Riconosciamo i membri del laboratorio Mably e Narie Storer per la loro assistenza tecnica, e l&#39;American Heart Association (NCRP Scientist Development Grant 0635363N) e il National Heart, Lung, and Blood Institute (Grant SCCOR RFA HL02-027) per il finanziamento.

Parte 1: Produzione di uova e raccolta <ol><li> La notte prima dell&#39;iniezione, istituito il pesce in vasche di allevamento con divisori in posizione. Per aumentare la produzione totale di uova, il pesce può essere impostato in un rapporto di due femmine per un maschio se lo si desidera. </li><li> La mattina seguente, dopo le luci della stanza si accende, tirare i divisori da più serbatoi e lasciare per circa 20 minuti di tempo di accoppiamento indisturbato. </li><li> Utilizzando un colino, raccogliere le uova dalle gabbie di allevamento e risciacquare con acqua uovo. Versare le uova in una capsula di Petri con acqua uovo e rimuovere le uova non fecondate e detriti con una pipetta di trasferimento. I pesci possono essere raggruppati in grandi vasche per la produzione di turni aggiuntivi di uova per l&#39;iniezione. Regolare i tempi di raccolta delle uova per consentire un numero massimo di uova da produrre senza farli passare alla fase singola cella. </li><li> Posizionare un vetrino da microscopio invertito nel coperchio di un piatto 100 millimetri Petri. Utilizzare una pipetta di trasferimento per allineare le uova contro il lato del vetrino che formano una singola colonna. Eliminare l&#39;acqua in eccesso uovo dalla diapositiva premendo un Kimwipe contro il lato opposto le uova. (Figura 1A) </li></ol> Parte 2: Ago tirare, il caricamento e la preparazione <ol><li> Con un estrattore micropipetta, tirare un bicchiere 1,0 millimetri OD capillare in due aghi e conservare in un piatto da 150 millimetri di Petri che oltre rampe Silly Putty. Aghi può essere tirato in anticipo. </li><li> Ritardare l&#39;ago con 3 ml di materiale di iniezione con una pipetta microloader. Agitare il bolo verso la punta dell&#39;ago finché non ci sono bolle pochi o nessun rimanenti. </li><li> Accendere la fonte di aria e microinjector. Inserire l&#39;ago nel microinjector e assicurare una perfetta tenuta all&#39;interno della custodia. Controllare che il micromanipolatore si trova in una posizione adeguata per consentire una vasta gamma di movimento e di regolazione. Portare la punta dell&#39;ago nel piano di vista del microscopio, alta dal palco, e mettere a fuoco la regione più sottile della punta. Usare un paio di pinze taglienti per pizzicare fuori l&#39;ago in un punto che lascia l&#39;ago sottile abbastanza per bucare il corion e il tuorlo, ma ancora in grado di fornire una dimensione coerente tallone. Una goccia di olio minerale su un micrometro può essere usata per calcolare il volume di ogni iniezione. Quando iniettato nel petrolio, una perlina con un diametro di 0,1 mm contiene 500 pL di materiale di iniezione (figura 1B); volumi di iniezione di 500 PL o 1nL sono tipicamente utilizzati. Premere il pedale e monitorare le dimensioni del cordone, mentre taglio l&#39;ago e la regolazione della pressione di iniezione in base alle esigenze. Volumi di iniezione ideale riempirà circa il 10% del volume dell&#39;uovo. La qualità della punta dell&#39;ago è cruciale sia per la facilità di iniezione e la qualità e la coerenza dei risultati. </li></ol> Parte 3: Iniezione <ol><li> Assicurarsi che gli embrioni non hanno sviluppato oltre la fase quattro celle. Idealmente, gli embrioni dovrebbero essere al unicellulare stadio. </li><li> Abbassare l&#39;ago verso la colonna di uova, tenendo il piatto in posizione con la mano opposta. </li><li> Perforare la superficie del corion e inserire il tuorlo in un colpo solo liscio durante la visione di qualsiasi schiacciamento o lacerazione del sacco vitellino. Iniettare il materiale iniezione nel tuorlo (figura 1C). Evitare di iniettare bolle d&#39;aria o si estende il tuorlo sia come può essere letale per l&#39;embrione. Di lavoro lungo la linea, regolare la pressione necessaria per mantenere una dimensione coerente tallone e, utilizzando un puntale, togliere le uova non fecondate che si affacciano o sono stati distrutti durante il processo di iniezione. </li><li> Dopo aver completato una colonna di uova, usare un getto di acqua dolce uovo di spostare le uova iniettato in una scatola di Petri pulita. Ripetere se necessario. Tenere diversi embrioni uninjected come controllo. Alla fine del primo giorno, rimuovere gli embrioni morti e registrare il numero di embrioni iniettati. Sostituire l&#39;acqua uovo nel piatto periodicamente per ridurre la probabilità di infezione. </li></ol> Parte 4: I risultati rappresentativi A seconda di cosa viene iniettato, gli embrioni possono sopravvivere a un tasso inferiore rispetto ai loro fratelli uninjected. Fortunatamente, è facile per iniettare un gran numero di loro, quindi questo è raramente un problema. È normale che morphants di esporre sviluppo leggermente ritardata. Per illustrare i risultati della microiniezione, abbiamo usato questo protocollo per manipolare i livelli della proteina Cuore di vetro (Heg). HEG è una proteina transmembrana necessario per lo sviluppo cuore normale. In sua assenza, gli embrioni sviluppano cuori con tratti afflusso gigantesco e camere 1. Abbiamo iniettato due Morpholinos non descritte in precedenza contro HEG, heg_e3i3_egfr1 e heg_e4i4_egfr2, ad una concentrazione di 500 micron. A 2 giorni dopo la fecondazione, i controlli fratello uninjected appaiono normali, come previsto (figura 2A e B). Embrioni iniettati con heg_e3i3_egfr1 hanno edema cerebrale (figura 2C). Anche se i cuori della maggior parte di questi morphants hanno modificato la morfologia, le loro camere sono normalmente di dimensioni (figura 2D). Gli embrioni iniettatiheg_e4i4_egfr2 con difetti cardiaci mostra variabile. Alcuni appaiono normali, mentre altri hanno tratti afflusso di grandi dimensioni e atri moderatamente allargata (2E figura e F). Il mutante HEG, come riportato in precedenza 1, ha un tratto d&#39;afflusso enormemente ampliato e atrio (figura 2G e H). Abbiamo anche iniettato embrioni tipo selvatico con 400 mRNA ng / mL trascritto da full-length HEG cDNA. Mentre i controlli uninjected svilupparsi normalmente (figura 3A e B), gli embrioni iniettati con mRNA HEG mostra uno spettro di fenotipi che vanno dalla comparsa di tipo selvatico ciclopia grave, accorciamento dell&#39;asse corpo principale, necrosi della testa e del corpo, e difetti della linea mediana (figura 3C e D). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%201%20FINAL.png" alt="" /> Embrioni Figura 1. Da iniettare sono allineati contro un vetrino da microscopio in una capsula di Petri (A). Volume di iniezione è determinata iniettando in olio minerale collocato su un micrometro. Un volume di iniezione di 500 PL, che è comunemente usato, ha un diametro di 0,1 mm (B). Immediatamente dopo l&#39;iniezione, il morfolino o mRNA è visibile come una macchia punteggiano nel tuorlo (C). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%202%20FINAL.png" alt="" /> Figura 2. A 2 giorni dopo la fecondazione, gli embrioni uninjected non hanno difetti lordo (A) o fenotipo cuore (B). Embrioni iniettati con il heg_e3i3_egfr1 morfolino hanno edema cerebrale (C, freccia) ma camere cardiache di solito di dimensioni (D). Alcuni embrioni iniettati con il heg_e4i4_egfr2 morfolino hanno tratti afflusso ampliato e atri (E, F). mutanti HEG sono tratti afflusso gravemente ampliato e atri (G, H). (A), (C), (E), e (G) sono 4x immagini DIC, (B), (D), (F) e (H) sono 20x immagini DIC. un atrio = it = tratto d&#39;afflusso. <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%203%20FINAL.png" alt="" /> Figura 3. A distanza di 24 ore dopo la fecondazione, uninjected embrioni hanno un corpo lungo e dritto, senza difetti o necrosi della linea mediana (A) e due occhi ben definita con un tubo neurale tra di loro (B). Alcuni embrioni iniettati con mRNA HEG, al contrario, mostrano un asse del corpo ridotto, necrosi, somiti deformi (C), e ciclopia (D). (A) e (C) sono 4x immagini DIC, (B) e (D) sono 20x immagini DIC.

<ol><li>Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((heart+of+glass+regulates+the+concentric+growth+of+the+heart+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).</li>
</ol>

Uno dei punti di forza del sistema modello Danio rerio è la facilità con cui i prodotti gene specifico può essere aggiunto o eliminato dal embrione di microiniezione. Per ubiquitariamente iperespressione di una proteina particolare, la codifica mRNA che viene iniettato nel tuorlo alla 1-cella di scena. Durante il successivo sviluppo dell&#39;embrione, l&#39;RNA è distribuito in tutto l&#39;organismo e tradotto. Viceversa, per eliminare una particolare proteina, Morpholinos vengono utilizzati. Morpholinos sono oligonucleotidi sintetici progettati con la complementarietà di RNA antisenso specifici. Come mRNA, Morpholinos vengono iniettati nel tuorlo alla 1-cella di scena. All&#39;interno l&#39;embrione si legano il loro RNA bersaglio, evitando di traduzione. La modifica principale che deve essere effettuata per ogni morfolino o mRNA è la concentrazione del materiale iniettato. Troppo alta la concentrazione di uno o morfolino mRNA possono causare tossicità non specifici, mentre ogni morfolino devono essere testati empiricamente per determinare la concentrazione ottimale, generalmente le concentrazioni di morfolino tra i 200 micron e 500 micron abbattere l&#39;attività dei geni in modo efficace, senza causare non specifici difetti. La dimensione esatta dell&#39;apertura ago non è cruciale. All&#39;interno di una gamma di dimensioni dell&#39;ago, la pressione d&#39;iniezione e il tempo di iniezione possono essere regolati per produrre un bolo del volume corretta. Morpholinos hanno molte applicazioni, tra cui la dissezione funzionale di domini all&#39;interno di una proteina. Quando progettati per target specifici giunzioni esone-introne, Morpholinos impedirà il verificarsi di splicing lì. Abbiamo esaminato gli effetti di due Morpholinos che legano esone-introne giunzioni nel pre-mRNA di HEG. Il heg_e3i3_egfr1 morfolino lega la giunzione tra esone 3 e introne 3, impedendo il meccanismo di splicing nell&#39;esone 3 che incorpora in trascrizioni maturi. Il heg_e4i4_egfr2 morfolino rimuove in modo simile esone 4. Sia esoni 3 e 4 codificano domini contenenti EGF-come ripete. Alcuni embrioni iniettati con heg_e4i4_egfr2 moderatamente fenocopia il mutante; ulteriori esperimenti saranno tenuti a comprendere il ruolo del Heg esone 4 in sviluppo cuore. Sorprendentemente, gli embrioni iniettati con heg_e3i3_egfr1 hanno edema cerebrale, una caratteristica che non si vedono in mutanti HEG. Ciò può essere dovuto alla capacità di Morpholinos di legare trascrizioni materno che lascia impregiudicata in mutanti zigotico.

<table><tbody><tr><td>Microinjector</td><td>Tool</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI 100</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Tool</td><td>Narishige International</td><td>MN 153</td><td></td></tr><tr><td>Needle Puller</td><td>Tool</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P 97</td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillaries</td><td>Tool</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100 F6</td><td></td></tr><tr><td>Microloader Pipettes</td><td>Tool</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td></td></tr><tr><td>Needle Holder</td><td>Tool</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH310</td><td></td></tr></tbody></table>

microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function

Uno dei vantaggi di zebrafish studio è la facilità e la velocità di manipolare i livelli di proteina nell&#39;embrione. Morpholinos, che sono oligonucleotidi sintetici con la complementarità antisenso di RNA bersaglio, può essere aggiunto l&#39;embrione di ridurre l&#39;espressione di un prodotto particolare gene. Al contrario, mRNA elaborati possono essere aggiunti per l&#39;embrione per aumentare i livelli di un prodotto genico. Il veicolo per l&#39;aggiunta di mRNA o morfolino di un embrione è microiniezione. Microiniezione è efficiente e rapida, che consente per l&#39;iniezione di centinaia di embrioni per ora. Questo video mostra tutte le fasi del processo di microiniezione. In breve, le uova vengono raccolte subito dopo la posa e allineati contro un vetrino da microscopio in una capsula di Petri. Poi, un bel punta l&#39;ago caricato con materiale di iniezione è collegato ad un microinjector e una fonte d&#39;aria, ed i controlli microinjector sono regolati per produrre un volume di iniezione desiderabile. Infine, l&#39;ago è immerso nel tuorlo dell&#39;embrione e la morfolino o mRNA viene espulso.

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Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Questo video mostra come morfolino o mRNA possono essere iniettati in embrioni di pesce zebra alla unicellulare stadio per diminuire o aumentare il livello di prodotti specifico gene durante lo sviluppo successivo.

Microiniezione di embrioni di zebrafish per analizzare la funzione del gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

77.4K Views.  Harvard Medical School. Questo video mostra come morfolino o mRNA possono essere iniettati in embrioni di pesce zebra alla unicellulare stadio per diminuire o aumentare il livello di prodotti specifico gene durante lo sviluppo successivo.

Video: Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish embryos, injection of plasmid DNA results in mosaic expression, allowing for the visualization of single cells or small clusters of cells 1 . We describe how injection of plasmid DNA encoding membrane-targeted Green Fluorescent Protein (mGFP) under the control of a ubiquitous promoter can be used for imaging cells undergoing neurulation. Central to this protocol is the methodology for imaging labeled cells at high resolution in sections and also in real time. This protocol entails the injection of mGFP DNA into young zebrafish embryos. Embryos are then processed for vibratome sectioning, antibody labeling and imaging with a confocal microscope. Alternatively, live embryos expressing mGFP can be imaged using time-lapse confocal microscopy. We have previously used this straightforward approach to analyze the cellular behaviors that drive neural tube formation in the hindbrain region of zebrafish embryos 2. The fixed preparations allowed for unprecedented visualization of cell shapes and organization in the neural tube while live imaging complemented this approach enabling a better understanding of the cellular dynamics that take place during neurulation.

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early embryo is the ability to image cells at high resolution. We describe here a technique for labeling single cells or small clusters of cells in whole zebrafish embryos with membrane-targeted Green Fluorescent Protein.

Etichettatura e cellule Imaging nel romboencefalo Zebrafish

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Ricerca

Neuroscienze

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microperla impianto nel zebrafish

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Biologia dello sviluppo

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microiniezione di mRNA e oligonucleotidi antisenso Morpholino in embrioni di zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biologia

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

Micromanipolazione di espressione genica in Zebrafish adulti cervello con microiniezione Cerebroventricular di Morpholino oligonucleotidi

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Design and Microinjection of Morpholino Antisense Oligonucleotides and mRNA into Zebrafish Embryos to Elucidate Specific Gene Function in Heart Development

The morpholino oligomer-based knockdown system has been used to identify the function of various gene products through loss or reduced expression. Morpholinos (MOs) have the advantage in biological stability over DNA oligos because they are not susceptible to enzymatic degradation. For optimal effectiveness, MOs are injected into 1-4 cell stage embryos. The temporal efficacy of knockdown is variable, but MOs are believed to lose their effects due to dilution eventually. Morpholino dilution and injection amount should be closely controlled to minimize the occurrence of off-target effects while maintaining on-target efficacy. Additional complementary tools, such as CRISPR/Cas9 should be performed against the target gene of interest to generate mutant lines and to confirm the morphant phenotype with these lines. This article will demonstrate how to design, prepare, and microinject a translation-blocking morpholino against hand2 into the yolk of 1-4 cell stage zebrafish embryos to knockdown hand2 function and rescue these "morphants" by co-injection of mRNA encoding the corresponding cDNA. Subsequently, the efficacy of the morpholino microinjections is assessed by first verifying the presence of morpholino in the yolk (co-injected with phenol red) and then by phenotypic analysis. Moreover, cardiac functional analysis to test for knockdown efficacy will be discussed. Finally, assessing the effect of morpholino-induced blockage of gene translation via western blotting will be explained.

<meta charset="utf8"></head><body>Progettazione e microiniezione di oligonucleotidi morfolino antisenso e mRNA in embrioni di zebrafish per chiarire la funzione genica specifica nello sviluppo card

The present protocol describes designing, preparing, and microinjecting a translational-blocking morpholino against a representative cardiac gene; Heart And Neural Crest Derivatives Expressed2 (hand2) into the yolk of newly fertilized zebrafish embryos to knock down gene function. It also shows a transient rescue of these "morphants" by co-injection of mRNA encoding this gene product.

Progettazione e microiniezione di oligonucleotidi morfolino antisenso e mRNA in embrioni di zebrafish per chiarire la funzione genica specifica nello sviluppo cardiaco

The morpholino oligomer-based knockdown system has been used to identify the function of various gene products through loss or reduced expression.  ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

Immagini dal vivo di estrusione in cella dal Epidermide di Zebrafish in via di sviluppo

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

An Efficient Protocol to Assess ERK Activity Modulation in Early Zebrafish Noonan Syndrome Models via Live FRET Microscopy and Immunofluorescence

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. Despite a broad genetic heterogeneity, germline gain-of-function mutations in key regulators of the RAS-MAPK pathway underlie the majority of the cases, and, thanks to advanced sequencing techniques, potentially pathogenic variants affecting the RAS-MAPK pathway continue to be identified. Functional validation of the pathogenicity of these variants, essential for accurate diagnosis, requires fast and reliable protocols, preferably in vivo. Given the scarcity of effective treatments in early childhood, such protocols, especially if scalable in cost-effective animal models, can be instrumental in offering a preclinical ground for drug repositioning/repurposing. 
Here we describe step-by-step the protocol for rapid generation of transient RASopathy models in zebrafish embryos and direct inspection of live disease-associated ERK activity changes occurring already during gastrulation through real-time multispectral F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging. The protocol uses a transgenic ERK reporter recently established and integrated with the hardware of commercial microscopes. We provide an example application for Noonan syndrome (NS) zebrafish models obtained by expression of the Shp2D61G. We describe a straightforward method that enables registration of ERK signal change in the NS fish model before and after pharmacological signal modulation by available low-dose MEK inhibitors. We detail how to generate, retrieve, and assess ratiometric FRET signals from multispectral acquisitions before and after treatment and how to cross-validate the results via classical immunofluorescence on whole embryos at early stages. We then describe how, via examining standard morphometric parameters, to query late changes in embryo shape, indicative of a resulting impairment of gastrulation, in the same embryos whose ERK activity is assessed by live FRET at 6 h post fertilization.

RASopathies are multisystem genetic syndromes caused by RAS-MAPK pathway hyperactivation. Potentially pathogenic variants awaiting validation emerge continuously while poor preclinical evidence limits therapy. Here, we describe our in vivo protocol to test and cross-validate RASopathy-associated ERK activation levels and its pharmacological modulation during embryogenesis by live FRET imaging in Teen-reporter zebrafish.

Un protocollo efficiente per valutare la modulazione dell'attività di ERK nei primi modelli di sindrome di Noonan del pesce zebra tramite microscopia FRET dal vivo e immunofluorescenza

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. ...

Biochimica

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Alta Risoluzione intero monte<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in embrioni di zebrafish per studiare l&#39;espressione genica e la funzione

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Microiniezione di embrioni di zebrafish per analizzare la funzione del gene

Riepilogo

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Progettazione e microiniezione di oligonucleotidi morfolino antisenso e mRNA in embrioni di zebrafish per chiarire la funzione genica specifica nello sviluppo cardiaco

Progettazione e microiniezione di oligonucleotidi morfolino antisenso e mRNA in embrioni di zebrafish per chiarire la funzione genica specifica nello sviluppo cardiaco

Immagini dal vivo di estrusione in cella dal Epidermide di Zebrafish in via di sviluppo

Un protocollo efficiente per valutare la modulazione dell'attività di ERK nei primi modelli di sindrome di Noonan del pesce zebra tramite microscopia FRET dal vivo e immunofluorescenza

Alta Risoluzione intero monte