ヒト心臓のマルチスケール3次元解剖学的研究のためのパイプライン

このプロトコルは、人間の心臓から得られたサンプルを微視的スケールと巨視的スケールで分析するための包括的なパイプラインを提供します。

移植が拒否された機能不全のない人間の心臓の詳細な研究は、微視的および巨視的なスケールで構造分析を実行するユニークな機会を提供します。これらの技術には、組織透明化(溶媒で透明化された臓器の修飾免疫標識対応3次元(3D)イメージング)および免疫組織化学染色が含まれます。メゾスコピック検査の手順には、立体解剖とマイクロコンピューター断層撮影(CT)スキャンが含まれます。肉眼的検査手順には、肉眼的解剖、写真撮影(アナグリフおよび写真測量を含む)、CT、および物理的または仮想的に解剖された心臓または全身の3Dプリントが含まれます。肉眼検査の前に、心臓の3D構造と生理学的に関連する形態を維持するために、圧力灌流固定を行う場合があります。これらの技術を組み合わせて人間の心臓を研究するための適用は、心臓の3D構造の文脈で冠状血管系と心筋神経支配などの異なる解剖学的特徴との関係を理解する上でユニークで重要です。このプロトコルでは、方法論を詳細に説明し、ヒト心臓解剖学の研究の進歩を示す代表的な結果が含まれています。

機能が形に従うように、心臓の構造を理解することは、その生理機能を理解するための基本です。数多くの調査により、ミクロスケールからマクロスケールまでの心臓の解剖学的構造が明らかになりました^1,2,3、^特に人間の心臓の解剖学的構造に関連する複数の問題が未解決のままです。これは、機能解剖学に焦点を当てた基礎研究が一般的に動物の心臓^4,5,6を使用しており、これらはしばしば人間の心臓^1,7,8とは異なるためである。さらに、個々の研究は、人間の心臓サンプルを使用したものであっても、非常に特殊な構造に焦点を当てる傾向があり、その結果を心臓全体の文脈に適用することが困難になります。これは、集束構造が近縁部⁹や神経節^神経叢10のようなミクロスケールまたはメソスケールにある場合はなおさらである。

この文脈では、移植が拒否されたヒト心臓の全身構造研究は、微視的および巨視的スケール¹¹にまたがって焦点をあてた心臓構造の包括的なアトラスを得るユニークでまれな機会を提供する。顕微鏡検査プロトコルには、組織透明化(溶媒除去された臓器の修飾免疫標識対応3次元(3D)イメージング、iDISCO+)^12,13、および免疫組織化学染色が含まれます。メゾスコピック検査プロトコルには、立体解剖、マクロ写真、およびマイクロコンピューター断層撮影(CT)スキャンが含まれます。肉眼的検査プロトコルには、肉眼的解剖¹⁴、写真撮影(アナグリフおよび写真測量を含む)^15、16、17、CT、仮想解剖¹⁸、および物理的または仮想的に解剖されたまたは全身の心臓¹⁷の3Dプリントが含まれる。肉眼的検査の準備として、心臓の3D構造と生理学的に関連性のある形態を維持するために、圧力灌流固定が行われる^14,19,20,21。これらの技術の組み合わせは、人間の心臓の3Dアーキテクチャのコンテキストで異なる解剖学的特徴を関連付けるためにユニークで重要です。

非病理学的ヒト心臓サンプルを得る機会は極めて限られているため、本明細書に記載のマルチスケールアプローチは、サンプルの使用を最大化する。以下に述べる様々な手順を適用することにより、代表的な結果は、科学研究¹¹ (心臓神経支配の包括的解析、神経節神経叢の分布の包括的解析)、臨床手順の改善(外科的およびインターベンション的アプローチのシミュレーション)、解剖学的教育(心臓解剖学の実際の3Dデモンストレーション)など、複数の目的で知見をどのように活用できるかを読者に示します。

この研究は、機能不全ではないドナーのヒト心臓から収集された匿名化された組織サンプルを使用し、カリフォルニア大学ロサンゼルス校(UCLA)の治験審査委員会によって承認されました。サンプルは、移植が拒否された非機能不全の心臓から採取されました。心臓を加圧灌流し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定し、以下の方法により組織処理前に画像化した。 図1 は、調査の順序のフローチャートをまとめたものです。本試験で使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. マイクロスケールの検査

1. 溶媒で除去された臓器の修飾免疫標識対応3Dイメージング(iDISCO+)プロトコルを使用した組織透明化。
   1. 共焦点顕微鏡用の3 mm×16 mm×25 mmのチャンバー内に収まるように、メスで4% PFA固定組織を解剖します。より厚い組織をイメージングするために、追加のチャンバーおよび/またはスペーサーをスライド上に積み重ねることができます。
   2. グレードドメタノール(MeOH)シリーズ(脱イオンH₂O [vol/vol]中の20%、40%、60%、80%、100%MeOH)を用いて、室温(RT)で各1時間攪拌しながら試料を脱水します。
   3. 100% MeOHでRTで1時間洗浄し、RTで66%ジクロロメタン/33% MeOHに浸漬し、一晩攪拌します。
   4. 翌日、MeOH(100%)で2回RTで1時間洗浄し、4°Cで冷やし、5%H₂O₂ in MeOH(vol/vol)で4°Cで一晩処理します。
   5. 等級付けされたMeOHシリーズ(80%、60%、40%、および20%MeOH)で再水和し、0.01 mol/L PBSでRTで各1時間攪拌しながら洗浄します。
   6. 組織を0.01 mol/L PBSで0.2% Triton X-100と共に室温で1時間2回洗浄します。
   7. 免疫標識の準備は、0.01 mol/L PBS、20%ジメチルスルホキシド(DMSO)、0.2% Triton X-100、および0.3 mol/Lグリシンを37°Cで2日間攪拌しながら透過処理します。
   8. 10% DMSO、0.2% Triton X-100、および5%の正常ロバ血清を含む0.01 mol/L PBSを、37°Cでさらに2日間、攪拌しながらブロックします。
   9. 10 mg/mL ヘパリン (PTwH)、0.2% Tween-20、5% DMSO、および 3% 正常ロバ血清 0.01 mol/L PBS で希釈した蛍光色素に結合した MeOH に適合した一次抗体で標識し、37 °C で 3-4 日間攪拌します。
   10. 抗体溶液を補充し、攪拌しながら37°Cでさらに3〜4日間インキュベートします。
   11. 一次抗体溶液で1週間インキュベートした後、PTwHでRTで一晩4〜5回洗浄します。
   12. PTwH、3%正常ロバ血清で希釈した蛍光色素に結合した二次抗体と、撹拌しながら37°Cで3日間インキュベートします。
   13. 二次抗体溶液を補充し、攪拌しながら37°Cでさらに3日間インキュベートします。
   14. 二次抗体溶液中で6日間インキュベートした後、PTwHでRTで一晩4〜5回洗浄します。
   15. 等級分けされたMeOHシリーズ(20%、40%、60%、80%、100%、および100%MeOH)で脱水します。サンプルはRTで一晩保存できます。
   16. 66%ジクロロメタン/33%MeOHでRTで3時間インキュベートし、攪拌します。
   17. 100%ジクロロメタンで15分間、攪拌しながらRTで2回洗浄します。
   18. 検体をベンジルエーテルでインキュベートし、保存します。サンプルの酸化による空気を最小限に抑えるために、チューブに充填します。
2. 組織クリア標本のイメージング
   1. スライドに接着剤の入ったチャンバーを貼り付け、チャンバーの周囲にマニキュアを塗布します。より厚い組織の場合、追加のチャンバーおよび/またはスペーサーをスライド上に積み重ねることができます。
   2. 透明化した組織をチャンバーに置き、ベンジルエーテルを充填し、カバースリップを塗布します。
   3. カバースリップの周りにマニキュアを塗ってシールを作成します。
   4. 5倍または10倍のレンズを備えた直立型レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して、タイルスキャンおよびZスタック画像を取得し、レンズの作動距離までの深さでイメージングします。
   5. 1024 x 1024の解像度で、使用した蛍光色素の発光スペクトルに適したレーザーラインを使用して画像化します。筋肉の自家蛍光は、488nmのレーザーラインを使用して見ることができます。
   6. z軸のステップサイズが、指定された対物レンズ¹¹の開口数に基づくナイキストサンプリングと一致していることを確認します。
   7. 画像をつなぎ合わせ、ソフトウェアを使用して3D視覚化します。
   8. 個々のチャンネルとマージされたチャンネルのZスタックの最大強度投影(MIP)画像を使用してフィギュアを作成します(図2)。
3. 免疫組織化学
   注:組織をパラフィン包埋²²した後、以下の手順を用いて免疫組織化学的研究のためのスライドを作成する。
   1. 屈折率マッチング溶液(RIMS)の調製。
      1. 10.9 gのNa₂HPO₄ (無水)と3.1 gのNaH₂PO₄ (一水和物)を脱イオンH₂Oに添加して、0.1 mol/Lリン酸緩衝液を調製し、総容量1 L(pH 7.4)にします。溶液をフィルター滅菌し、RTで保存します。
      2. リン酸緩衝液を0.02 mol/Lに希釈します。
      3. Histodenzを30 mLの0.02 mol/Lリン酸緩衝液に溶解し、蒸発と汚染を最小限に抑えるために密封できる最終保存ボトル内の磁気攪拌子を使用して溶液を10分間攪拌します。
      4. アジ化ナトリウムを総濃度0.01%(w / v)に添加し、NaOHでpHを7.5に調整します。
      5. Histodenzの最終濃度を変化させてRIを調整します。
      6. RIMSはRTで数ヶ月間保管してください。微生物汚染が認められた場合は廃棄してください。
         注:アジ化ナトリウムを含む溶液をオートクレーブしないでください。
   2. 免疫組織化学研究用スライドの作製
      1. ミクロトームで厚さ5μmの切片を作成します。ティッシュ切片を帯電したスライドに塗布します。
      2. スライドを>75%キシレンで10分間インキュベートすることにより、パラフィンを除去します。スライドをキシレンの入った2つ目の容器にさらに10分間移動します。
      3. スライドを100% EtOHに10分間浸漬し、次に95% EtOHに5分間、70% EtOHに5分間浸漬してキシレンを除去します。
      4. スライドを脱イオンH₂Oで5分間すすぎます。
      5. スライドを抗原賦活化バッファーに90-95^°Cで25分間浸漬します。
      6. 攪拌しながら容器をRTまで1時間冷まします。
      7. スライドを浸漬バッファー(0.01 mol/L PBS + 0.4% Triton X-100)に4^°Cで30分間浸漬します。
      8. PAPペンでティッシュを囲みます。各スライドにPBSを追加し、乾燥を防ぐために加湿チャンバーに入れます。
      9. スライドをRTでPBSで洗浄し、5分間攪拌します。
      10. ブロッキングバッファー(0.01 mol/L PBS + 10% Donkey Serum + 0.1% TX-100)で1時間攪拌しながらブロックします。
      11. ブロッキングバッファーで希釈した一次抗体と4^°Cで一晩インキュベートします。
      12. 翌日、スライドをRTまで15分間温めます。
      13. スライドを0.01 mol/L PBS + 0.2% TritonX-100で5分間3回洗浄します。
      14. ブロッキングバッファーで希釈した二次抗体と室温で1時間インキュベートし、攪拌します。
      15. スライドを0.01 mol/L PBS + 0.2% TritonX-100で5分間3回洗浄します。
      16. スライドを0.01 mol/L PBSで5分間3回洗浄します。
      17. RIMSを1滴スポイトで置き、カバースリップを貼ります。
      18. カバーガラスの周りにマニキュアを塗ってシールを作成します。
      19. ネガティブコントロールとして、一次抗体を含まないサンプルを分析して、特異的な染色がないことを実証します。
   3. 免疫染色スライドのイメージング
      1. 10倍、20倍、40倍の対物レンズを備えたレーザー走査型共焦点顕微鏡でスライドを画像化します。
      2. 使用した二次抗体の発光スペクトルに適したレーザーラインを使用して、1024 x 1024の解像度で画像化します。
      3. 個々のチャンネルとマージされたチャンネルのZスタックの最大強度投影(MIP)画像を使用してフィギュアを作成します(図3)。

2. メソスケール試験

1. 立体解剖
   1. 房室結節、房室結節動脈、心臓神経叢(サブミリメートルからミリメートルのスケール)などの小さなまたは薄い構造に焦点を当てて、クランプ付き拡大デスクランプ、手術用望遠鏡、または実体顕微鏡を使用して繊細な解剖を行います。
2. マイクロCTスキャン
   注:CTイメージングは、圧力灌流および固定後、および解剖の任意の段階で、マイクロ陽電子放出断層撮影法(PET)/CTスキャナーを使用して行われます(図4)。
   1. サンプルイメージングの前に、CT X線源を25分間ウォームアップします。
   2. 心臓サンプルをスキャナーベッドに置きます。
   3. スキャナーベッドを水平位置544 mm、垂直位置14 mmに移動して、心臓をCT視野(FOV)の中央に配置します。
   4. 80 kVp、150 μA、1分間のスキャン時間中に720回の投影でCT画像を取得し、200 μmの空間分解能で取得します。
   5. 12 cm x 12 cm x 10 cm の視野と 600 x 600 x 500 ボクセルの行列で CT データを再構築し、DICOM ファイルとして保存します。

3. マクロスケールの検討

1. 圧力灌流と固定
   注:著者らは、前述の圧力灌流および固定技術を変更し、移植^14,19,20,21のために拒否された非機能的な人間の心臓に適用します。
   1. 灌流固定には高流量ポンプを使用してください。固定剤には、100%エタノール¹⁴、4%PFA、または10%ホルマリンのいずれかを使用してください。
      注:心臓は、上行大動脈、肺幹、大静脈、および肺静脈の両方を可能な限り遠位に切除し、ウィスコンシン大学のソリューション²³で送達することで回復します。
   2. 右心と左心の灌流には、2つの20-24 Fr外科用カニューレを使用します。右心灌流の場合は、上大静脈をカニューレに挿入し、3方向ストップコックに取り付けられたルアーロックチップ付きのハーフカット12〜30mLサイズのプラスチックシリンジを使用して、肺幹または肺動脈に通気口を配置します。
   3. 適切なサイズのロックされたハーフカットプラスチックシリンジまたは1.5〜5.0mLの遠心分離チューブを入れた後、下大静脈と他の肺動脈を麻ひもで閉塞します。
      1. 左心臓の順行性灌流のためには、肺静脈の1つをカニューレ挿入し、大動脈の遠位端にベントを配置します ハーフカットされた12-30mLサイズのプラスチックシリンジとルアーロックチップを三方ストップコックに取り付けます。.
      2. 左心臓の逆行性灌流の場合は、大動脈弓の枝の1つをカニューレに挿入し、大動脈弓の別の枝に通気口を配置します。カニューレの先端を両心室に配置します。
   4. 適切なサイズのロックされたハーフカットプラスチックシリンジまたは1.5-5.0mLの微量遠心チューブを挿入した後、他の容器の開口部を麻ひもで閉めます。.シリンジ/チューブ/カニューレの挿入部分を薄いガーゼで覆い、漏れや滑りを防ぎます。大きな漏れは、縫合糸、バンディング、または凝集を使用して修正します。小さな漏れは許容されます。
   5. プラスチック容器に心臓を吊るします。
   6. 22-24 Fr軟質プラスチックチューブを各カニューレに接続し、チューブのもう一方の端を固定剤で満たされた容器に挿入します。
   7. 右心室で約100〜300 mL / min、左心で約200〜400 mL / minに設定された高流量ポンプを使用して、右心室と左心室の回路に固定液を循環させ、右心室で約20 mmHg、左心室で約80 mmHgを達成します。
   8. 灌流を4°Cで24時間維持します。
   9. 心臓を0.01 mol/L PBSで30分間、4回攪拌しながら洗浄します。
   10. 心臓を0.01 mol/L PBS/0.02%アジ化ナトリウムに4°Cで保存します。
       注:圧力灌流固定は、新鮮な心臓にのみ有効であり、防腐処理された死体から回収された心臓には効果がありません。
2. 肉眼的解剖
   1. 解剖の各段階で写真記録を使用して漸進的な解剖を行います。
   2. 臨床的関連性を維持するために、心臓の生理学的形態を維持するために、構造を歪めたり変形させたりしないように特別な注意を払ってください。.
   3. 右前方斜め方向など、臨床的に関連性のある向きを使用してターゲット構造を画像化します。
3. 写真術
   1. 圧力が灌流され固定された心臓を、複数のプロングが取り付けられたプラットフォームと360^度回転する機能を備えた三脚に置きます。
   2. デジタル一眼レフカメラ(図5)²⁴ で心臓を撮影し、Cスタンドにセットされた複数の発光ダイオードライトパネルと幅広の黒い羽毛布団の背景布を使用します。
   3. 被写体の歪みを最小限に抑えるために、焦点距離が200〜4フィートの長いレンズ(6 mm)で撮影します¹⁴。
4. アナグリフ
   1. アナグリフ画像を表示するには、水平面上の回転角度に 10° の差がある CT データセットから、一対の写真またはボリュームレンダリング画像を再構築します。
   2. ステレオグラムと呼ばれるこれらの2次元(2D)画像のセットを、フリーウェア¹⁶を使用してアナグリフに変換する。
   3. アナグリフを表示するには、赤またはシアンのメガネを使用します。
5. 写真測量
   注:フォトグラメトリは、さまざまな角度で撮影された複数の2次元写真から3次元の表面レンダリング再構成を生成する応用科学です¹⁷。
   1. サンプルをCスタンドに吊り下げたり、回転テーブルに置いたりして、スマートフォンで数百枚の多方向写真を撮影します。
   2. 市販のソフトウェアを使用してFBX形式の3Dモデルを生成します。
6. CTスキャン
   注:CTスキャンは、圧力灌流および固定後、および解剖のどの段階でも実行できます。
   1. 容器の上部に配置されたバーから心臓サンプルを吊り下げます。スキャン中に心臓が揺れるのを防ぐために、容器の底に固定されたプラスチック製のプロングで心臓の基部を支えます。したがって、空気は負のコントラストとして機能します。
   2. CTスキャンは、120kVの管電圧、800-900mAの管電流、280msのガントリー回転のパラメータで、市販のマルチ検出器列CTスキャナーを使用して実行します。用量長の製品は一般に500〜1200 mGy.cm です。
   3. 次のパラメータを使用して軸方向画像データを再構築します:断面の厚さ、0.6 mm;増分間隔、0.3 mm;視野は、できるだけ小さく(通常は100〜200 mm)。マトリックス、512×512。
7. 仮想解剖
   1. 市販のソフトウェアを使用してCTスキャン画像を解析し、仮想解剖画像を生成します。
      注:仮想解剖は、焦点が心室および血管¹⁸の壁に移されるボリュームレンダリングプロセスの修正である。このプロセスでは、手動しきい値処理により、元のデータセットから強化されたチャンバーが仮想的に削除されます。
   2. 非強化壁、セプタム、バルブを仮想解剖で視覚化し、肉眼的解剖と同様の画像を生成します。心臓標本の肉眼的解剖とは異なり、仮想解剖中の切断面は実質的に無制限です。必要に応じて、ほとんどすべてのビューを再作成して、関心のある構造を視覚化できます。
8. 3Dプリンティング
   1. 心臓サンプルの互換性のあるファイルを開きます file 3Dプリンターソフトウェアで。
   2. 0.10Dプリンターのプリント設定に 3mmのFast DETAIL のプロファイルを使用し、プリント速度を20mm / sに下げます。 [サポート資料の生成] を有効にします。
   3. TPUフィラメントのプロファイルを3Dプリンターの「フィラメント設定」に使用します。
   4. Original Prusa MK4 Input Shaper 0.4ノズルのプロファイルをプリンターの「Printer Settings」に使用します。
   5. スライスが完了したら、BGCODEファイルをUSBフラッシュドライブに保存して3Dプリントします。
   6. 1.75 mm TPUフィラメントを使用して、人間の心臓サンプルを3Dプリントします。3Dプリントの前に、フィラメントドライヤーを使用してTPUフィラメントを6時間乾燥させます。
   7. 3Dプリント中のフィラメント張力を減らすには、フィラメントスプールをベアリングが組み込まれたスプールホルダーに置き、フィラメントスプールの回転を容易にします。市販の3Dプリンターを用いて、テクスチャー加工された粉体塗装鋼板で3Dプリントを行います。
   8. 3Dプリントが完了したら、サポート材料を慎重に取り除きます。

マイクロスケールの検査
ティッシュクリアを適用することで、共焦点顕微鏡を使用して大量の組織を3Dでイメージングできます。心臓では、心神経節を含む神経節と心筋神経支配の神経パターンを可視化することができます(図2)。 図3 は、神経細胞と平滑筋細胞の免疫染色されたヒト左心室心筋の共焦点画像を示しています。血管は心筋を横切ることが注目され、血管に関連して、または血管とは無関係に、多数の神経線維が同定されます。

メソスケールおよびマクロスケールの検査
24時間の圧力灌流および固定に無水エタノールを使用すると、サンプルの自然な色が漂白され、組織が脱水され²⁵、弾力性が大幅に低下します。一方、PFAとホルマリンを固定すると、自然な色と弾力性が格段に保たれます。これらの理由から、PFAまたはホルマリンが主に好ましい固定剤として使用されます。

図6 は、肉眼的解剖、仮想解剖、STLポリゴンモデル、および3次元印刷の代表的な画像を示しています。 図7 は、グロス解剖画像と仮想解剖画像の両方から作成されたアナグリフの代表的な画像を示しています。奥行き知覚は、アナグリフメガネで得ることができます。キャプチャされた単一の写真測量モデルは、市販のソフトウェアを使用してほぼすべての方向から観察でき、日常的な経カテーテル心臓処置に関連する複雑な解剖学的特徴を示しています。これらの技術を圧力灌流と固定で調製した心臓に適用することにより、心臓に関する3次元情報をデジタルまたは物理的にほぼ永久に保持し、境界なく共有することができます。 図8 は、移植が拒否された解剖された心臓から複製された50%スケールの3Dプリントを示しています。

図 1: プロトコルのフロー チャート。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:人権心房の組織除去された部分 (A)組織除去のために解剖された右心房神経節(RAGP)を持つヒト右心房の右後斜め図。(B)組織透明化前後のRAGP標本。(C)汎ニューロンマーカータンパク質遺伝子産物9.5(PGP9.5)で免疫染色された神経節(矢じり)を示すヒトRAGPのiDISCO+クリア部分の最大強度投影。スケールバーは、1cm(A)、5mm(B)、500μm(C)です。この図は、Hanna et ^al.11 から引用されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:ヒト左心室の免疫染色スライド。 汎ニューロンマーカータンパク質遺伝子産物9.5(PGP9.5)および平滑筋細胞マーカー α-平滑筋アクチン(αSMA)で免疫染色したヒト左心室心筋スライスからの共焦点画像。筋肉の自家蛍光は、488 nmレーザーライン(緑)を使用して見ることができます。スケールバーは50μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:心臓サンプルのマイクロコンピュータ断層撮影イメージング (A)心臓サンプルイメージング用のマイクロコンピュータ断層撮影セットアップ。(B)マイクロコンピュータ断層撮影イメージングのためのユーザーインターフェース。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:UCLA心不整脈センターの写真スタジオの設定。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 6: 大動脈弁および僧帽弁複合体の肉眼的解剖 (左上)、仮想解剖 (右上)、STL ポリゴン モデル (左下)、3 次元印刷 (右下) の画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:大動脈弁膜と僧帽弁複合体の肉眼的解剖(左)と仮想解剖(右)のアナグリフ。 アナグリフメガネ(赤/シアン)は、奥行き知覚を得るために必要です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図8:心臓サンプルの3次元プリント (A)TPUフィラメントを使用した心臓サンプル3Dプリント用の3次元(3D)プリンターのセットアップ。(B)本研究で説明した方法を用いて作製した代表的な心臓3Dプリント。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

本研究は、人間の心臓全体から得られたサンプルを分析するための包括的なパイプラインを示しています。代表的な結果は、単一の心臓に対して日常的に実施されたミクロスケールからマクロスケールの解剖学的検査を示しています。ヒトの心臓試料は非常に貴重であるため、科学研究における発見、臨床手技の改善、全身の解剖学的相関性を保ちながらの解剖学教育など、様々な目的に対して複数のプロトコールを適用し、試料の一部を無駄にしないマルチスケールアプローチが理想的かつ効果的です。

マイクロスケールの検査に関しては、免疫染色と顕微鏡法を適用して、ヒト心臓標本の細胞構造を理解することができます。ここでは、細胞スケールでの心臓神経解剖学を研究するための組織透明化と免疫組織化学の応用が実証されています。これらの技術の使用は、心臓伝導系や心室などの関心のある構造に関連する心臓神経系および心筋神経支配パターンの特性評価に役立ちます。優れた空間分解能が達成されますが、共焦点顕微鏡の使用、特に組織透明化された標本の使用には時間がかかります。ライトシート顕微鏡は、空間分解能を犠牲にして画像取得の時間を短縮するために使用できます。

メソスケールからマクロスケールの検査に関しては、著者の施設におけるマイクロCTスキャナーの空間分解能は10〜200μmの範囲です。サンプルサイズは、10 μmスキャンでは20 mm、100〜200 μmスキャンでは120 mmに制限されています。著者の施設にあるマイクロCTスキャナーは、心臓全体を収容することはできません。したがって、著者らの施設では、全心臓スキャンには600μmの空間分解能の臨床用CTスキャナーを使用する必要がありますが、進歩により心臓全体を画像化できるマイクロCTスキャナーの開発が可能になりました²。フォトンカウンティングCTなどの技術開発は、さらなる可能性を広げてくれることでしょう。STLファイルの空間解像度の向上は、3Dプリントの品質をさらに向上させるための最初のステップであるべきです。3Dプリンティングのコストが高いため、この技術の適用は日常的な臨床診療に限定されています。スマートフォンアプリケーションから生成された写真測量画像は、開発が容易で許容できる品質ですが、解像度を向上させるには、さらに高度ですが、高価で時間のかかるシステムが必要になります²⁶。3Dで視覚化するためには、専用のヘッドギア^27、28 およびホログラフィックモニタ²⁹ を備えた拡張現実は、追加のツールであるが、コストが高いことによっても制限される。

要約すると、ミクロスケールとマクロスケールにわたる包括的な構造解析を通じて、各構造のミクロスケールの解剖学的構造とその機能的寄与を心臓全体の文脈で理解することができます。高解像度イメージングの発展に伴い、ミクロスケールとマクロスケールの解剖学的構造の間の距離は劇的に拡大しています。心筋細胞の電子顕微鏡分析の専門家は、僧帽弁の数に精通していないかもしれませんし、 その逆も同様です。心臓の形態を包括的に理解するために、科学者は森林全体の鳥瞰図を維持しながら、各樹木の詳細をさらに探求し続ける必要があります。

何一つ。

教育と研究の進歩のために体を寄付してくださった方々に感謝いたします。研究のためのドナーハートを得るための基盤を形成したOneLegacy財団に感謝します。また、CTデータ取得において、UCLAトランスレーショナルリサーチイメージングセンター(放射線科)のAnthony A. Smithson氏とArvin Roque-Verdeflor氏にも感謝しています。このプロジェクトは、UCLA Amara Yad Projectの支援を受けました。Kalyanam Shivkumar博士とOlujimi A. Ajijola博士には、研究のための人間の心臓パイプラインを確立し、維持してくれたことに感謝しています。私たちは、リサーチ・オペレーション・マネージャーのアミクシャ・S・ガンジーが私たちのプロジェクトを支援するために献身的に取り組んでくれたことに感謝しています。この作業は、NIHの助成金OT2OD023848 & P01 HL164311とLeducqの助成金23CVD04からKalyanam Shivkumarへの支援、American Heart Association Career Development Award 23CDA1039446からPHへの支援、およびUCLAのAmara-Yadプロジェクト(https://www.uclahealth.org/medical-services/heart/arrhythmia/about-us/amara-yad-project)の支援によって可能になりました。本研究で使用したGNEXT microPET/CTスキャナーは、NIH Shared Instrumentation for Animal Research Grant(1 S10 OD026917-01A1)の資金提供を受けました。