Nous reconnaissons les membres du laboratoire de Mably et Narie Storer pour leur assistance technique, et l&#39;American Heart Association (NCRP Scientist Development Grant 0635363N) et le National Heart, Lung, and Blood Institute (Grant SCCOR RFA HL02-027) pour le financement.

Partie 1: La production d&#39;œufs et de la collecte <ol><li> La nuit avant l&#39;injection, mis en place le poisson dans l&#39;élevage des réservoirs avec des intercalaires en place. Pour augmenter la production totale d&#39;oeufs, le poisson peut être mis en place dans un rapport de deux femelles pour un mâle, si désiré. </li><li> Le lendemain matin, après l&#39;éclairage de la salle s&#39;allument, tirez les diviseurs de plusieurs chars et de permettre à environ 20 minutes de temps de l&#39;accouplement non perturbées. </li><li> En utilisant une passoire, ramasser les oeufs des cages d&#39;élevage et les rincer avec de l&#39;eau d&#39;œuf. Verser les oeufs dans une boîte de Pétri avec de l&#39;eau d&#39;œuf et enlever les œufs non fécondés et les débris avec une pipette de transfert. Les poissons peuvent être regroupés dans de plus grands réservoirs pour produire des tours supplémentaires d&#39;oeufs destinés à l&#39;injection. Ajuster le calendrier de collecte des œufs afin de permettre un nombre maximal d&#39;œufs à produire sans les laisser passer le stade de simple cellule. </li><li> Placer une lame de microscope inversé dans le couvercle d&#39;un plat de Pétri de 100 mm. Utiliser une pipette de transfert pour aligner les oeufs contre le côté de la lame formant une seule colonne. Enlever l&#39;eau excédentaire d&#39;œufs de la diapositive en appuyant sur une Kimwipe contre le côté opposé les oeufs. (Figure 1A) </li></ol> Partie 2: Aiguilles de traction, le chargement et la préparation <ol><li> Avec un extracteur micropipette, tirez un verre OD 1.0mm capillaire dans deux aiguilles et le ranger dans un plat de Pétri de 150 mm en posant sur des rampes Silly Putty. Les aiguilles peuvent être retirés à l&#39;avance. </li><li> Backloading l&#39;aiguille avec 3 pi de matériel d&#39;injection à l&#39;aide d&#39;une pipette microloader. Agiter le bolus vers la pointe de l&#39;aiguille jusqu&#39;à ce qu&#39;il n&#39;y pas ou peu de bulles restantes. </li><li> Allumez la source de l&#39;air et microinjecteur. Insérez l&#39;aiguille dans la microinjecteur et assurer une bonne étanchéité dans le boîtier. Vérifier que le micromanipulateur est dans une position adéquate pour permettre un large éventail de mouvements et d&#39;ajustement. Apportez la pointe de l&#39;aiguille dans le plan de vue du microscope, haute de la scène, et se concentrer sur le plus mince région de la pointe. Utilisez une pince forte pour pincer l&#39;aiguille à un point qui laisse l&#39;aiguille suffisamment étroite pour percer le chorion et le jaune mais toujours capable de délivrer une taille uniforme perle. Une goutte d&#39;huile minérale sur un micromètre peut être utilisé pour calculer le volume de chaque injection. Lorsqu&#39;elle est injectée dans l&#39;huile, une bille d&#39;un diamètre de 0,1 mm contient 500 pL de matériel d&#39;injection (figure 1B); volumes d&#39;injection de 500 pl ou 1NL sont généralement utilisés. Appuyez sur la pédale et de surveiller la taille de la perle tout en réduisant l&#39;aiguille et en ajustant la pression d&#39;injection au besoin. Volumes d&#39;injection Idéal remplira environ 10% du volume de l&#39;œuf. La qualité de la pointe de l&#39;aiguille est cruciale à la fois à la facilité d&#39;injection et de la qualité et la cohérence des résultats. </li></ol> Partie 3: Injection <ol><li> Assurez-vous que les embryons n&#39;ont pas développé passé le stade de quatre cellules. Idéalement, les embryons doivent être au stade unicellulaire. </li><li> Abaissez l&#39;aiguille vers la colonne d&#39;œufs, de la tenue du plat en place avec votre main opposée. </li><li> Pierce la surface du chorion et entrez le jaune d&#39;un seul coup en douceur tout en regardant pour tout écrasement ou déchirure de la vésicule ombilicale. Injecter le matériau d&#39;injection dans le jaune (figure 1C). Éviter d&#39;injecter des bulles d&#39;air ou en étirant le jaune que ce soit peut être mortel pour l&#39;embryon. De travail sur toute la ligne, ajuster la pression au besoin pour maintenir une taille uniforme et de perles, à l&#39;aide d&#39;une pipette, enlever les œufs non fécondés qui donnent ou sont détruits au cours du processus d&#39;injection. </li><li> Après avoir complété une colonne d&#39;œufs, utilisez un jet d&#39;eau d&#39;œuf pour déplacer les oeufs injectés dans une boîte de Petri propre. Répéter au besoin. Gardez plusieurs embryons non-injecté comme un contrôle. A la fin de la première journée, retirez embryons morts et d&#39;enregistrer le nombre d&#39;embryons injectés. Remplacer l&#39;eau d&#39;œuf dans le plat périodiquement pour réduire le risque d&#39;infection. </li></ol> Partie 4: Les résultats représentatifs Selon ce qui est injecté, les embryons peuvent survivre à un taux inférieur à celui de leurs frères et sœurs non-injecté. Heureusement, il est facile d&#39;injecter un très grand nombre d&#39;entre eux, donc c&#39;est rarement un problème. Il est normal d&#39;exposer le développement morphants légèrement retardée. Pour illustrer les résultats de la micro-injection, nous avons utilisé ce protocole pour manipuler les niveaux de la protéine de Coeur de Verre (HEG). Heg est une protéine transmembranaire requis pour le développement normal de coeur. En son absence, les embryons se développent avec des coeurs de vastes flux géantes et des chambres 1. Nous injecté deux morpholinos précédemment non décrite contre la HEG, heg_e3i3_egfr1 et heg_e4i4_egfr2, à une concentration de 500 uM. A deux jours après la fécondation, les contrôles non-injecté fratrie semblent normales, comme attendu (figure 2A et B). Embryons injectés avec heg_e3i3_egfr1 ont œdème cérébral (figure 2C). Bien que le cœur de la plupart de ces morphants ont modifié la morphologie, leurs chambres sont de taille normale (figure 2d). Les embryons injectésavec des défauts d&#39;exposition heg_e4i4_egfr2 coeur variable. Certains semblent normales, tandis que d&#39;autres ont de vastes afflux et les oreillettes modérément élargie (figure 2E et F). Le mutant HEG, comme indiqué précédemment 1, a une étendue immense afflux élargie et de l&#39;oreillette (figure 2G et H). Nous avons également injecté des embryons de type sauvage avec 400 ARNm ng / uL transcrit à partir de pleine longueur HEG ADNc. Alors que les contrôles non-injecté développer normalement (figure 3A et B), les embryons injectés avec HEG ARNm présentent un spectre de phénotypes allant de l&#39;apparence de type sauvage à la cyclopie sévère, le raccourcissement de l&#39;axe du corps principal, la nécrose de la tête et le corps, et les défauts de ligne médiane (figure 3C et D). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%201%20FINAL.png" alt="" /> Embryons Figure 1. Être injectés sont alignés contre une lame de microscope dans une boîte de Pétri (A). Le volume d&#39;injection est déterminée en injectant dans l&#39;huile minérale placée sur un micromètre. Un volume d&#39;injection de 500 pL, qui est couramment utilisé, a un diamètre de 0,1 mm (B). Immédiatement après l&#39;injection, le morpholino ou ARNm est visible comme une tache dans le jaune ponctuent (C). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%202%20FINAL.png" alt="" /> Figure 2. A deux jours après la fécondation, les embryons n&#39;ont pas de défauts non-injecté brut (A) ou d&#39;un phénotype cardiaque (B). Les embryons injectés avec les morpholino heg_e3i3_egfr1 ont œdème cérébral (C, flèche), mais cavités cardiaques de taille normale (D). Certains embryons injectés avec les morpholino heg_e4i4_egfr2 ont de vastes flux élargie et les oreillettes (E, F). HEG mutants ont de vastes flux fortement élargie et les oreillettes (G, H). (A), (C), (E) et (G) sont 4x images DIC; (B), (D), (F) et (H) sont 20x images DIC. un atrium =, il tractus = entrées. <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%203%20FINAL.png" alt="" /> Figure 3. A 24 heures après fécondation, les embryons non-injecté ont un corps long et rectiligne et sans défauts nécrose ou médiane (A) et deux yeux clairement définis avec un tube neural entre eux (B). Certains embryons injectés avec l&#39;ARNm HEG, en revanche, présentent un axe du corps raccourci, la nécrose, somites misshaped (C), et cyclopie (D). (A) et (C) sont 4x images DIC; (B) et (D) sont 20x images DIC.

<ol>
	<li>Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=heart+of+glass+regulates+the+concentric+growth+of+the+heart+in+zebrafish.">heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).</li></ol>

Un des points forts du système modèle de poisson zèbre est la facilité avec laquelle les produits des gènes spécifiques peuvent être ajoutés ou éliminés de l&#39;embryon par microinjection. Pour ubiquiste surexpriment une protéine particulière, l&#39;ARNm codant il est injecté dans le jaune d&#39;œuf au stade 1-cellule. Au cours du développement ultérieur de l&#39;embryon, l&#39;ARN est distribué dans tout l&#39;organisme et traduit. A l&#39;inverse, pour éliminer une protéine particulière, morpholinos sont utilisés. Morpholinos oligonucléotides synthétiques sont conçus avec la complémentarité des ARN antisens pour particuliers. Comme ARNm, morpholinos sont injectés dans le jaune d&#39;œuf au stade 1-cellule. A l&#39;intérieur de l&#39;embryon qu&#39;ils lient leurs ARN cibles, ce qui empêche la traduction. La principale modification qui doit être faite pour chaque morpholino ou ARNm est la concentration du produit injecté. Une concentration trop élevée de l&#39;ARNm soit morpholino ou peut causer toxicité non spécifique, tandis que chaque morpholino doit être testé empiriquement pour déterminer sa concentration optimale, généralement les concentrations de morpholino entre 200 um et 500 um renverser l&#39;activité des gènes de manière efficace sans causer de non-spécifique des défauts. La taille exacte de l&#39;ouverture de l&#39;aiguille n&#39;est pas crucial. Dans une gamme de tailles d&#39;aiguilles, la pression d&#39;injection et le temps d&#39;injection peut être ajusté pour produire un bolus du volume correct. Morpholinos ont de nombreuses applications, y compris la dissection fonctionnelle des domaines au sein d&#39;une protéine. Lorsqu&#39;ils sont conçus pour cible spécifique jonctions exon-intron, morpholinos permettra d&#39;éviter l&#39;apparition de l&#39;épissage là. Nous avons examiné les effets de deux morpholinos qui lient jonctions exon-intron du pré-ARNm de la HEG. Le heg_e3i3_egfr1 morpholino lie la jonction entre l&#39;exon 3 et l&#39;intron 3, la prévention de la machinerie d&#39;épissage de l&#39;exon 3 incorporant dans des transcriptions matures. Le heg_e4i4_egfr2 morpholino supprime pareillement l&#39;exon 4. Les deux exons 3 et 4 codent domaines contenant des répétitions EGF-like. Certains embryons injectés avec heg_e4i4_egfr2 modérément phénocopie le mutant; expériences supplémentaires seront nécessaires pour comprendre le rôle de l&#39;exon 4 Heg dans le développement du cœur. Étonnamment, les embryons injectés avec heg_e3i3_egfr1 ont oedème cérébral, une caractéristique ne voit pas dans les mutants HEG. Cela peut être dû à la capacité de se lier morpholinos transcriptions maternelle qui ne serait pas affectée dans des mutants zygotiques.

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microinjector</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>PLI 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Tool</td>
<td>Narishige</td>
<td>MN 153</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Puller</td>
<td>Tool</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P 97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Capillaries</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100 F6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microloader Pipettes</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Holder</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>MPH310</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function

Un des avantages du poisson zèbre étudier est la facilité et la rapidité de la manipulation des taux de protéines dans l&#39;embryon. Morpholinos, qui sont des oligonucléotides antisens synthétiques avec la complémentarité d&#39;ARN cibles, peuvent être ajoutés à l&#39;embryon de réduire l&#39;expression d&#39;un produit de gène particulier. Inversement, l&#39;ARNm traitées peuvent être ajoutés à l&#39;embryon pour augmenter les niveaux d&#39;un produit du gène. Le véhicule pour l&#39;ajout de deux ARNm ou morpholino d&#39;un embryon est la microinjection. La microinjection est efficace et rapide, permettant l&#39;injection de centaines d&#39;embryons par heure. Cette vidéo montre toutes les étapes impliquées dans la micro-injection. Brièvement, les œufs sont prélevés immédiatement après avoir été pondus et alignés contre une lame de microscope dans une boîte de Pétri. Ensuite, une aiguille à pointe fine chargé de matériel d&#39;injection est relié à un microinjecteur et une source d&#39;air, et les contrôles sont microinjecteur ajusté pour produire un volume d&#39;injection souhaitable. Enfin, l&#39;aiguille est plongé dans le jaune de l&#39;embryon et le morpholino ou ARNm est expulsé.

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Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Cette vidéo montre comment morpholino ou ARNm peut être injecté dans des embryons de poisson zèbre au stade d&#39;une cellule pour diminuer ou augmenter le niveau des produits de gènes spécifiques au cours du développement ultérieur.

Microinjection d&#39;embryons de poissons zèbres pour analyser la fonction génique

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

microinjection-of-zebrafish-embryos-to-analyze-gene-function

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

77.2K vues.  Harvard Medical School. Cette vidéo montre comment morpholino ou ARNm peut être injecté dans des embryons de poisson zèbre au stade d'une cellule pour diminuer ou augmenter le niveau des produits de gènes spécifiques au cours du développement ultérieur.

Vidéo: Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinjection d&#39;embryons aegypti a. Pour obtenir les moustiques transgéniques

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Recherche

Biologie

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjection d&#39;ARNm et oligonucléotides antisens morpholino dans embryons de poissons zèbres.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Génération embryons de poissons zèbres chimériques par transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

En utilisant la réponse optocinétique pour étudier la fonction visuelle du poisson zèbre

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Deux-Photon-Based photoactivation dans Live embryons de poissons zèbres

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinjection d&#39;embryons Medaka pour être utilisé comme un organisme modèle génétique

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Analyse du profil métabolique des embryons de poisson zèbre

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional mutagenesis using fluorescent reporters to tag expression of mutated genes. Several laboratories have constructed and tested enhancer- and gene-trap vectors in zebrafish, using fluorescent proteins, Gal4- and lexA- based transcriptional activators as reporters 1-7. These vectors had two potential drawbacks: suboptimal stringency (e.g. lack of ability to differentiate between enhancer- and gene-trap events) and low mutagenicity (e.g. integrations into genes rarely produced null alleles). Gene Breaking Transposon (GBTs) were developed to address these drawbacks 8-10. We have modified one of the first GBT vectors, GBT-R15, for use with Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter and added UAS:eGFP as the secondary reporter for direct detection of gene trap events. Application of Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter provides two main advantages. First, it increases sensitivity for genes expressed at low expression levels. Second, it enables researchers to use gene trap lines as Gal4 drivers to direct expression of other transgenes in very specific tissues. This is especially pertinent for genes with non-essential or redundant functions, where gene trap integration may not result in overt phenotypes. The disadvantage of using Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter is that genes coding for proteins with N-terminal signal sequences are not amenable to trapping, as the resulting Gal4-VP16 fusion proteins are unlikely to be able to enter the nucleus and activate transcription. Importantly, the use of Gal4-VP16 does not pre-select for nuclear proteins: we recovered gene trap mutations in genes encoding proteins which function in the nucleus, the cytoplasm and the plasma membrane.

This protocol describes the method of gene trap insertional mutagenesis using Gal4-VP16 as the primary reporter and GFP/RFP as secondary reporters in zebrafish. Approximately one in ten high-expressing F0 fish yield gene trap progeny co-expressing GFP and RFP. The screening procedure can be readily scaled to adapt to the size of the laboratory performing the insertional mutagenesis screen.

Gene piégeage utilisant Gal4 chez le poisson zèbre

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Mesure de la force lors de la contraction d&#39;évaluer la fonction musculaire en poisson zèbre

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Haute Résolution Mont entier<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans les embryons de poisson zèbre pour étudier l&#39;expression des gènes et la fonction

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Microinjection d'embryons de poissons zèbres pour analyser la fonction génique

Résumé

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