我々は彼らの技術支援のためにマブリーラボとNarieのStorerのメンバーを認識し、米国心臓協会（NCRPサイエンティスト開発グラント0635363N）と資金調達のための国立心臓、肺、血液研究所（グラントSCCOR RFA HL02 - 027）。

パート1：卵の生産とコレクション<ol><li>注射前に夜、場所の仕切​​りでタンクを繁殖で魚をセットアップする。必要に応じて総産卵数を増やすために、魚は1つの男性に女性2の比率で設定することができます。 </li><li>次の朝は、部屋の点灯後、電源をオンにいくつかのタンクから仕切りを引き出し、邪魔されずに嵌合時の約20分間できます。 </li><li>ストレーナーを使用して、繁殖ケージから卵を収集し、卵の水ですすいでください。卵を水でペトリ皿に卵を注ぐと、転送ピペットで未受精卵や破片を取り除く。魚は、注射のために卵の追加のラウンドを生産する大規模なタンクに再グループ化することができます。それらが単一の細胞の段階を通過させることなく生産される卵の最大数を可能にするために採卵のタイミングを調整します。 </li><li> 100ミリメートルペトリ皿の倒立蓋の顕微鏡スライドを置きます。単一の列を形成するスライドの側面に卵を整列するために、転送ピペットを使用してください。卵反対側に対してキムワイプを押すことで、スライドから過剰な卵水を取り外します。 （図1A） </li></ol>パート2：引っ張ってニードル、ロード、および準備<ol><li>マイクロピペットプラーで、愚かなパテのランプを介して敷設して、2つの針および150mmシャーレ内ストアにキャピラリー1.0ミリメートルODのガラスを引き出します。針は、事前にプルアップすることができます。 </li><li> microloaderピペットを用いて注入材料の3μLと積み込む針。残りのほとんどまたはまったく気泡がなくなるまで、針の先端に向かってボーラスを振る。 </li><li>空気源とマイクロインジェクターをオンにします。微量注入器に針を挿入し、ハウジング内に密封を保証する。マイクロマニピュレータの運動と調整の広い範囲を可能にするために適切な位置にあることを確認してください。ステージから高い顕微鏡の視野の平面、、、チップの薄地域を中心に針の先端をもたらす。ピアス絨毛膜と卵黄に十分な針は、細い葉が一貫性のあるビーズの大きさを提供する能力がまだある時点で針をピンチオフする鋭いピンセットを使用してください。マイクロメータでのミネラルオイルを一滴は、各注射の量を計算するために使用することができます。オイルに注入すると、0.1mmの直径を持つビーズは、注入材料の500 PL（図1b）が含まれ、500 PLまたは1nLの注入量は、一般的に使用されています。フットペダルを踏むと針をトリミングし、必要に応じて射出圧力を調整しながらビーズの大きさを監視します。理想的な注入量は、卵の体積の約10％を記入します。針先の品質は、注入の容易さと結果の質と一貫性の両方にとって非常に重要です。 </li></ol>パート3：インジェクション<ol><li>胚は、4細胞期を過ぎて開発していないことを確認します。理想的には、胚は1細胞期になっているはず。 </li><li>あなたの反対側の片手で料理を持って、卵の列に向かって針を下ろします。 </li><li>ピアースは、絨毛膜の表面および卵黄嚢の破砕または引き裂くために見ている間の滑らかなストロークで卵黄を入力してください。卵黄（図1C）への注入材を注入します。気泡を注入するかのどちらかの胚に致死となることができるように卵黄をストレッチすることは避けてください。行を下に向かって、ピペットチップを使用して一貫性のあるビーズのサイズとを、維持するために必要な圧力を調整し、未受精卵を見たり、射出プロセス中に破棄される卵を除去する。 </li><li>卵の列が完了した後、きれいなペトリ皿に注入卵を移動するために卵の水の穏やかな流れを使用してください。必要に応じて繰り返します。対照として、いくつかのuninjected胚を保管してください。初日の終わりには、死亡胚を除去し、注入された胚の数を記録。感染の機会を減らすために定期的に皿の中で卵の水を交換してください。 </li></ol>パート4：代表的な結果注入されているものに応じて、胚は、彼らのuninjected兄弟よりも低いレートで生き残ることができる。幸いなことに、それはそれらの膨大な数字を入れることは容易であるので、これはほとんど問題になりません。それはわずかに発育の遅れを示すことがmorphantsのは正常です。 マイクロインジェクションの結果を説明するために、我々は、ガラスのタンパク質のハート（HEG）のレベルを操作するためにこのプロトコルを使用していました。 HEGは、正常な心臓の開発に必要な膜貫通タンパク質である。その不在では、胚は巨大な流入の器官とチャンバー1の心を開発する。我々は、500μMの濃度で、heg_e3i3_egfr1とheg_e4i4_egfr2、HEGに対して2以前に未記載モルフォを注入した。 2日後の受精では、uninjected兄弟のコントロールは、（図2AおよびB）期待される、正常に表示されます。 heg_e3i3_egfr1を注入された胚は、脳浮腫（図2C）を持っている。これらmorphantsのほとんどの心は、形態を変更したものの、彼らのチャンバーは（図2D）は通常サイズです。胚の注入heg_e4i4_egfr2展示変数心臓欠陥を持つ。他の人が大規模な流入の広大と適度に拡大した心房（図2E及びF）を持っている一方、一部では、正常に表示されます。 HEGの変異体、以前に1を報告したが、非常に拡大した流入路およびアトリウム（図2GおよびH）があります。 我々はまた、完全長cDNA HEGから転写された400 ng /μLのmRNAと野生型胚を注入した。 uninjectedコントロールが（図3AおよびB）正常に発達しながら、HEG mRNAを注入された胚は、本体の軸の短縮野生外観から厳しい単眼症に至るまで表現型のスペクトル、、頭と体の壊死、及び正中線欠陥（図3Cに示すおよびD）。 <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%201%20FINAL.png" alt="" />注入されるように図1。胚をシャーレ（）で顕微鏡のスライドに対して、並んでいる。注入量は、マイクロメートルに置かれた鉱物油中に注入することによって決定されます。一般的に使用される500 PL、、の注入量は0.1 mm（B）の直径を有している。すぐに注入した後、モルホリノまたはmRNAは卵黄（C）で中断させるスポットとして表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%202%20FINAL.png" alt="" /> 図2：2日後の受精では、uninjected胚は、肉眼的欠陥（）または心臓の表現型（B）を持っていません。モルホリノheg_e3i3_egfr1を注入された胚は、脳浮腫（C、矢印）が、通常サイズの心腔（D）を持っている。モルホリノheg_e4i4_egfr2を注入いくつかの胚は肥大流入地帯と心房（E、F）を持っている。 HEG変異が著しく拡大した流入地帯と心房（G、H）を持っている。 （）、（C）、（E）、及び（G）4X DICイメージです。、（D）、（B）（F）及び（H）20 × DICイメージです。 =アトリウム、それ=流入路。 <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%203%20FINAL.png" alt="" /> 図3。24時間後の受精で、胚は、それらの（B）の間に神経管となく壊死や正中欠損（）と2つの明確に定義された目で長く、まっすぐなボディを持っているuninjected。 HEG mRNAを注入されたいくつかの胚は、対照的に、短縮された体軸、壊死、misshaped体節（C）、及び単眼症（D）を示す。 （A）と（C）4X DICイメージです。（B）と（D）20 × DIC画像です。

<ol><li>Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((heart+of+glass+regulates+the+concentric+growth+of+the+heart+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).</li>
</ol>

ゼブラフィッシュのモデルシステムの強みの一つは、特定の遺伝子産物が追加されたり、マイクロインジェクションによる胚から除去することができる容易さです。普遍的に特定のタンパク質を過剰発現するように、コードするmRNAは、それは、1細胞期における卵黄中に注入される。胚のその後の開発中に、RNAは生物全体に分散して変換されます。逆に、特定のタンパク質を除去するために、モルフォが使用されます。モルフォは、特定のRNAのアンチセンス相補性で設計された合成オリゴヌクレオチドである。のmRNAと同様に、モルフォは、1細胞期における卵黄中に注入されています。胚の内部に、彼らは翻訳を防止する、彼らのターゲットRNAをバインドします。 各モルホリノまたはmRNAのために作られる必要がある主な変更は、注入された物質の濃度である。あまりにモルホリノまたはmRNAのどちらかの高濃度は、非特異的毒性を引き起こす可能性があります。各モルホリノが、その最適濃度を決定するために経験的にテストしなければならない一方、200μMと500μMの間で一般的にモルホリノ濃度は、非固有の欠陥を引き起こすことなく効果的に遺伝子の活性をノックダウン。針の開口部の正確なサイズは重要ではありません。針のサイズは、噴射圧力と噴射時間の範囲内で適切なボリュームのボーラスを生成するために調整することができます。 モルフォは、蛋白質内ドメインの機能解剖を含む多くのアプリケーションを持っている。特定のエクソン - イントロン接合部を標的とするように設計するときに、モルフォが発生スプライシングを防止します。我々は、HEGのpre - mRNAの二つモルフォそのバインドエクソン-イントロン接合部の影響を調べた。モルホリノheg_e3i3_egfr1は、成熟した成績証明書にエクソン3を組み込んだからスプライシング機構を防止する、エクソン3とイントロン3の間の接合部を結合する。モルホリノheg_e4i4_egfr2は、同様にエクソン4を削除します。エクソン3と4の両方がEGF様リピートを含むドメインをエンコードする。いくつかの胚はheg_e4i4_egfr2適度に模写変異体を注入し、さらに実験は、心臓の開発にエクソン4をHEGの役割を理解する必要があります。驚いたことに、heg_e3i3_egfr1を注入胚では、脳浮腫、HEG変異体では見られない特徴を持っている。これにより、接合子の変異体では影響を受けないであろう母親の成績証明書をバインドするモルフォの能力に起因する可能性があります。

<table><tbody><tr><td>Microinjector</td><td>Tool</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI 100</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Tool</td><td>Narishige International</td><td>MN 153</td><td></td></tr><tr><td>Needle Puller</td><td>Tool</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P 97</td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillaries</td><td>Tool</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100 F6</td><td></td></tr><tr><td>Microloader Pipettes</td><td>Tool</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td></td></tr><tr><td>Needle Holder</td><td>Tool</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH310</td><td></td></tr></tbody></table>

microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function

ゼブラフィッシュを研究することの利点の一つは、胚のタンパク質レベルの操作の容易さと速度です。標的RNAに対するアンチセンス相補性を有する合成オリゴヌクレオチドであるモルフォは、、特定の遺伝子産物の発現を減らすために胚に追加することができます。逆に、処理されたmRNAは、遺伝子産物のレベルを高めるために胚に追加することができます。胚へのmRNAまたはモルホリノのいずれかを追加するための車両は、マイクロインジェクションです。マイクロインジェクションは、時間あたりの胚数百の注入を可能にする、効率的かつ迅速です。このビデオでは、マイクロインジェクションに関係するすべてのステップを示しています。簡単に言えば、卵は敷設後すぐに採取し、ペトリ皿で​​顕微鏡のスライドに対して、並んでいる。次に、注入材料がロード先の細い針は、インジェクターと空気源に接続されており、インジェクターコントロールが望ましい注入量を生成するために調整されます。最後に、針は、胚の卵黄に突入されており、モルホリノまたはmRNAが排出されます。

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Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

このビデオは、モルホリノまたはmRNAが、その後の開発中に特定の遺伝子産物のレベルを増減して1細胞段階でゼブラフィッシュ胚に注入する方法を示しています。

遺伝子機能を解析するためにゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクション

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

77.4K ビュー.  Harvard Medical School. このビデオは、モルホリノまたはmRNAが、その後の開発中に特定の遺伝子産物のレベルを増減して1細胞段階でゼブラフィッシュ胚に注入する方法を示しています。

ビデオ: Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish embryos, injection of plasmid DNA results in mosaic expression, allowing for the visualization of single cells or small clusters of cells 1 . We describe how injection of plasmid DNA encoding membrane-targeted Green Fluorescent Protein (mGFP) under the control of a ubiquitous promoter can be used for imaging cells undergoing neurulation. Central to this protocol is the methodology for imaging labeled cells at high resolution in sections and also in real time. This protocol entails the injection of mGFP DNA into young zebrafish embryos. Embryos are then processed for vibratome sectioning, antibody labeling and imaging with a confocal microscope. Alternatively, live embryos expressing mGFP can be imaged using time-lapse confocal microscopy. We have previously used this straightforward approach to analyze the cellular behaviors that drive neural tube formation in the hindbrain region of zebrafish embryos 2. The fixed preparations allowed for unprecedented visualization of cell shapes and organization in the neural tube while live imaging complemented this approach enabling a better understanding of the cellular dynamics that take place during neurulation.

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early embryo is the ability to image cells at high resolution. We describe here a technique for labeling single cells or small clusters of cells in whole zebrafish embryos with membrane-targeted Green Fluorescent Protein.

ゼブラフィッシュ後脳における標識およびイメージング細胞

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

神経科学

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

ゼブラフィッシュ胚におけるマイクロビーズの移植

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

発生生物学

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

ゼブラフィッシュ胚におけるmRNAおよびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのマイクロインジェクション。

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

生物学

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

モルホリノオリゴヌクレオチドの脳室マイクロインジェクションを使用した大人のゼブラフィッシュ脳における遺伝子発現のマイクロマニピュレーション

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Design and Microinjection of Morpholino Antisense Oligonucleotides and mRNA into Zebrafish Embryos to Elucidate Specific Gene Function in Heart Development

The morpholino oligomer-based knockdown system has been used to identify the function of various gene products through loss or reduced expression. Morpholinos (MOs) have the advantage in biological stability over DNA oligos because they are not susceptible to enzymatic degradation. For optimal effectiveness, MOs are injected into 1-4 cell stage embryos. The temporal efficacy of knockdown is variable, but MOs are believed to lose their effects due to dilution eventually. Morpholino dilution and injection amount should be closely controlled to minimize the occurrence of off-target effects while maintaining on-target efficacy. Additional complementary tools, such as CRISPR/Cas9 should be performed against the target gene of interest to generate mutant lines and to confirm the morphant phenotype with these lines. This article will demonstrate how to design, prepare, and microinject a translation-blocking morpholino against hand2 into the yolk of 1-4 cell stage zebrafish embryos to knockdown hand2 function and rescue these "morphants" by co-injection of mRNA encoding the corresponding cDNA. Subsequently, the efficacy of the morpholino microinjections is assessed by first verifying the presence of morpholino in the yolk (co-injected with phenol red) and then by phenotypic analysis. Moreover, cardiac functional analysis to test for knockdown efficacy will be discussed. Finally, assessing the effect of morpholino-induced blockage of gene translation via western blotting will be explained.

<meta charset="utf8"></head><body>モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドとmRNAのゼブラフィッシュ胚へのマイクロインジェクションによる心臓発生における特異的遺伝子機能の解明

The present protocol describes designing, preparing, and microinjecting a translational-blocking morpholino against a representative cardiac gene; Heart And Neural Crest Derivatives Expressed2 (hand2) into the yolk of newly fertilized zebrafish embryos to knock down gene function. It also shows a transient rescue of these "morphants" by co-injection of mRNA encoding this gene product.

モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドとmRNAのゼブラフィッシュ胚へのマイクロインジェクションによる心臓発生における特異的遺伝子機能の解明

The morpholino oligomer-based knockdown system has been used to identify the function of various gene products through loss or reduced expression.  ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

開発ゼブラフィッシュの表皮から細胞の押出のライブイメージング

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

An Efficient Protocol to Assess ERK Activity Modulation in Early Zebrafish Noonan Syndrome Models via Live FRET Microscopy and Immunofluorescence

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. Despite a broad genetic heterogeneity, germline gain-of-function mutations in key regulators of the RAS-MAPK pathway underlie the majority of the cases, and, thanks to advanced sequencing techniques, potentially pathogenic variants affecting the RAS-MAPK pathway continue to be identified. Functional validation of the pathogenicity of these variants, essential for accurate diagnosis, requires fast and reliable protocols, preferably in vivo. Given the scarcity of effective treatments in early childhood, such protocols, especially if scalable in cost-effective animal models, can be instrumental in offering a preclinical ground for drug repositioning/repurposing. 
Here we describe step-by-step the protocol for rapid generation of transient RASopathy models in zebrafish embryos and direct inspection of live disease-associated ERK activity changes occurring already during gastrulation through real-time multispectral F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging. The protocol uses a transgenic ERK reporter recently established and integrated with the hardware of commercial microscopes. We provide an example application for Noonan syndrome (NS) zebrafish models obtained by expression of the Shp2D61G. We describe a straightforward method that enables registration of ERK signal change in the NS fish model before and after pharmacological signal modulation by available low-dose MEK inhibitors. We detail how to generate, retrieve, and assess ratiometric FRET signals from multispectral acquisitions before and after treatment and how to cross-validate the results via classical immunofluorescence on whole embryos at early stages. We then describe how, via examining standard morphometric parameters, to query late changes in embryo shape, indicative of a resulting impairment of gastrulation, in the same embryos whose ERK activity is assessed by live FRET at 6 h post fertilization.

RASopathies are multisystem genetic syndromes caused by RAS-MAPK pathway hyperactivation. Potentially pathogenic variants awaiting validation emerge continuously while poor preclinical evidence limits therapy. Here, we describe our in vivo protocol to test and cross-validate RASopathy-associated ERK activation levels and its pharmacological modulation during embryogenesis by live FRET imaging in Teen-reporter zebrafish.

ライブFRET顕微鏡法および免疫蛍光法による初期ゼブラフィッシュヌーナン症候群モデルにおけるERK活性調節を評価するための効率的なプロトコール

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. ...

生化学

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

高解像度全マウント<em&gt;その場で</em遺伝子発現と機能を研究するためにゼブラフィッシュ胚内&gt;ハイブリダイゼーション

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

遺伝子機能を解析するためにゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクション

要約

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ゼブラフィッシュ後脳における標識およびイメージング細胞

ゼブラフィッシュ胚におけるマイクロビーズの移植

ゼブラフィッシュ胚におけるmRNAおよびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのマイクロインジェクション。

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

モルホリノオリゴヌクレオチドの脳室マイクロインジェクションを使用した大人のゼブラフィッシュ脳における遺伝子発現のマイクロマニピュレーション

モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドとmRNAのゼブラフィッシュ胚へのマイクロインジェクションによる心臓発生における特異的遺伝子機能の解明

モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドとmRNAのゼブラフィッシュ胚へのマイクロインジェクションによる心臓発生における特異的遺伝子機能の解明

開発ゼブラフィッシュの表皮から細胞の押出のライブイメージング

ライブFRET顕微鏡法および免疫蛍光法による初期ゼブラフィッシュヌーナン症候群モデルにおけるERK活性調節を評価するための効率的なプロトコール

高解像度全マウント