この作品は、オーストラリア研究評議会助成DP0986937によってサポートされていました。

適切なコントロールの酵母株を選択するアッセイは、視覚的に酵母の液胞の赤色蛍光の蓄積を評価する実験者に依存しています。このようなアッセイとして主観的であり、適切な対照株と成長条件の選択に依存しています。野生型のコントロールは、通常期待されるオートファジーのレベルを示すために使用されます。ネガティブコントロールとして、コアのオートファジー遺伝子の一つ（例えば、ATG3）の発現のためのひずみはnullが適しています。このような菌株は、液胞に（例えば、ミトコンドリア、核）材料を提供することはできません 1。プラスミドDNAによる酵母細胞の形質転換酵母細胞は容易にLiAcetateで処理することにより、形質転換用のコンピテントにすることができます。市販のキットを購入（例えば、EasyComp、Invitrogen社）と発表されたプロトコルが13用意されていますことがあります。 このプロトコルでは、野生型株BY4741（MAThis3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0を ）、およびそれから派生した欠失変異株（例えば、Δatg3）、別の非必須遺伝子の各欠けて発現の包括的なライブラリの一部のメンバーを使用してください。欠失株ライブラリはローゼラベースのプローブを使用してオートファジーを調査するための貴重なツールを表します。 MT -ローゼラ12：このプロトコルで用いられるレポーターはpAS1NBでエンコードされたミトコンドリア用のmt -ローゼラ（ 図2A）、です。 次の手順は、細胞の使用に基づいています。EasyComp変換キットを使用して有能なものや便利な使用のための° Cは、-80℃で凍結保存。 <ol><li> 30分酵母細胞に添加する前に室温にソリューションIIIを（EasyComp変換キット）平衡化させます。 </li><li>滅菌1.7ミリリットルスナップキャップのプラスチックのマイクロ遠心チューブへ：レポーターをコードするプラスミドDNA（MT -ローゼラpAS1NB）の2から2.5μlを（〜は100 ng /μl）を添加。 </li><li>有能な酵母細胞の新鮮​​な融解懸濁液5μlを追加し、穏やかなピペッティングにより混和する。 </li><li>混在させるソリューションIII（EasyComp変換キット）と渦の50μlを追加します。 1.5）精力的にまたは手動で指でチューブをタッピングしボルテックスミキサーを用いて15分ごとに混合しながら28〜30 ° Cで1​​時間の変換反応をインキュベートする。 </li><li>慎重にメチオニンとウラシル、ヒスチジンを添加した単YMM寒天の成長板に形質転換混合物を転送し、そして穏やかに滅菌ガラススプレッダーと寒天の表面の周囲にセルを配信します。酵母細胞は、この段階で壊れやすく、穏やかなハンドリングでは、形質転換体の収量を増やすことができます。 </li><li> 28〜30℃で2〜4日またはコロニーは直径2-3 mm程度表示されるまで、成長板をインキュベートする。 </li></ol> 2。酵母細胞でローゼラの発現を確認詳細な実験に着手する前にローゼラの正しい局在と効率的な発現を確認してください。 <ol><li>滅菌つまようじを使用すると、別の滅菌1.7ミリリットルスナップキャッププラスチック製のマイクロ遠心チューブに滅菌水50μlの形質転換プレートを再懸濁します細胞から各系統5つのシングルコロニーを選択してください。 </li><li>プレイス10別のラベルが付いた顕微鏡用スライドガラス（76 × 26 mm）の上にそれぞれの細胞懸濁液の液と正方形のカバー（22 × 22 mm）の細胞懸濁液をカバーしています。 </li><li>直ちに蛍光顕微鏡（例えば、オリンパスFluoview FV500）を使用して蛍光発光のための細胞を調べます。強い緑色と赤色蛍光とミトコンドリア局在した（ 図2Bおよび2C）の典型的なラベルを探します。 </li><li>このように蛍光を調べた各コロニーの残りの部分は、新鮮なYMMの成長板に接種すべきである。 </li><li> 2日間28〜30 ° Cでインキュベートプレートは、コロニーまでは直径で約2〜3 mmである。 </li></ol> 3。オートファジーの細胞増殖および誘導オートファジーは、固定相、炭素源、ラパマイシンの投与、または窒素飢餓の変化への参入を含む、さまざまな実験条件、の数を用いて誘導することができる。我々は日常的にmitophagyを誘導する方法として、窒素飢餓を使用。 <ol><li>エタノールと適切な栄養要求性のサプリメントを含む増殖培地10mlにシングルコロニーを植菌。 </li><li>約48時間の軌道振とう（200rpm）して28〜30℃で酵母培養物をインキュベートする。細胞は中期対数増殖期にある必要があります。 </li><li>室温で2分間2,000 × gで遠心分離によって滅菌1.7ミリリットルスナップキャップのプラスチック遠心管における文化の重複1ミリリットルの試料から、細胞をペレット化する。慎重に細胞ペレットを乱すことなく上清を除去し捨てる。 </li><li>残留mを除去するために遠心分離に続いて再懸濁1 mlの滅菌蒸留水で細胞を3回洗浄edium。 </li><li>後にサード洗浄は、成長培地または窒素飢餓培地100 mlに細胞を懸濁します。 </li><li>新鮮な増殖培地または10ミリリットル窒素飢餓培地10mlに懸濁している細胞を再接種する。 mitophagyの誘導を可能にするために6〜12時間の軌道に振とうしながらインキュベートする。飢餓後に蛍光顕微鏡で見るための細胞を準備する。 </li></ol>注：CMAC - Argを持つ液胞の標識第1のアッセイを確立するときには、液胞へローゼラの蛍光顕微鏡の配信で確認すると便利です。酵母の液胞には、場所が頻繁に簡単に酵母の一部の菌株ではと液胞が断片化し、見つけるのが困難であると思われるいくつかの成長条件の下で、透過光の画像を参照して決定することができる大規模な細胞小器官ですが。 液胞は、容易にそのようなCMAC -アルギニン（7 - アミノ-4 - chloromethylcoumarin、L -アルギニンアミド）などのクマリン系液胞色素を用いて標識することができます。液胞の明るい青色の蛍光標識色素結果に関する液胞プロテアーゼの作用。青色発光が容易にローゼラ11の赤と緑の排出量を区別することができます。 CMAC - Argでラベリングは、日常的に実行する必要はありませんが、それは酵母の液胞の位置と外観に慣れていない方にお勧めです。 4。 CMAC - Argで液胞の標識<ol><li>成長や窒素飢餓細胞イメージングの前にCMAC - Argを（100mMの最終濃度）を追加します。 CMAC - Argのソリューションは、事前に準備されていましたが、解決策は光に敏感なので、それは光への曝露から保護する必要がありますすることができます。 </li><li> 30分間軌道振とう（200rpm）して28〜30℃でインキュベートする。 </li><li>室温で2分間2,000 × gで遠心分離により細胞をペレット化する。 </li><li>上清を捨てる。 </li><li>残留培地と過剰CMAC - Argの色素を除去するために遠心分離に続いて再懸濁によって滅菌蒸留水で細胞を3回洗浄する。 </li><li>後述するようにイメージングのための細胞をマウントします。 </li></ol> 5。共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）のライブ酵母細胞の取り付け<ol><li> 70℃でインキュベートすることによって、増殖培地と窒素飢餓培地の別々の1mlのアリコートに低融点アガロース2mgを溶かす溶融アガロースを70℃に維持する</li><li>穏やかにペレットを室温で2分間2,000 × gで遠心分離により各細胞培養液1mlアリコートの細胞と上清を捨てる。 </li><li>ステップ5.2のように再懸濁と遠心分離で1 mlの滅菌蒸留水で細胞を3回洗浄する。 </li><li>滅菌蒸留水100μlの洗浄した細胞を再懸濁します。 </li><li>ラベルの付いたガラスの顕微鏡スライド（76 × 26 mm）の上に溶融アガロースの細胞のスポット20μlをマウントするには。 </li><li>直ちにアガロースベッドの上に洗浄細胞懸濁液10μlを見つける。 </li><li>カバースリップ（22 × 22 mm）のアガロースのベッドカバー。細胞はカバースリップの下にアガロースの表面全体に行き渡ります。 </li><li>撮像中にカバースリップの脱水と動きを防ぐために慎重にマニキュアの薄膜でカバースリップの端をシールします。 </li><li>マニキュアが完全に乾燥したら（10分）スライドは蛍光顕微鏡の用心して表示する準備ができています：マニキュアは、顕微鏡対物レンズへのダメージを引き起こす可能性があります。 </li><li>細胞は、この技術が実装後1時間まで観察することができます使用してマウントされた。 </li></ol> 6。 CLSMを用いて可視化するオートファジー細胞集団におけるオートファジーのレベルは、日常的にオートファジーの誘導前と後の赤空胞の蛍光を示す細胞の数を決定することによって評価される。理想的にはオートファジーの進行は、オートファジーの誘導（ 図3）に続く、選択した時点で監視されます。これは最高の顕微鏡の双眼を通して視覚化することによって行われます。それは、正しいコントロールが採用されていることが重要です（例えば、Δatg3変異体）と顕微鏡の設定は、異なるサンプル（例えば、減光フィルターの使用、フィルタ選択）観察の間に変更されないままという。 酵母細胞は、GFPおよび/またはpHluorinの別々の可視化（緑色蛍光発光）に適した励起/発光フィルターを装備した質の良い蛍光顕微鏡（例えば、オリンパスFluoview FV500）（FITCフィルター）を必要とする比較的小さいとDsRed.T3（赤蛍光発光）（TRITCフィルター）。 <ol><li>交互にFITCとTRITCフィルターを使用して非飢えた野生型の細胞は60倍の水の客観的なビューを使用する。野生型細胞では、赤と緑の両方の蛍光を示す細胞の周囲にミトコンドリアの典型的な細胞分布を示すべきである。ミトコンドリアのこの分布はpinhに依存していることに注意してください共焦点顕微鏡のOLE設定。通常、私たちはミトコンドリアが液胞は、12を隠されていないようにセルの周囲（ 図2C）に局在する一連のドットとして観察することができるように125μmの低いピンホールの値を使用してください。の高いピンホールの値（200μmに）使用されている場合、これは典型的な糸状ミトコンドリアネットワーク11を観察する（そしてそれが受ける変化）細胞全体に分散できます。セル内の他の構造体は、蛍光標識されないことがあります。 </li><li>順次飢餓培地への転送は、次のタイムポイントごとのセルを見る。緑色と赤色の発光フィルターを使用して交互に視覚化する。 6時間飢餓時時点赤色蛍光で、しかし、対応する緑色発光は、液胞の識別可能でなければいけません。液胞局在性は、個別にCMAC -アルギニン（ 図2C）を用いて確認することができます。ビュー〜200細胞と液胞（ミトコンドリアのすなわち液胞の取り込み）でのみ赤色蛍光を示す数を数えます。 </li><li> &gt; 200セルし、液胞蓄積を示すセルのプロットの割合を観察するすべての時間ポイントのために液胞蓄積を数える。 </li><li>飢餓前にMT -ローゼラを発現し、6時間の飢餓をオートファジーに続く陰性コントロール細胞を調べます。 </li></ol> 7。代表的な結果： ここで、我々は、野生型とΔatg3変異細胞で発現してMT -ローゼラを、使用して得られた典型的な結果を示す。エタノールで栽培条件下で炭素源として、野生型とΔatg3変異体細胞の両方は、酵母細胞内のミトコンドリアの典型的な蛍光（赤と緑）の細胞内分布を示す。赤色と緑色の蛍光発光は、液胞（ 図2Bおよび2C）で検出されていません。 6時間、窒素飢餓を受け、その後を超えて、赤やミトコンドリア、野生型の細胞に対応する緑色の蛍光に加えても液胞内腔の緑色蛍光ではない赤の蓄積を示すが、ときに（ 図2B、図3） 。しかし、Δatg3変異細胞では赤も緑もない蛍光は液胞内腔（。図3】図2C）に蓄積する。 <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig1.jpg" alt="図1" /> 図1 トップ 、酵母細胞内小器官とコンパートメントのスキーム。底は、酵母細胞の液胞を中心としたビューは、異なるオルガネラとコンパートメントのオートファジー劣化を示す表示されます。オートファジーの様々なオルガネラ固有の型（例えば、mitophagy、nucleophagy）の違いの一部は 、ATG、巻き込ま内容、様々な細胞内のニーズや外手がかりの特異性（貨物の選択）（例えば、飢餓、損傷）、特定の信号が含まれています遺伝子と時間依存性。 <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2a.jpg" alt="図2a" /> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2b.jpg" alt="図2b" /> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2c.jpg" alt="図2c" /> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2d.jpg" alt="図2d" /> 図2。 MT -ローゼラの（A）の模式図。ミトコンドリアのリーダー配列は、（クエン酸シンターゼのこのケースでは）ミトコンドリアマトリックスにローゼラバイオセンサーを対象とするために使用されています。赤色蛍光タンパク質（DsRed.T3）と緑色蛍光タンパク質の両方の励起と発光極大（pHluorin）が示されます。高pH（ミトコンドリアpH約8.2）で、バイオセンサーは、それが唯一の赤の蛍光を発する低pH（液胞のpH〜5.5）で、しかし、赤と緑の両方蛍光を発する。発現する野生型とΔatg3変異細胞で期待した結果の（B）の回路図表現は、成長と窒素飢餓条件下で野生型の細胞のためにCLSMで得られたMT -ローゼラ。（C）実績。左から右へ：下Datg3変異細胞の蛍光顕微鏡によって得られたDIC（コントラストの違い）、RFP（DsRed.T3）蛍光発光、GFP（pHluorin）の蛍光発光、CMAC - Argの蛍光とマージの画像（D）実績成長と窒素飢餓条件。左から右へ：DIC（コントラストの違い）、RFP（DsRed.T3）蛍光発光、GFP（pHluorin）の蛍光発光、CMAC - Argの蛍光とマージのイメージ。 <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。48時間の時間の経過とともに液胞に赤色蛍光を示すMT -ローゼラを表現し、窒素飢餓下で成長し、野生型とΔatg3変異細胞、、の割合。液胞に赤色蛍光の蓄積を示す細胞の割合は、窒素飢餓を開始後0、6、12、24および48時間で記録されました。

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利害の衝突は宣言されません。

図に示した代表的な画像で。 2Bと2Cは、それがはっきりとオルガネラ特異的蛍光レポーターと蛍光顕微鏡の使用は、成長と窒素飢餓細胞の両方におけるミトコンドリア局在/ディストリビューションの証拠を提供し、視覚化されるmitophagyことができることがわかる。 それは、このメソッドは、次mitophagyに限定されていないことを強調することです。他の細胞成分や細胞小器官（例えば、リボソーム、脂質滴、ペルオキシソーム、小胞体や核）のオートファジーは、適切なラベルを使用して監視することができます。ローゼラバイオセンサーの構造、細胞の培養条件と核の売上高（nucleophagy）の典型的な結果の詳細は、メソッドのより広範なアプリケーションを示す11,12を報告されている。 モニタリングオートファジーのためのオルガネラ特異的蛍光レポーターの使用は、構造設計のいくつかの考慮事項を念頭に保持する必要があります。これらは、（1）細胞小器官特異的ターゲティングを達成するための適切な標的シグナルの選択と融合、適切な蛍光タンパク質（s）の（2）選択、（3）強い蛍光発光が、（4）正しい細胞小器官の局在および/または細胞内分布。オルガネラ特異的レポーターが正常に選択された酵母の宿主中で発現されるとなる検討事項の第二のグループを、ひずみ：（1）酵母の成長条件、（2）細胞の試料調製、（3）の撮像パラメータは、パラメータが選択されていることが重要であるとしてCLSMのために（例えば、レーザーの強度、速度とモード、ピンホールの値、ズーム値、使用目的やCCDカメラの露出をスキャン）の比較を制御（増殖中の細胞）と飢えたサンプル間行うことができることを確実に実験を通して維持されます。（ 3）オートファジーの誘導と液胞へのレポーターの配信が正常に完了したが。 全体的に、この蛍光顕微鏡法は、比較的早く、簡単で、オートファジーを促進または阻害する新規薬剤のため、とにもオートファジーを制御するまたは調節する遺伝子のハイスループットスクリーニングのための潜在的なアプリケーションを持っています。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬/装置の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td> サッカロマイセスセレビシエEasyComp変換キット</td><td>インビトロジェン</td><td> K5050 - 01 </td></tr><tr><td>アミノ酸および硫酸アンモニウムのない酵母窒素塩基</td><td> BD Difco社</td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td> PROGENバイオサイエンス</td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td>顕微鏡スライド（76 × 26 mm）を</td><td>メンツェル-グレイザー</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡のカバーガラス（22 × 22 mm）を</td><td>メンツェル-グレイザー</td><td> BB022022A1 </td></tr><tr><td>共焦点レーザー顕微鏡Fluoview FV500 </td><td>オリンポス</td><td></td></tr><tr><td> CMAC - Argを</td><td> Moleularプローブ、Invitrogen社</td><td> Y - 7531 </td></tr></tbody></table>特に明記しない限り、指定されたすべての濃度は、w / vのです。 酵母最小培地（YMM）：アミノ酸を含まない0.67％酵母窒素塩基、2％グルコース、1.5％寒天（固体培地を作るときのみ追加）し、必要な栄養要求性のサプリメント（0.01％）]。 サッカ塩（SS）：（NH 4）2 SO 4、0.12％、KH 2 PO 4、0.10％、MgC1 2 · H2O、0.07％NaC1、0.05％、塩化カルシウム、0.01％、FeC1 3、0.0005％。 増殖培地：SS、2％エタノール（v / v）および適切な栄養要求性のサプリメント。 窒素飢餓培地：0.17％酵母窒素塩基性アミノ酸および硫酸アンモニウム（Difco社製）なしで、2％エタノール（v / v）で。

a fluorescence microscopy assay for monitoring mitophagy in the yeast saccharomyces cerevisiae

オートファジーは、異なる条件の範囲内での細胞成分の代謝回転のために重要です。それは本質的な恒常性維持機能だけでなく、ターゲットと選択的organelles1 - 4を含む細胞物質を低下させる可能性の品質管理機構を提供しています。例えば、オートファジーによる処分ではない、（図1）ミトコンドリア損傷または冗長な、細胞のホメオスタシスと細胞の生存に脅威を表すことができます。酵母では、 サッカロマイセスセレビシエ 、栄養枯渇（例えば、窒素飢餓）または損傷がmitophagy 5月9日と呼ばれるプロセスにおけるオートファジーによるミトコンドリアの選択的なターンオーバーを促進することができます。 我々は、オートファジーを評価するためにシンプルな蛍光顕微鏡のアプローチを説明します。明確にするために我々はアプローチが酵母細胞にmitophagyを監視するために使用する方法を示すためにここでの説明を制限する。アッセイは、pH感受性の緑色蛍光タンパク質にリンクされている比較的pHが安定赤色蛍光タンパク質を含むデュアルエミッションバイオセンサーである蛍光レポーター、ローゼ、利用しています。この記者の操作は、生きた細胞の液胞（pH約5.0〜5.5）とミトコンドリア（pH約8.2）の間のpHの違いに依存しています。栽培条件下では、野生型細胞はミトコンドリアの方法の特性に分布し、赤色と緑色蛍光の両方を示す。蛍光発光は、液胞に関連付けられていません。窒素飢餓にさらされたとき、mitophagy誘導条件は、赤とミトコンドリアを標識する緑色蛍光に加えて、細胞は液胞へのミトコンドリアの配信を表す酸性液胞内腔に、緑色の蛍光を赤色の蓄積を示すが、ではない。赤ではなく、緑色蛍光液胞で得点細胞は細胞5,10-12でmitophagic活性の尺度として使用することができます。

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A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

劣化とリサイクルのための酵母の液胞の酸性内腔に細胞小器官の配信を監視するための堅牢なアプローチが説明されています。方法は、遺伝的に符号化されたデュアルエミッション蛍光のpHバイオセンサー、及び蛍光顕微鏡を使用して、個々の細胞の可視化とターゲットの細胞小器官の特定のラベルに依存しています。

酵母でMitophagyを監視するための蛍光顕微鏡アッセイサッカロマイセスセレビシエ

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

25.4K ビュー.  Monash University. 劣化とリサイクルのための酵母の液胞の酸性内腔に細胞小器官の配信を監視するための堅牢なアプローチが説明されています。方法は、遺伝的に符号化されたデュアルエミッション蛍光のpHバイオセンサー、及び蛍光顕微鏡を使用して、個々の細胞の可視化とターゲットの細胞小器官の特定のラベルに依存しています。

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

の解剖サッカロマイセスセレビシエ ASCI

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

生物学

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

脂肪酸の定量的なPhosphoproteomicsは刺激を受けてサッカロマイセスセレビシエ</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

マイクロアレイ解析のためのサッカロマイセスセレビシエ</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

分裂酵母の定量的なライブセル蛍光-顕微鏡解析

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

甲殻類との長期致死毒性試験アルテミアfranciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

で嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子タンパク質の発現および精製サッカロマイセスセレビシエ

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

のリフォールディング監視タンパク質を結合アッセイ<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.