نعترف أعضاء المختبر Mably وStorer Narie للحصول على المساعدة التقنية ، وجمعية القلب الأمريكية (NCRP ساينتست التنمية 0635363N غرانت) والمعهد الوطني للقلب والرئة والدم المعهد (المنحة SCCOR RFA HL02 - 027) للحصول على التمويل

الجزء 1 : إنتاج البيض ، وجمع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليلة قبل الحقن ، التي أنشئت في تربية الأسماك مع فواصل الدبابات في المكان. لزيادة إجمالي إنتاج البيض ، ويمكن تعيين ما يصل السمك في نسبة اثنين إلى واحد من الذكور الإناث إذا رغبت في ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في صباح اليوم التالي ، وبعد تشغيل أضواء الغرفة ، سحب فواصل من عدة دبابات والسماح لحوالي 20 دقيقة من وقت التزاوج دون عائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مصفاة ، وجمع البيض من أقفاص التربية وشطف لهم المياه البيض. صب البيض في صحن بيتري البيض مع الماء وإزالة الأنقاض وبويضة غير مخصبة مع ماصة نقل. ويمكن تجميع الأسماك في خزانات أكبر لانتاج قذائف إضافية من البيض للحقن. ضبط توقيت جمع البيض للسماح للأرقام الحد الأقصى من البيض إلى أن يتم إنتاجها من دون السماح لهم بالمرور المرحلة خلية واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان شريحة المجهر في غطاء المقلوب طبق بيتري 100mm. استخدام ماصة نقل إلى خط يصل البيض ضد الجانب من الشريحة التي تشكل عمود واحد. إزالة المياه الزائدة من البيض الشريحة بالضغط على Kimwipe ضد الجانب الآخر البيض. (الشكل 1A) </li></ol> الجزء 2 : سحب إبرة ، التحميل ، وإعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع مجتذب micropipette ، سحب الزجاج OD 1.0mm الشعرية إلى قسمين الإبر وتخزينها في طبق بتري 150mm عن طريق وضع المعجون على سلالم سخيفة. يمكن سحب الإبر مقدما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Backload الإبرة مع 3 ميكرولتر من مواد الحقن باستخدام ماصة microloader. يهز بلعة نحو غيض الإبرة حتى هناك فقاعات قليلة أو معدومة المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مصدر الهواء وmicroinjector. ادخال الإبرة في microinjector وضمان ختم ضيقة داخل السكن. تأكد من أن micromanipulator في موقف مناسب للسماح لمجموعة واسعة من الحركة والتكيف. جلب رأس الإبرة في الطائرة من عرض من المجهر ، وارتفاع قبالة المرحلة ، والتركيز على أنحف منطقة الحافة. استخدام زوج من الملقط حادة لقرصة قبالة الإبرة في النقطة التي يترك إبرة ضيقة بما يكفي لاختراق المشيماء وصفار البيض ولكن لا تزال قادرة على إيصال حجم حبة متسقة. ويمكن استخدام قطرة من الزيت المعدني على ميكرومتر لحساب حجم كل حقنة. عندما يحقن في النفط ، مع حبة قطره 0.1 ملم تحتوي على 500 من المواد PL الحقن (1B الشكل) ، وتستخدم عادة حقن كميات من 500 أو PL 1nL. كساد على دواسة القدم ورصد حجم حبة في حين خفضت الإبرة وضبط ضغط الحقن حسب الحاجة. وحقن كميات مثالية ملء ما يقرب من 10 ٪ من حجم البيضة. نوعية رأس إبرة أمر حاسم لتخفيف كل من الحقن والجودة والاتساق في النتائج. </li></ol> الجزء 3 : حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمان أجنة لم تتطور في المرحلة الماضية أربعة الخلية. من الناحية المثالية ، ينبغي أن تكون الأجنة في مرحلة واحدة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انخفاض الإبرة في اتجاه العمود من البيض ، وعقد الطبق في مكان مع يدك المعاكس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يخترق سطح المشيماء وأدخل صفار بضربة واحدة على نحو سلس في حين يراقب عن أي تكسير أو تمزق في كيس المح. حقن مواد الحقن في صفار (الشكل 1C). تجنب فقاعات الهواء عن طريق الحقن أو تمتد صفار إما أن تكون قاتلة للجنين. تعمل باستمرار على الخط ، وضبط الضغط حسب الحاجة للحفاظ على حجم حبة ومتسقة ، وذلك باستخدام ماصة الحافة ، إزالة البيض التي تبدو غير مخصبة أو دمرت خلال عملية الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتهاء من عمود من البيض ، واستخدام تيار من الماء البيض لطيف لنقل البيض حقنها طبق بيتري نظيفة. كرر حسب الضرورة. تبقي عدة أجنة uninjected كمجموعة تحكم. في نهاية يوم واحد ، وإزالة أجنة ميتة وسجل عدد من الأجنة المحقونة. استبدال الماء في طبق البيض دوريا لتقليل فرصة الإصابة. </li></ol> الجزء 4 : نتائج الممثل اعتمادا على ما يجري حقن ، قد الأجنة البقاء بسعر أقل من إخوانهم uninjected. لحسن الحظ ، فإنه من السهل على ضخ كميات هائلة منه ، لذلك هذا نادرا ما يمثل مشكلة. فمن الطبيعي أن تظهر لmorphants التنمية تأخر قليلا. لتوضيح نتائج microinjection ، استخدمنا هذا البروتوكول لمعالجة مستويات البروتين القلب من الزجاج (حج). حج هو بروتين عبر الغشاء اللازمة للتنمية القلب العادي. في غيابها ، مع قلوب الأجنة تطوير مساحات تدفق العملاقة والغرف 1. حقن نحن اثنان morpholinos لم يسبق وصفه ضد حج ، وheg_e3i3_egfr1 heg_e4i4_egfr2 ، عند تركيز 500 ميكرومتر. في آخر أيام 2 الإخصاب ، والضوابط الأخوة uninjected تبدو طبيعية ، كما هو متوقع (2A الرقم وباء). أجنة حقنوا heg_e3i3_egfr1 وذمة الدماغ (الشكل 2C). على الرغم من أن قلوب معظم هذه morphants غيرت التشكل ، والغرف الخاصة بهم الحجم عادة (الشكل 2D). حقن الأجنةبعيوب المعرض heg_e4i4_egfr2 القلب متغير. بعض تبدو طبيعية ، في حين أن البعض الآخر تدفق مساحات كبيرة ومتوسطة الأذينين الموسع (2E الرقم وF). ومتحولة حج ، كما ذكرت سابقا 1 ، لديها الجهاز بشكل كبير وتوسيع تدفق الأذين (الشكل 2G و H). نحن أيضا حقن الأجنة wildtype مرنا مع 400 نانوغرام / ميكرولتر مستنسخة من كامل طول حج [كدنا]. بينما تسيطر uninjected تتطور بشكل طبيعي (الشكل 3A وباء) والأجنة حقنوا حج مرنا المعرض تشكيلة واسعة من الظواهر تتراوح ما بين ظهور wildtype لتصقلب شديد ، وتقصير من محور الجسم الرئيسي ، تنخر في الرأس والجسم ، وعيوب خط الوسط (الشكل 3C ودال). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%201%20FINAL.png" alt="" /> تصطف الشكل 1. الأجنة ليتم حقنه ضد شريحة المجهر في طبق بيتري (A). ويتحدد حجم الحقن عن طريق حقن في الزيوت المعدنية وضعت على ميكرون. وحدة تخزين حقن 500 رر ، التي يشيع استخدامها ، التي يبلغ قطرها 0.1 ملم (B). فورا بعد الحقن ، وmorpholino مرنا أو مرئيا كبقعة تلم في صفار (C). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%202%20FINAL.png" alt="" /> الشكل 2. وفي آخر أيام 2 الإخصاب والأجنة uninjected ليس لديهم عيوب جسيمة (A) أو النمط الظاهري القلب (B). أجنة حقنوا heg_e3i3_egfr1 morpholino وذمة الدماغ (C ، السهم) ولكن عادة حجرات القلب الحجم (D). بعض الأجنة حقنوا heg_e4i4_egfr2 morpholino ومساحات تدفق الموسع والأذينين (E ، F). حج والمسوخ مساحات تدفق الموسع بشدة والأذينين (G ، H). (أ) و (C) ، (E) ، و (G) هي صور مدينة دبي للإنترنت 4X ، (B) ، (D) ، (F) و (ه) هي الصور 20X مدينة دبي للإنترنت. ردهة = ، فإنه = تدفق المسالك. <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%203%20FINAL.png" alt="" /> الشكل 3. وفي 24 التسميد آخر ساعة ، uninjected اجنة لديها طويل ، مستقيم الجسم مع عدم وجود عيوب أو نخر خط الوسط (أ) و عينان محددة بوضوح مع الأنبوب العصبي بينهما (B). بعض الأجنة حقنوا مرنا حج ، في المقابل ، يحمل محور الجسم تقصير ، نخر ، somites شوه (C) ، وتصقلب (D). (أ) و (ج) هي صور مدينة دبي للإنترنت 4X ، (B) و (D) والصور 20X مدينة دبي للإنترنت.

<ol>
	<li>Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=heart+of+glass+regulates+the+concentric+growth+of+the+heart+in+zebrafish.">heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).</li></ol>

واحدة من نقاط القوة في النظام النموذجي الزرد هو السهولة التي يمكن أن تضاف إلى المنتجات جين معين أو التخلص من الجنين قبل microinjection. لoverexpress بتواجد مطلق بروتين خاص ، ترميز مرنا يحقن في صفار في المرحلة 1 - الخلية. خلال نمو الجنين في وقت لاحق ، يتم توزيع الحمض النووي الريبي في جميع أنحاء الحي وترجمتها. على العكس ، من أجل القضاء على بروتين خاص ، تستخدم morpholinos. Morpholinos هي [أليغنوكليوتيد] الاصطناعية المصممة التكامل مع العقاقير لالرناوات محددة. مثل mRNAs ، يتم حقن morpholinos في صفار في المرحلة 1 - الخلية. داخل الجنين أنها تربط الرناوات هدفهم ، ومنع الترجمة. التعديل الرئيسي الذي يحتاج الى بذل كل morpholino مرنا أو هو تركيز المادة المحقونة. قد عالية للغاية من تركيز إما morpholino مرنا أو غير محددة تسبب التسمم ، في حين يجب أن يتم اختبار كل morpholino تجريبيا لتحديد تركيز على النحو الأمثل ، وعادة تركيزات morpholino بين 200 ميكرومتر و500 ميكرومتر نهدم نشاط الجينات على نحو فعال دون أن تسبب تشوهات غير محددة. الحجم الدقيق لفتح إبرة ليست حاسمة. ويمكن ضمن مجموعة من الأحجام الإبرة ، وضغط الحقن والحقن يمكن ضبط الوقت لانتاج بلعة من حجم الصحيح. Morpholinos لها تطبيقات عديدة ، بما في ذلك تشريح وظيفي من المجالات داخل البروتين. عندما صمم لهدف محدد ، اكسون إنترون التقاطعات ، وسوف morpholinos منع الربط من حدوث هناك. درسنا آثار اثنين من morpholinos التي تربط بين اكسون - إنترون تقاطعات مرنا في حج من قبل. وheg_e3i3_egfr1 morpholino يربط بين مفترق اكسون 3 و 3 إنترون ، ومنع من الربط آلات دمج اكسون 3 في النصوص الناضجة. وبالمثل heg_e4i4_egfr2 morpholino يزيل اكسون 4. كلا exons متماثلة 3 و 4 التي تحتوي على ترميز EGF المجالات مثل تكرار. بعض الأجنة حقنوا نسخة مظهرية معتدلة heg_e4i4_egfr2 ومتحولة ، وسوف تكون هناك حاجة إلى مزيد من التجارب على فهم دور حج اكسون 4 في التنمية القلب. من المدهش ، مع حقن الأجنة heg_e3i3_egfr1 وذمة الدماغ ، وهي ميزة لا ينظر في حج المسوخ. هذا قد يكون راجعا إلى قدرة morpholinos ربط النصوص الأم التي لن تتأثر في لاقحي المسوخ.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microinjector</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>PLI 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Tool</td>
<td>Narishige</td>
<td>MN 153</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Puller</td>
<td>Tool</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P 97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Capillaries</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100 F6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microloader Pipettes</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Holder</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>MPH310</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function

واحدة من مزايا دراسة الزرد هو سهولة وسرعة معالجة مستويات البروتين في الجنين. يمكن إضافة Morpholinos ، والتي هي [أليغنوكليوتيد] الاصطناعية مع التكامل العقاقير لالرناوات المستهدفة ، إلى جنين للحد من التعبير عن الجينات منتج معين. على العكس ، يمكن إضافة إلى معالجة مرنا الجنين لزيادة مستويات منتج الجين. السيارة إما لإضافة أو مرنا morpholino إلى الجنين microinjection. Microinjection غير فعالة وسريعة ، مما يسمح للحقن مئات من الأجنة في الساعة. هذا الفيديو يبين كل الخطوات التي تنطوي عليها microinjection. باختصار ، يتم جمع البيض على الفور بعد أن وضعت واصطف ضد شريحة المجهر في طبق بتري. المقبل ، ويرتبط إبرة رفيعة ذات الرؤوس محملة مواد الحقن لmicroinjector ومصدر الهواء ، ويتم ضبط الضوابط microinjector لإنتاج وحدة حقن مرغوب فيه. وأخيرا ، انخفضت الإبرة في صفار الجنين ويطرد morpholino أو مرنا.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function at JoVE.com

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

هذا الفيديو يبين كيف يمكن حقنها أو morpholino مرنا في الأجنة الزرد في مرحلة واحدة الخلية إلى نقصان أو زيادة مستوى المنتجات جين معين خلال التطور اللاحق.

Microinjection الجنين اسماك الزرد إلى تحليل وظائف الجينات

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

microinjection-of-zebrafish-embryos-to-analyze-gene-function

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

77.2K Views.  Harvard Medical School. هذا الفيديو يبين كيف يمكن حقنها أو morpholino مرنا في الأجنة الزرد في مرحلة واحدة الخلية إلى نقصان أو زيادة مستوى المنتجات جين معين خلال التطور اللاحق.

Video: Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinjection الجنين بعوض ألف الحصول على البعوض المعدلة وراثيا

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjection من مرنا والعقاقير [أليغنوكليوتيد] Morpholino اسماك الزرد في الأجنة.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

توليد الأجنة اسماك الزرد همي بواسطة زرع

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

باستخدام optokinetic استجابة لدراسة وظيفة البصرية من الزرد

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

ثنائي الفوتون المستندة إلى تنشيط ضوئي في الأجنة الحية اسماك الزرد

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinjection الجنين الميداكا لاستخدامها بوصفها كائنا النموذجي الوراثية

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

الأيض تحليل الملف من الأجنة الزرد

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional mutagenesis using fluorescent reporters to tag expression of mutated genes. Several laboratories have constructed and tested enhancer- and gene-trap vectors in zebrafish, using fluorescent proteins, Gal4- and lexA- based transcriptional activators as reporters 1-7. These vectors had two potential drawbacks: suboptimal stringency (e.g. lack of ability to differentiate between enhancer- and gene-trap events) and low mutagenicity (e.g. integrations into genes rarely produced null alleles). Gene Breaking Transposon (GBTs) were developed to address these drawbacks 8-10. We have modified one of the first GBT vectors, GBT-R15, for use with Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter and added UAS:eGFP as the secondary reporter for direct detection of gene trap events. Application of Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter provides two main advantages. First, it increases sensitivity for genes expressed at low expression levels. Second, it enables researchers to use gene trap lines as Gal4 drivers to direct expression of other transgenes in very specific tissues. This is especially pertinent for genes with non-essential or redundant functions, where gene trap integration may not result in overt phenotypes. The disadvantage of using Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter is that genes coding for proteins with N-terminal signal sequences are not amenable to trapping, as the resulting Gal4-VP16 fusion proteins are unlikely to be able to enter the nucleus and activate transcription. Importantly, the use of Gal4-VP16 does not pre-select for nuclear proteins: we recovered gene trap mutations in genes encoding proteins which function in the nucleus, the cytoplasm and the plasma membrane.

This protocol describes the method of gene trap insertional mutagenesis using Gal4-VP16 as the primary reporter and GFP/RFP as secondary reporters in zebrafish. Approximately one in ten high-expressing F0 fish yield gene trap progeny co-expressing GFP and RFP. The screening procedure can be readily scaled to adapt to the size of the laboratory performing the insertional mutagenesis screen.

الجينات الاصطياد عن طريق GAL4 في الزرد

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

قياس القوة خلال تقلص العضلات لتقييم وظيفة في يرقات اسماك الزرد

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

ارتفاع القرار جبل بأكمله<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين داخل الأجنة الزرد لدراسة التعبير الجيني وظيفة

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...