>V-bottom 96-well plate</td><td>Nunc/Thermofisher</td><td>055142</td><td></td></tr><tr><td>Nunc easy 175 cm2 flasks</td><td>Nunc/Thermofisher</td><td>12-562-000</td><td></td></tr><tr><td>ELISA/ELISPOT coating buffer</td><td>eBiosciences</td><td>00-0044-59</td><td></td></tr><tr><td>Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates</td><td>Nunc/Thermofisher</td><td>44-2404-21</td><td>high protein binding</td></tr><tr><td>Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP)</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>55788</td><td></td></tr><tr><td>TMB substrate</td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Sigma</td><td>S0677</td><td></td></tr><tr><td>1 mL-HiTrap protein A HP column</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0402-01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Auml;KTA FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>18190026</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL column</td><td>GE Healthcare</td><td>17517501</td><td></td></tr><tr><td>NGC Quest 10 Plus Chromatography System</td><td>BioRad</td><td>7880003</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of discriminative human monoclonal antibodies from rare antigen-specific b cells circulating in blood

モノクローナル抗体 (Mab) は、両方の基礎研究および生体医に役立つ強力なツールです。抗体は (例えば、正常な蛋白質およびその変異バージョン) の関連性の高い構造を区別する必要がある場合、高い特異性が必要不可欠です。このような差別の Mab を生成する現在の方法には高価な時間のかかる複数の Ab-産生 B 細胞のスクリーニングが含まれます。提案する迅速かつコスト効果の高い方法の識別、生成のため B リンパ球を循環血液から始まって完全ひと抗体.この戦略の独創性は、容易に利用可能な末梢血単核細胞 (PBMC) を使用して、他のすべてのセルのカウンターの選択を組み合わせる特異抗原結合 B セルの選択によるものです。単一のセルを逆転写ポリメラーゼの連鎖反応 (RT-PCR) 技術を使用して人間で表されるその後に対応する mAb のコーディング (相補的デオキシリボ核酸) cDNA シーケンスを取得特定の B 細胞が分離されたら、セルです。わずか 1 ヶ月で、内自然 B 細胞レパートリーによって検出されたあらゆる目的の抗原に対して指示される高い識別人間 Mab のミリグラムを生成することが可能です。

このプロジェクトでは、ペプチド Pp65495を認識する人間の Mab の世代に健康なドナーから PBMC から始まって主要な組織適合性の複雑なクラスによって (Pp65、ヒトサイトメガロから) 提示私 (MHC-私) 分子 HLA A * 0201 (HLA-A2)。これらの Mab を区別このコンプレックスと同じ MHC に読み込まれる他のペプチドを表す複合体-私の分子。
PBMC は、HLA A2 Pp65 PE、HLA-A2/Pp65-APC、HLA A2/MelA2 BV421 テトラマー上記プロトコルで説明したようと染色.PE と APC テトラマー陽性細胞の免疫細胞濃縮後、溶出細胞は追加モノクローナル抗体で染色しました。流れ cytometry セルソーターの磁気濃縮細胞が実行可能な CD14 のゲート最初-CD16-CD3-CD19+シングレット (B 細胞)。BCRs HLA-A2/Pp65 と他を区別することができるを発現する B 細胞を隔離するゲート戦略関連 HLA-A2 ・ ペプチド複合体を図 1に示します。ゲーティング HLA-A2/Pp65 PE+と HLA-A2/Pp65 APC+ PE+または APC+単独で染色した螢光色素の特定の B 細胞を除外するのには、二重陽性後興味の B セルの選択を行った。最後に、非常に特定の B 細胞は HLA A2/MelA2 BV421 否定的な細胞のゲーティングによって識別されました。これにより、BCRs ペプチドと HLA A2 依存的 HLA-A2/Pp65 をバインドできないこれらの B 細胞と β 2 ミクログロブリン、ビオチン、HLA-A2、または差別しないそれらに対して指示されるそれらの間差別を発現する B 細胞の同定MHC バインディングの溝にペプチド。すべてのこれらの後者のセル BV421 陽性細胞になります。先ほどさらに Ag の他の種類の文書化と、この除外戦略は Ag9の B 細胞の識別能力の増加によるより重要です。
単一の特定の B 細胞がソートされた後は、RT-PCR により増幅した Cdna が重いと光 Ig チェーンのエンコーディングします。重いと光の鎖セグメントのコーディングのペアは、単一 B 細胞テスト (表 1) の約 50% で得られました。シーケンスは、式に複製された可変ベクトル一定のドメインの対応するシーケンスが含む (重い定数 1 と光定数 κ または λ)。人間の萌芽期の腎臓の細胞 (HEK、293A 細胞) は、重鎖および軽鎖のベクトル cotransfected でした。IgG1 アイソタイプの分泌された抗体は、トランスフェクション (完全ひと抗体生産のグローバル戦略の図 3参照) 後 5 日 293A 細胞の培養上清から収穫されました。これは正常に重いと光の鎖セグメント (表 1) をコーディングのペアを降伏 3 の単一の B リンパ球細胞から始まって 1 つの HLA-A2/Pp65 特定の抗体を生産しました。ELISA の試金が明らかになった、この mAb は両方 MHC とペプチドに依存 (図 4 a)、HLA-A2/Pp65 錯体にそのバインドと mAb の数ミリグラムが (例えば、親和性の分析、分析を進めるため容易に作り出されました。機能試金)。その結合親和性、表面プラズモン共鳴 (SPR) によって決定された約 7 × 10-6 M (図 4 b)。
したがって、この記事は i) 関連する Ag 特定の B 細胞の検出を可能にする敏感かつ効率的なメソッドの組み合わせを表す、さらに健常者の血と高い識別人間 Mab の二世代で非常に低い周波数で現在とき。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56508/56508fig1.jpg"> 図 1: 人間の PBMC から HLA-A2/Pp65 特定の B 細胞の検出。 3 × 10 の8 PBMC HLA A2 Pp65 PE、HLA-A2/Pp65-APC、HLA A2/MelA2 BV421 テトラマーと染色.PE と APC テトラマー陽性細胞の免疫細胞濃縮後、溶出細胞は追加モノクローナル抗体で染色しました。流れの cytometry セルソーターのセルは実行可能な一重項 CD14 の最初ゲートが-CD16、CD19 の-のリンパ球の (表示されていません)+CD3-細胞。その後、B 細胞の HLA A2 Pp65 PE と HLA A2 Pp65 APC テトラマーで染色されたゲート。HLA A2/メラ BV421 テトラマーはペプチドと MHC 依存的 HLA-A2/Pp65 を認識していない B 細胞を除外する使用されました。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56508/56508fig2.jpg"> 図 2: 増幅と Ig 遺伝子のクローニングのための戦略。光と重い遺伝子 Ig チェーンは、入れ子になった RT-PCR により増幅しました。リーダー地域および逆プライマー適切な重い、軽いカッパまたは光ラムダ チェーンの定数領域の特定を交配させること前方のプライマーの組み合わせで最初の Pcr を行った。制限のサイトを含むプライマー第 2 Pcr を行った、前方および逆プライマー V セグメントの先頭のと J セグメントの終わりのためにそれぞれ固有。PCR の製品は制限の酵素と消化と適切な一定のドメインを含む発現ベクターにクローンとして作られたシーケンスに配置されました。CMV: サイトメガロ ウイルス プロモーター。アンピシリンの AmpR: 抵抗性遺伝子。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56508/56508fig3.jpg"> 図 3: 組換えヒト抗体の再構築の全体的な戦略。 四量体ベースの並べ替え方法では、興味の B 細胞の検出をことができます。非常に特定の B 細胞は単一セルの並べ替え.光と重い Ig チェーン エンコード セグメントは、RT-PCR を使用して増幅されました。変数の領域のシーケンスは、一定の光と重い領域をエンコードする遺伝子セグメントでフレームに別の真核生物発現ベクターにクローンしました。対応する完全ひと抗体は、一過性トランスフェクション HEK 293A 細胞によって表現され、培養上清より精製しました。この図は、Ouisseらから変更されました。(2017)9。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56508/56508fig4.jpg">
図 4: HLA-A2/Pp65 ひと末梢血 B 細胞を循環から生成に対する代表的な高い弁別 mAb の性格描写。 A) elisa 法による特異性モノクローナル抗体 HLA-A2/Pp65 に対して PC1.02 のテストします。プレートは関連する (HLA-A2/Pp65) または HLA A2 制限ペプチドを含む無関係な HLA A2 複合体でコーティングした: メラ、NS3 (c 型肝炎ウイルス-1)、および GagP17 (HIV-1) で 2 μ g/mL、PC1.02 が追加されたモノクローナル抗体、抗ひと IgG HRP Ab が検出のために使用されました。光学密度 (OD) を読んだ時 450 nm。B) PC1.02 表面プラズモン共鳴 (SPR) の CM5 チップ バインド mAb 流れる濃度 HLA-A2/Pp65 錯体を用いたモノクローナル抗体の親和性決定。この図は、Ouisseらから変更されました。(2017)9。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>PBMC の数</td>
			<td>PE + APC + 濃縮後細胞数</td>
			<td>除外 (BV421 +) セルの数</td>
			<td>並べ替えられた単一セルの数</td>
			<td>分析された井戸数</td>
			<td>HC と LC の井戸の数 (% 回復) を関連付けられています。</td>
			<td>Mab 生産数</td>
			<td>特定の抗体の数</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-A2/Pp65 モノクローナル抗体 (PC1.02)</td>
			<td>3 × 10 の8
</td>
			<td>818</td>
			<td>117</td>
			<td>161</td>
			<td>7</td>
			<td>3 (43%)</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: HLA-A2/Pp65 特定の B 細胞の解析。 不明確な B 細胞、Ig 遺伝子増幅と mAb 生産分離 HLA-A2/Pp65 特定 B 細胞からの利回りの除外戦略の効果は、評価測定でした。

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Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

希少な B 細胞人間の血液循環から始まって、興味の抗原のために特定の抗体の生産のための手法について述べる。これらの自然抗体の生成は効率的かつ迅速、得られた抗体関連性の高い抗原の間で区別することができます。

まれな抗原特異的 B 細胞血液の循環から弁別に対するモノクローナル抗体の生成

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

generation-discriminative-human-monoclonal-antibodies-from-rare

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.3K ビュー.  Université de Nantes. 希少な B 細胞人間の血液循環から始まって、興味の抗原のために特定の抗体の生産のための手法について述べる。これらの自然抗体の生成は効率的かつ迅速、得られた抗体関連性の高い抗原の間で区別することができます。

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Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

臍帯血から前駆B細胞サブセットの分離

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

免疫・感染学

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

末梢血からのヒトアロ抗原特異的T細胞の生成

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

不死化ソートB細胞からの組換えヒトIgGモノクローナル抗体の作製

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

ハイブリドーマ技術によってマウスモノクローナル抗体の作製

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

表現型および機能解析のためのレア抗原特異的B細胞の検出および濃縮

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

天然物に対するモノクローナル抗体の作製

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational methods, such as next generation sequencing (NGS), yield enormous sets of data on the antibody repertoire at the sequence level, functional data is required to identify which sequences are relevant for a particular antigen or set of antigens. Here, we describe a method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from a human blood donor. This method utilizes an initial enrichment of mature B cells and requires a combination of phenotypic cell markers and fluorescently-labeled protein to isolate IgG memory B cells via flow cytometry. The heavy and light chain variable regions are then cloned and re-screened. Although limited to the memory B cell compartment, this method takes advantage of flow cytometry to interrogate millions of B cells and returns paired heavy and light chain sequences from a single cell in a format ready for expression and confirmation of specificity. Antibodies recovered with this method can be considered for therapeutic potential, but can also link specificity and function with bioinformatic approaches to assess the B cell repertoire within individuals.

The BSelex method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from human peripheral blood mononuclear cells combines flow cytometry with single cell PCR and cloning.

濃縮ヒト記憶B細胞集団からの所望特異性を持つ抗体の選択と回収のための単細胞スクリーニング法

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational ...

Antibody Generation: Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4 
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
2 Center for Immunology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
3 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
4 Masonic Cancer Center, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
Polyclonal antibodies are defined as a collection of antibodies directed against different antigenic determinants of an antigen or several antigens (1). While polyclonal antibodies are powerful tools for identifying biological molecules, there is one important limitation - they are unable to distinguish between antigens that share antigenic determinants. For example, when bovine serum albumin is used to immunize an animal, B cells with different surface Ig will respond to different antigenic determinants on bovine serum albumin. The result is a mixture of antibodies in the antiserum. Because bovine serum albumin shares some epitopes with human serum albumin in evolutionarily conserved regions of the protein, this anti-bovine serum albumin antiserum will also react with human serum albumin. Therefore, this antiserum will not be useful for distinguishing between bovine and human serum albumins.
Several approaches have been taken to overcome the specificity issue of polyclonal antisera. One is by absorbing the unwanted antibodies by passing the antiserum through a chromatography column of immobilized antigens (2). This method is tedious and frequently unable to completely remove the unwanted antibodies. Another approach is to isolate individual antibody-producing B cells and expand them in culture. However, like most normal untransformed cells, B cells do not survive in long-term culture.
To overcome the inability of B cells to survive in culture, one approach is to prepare a myeloma-B cell hybridoma. In 1847, Henry Bence-Jones discovered that patients with multiple myeloma, a lymphoid tumor, produced a large quantity of antibodies (3). B cells in these patients have become malignant and grow uncontrollably. Since the malignant B cells are derived from a single clone, they are identical and produce only a single type of antibody (i.e., a monoclonal antibody, or mAb). However, most of these myeloma cells produce antibodies of unknown specificities. In 1975, by fusing a myeloma cell to a B cell, Cesar Milstein and Georges Kohler succeeded in producing a hybridoma that can be cultured indefinitely in vitro and produces an unlimited number of monoclonal antibodies of known antigenic specificity (4). The rationale behind their approach is to combine the immortal properties of the myeloma cell and the antibody producing properties of the B cell. Their technique revolutionized antibody production and provides a powerful means for identification and purification of biological molecules using monoclonal antibodies.
Generally, preparing a monoclonal antibody requires several months. The general procedure includes the following steps:
<ol>
	<li>Immunization and screening of antibody titer</li>
	<li>Fusion of antibody-producing B cells and myeloma cells</li>
	<li>Selective growth of the hybridoma</li>
	<li>Screening the hybridomas for producing the desired monoclonal antibody</li>
	<li>Cloning by limiting dilution - a process whereby cells are diluted to a concentration to statistically allow for less than 1 cell to be added to the wells of a 96-well plate. Some wells will end up with 0 cells and some will have 1 cell. The wells with seeded with 1 cell will eventually grow into a monoclonal population of cells.</li>
	<li>Growth of the hybridoma and preparation of monoclonal antibody</li>
</ol>
This protocol focuses on the last step - growth of the hybridoma and preparation of the monoclonal antibody. The antibody is purified from the culture supernatant by ammonium sulfate precipitation (often referred to as salting out) - a commonly used method of removing proteins from a solution. Proteins in solution form hydrogen bonds, along with other hydrophilic interactions, with water through their exposed polar and ionic groups. When concentrations of small, highly charged ions (such as ammonium or sulfate) are added, these groups compete with the proteins for binding to water. This removes the water molecules from the protein and decreases its solubility, resulting in precipitation of the protein.

Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

抗体生成:ハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の産生

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, ...

Education

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高等生物学

免疫学

Generating Recombinant Monoclonal Antibodies From Mammalian Cell Cultures

Source: Nogales-Gadea, G. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/52830">Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015)
This video demonstrates a method of antibody generation from mammalian cells by introducing plasmid vectors with heavy and light chain genes. These vectors interact with polyethylenimine and enter the cells by forming polyplexes; later, they are translated into individual proteins and assembled into complete antibodies, which are secreted into the extracellular medium.

哺乳類細胞培養物からの組換えモノクローナル抗体の作製

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Isolation of Peripheral Blood ...

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抗体ベースの技術

製造と精製

A Technique to Generate Monoclonal Antibodies from Antigen-Specific B Cells

Source: Devilder, M., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/56508">Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.</a> J. Vis. Exp. (2018).
The video demonstrates a technique for generating monoclonal antibodies from antigen-specific B cells. Eukaryotic expression vectors encoding the heavy and light chains of antibodies, cloned from isolated antigen-specific B cells, are introduced into mammalian cells using polyplexes. Once inside the cells, these vectors undergo translation, and the resulting heavy and light chain peptides assemble into antibodies, which are subsequently secreted by the cells.