動的界面の共焦点顕微鏡可視化のためのマイクロテンシオメータ

本稿では、界面形態を可視化しながら界面張力と表面拡張レオロジーを同時に測定するためのマイクロテンシオメータ/共焦点顕微鏡の設計と操作について述べる。これにより、技術や生理学において重要な界面の構造と特性の関係をリアルタイムに構築することができます。

界面活性分子の流体-流体界面への吸着は、本質的に遍在している。これらの界面を特徴付けるには、界面活性剤吸着速度を測定し、バルク界面活性剤濃度の関数として平衡表面張力を評価し、平衡化後の界面領域の変化と表面張力がどのように変化するかを関連付ける必要があります。高速共焦点顕微鏡による蛍光イメージングによる界面の同時可視化により、構造機能関係を直接評価することができます。キャピラリー圧力マイクロテンシオメータ(CPM)では、半球状の気泡がキャピラリーの端部に固定され、1mL容の液体リザーバに固定される。気泡界面を横切る毛細管圧力は、ラプラス方程式に基づくモデルベースの圧力、気泡曲率、または気泡面積制御を可能にする市販のマイクロ流体フローコントローラ を介して 制御される。Langmuirトラフやペンダントドロップなどの以前の技術と比較して、測定と制御の精度と応答時間が大幅に向上しています。毛細管圧力の変化は、ミリ秒単位で適用および制御できます。気泡界面の動的応答は、気泡が膨張および収縮するにつれて、第2の光学レンズ を介して 視覚化される。気泡の輪郭は円形プロファイルにフィットし、気泡の曲率半径 R と、結果を無効にする円形度からの偏差を決定します。ラプラス方程式は、界面の動的表面張力を決定するために使用されます。平衡化に続いて、コンピュータ制御のマイクロ流体ポンプによって小さな圧力振動を課して気泡半径(0.001〜100サイクル/分の周波数)を振動させて拡張弾性率を決定することができ、システムの全体的な寸法は、マイクロテンシオメータが高速共焦点顕微鏡のレンズの下に収まるほど十分に小さく、蛍光タグ付き化学種をサブミクロンの横方向分解能で定量的に追跡することができる。

界面活性剤膜で覆われた空気と水の界面は、日常生活の中で遍在しています。界面活性剤 - 水注入は、枯渇した油田からの油回収を強化するために使用され、シェールガスおよび油の水圧破砕ソリューションとして使用されます。気液フォームおよび液液エマルジョンは、潤滑剤および洗浄剤として多くの工業的および科学的プロセスに共通しており、食品において一般的である。界面における界面活性剤およびタンパク質は、包装、保存、および投与中に抗体立体配座を安定化させ¹、²、³、⁴、⁵、眼における涙液膜安定性⁶、⁷、⁸、および肺力学⁹、^10、11、¹²、^13、14、15。

界面に吸着する界面活性剤または界面活性剤およびその特性の研究は、多くの異なる実験技術16、17、18、19、20、²¹、22、²³、^24、25、^26、27.最近の開発は毛細血管圧力マイクロテンシオメータ(CPM)であり、これは他の一般的な方法よりも大幅に少ない材料を使用しながら、はるかに小さな長さスケールで高度に湾曲した界面上の界面特性の検査を可能にする9,23,24,25。共焦点蛍光顕微鏡(CFM)は、CPM 22またはラングミュアトラフ²⁰、26、²⁷、^28、29の空気 - 水界面における脂質およびタンパク質の形態を研究するために使用することができる。ここでは、CPMとCFMを組み合わせて、形態学的現象を動的および平衡界面特性に結びつけ、生物学的および技術的インターフェースの構造機能関係を発展させています。

CPM-CFMがアクセス可能な界面界面活性剤系には、多数の重要なパラメータがあります。CPMでは、直径30〜200μmの気泡がガラスキャピラリーチューブの先端に固定されています。CPMの以前のバージョンでは、気泡の内側と外側の間の毛細管圧力差は、水柱および振動シリンジポンプを介して制御された^9,30;ここで説明する新しいバージョンは、これらを高精度のコンピュータ制御マイクロ流体ポンプに置き換えます。表面張力(γ)は、ポンプによって設定された界面を横切る圧力損失ΔP、および気泡の曲率半径Rの光学分析から、ラプラス方程式ΔP = 2γ/Rを介して決定されます。界面の動的表面張力は、可溶性界面活性剤を含むバルク液体と接触する新しい気泡の発生に続く10msの時間分解能で決定することができる。界面活性剤吸着ダイナミクスは、拡散度、表面被覆率、およびバルク濃度と平衡表面張力の関係を含む界面活性剤の本質的な特性を決定するために、古典的なワードトルダイ式^10、31によって記述することができる。平衡表面張力が達成されると、界面面積を振動させて拡張弾性率を測定することができ、、気泡表面積の小さな変化によって誘発される表面張力の変化を記録することによって、^A32。絡み合ったポリマーまたはタンパク質などの独自の内部構造を発達させるより複雑な界面の場合、表面張力は、、より一般的な表面応力⁴、^33、によって置き換えられる。

呼吸中の肺安定性は、肺胞空気液界面^9、10における低い表面張力および高い拡張弾性率の両方を維持することに直接結びついていてもよい。すべての内部肺表面は、組織水和34を維持するために、上皮ライニング液の連続したミクロン厚の膜で裏打ちされている³⁴。この上皮内層液は主に水であり、塩および様々な他のタンパク質、酵素、糖、および肺界面活性剤を含む。湾曲した液体 - 蒸気界面の場合と同様に、毛細管圧力は、肺胞(または気泡)の内側の圧力が高いほど誘導される。しかし、表面張力が肺内のあらゆる場所で一定であった場合、ラプラス方程式ΔP = 2γ/Rは、小さな肺胞は大きな肺胞と比較してより高い内圧を有し、小さな肺胞のガス含有量はより大きく、より低い圧力の肺胞に流れることを余儀なくされることを示している。これは「ラプラス不安定性」^9,35として知られています。最終的な結果は、最小の肺胞が崩壊して液体で満たされ、再膨張が困難になり、肺の一部が崩壊し、他の部分が過剰に膨張し、どちらも急性呼吸窮迫症候群(ARDS)の典型的な症状である。しかし、適切に機能している肺では、呼吸中に肺胞界面領域の空気 - 上皮液界面が伸縮するにつれて、表面張力が動的に変化する。ラプラス圧力が半径の減少とともに減少し、半径の増加とともに増加してラプラスの不安定性を排除すると、肺⁹が安定化する。したがって、、それが周波数、単層形態および組成、ならびに肺胞液組成にどのように依存するかは、肺安定性に不可欠であり得る。CPM-CFMはまた、界面活性剤吸着25、単層形態^{22および拡張}弾性率⁹に対する界面曲率の影響の最初の実証を提供した。CPM内のリザーバの小容量(〜1mL)は、液相の迅速な導入、除去、または交換を可能にし、高価なタンパク質または界面活性剤¹⁰の必要量を最小限に抑える。

CPM−CFM画像におけるコントラストは、界面^16、27における蛍光的にタグ付けされた脂質またはタンパク質の小さな画分の分布によるものである。二次元界面活性剤単層は、しばしば表面張力または表面圧力の関数として横方向の相分離を示すπ、 γは、清浄な流体−流体界面の表面張力(γ₀)と界面活性剤被覆界面との差π、純粋な流体表面張力を低下させるように作用する界面における界面活性剤分子の相互作用によって引き起こされる2−D「圧力」と考えることができる。低い表面圧力では、脂質単層は液体のような無秩序な状態にある。これは液体膨張(LE)相として知られています。面圧が上昇し、脂質分子当たりの面積が減少するにつれて、脂質は互いに配向し、長距離秩序液体凝縮(LC)相への一次相転移を受けることができる¹⁶、^20、27。LE相およびLC相は、様々な表面圧力で共存することができ、蛍光的にタグ付けされた脂質がLC相から除外され、LE相に分離されるので視覚化することができる。したがって、CFM¹⁶で撮像すると、LE位相は明るく、LC位相は暗い。

この原稿の目的は、複合共焦点顕微鏡マイクロテンシオメータを構築して操作するために必要なステップを記述することです。これにより、読者は吸着研究を行い、表面張力、レオロジー挙動を測定し、ミクロンスケールの空気/水または油/水の界面で界面形態を同時に調べることができます。これには、必要な毛細血管を引っ張り、切断し、疎水化する方法、圧力、曲率、および表面積制御モードを使用するための指示、およびマイクロテンシオメータ湾曲界面への不溶性界面活性剤の界面移動に関する議論が含まれる。

1. キャピラリーチューブの作製

1. キャピラリーをキャピラリープーラーに入れ、目的の引っ張りプログラムを実行して、先端に外径(OD)が〜1μmのテーパーキャピラリーを2つ作ります。
   注: 引っ張る前のキャピラリーの OD は、マイクロテンシオメーターセルのキャピラリーホルダーに収まるように指定された OD である必要があります。キャピラリーの内径(ID)はさまざまですが、引っ張った後のキャピラリーの臨界半径に影響します。結果として生じるテーパが最初にキャピラリーODおよびIDを迅速に減少させ、次に所望のキャピラリーODおよびIDの近くの半径に達し、次いでよりゆっくりと直径を減少させるように、引っ張りプログラムが選択される。これにより、より大きなキャピラリー長が作成され、IDで30〜100μmの使用可能なキャピラリーが得られるようにスコアリングできます。
2. 毛細血管の先端を所望のスポットにスコア付けして、30〜100μmのIDを取得し、先端を切断する。これで、毛細血管の先端に所望の半径のODとIDが与えられます(図1A)。毛細血管はステップ2まで保存することができる。
   メモ:キャピラリーの切断エッジは、90°のクリーンブレイクでなければなりません。切断エッジに欠陥があると、キャピラリーへの気泡のピン留め不良や表面特性測定不良につながります。テーパー毛細血管の先端は非常に繊細です。溶液以外のもの(バイアル壁、エアノズルなど)と接触すると破壊されます。

2. 毛細血管の疎水化

1. 引っ張ったガラスキャピラリー、酸洗浄液、プラスチックピンセット、脱イオン(DI)水、疎水化溶液(エタノール中の2%シラン)、真空ポンプ、エタノール溶液を集めます。詳細については 、材料表 を参照してください。
   警告: 酸洗浄液は毒性があり、皮膚や目の腐食/刺激を引き起こし、酸化します。疎水化溶液は、皮膚/眼/呼吸器刺激物です。目の保護具、白衣、手袋を着用し、ヒュームフードで溶液で作業してください。
2. キャピラリーを酸洗浄
   注:キャピラリーを酸洗浄すると、キャピラリー内の有機残留物が除去され、キャピラリーを疎水性にするシラン化反応のためにガラス表面が準備されます。
   1. ピンセットで毛細血管の広い端付近をしっかりとつかみます。
   2. テーパ状の先端を酸洗浄液に浸し、真空ポンプからホースをキャピラリーの広い端に取り付けます。これは溶液を毛細血管に吸い込みます。
      メモ: キャピラリーホースの端にピペットチップを取り付けて、キャピラリー端部とのフィット感を高めることができます。
   3. 酸洗浄液がキャピラリーの約半分を満たしたら停止します。
      注:酸洗浄液からキャピラリー先端を除去した後、キャピラリーの外側にある溶液は、しばしばキャピラリー先端の近くにビーズを形成する。キャピラリーを溶液バイアルの首にそっと触れて、余分な溶液を除去します。
   4. 酸洗浄液をキャピラリー内に少なくとも30分間留まらせ、液体のプラグがキャピラリーのテーパ端に残っていることを確認する。
   5. ピンセットでキャピラリをしっかりと保持し、真空ホースを使用してキャピラリの大きな端から液体を引き出すことによって、キャピラリから酸洗浄液を取り外します。
3. 毛細血管をすすいでください
   1. キャピラリーのテーパ状端部をDI水に沈め、酸洗浄液に浸した外部を覆うのに十分な深さまで浸すようにします。先端が水没している間に、真空ホースを使用してDI水をキャピラリーに引っ張ります。水から毛細血管を取り外し、真空ホースで残りの水を取り除きます。
   2. 上記の手順を少なくとも4倍繰り返します。
4. 工程2.3をDI水にエタノールを代入して再度実行する。
5. エタノールがキャピラリーの内部から完全に蒸発するまで、吸引を連続的に適用します。エタノールが蒸発し始めると、毛細血管は曇り、触れると涼しくなりますが、30〜45秒後には透明になります。
6. キャピラリーを疎水化処理液でコーティングする
   1. キャピラリーの広い端部をエタノール溶液中の〜2%シランに短時間浸漬する。毛細管現象は、コーティング溶液を毛細血管内で上昇させる。キャピラリー内に〜1cmサイズのプラグが浮かび上がったら、溶液からキャピラリーを取り外します。
   2. テーパ状の先端が下を向くようにキャピラリーを向け、コーティング溶液がテーパ状の先端に向かって重力で落下するようにします。
   3. コーティング溶液をキャピラリー内に少なくとも3分間留まらせる。
      メモ:テーパチップの内部に接触しているコーティング溶液のプラグに気泡があってはなりません。気泡がある場合、キャピラリー内部はステップ2.5で十分に乾燥していない可能性があります。これを解決するには、必要に応じて手順 2.4 ~ 2.6 を繰り返します。
7. 工程2.3と同様にして毛細血管をエタノール1xですすいでください。
8. 疎水性コーティングをキャピラリーにセットする
   1. 清潔で乾燥したシンチレーションバイアルを120°Cに設定した真空オーブンに入れます。 コーティングされた毛細血管をバイアル(理想的にはバイアルあたり1つの毛細血管)に配置し、広い端をバイアルの基部に置きます。キャピラリーを少なくとも6時間(一晩が好ましい)オーブン内に留まらせて、疎水性シラン層とキャピラリーとの永久的な結合を達成する。毛細血管はステップ4まで保存することができる。

3. サンプルの準備と保管

1. 界面活性剤と蛍光色素分子溶液を混合し、清潔な酸洗浄バイアルに保管して、汚染を回避します。
   注:市販の脂質は、最高純度のものでなければならず、使用中は〜20°Cで保存する必要があります。 古いまたは汚染された脂質は、しばしば結果を再現するのが困難になります。

4. マイクロテンシオメータの設定

1. 図2の説明に従ってCPMセルを組み立てます。
   1. キャピラリーの大きな側面をCPMセルの上部に、セルの下側に押し込むまで置きます。
   2. PEEKプラグを静かに締めてキャピラリーを固定し、マイクロ流体ポンプからチューブをキャピラリーの大きな側面に取り付けます。先細りの毛細血管先端に触れないように注意してください。
2. 必要に応じて、リザーバ交換ホースおよび/または温度制御ホースをCPMセルのそれぞれの入口と出口に取り付けます(図2)。それ以外の場合は、未使用の入口とコンセントを差し込みます。
3. CPMセルを共焦点顕微鏡ステージに取り付け、CFM対物レンズ、CPMカメラ、CPM光源に大まかに合わせます(図3)。
4. マイクロ流体ポンプへのガス流をポンプの推奨動作圧力(ここで使用するマイクロ流体ポンプの場合は150mbar)で開き、キャピラリーへの流れが開いていることを確認します。
5. CPM仮想インタフェース(補足符号化ファイル1:マイクロテンシオメータ仮想 Interface.vi)を、キャピラリー圧力振動周波数と振幅をゼロに設定して圧力制御モードで実行を開始します(図4-7)。図 4 に、仮想インターフェースのスクリーンショットを示します。DI水および約35μmのキャピラリー半径の場合、〜20mbarの圧力は、水がキャピラリーに入らないようにします。
6. ピペットを使用してCPMセルを水で満たします。
7. マイクロテンシオメーターカメラを使用して毛細血管先端に焦点を合わせます。
8. CFMで毛細血管先端に焦点を合わせます。キャピラリーを見つけるのが難しい場合は、CPMカメラを使用してCFM対物レンズを見つけます。これは、CFM目標とバブルの間の距離を近似し、正しい作動距離を達成するのに役立ちます。
9. 環状(グリーンセクター投影)がバブルの中心になったら、バブルエッジがはっきりと見えるように手動でフォーカスを調整します(図4-3)。
   メモ: 環状の位置、開始角度と終了角度、内側と外側の半径は、ビュー ウィンドウの下のメニューから 調整できます。
10. [バブルのリセット]をクリックし、新しいバブルが形成されていることを確認します(古いバブルポップが聞こえ、新しいバブルがコントロールパネルの表示ウィンドウから観察可能になります)。図 4-3)。バブルがはじけない場合は、表示ウィンドウの下にある「バブルリセット」タブの「リセット圧力」を上げるか、「リセット遅延時間」を増やします。表面張力が約73 mN/m(生理食塩水または水/気泡の場合)であるかどうかを確認します(図4-9)。
11. 細胞直噴シリンジ(図 3-13)から水を取り出し、空にしてから取り付け直します。サンプルを読み込んで実験を実行する準備ができました。

5. 吸着試験

1. CPMソフトウェアを 圧力制御 モードに保ちながらオートクレーブ処理されたピペットを使用して、セルに目的のサンプルを充填します。新しいバブル界面を作成するときの初期表面張力が約73 mN/mであることを確認してください。
2. 新しく形成されたバブルの半径を決定し、その値を中心線エリアコントロール(図 4-7)に入力し、[エリアコントロール]タブ(図4-8)をクリックしてコントロールタイプをエリアコントロールに変更します。
   メモ: 一定の圧力制御を使用することもできますが、これにより、界面の表面張力が変化するにつれて気泡半径が連続的に変化します。この変化領域は、界面活性剤吸着率の分析を複雑にし、研究中に気泡をはじきさせる可能性がある。
3. 共焦点ビデオの録画を開始します。
4. [バブルのリセット](図 4-5)をクリックし、すぐに[データの収集](図 4-6)をクリックします。ボタンのシグナリングライトが緑色に変わります。
5. 図4-6に示すバーをスライドさせて試料の濃度に応じてデータ記録速度を調整します。吸着が遅い場合は、記録速度を遅くします。これは、早い段階で高い記録レートが必要な場合は、実行の途中で調整できますが、ファイルサイズを小さくするために、長いスタディでは遅いレートが望ましいです。
6. 実験終了後(最終的な表面張力プラトーに達したとき)、正しいファイルパスを選択し(図4-1)、保存ボタン(図4-2)をクリックしてファイルを保存します。
7. 記録を停止してCFMにも保存します。

6. 振動・リラクゼーション研究

1. CPMソフトウェアを 圧力制御 モードに保ちながらオートクレーブ処理されたピペットを使用して、セルにサンプルを充填します。新しいバブル界面を作成するときは、表面張力が約73 mN/mであることを確認してください。
2. サンプルが界面に完全に吸着するまで待ちます。これは、新しいバブル界面で最初からやり直すのではなく、吸着研究の直後に実行できます。
3. 振動が圧力振動、面積振動、曲率振動のいずれになるかは、適切なタブ(図4-8)を選択し、目的のベースライン値、振動%、発振周波数(図4-7)を入力して決定します。
   メモ: 鋸歯状、矩形波、および三角波の領域振動は、[ その他の領域の振動] タブのドロップダウンメニューからもアクセスできます。
4. 共焦点ビデオの録画を開始し、CPMソフトウェアの [データの収集](図4-6)をクリックします。
5. 振動を開始します。最良の結果を得るためには、少なくとも7つのサイクルを記録してください。データ集録レート(図4-6)を選択して、各発振サイクルに適切な数のデータポイントを提供します。
6. 他の発振振幅または周波数が必要な場合は、実験中に値を変更します。
7. 手順 5.6 および 5.7 のように結果を保存します。

7. 溶剤交換研究

1. CPMソフトウェアを圧力制御モードに保ちながら、オートクレーブ処理されたピペットを使用してセルにサンプルを充填します。新しいバブル界面を作成するときに、表面張力が約 73 mN/m であることを確認してください。
   注:吸着および/または振動研究は、溶媒交換研究の前に実施することができる。
2. 導入チューブを目的の交換溶液のボトル(図 3-11)とともに蠕動ポンプ(図 3-10)に接続します。
3. 共焦点ソフトウェアでビデオの録画を開始し、CPM ソフトウェアの「データの収集」(図 4-6)をクリックします。
4. ペリスタルティックポンプの速度を設定します。これは流体交換の速度を制御し、実験の要件、すなわち溶媒を交換する必要がある速度に基づいて選択する必要があります。
5. 複数の流体を交換する必要がある場合は、ペリスタルティックポンプを停止し、入口を別の交換溶液に接続します。
6. 交換が終了したら (約 20 分)、手順 5.6 および 5.7 のように結果を保存します。

8. 不溶性界面活性剤吸着

注:吸着される界面活性剤がリザーバ液体に可溶でない場合、この方法を使用して、セルの空気/水界面から気泡表面に単層を移動させることができる。多くの二重層形成脂質は、生理食塩水にほとんど不溶性であり、リザーバ溶液に懸濁したときに自発的に気泡に吸収しない。

1. CPMソフトウェアを 圧力制御 モードに保ちながらオートクレーブ処理されたピペットを使用して、セルにサンプルを充填します。新しいバブル界面を作成するときに、表面張力が約 73 mN/m であることを確認してください。
2. 揮発性有機溶液中の溶液から細胞の空気水界面に不溶性界面活性剤の単層を堆積させる。シリンジを使用して、界面に小さな液滴を堆積させ、溶媒が蒸発して脂質を薄膜として残すことを可能にする。
   注意:クロロホルムは、ホスファチジルコリンや脂肪酸などのリン脂質の溶媒として使用されます。拡散溶液は、通常、溶媒のmLあたり0.01〜0.02mgの脂質である。クロロホルムは急性毒性があり、皮膚や眼の刺激を引き起こす可能性があり、発がん性があります。適切な目の保護具、白衣、手袋を着用し、ヒュームフードで溶液を作ります。
3. 気泡の中心線圧力制御(図 4-7)を使用して、バブルがほぼ平坦になるまで表面積を小さくします。これにより、界面活性剤が吸着した後に気泡がはじけるのを防ぎます。
4. 空気/水界面がキャピラリーの先端を通過するまで、細胞への直接シリンジ を介して 細胞からリザーバ液体を除去します。シリンジポンプを使用することができるが、このステップは、シリンジを手動で使用することによって達成することができる。
5. リザーバの液体の高さを初期レベルまで上げます。
   注:先端を再水没した後、界面に吸着した界面活性剤のために気泡が大きくなります。単分子膜は、振動または溶媒交換実験の準備が整いました。

9. クリーンアップ

1. CFM をオフにします。
2. 圧力制御モードに変更します。
3. ピペットを用いて細胞から試料を除去する。セルにDI水をロードし、圧力を〜50mbarに上げて、泡が常にキャピラリーから逃げ出し、キャピラリー先端をきれいにします。このプロセスを 2 回繰り返します。
4. 安全弁を閉じ、左上隅にある赤いボタンをクリックしてCPMをオフにし、ライトと青の圧力コントロールパネルをオフにして、圧力源を閉じます。
5. 共焦点顕微鏡ステージから細胞を取り外します。エタノールとDI水で細胞を洗い流します。CPMセルからキャピラリーチューブを取り外します。

10. セルのクリーニング

1. セルを分解します。DI水ですすぎながら歯ブラシで内壁をブラッシングします。エタノールに部品を浸し、〜30分間超音波処理します。
2. DI水ですべての部品を数回すすいでください。部品を窒素ガスで吹き込むか、真空オーブン内で乾燥させて乾燥させます。

11. 振動解析

1. Dilatational_Rheology_Analysis.m コード(補足コーディングファイル 2)を実行し、CPM 仮想インタフェースから保存するファイルを選択します。サンプル データは補足ファイルに含まれています。
2. 圧力対時間プロットは、 補足図1に示すように表示されます。振動が始まる点を左クリックし、振動が終了する点をもう一度左クリックします。データに複数の振動が含まれている場合は、すべての振動に対してこのプロセスを繰り返します。
   1. すべての始点と終点が左クリックされたら、マウスを任意の場所で右クリックします。たとえば、 補足図 1 に示すように、ポイント 1、2、3、および 4 で左クリックし、その後に右クリックすることができます。
      注: このコードでは、拡張係数と位相角が計算され、その結果が元のファイルの場所にある新しい.csvファイルに書き込まれます。サンプル データの結果は、 補足コーディング ファイル 2 に記載されているコード結果で確認できます。MATLAB は、 補足図 2 に示すように、データのいくつかのグラフィカル表現も生成します。

測定誤差の主な原因は、切断プロセス(図5A、B)またはコーティングプロセス(図5D)のいずれかに欠陥がある毛細血管から生じます。どちらのタイプの欠陥も、光学画像解析システムによる気泡の形状およびサイズを決定する際にエラーをもたらし、不正確な表面張力値につながる。新しいキャピラリーを引っ張ってコーティングした後、CPMにキャピラリーを挿入する前に、光学顕微鏡下でコーティングした後、各新しいキャピラリーを慎重に検査することが重要です。ミスカットされたキャピラリーは廃棄する必要がありますが、コーティングが不十分なキャピラリーは酸洗浄して再コーティングして、キャピラリーの端部での気泡のピン留めを改善することができます(プロトコルのステップ2)。キャピラリーは、エンドカットがキャピラリーに対して完全に垂直であり(図5C)、バブルピンがキャピラリーの端部に直接ある場合(図5E)に最も効果的です。キャピラリー上の疎水性コーティングは、使用に伴うピン留めの効果が低下し、キャピラリーを再洗浄して再コーティングする必要があります。

界面活性剤吸着対時間に関する代表的なデータを図6に提示する。 界面活性剤吸着の測定に使用されたペンダントまたは固着滴などの以前の実験技術は、表面張力の変化が吸着中に気泡面積を変化させるので、毛細管圧力を動的に調整する機構を有さなかった³⁰、^36、37。実際、より大きな気泡および滴の場合、キャピラリー圧力が独立して測定されず、キャピラリー圧力が落下または気泡表面³⁷にわたって変化するので、界面形状の解析から表面張力を決定するために、気泡または液滴形状(したがって表面積)の変化が必要である。これはまた、界面活性剤が界面に吸着するにつれて表面張力が低下し、ラプラス方程式を満たすためには気泡の表面積を増加させなければならず、吸着するために追加の界面活性剤が平衡に達するために吸着する必要があるため、吸着の分析を複雑にする。CPMでは、固定されたキャピラリー圧力は、表面張力が過度に低下した場合にキャピラリーから気泡が噴出するのを防ぐために、界面活性剤吸着の前に初期気泡半径が小さい範囲内になければならないことを必要とする。界面活性剤吸着ダイナミクスは、多くの場合、一定の界面領域の清浄な界面への界面活性剤分子の吸着を記述する古典的なワード・トルダイ式³¹によってモデル化される。Ward-Tordai方程式は、変化する表面積を考慮して修正することができますが、これは追加のパラメータを導入し、分析^38,39を非常に複雑にします。

これらの問題を克服するために、毛細管圧力を動的に調整することによって、吸着プロセス全体を通して気泡の曲率(および表面積)を一定に保持するラプラス方程式を使用して、モデルベースのフィードバックループが開発されました。気泡の面積が絶えず増加していないため、表面張力の変化率に大きな違いがある。吸着中の気泡面積の変化は、表面張力が最初にゆっくりと変化し、その後平衡化の前に急速に加速するため、時間とともに一定ではありません。もう1つの問題は、面積の部分的な変化が初期気泡半径に依存することです。一定の気泡半径のもう1つの利点は、気泡表面が固定されたままであるため、界面のイメージングが簡素化され、CFMの集束が簡素化されることです。吸着プロセスの間、界面活性剤が界面に吸着するにつれて(ビデオ1)、界面からの蛍光シグナルが増加する。界面活性剤が表面ドメインを形成する場合、これらのドメインは形成および成長を観察することができる²²。

領域振動時の表面張力の変化を図7に示す。CPMの以前のバージョンでは、気泡毛細管圧で振動が行われていました。しかし、毛細管圧で正弦波を生成しても、表面積の正弦波には直接変換されず、両者はラプラス方程式を介して関連している。ラプラス方程式を使用したモデルベースのフィードバックループを利用することで、振動は毛細管圧ではなく領域で生成され、より広い範囲の振幅にわたって分析と収集が容易なデータが得られます。その結果、この方法から収集された表面張力対面積データは、界面活性剤層の界面拡張弾性率を直接計算するために使用することができる(図8: )が、ここで、系の全応力およびτ応力は、非等方性偏差_応力であり、単純な界面活性剤溶液^4、33中にはしばしば存在しない。したがって、単純な界面活性剤系に対しては、.界面活性タンパク質など、弾性ネットワークを形成できる界面では、余分な応力がしばしば存在するため、拡張弾性率を定義する際に考慮する必要があります。ビデオ2は、リン脂質単層における連続的な着色LE相マトリックスにおける黒色LCドメインの動きのCFMビデオを示す。界面上の別個のLCドメインは、湾曲した気泡^22,40上で振動が起こるときに界面を覆う分岐ネットワークに再編成される。「その他の領域振動」タブを使用して、補足図 3 に示すようにのこぎり歯状波、四角形波、三角波を作成でき、「圧縮」タブでは一定速度の領域の圧縮と拡張が可能です。

溶媒交換研究のために、界面活性剤を最初に界面に吸着させ、次いでリザーバ液体を交換して、第2の表面活性種がその界面に接触することを可能にする。第2の界面活性剤が界面で元の界面活性剤と競合するように表面張力の変化を調べることができる。この表面拡張弾性率は、CFM を介した 表面形態とともに界面活性剤交換のより高感度なプローブであることが多い。 図9 は、そのような溶媒交換が起こる1つとしての表面張力、表面膨張弾性率、および表面形態の変化を示す。このような交換の詳細はさまざまですが、3つの特性のいずれかに対する変化は、第2の成分の単層への統合またはバルクへの一次成分の溶媒和を示す可能性があります。第2の蛍光タグを二次種に取り付けて、CFM画像から界面との相互作用を観察することができる。

図1:毛細血管治療(A)毛細血管のスコアリングを示す画像。ガラススコアリングセラミックは、それを安定させるためにクランプに保持されています。(B)毛細血管の酸洗浄。酸洗浄液は、真空ポンプでキャピラリーに引き込まれます。(c)毛細血管の疎水化。キャピラリー内部に保持されたシラン溶液プラグ この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

(1)大型アルミセルホルダー、(2)フルオロエラストマーガスケット(合計4個)、(3)スライドガラス(合計2個)、(4)PEEKセル、(5)小型アルミセルホルダー。組み立てると、各スライドガラスの両側にフルオロエラストマーガスケットが配置されます。セルはネジとボルトで一緒に保持されています。PEEKセルの拡大画像は、(6)キャピラリーポート、(7)溶媒交換入口、(8)溶媒交換出口、および(9,10)温度制御ジャケット入口および出口のさまざまなポートの位置を示しています。PEEKプラグを使用して、チューブまたはキャピラリーをセルに取り付けることができます。使用されていないポートは、チャネルのないプラグによって完全に閉じることができます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:CPM/CFMの回路図(スケーリング不可) (1)CPMセル、(2)先端に気泡を有するキャピラリーチューブ、(3)共焦点顕微鏡対物レンズ、(4)フィルター付き顕微鏡カメラ対物レンズ、(5)CPM光源、(6)マイクロ流体ポンプ、(7)安全弁、(8)流体交換入口、(9)流体交換出口、(10)ペリスタルティックポンプ、(11)交換流体貯留槽、(12)流体交換廃液、(13)細胞シリンジへの直接、 (14)温度制御ジャケット入口および出口、ならびに(15)温度制御されたリザーバおよびポンプ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:CPM仮想インタフェース 。(1)データが保存されるファイルパス。(2) システムパラメータ、コメント、および保存ボタン。この領域のすべてのフィールドは、最終データ・ファイルに保存されます。(3)CPMカメラ画像;(4)画像解析、環状測定、バブルリセット、およびフレーム/秒トラッキングを制御する設定。(5)バブルリセットボタン。(6) データ収集ボタン、データ記録速度制御、およびデータ収集インジケータ。(7)すべての動作モードの中心線値、発振振幅、および発振周波数を制御します。(8)動作モード切り替え:各タブをクリックすると、その制御モードに変わります。各モードは、「圧力信号」グラフにポンプに送信される圧力信号といくつかの追加制御を示します。(9)ライブ表面張力データ;(10)生圧データ;(11)ライブ曲率半径データ;(12)ライブ表面積データ;(13)振動スタディ中の位相角を大まかに決定するために使用できるライブ表面張力および表面積データ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:毛細血管の欠陥。 (A)および(B)誤カット毛細血管;(C)キャピラリを正しく切断し、(D)コーティング不良または劣化によりピン留め不良のキャピラリー、および(E)キャピラリを適切に固定したキャピラリ。 D と E の赤い矢印は、バブルが固定されている場所を示します。最良の結果を得るために、気泡は毛細血管先端に固定されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:定圧(オレンジ色)と定面積(青色)の両方の吸着に対する吸着研究マイクロテンシオメータの結果。 一定面積吸着のための気泡表面積は、研究を通して著しく増加し、吸着が同じ表面張力に達するまでに時間がかかる原因となる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:標準的な表面積制御振動 、(A)圧力、(B)曲率、および(C)表面積データ。表面積データは正弦波ですが、中心線値が振動の中間点にないことからもわかるように、圧力と曲率のデータはそうではありません。3つの値の間の数学的関係は、1つだけが真の正弦波になることができることを意味します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図8:分析後のレオロジー結果のサンプル。 〜45μm半径の気泡に対するLyso PCの濃度を増加させるための頻度の関数としてのLyso PC(1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)の拡張弾性率。炎症に伴う濃度>0.1mMのLyso PCは、正常な換気/呼吸数(黄色)の範囲にわたって拡張弾性率を低下させ、ラプラス不安定性を誘発するためのクロスオーバー値である2ε−γ <0にする(赤い点線)。低濃度のLyso PC≤0.01 mM、すなわち正常な肺で起こり得ることは、不安定性を誘発しない。周波数>10 rad/秒では、すべてのLyso PC濃度がクロスオーバーを超えており、ラプラス不安定性の影響を受けません。赤い実線は、データに対する理論の適合です。図は参考文献⁹から転載した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図9:DI水と交換された肺界面活性剤、次いでLyso PCの溶媒交換研究のCFMおよびCPMの結果 (A)は、研究を通して表面張力および表面拡張弾性率がどのように変化するかを示す。グラフは、肺界面活性剤が界面に吸着したとき(青)、LSをDI水と交換したとき(緑)、交換溶液をLyso PC溶液に切り替えたとき(赤)、細胞がLyso PC溶液で満たされたとき(オレンジ)の4つの領域に分かれています。プロパティは、インターフェイスが変化していることを示すさまざまな交換全体で変化していることがわかります。(B)は交換前の界面に吸着した肺用界面活性剤の共焦点像を示し、(C)はLyso PC溶液との交換が完了した後の同じ表面を示す。どちらの場合も、白い破線の円は毛細血管の内縁を示す。単層上のドメインの構造は、溶媒交換後に劇的に変化し、CPMの結果を裏付ける。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ビデオ1:肺界面活性剤の定圧吸着研究の共焦点ビデオ。 偽色は Z 方向の距離を示し、ビデオの左側にカラーバーが表示され、紫はキャピラリーの近くのバブルを示し、緑はバブルの上部を示します。界面は、最初は蛍光界面活性剤のほんの少しのみが吸着されるように薄暗く照らされる。ますます多くの界面活性剤が吸着するにつれて、色が緑色にシフトするにつれて気泡が成長し始め、界面を横切ることができる黒いLCドメインが界面に移入されるようになる。溶液中の界面活性剤の凝集体は、明るい非晶質形状として溶液中に浮遊し、いくつかが気泡界面に沈降し、崩壊して界面に界面活性剤を堆積させるのを見ることができる。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ビデオ2:肺界面活性剤の振動研究の共焦点ビデオ。偽色は、ビデオの左側にカラーバーがある Z 方向の距離を示します。表面はいくつかの異なる発振周波数にさらされ、界面上の暗いLCドメインは振動を通して変化するのを見ることができます。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図1:拡張レオロジーを決定するためのコードにおける中間ステップの例。 この画面が表示されたら、ユーザーは分析する振動の左端を左クリックし、右端を左クリックする必要があります。複数の振動を分析できるため、ユーザーは 1、2、3、および 4 を左クリックし、右クリックしてこれら 2 つの振動を分析できます。表示されている振動は、異なる振幅と周波数のものです。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2:拡張レオロジーコードによって生成されたグラフィカルな結果の例。 これは、圧力、半径、表面積、表面張力における振動に対する正弦波の適合度と、各振動のフーリエ変換を示しています。理想的には、フーリエ変換の第2高調波は、表面積と表面張力の第1高調波の10%未満でなければなりません。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図 3: 代替動作モード。 (A)正弦波、(B)鋸歯状波、(C)方形波、(D)三角波、(E)定率膨張、(F)定速圧縮。圧縮モードと膨張モードにより、不溶性界面活性剤に対してラングミュア型等温線を作成することができます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足コーディングファイル1:マイクロテンシオメータ仮想 Interface.vi。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足コーディングファイル2:Dilatational_Rheology_Analysisこのファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

結合されたCPM/CFMは、界面ダイナミクス、平衡、および形態を調べるための強力なツールです。このプロトコルでは、CPM/CFM を使用してデータを取得するために必要な手順について説明します。

図2 は、キャピラリー、溶媒、および熱交換用のチャネルが示されているセル設計を示しています。溶媒交換の入口はセルの下部にあり、出口は上部になければならず、交換中にセルがオーバーフローしないようにする必要があります。実際には、入口と出口の流量は、同じ蠕動ポンプに対してわずかに異なる場合があります。このセル設計の一般的な問題の 1 つは、セルからの漏れです。これは、ほとんどの場合、セルと接続の1つとの間の接続不良によって引き起こされますが、すべての接続が乾燥していて漏れていない場合、これはセルを囲むボルトの締め過ぎによるセルのスライドガラスの亀裂が原因である可能性があります。

図3 は、さまざまなポンプとセル間の接続、およびセルとCFMおよびCPMの目標とのアライメントを示しています。CPMカメラ(4)は、動作中の気泡形状を撮像するために使用される。CPMカメラには、CFM励起レーザー光がCPMカメラに入射するのを防ぐ光学フィルタを装備する必要があります。さもなければ、CFMレーザーはCPMカメラ内の画像を非常にノイズが多くし、画像解析を使用して収めるのが難しくなります。安全弁は、キャピラリーとマイクロ流体ポンプ(7)を接続し、セルからの逆流がポンプに到達するリスクなしに、ポンプおよび空気圧源に変更を加えることを可能にする。第2のバルブ(13)は、シリンジへのアクセスを提供し、リザーバへの流体のリザーバへの直接注入を可能にする。液体は、漏れの場合にリザーバに加える必要があり、プロトコルのステップ8(不溶性界面活性剤吸着)のために除去するか、共焦点対物レンズに付着している場合は毛細管から除去された気泡を除去する必要があるかもしれない。

各実験では、いくつかの重要な手順を慎重に実行する必要があります。機器が稼働した後に発生する問題のほとんどは、毛細血管自体に関係しています。そのため、慎重な切断とコーティングは困難を最小限に抑えることができます。キャピラリーを所望の直径に切断することは、困難で低収率のプロセスです。毛細血管の先端の切りくずや凹凸は、気泡半径の読み取り値が悪くなります。さらに、疎水性コーティングが正しく塗布されていない場合、または時間の経過とともに劣化して使用すると、気泡がキャピラリーの先端に正しく固定されません。これは、気泡がキャピラリーの内側に固定されているように見えるか、振動スタディ中にキャピラリーの内側に沿ってスライドすることによって示すことができます。うまく切断されているが、適切に固定されていない毛細血管は、再洗浄して疎水的に処理することができます。

もう1つの重要なステップとエラーの原因は、異なる材料間または同じ材料の異なる濃度の間でセルリザーバ、チューブ、およびキャピラリーを洗浄することです。貯水池には多くの小さな隙間があり、界面活性剤は適切に洗浄されなければ、後で行われた測定値を吸着して変更する可能性があります。セルの完全な分解と浸漬は、余分な表面活性材料を確実に除去するためにしばしば必要とされます。同じ界面活性剤の一連の濃度を研究する場合は、最低濃度を使用することから始める方が良いです。

時には、キャピラリーチューブを共焦点対物レンズと並べることは困難な場合があります。マイクロテンシオメータカメラは、共焦点対物レンズの位置合わせに役立てるために使用できますが、CFM対物レンズの作動距離が大きい場合、これは役に立たない場合があります。共焦点顕微鏡がキャピラリーの先端を越えて集束している場合、キャピラリー断面は、蛍光材料のない領域であり、対物レンズの配向を助けるためにも使用することができる。キャピラリーバブルが排出されない場合は、キャピラリーに供給される圧力(通常の動作では150 mbarと想定されています)に問題がある可能性があります。これは、圧力制御モードに入り、圧力を高い値に設定することで確認できます。圧力が設定圧力に達しない場合、マイクロ流体ポンプからのチューブ内の漏れがあるか、ポンプが十分なガス圧力を受けていない可能性があります。表面科学を含む多くの研究と同様に、汚染物質がどの時点でもソリューションに導入されないようにすることが重要です。測定値が期待どおりでない場合(表面張力が低すぎる、または減少しすぎる)は、新しいサンプルを作成するか、よく研究されたサンプルまたは純粋な液体を使用することも、トラブルシューティングの初期段階で役立ちます。

他の実験目標を達成するために、装置にいくつかの修正を加えることができる。油または水をキャピラリーに添加して、空気−水界面³⁹の代わりに油水の研究を可能にすることができる。これにより、ポンプへの逆流のリスクが高まるため、追加の注意を払う必要があり、ポンプとキャピラリーの間のチューブにオイルトラップを追加することさえ必要になる可能性があります。

CPM/CFM にはいくつかの制限があります。CPMは、キャピラリーサイズの限られた動作範囲を有し、ポンプおよびシステム内の光学系用のキャピラリーODに対して20〜300μmを有する。溶媒交換⁴¹またはここで説明した方法を用いて界面に不溶性界面活性剤を添加することは可能であるが、表面濃度は、表面張力対面積等温線を行い、ラングミュアトラフから得られたものと比較することによってのみ推測することができる。CFMは蛍光物質のみを検出できるため、非蛍光性または非蛍光性のタグが付けられた物質は視覚化できません。多くの界面活性剤は小分子であり、それらをタグ付けすることは潜在的にその特性を変化させる可能性があるが、これはタンパク質またはポリマーなどのより大きな界面活性分子にとってはあまり問題にならないはずである^26,27。

この方法には、界面活性剤を含む界面の以前のCPMおよびCFM分析に比べていくつかの重要な利点があります。最も重要なのは、ハイブリッド機器が、さまざまな動的および平衡表面特性が測定されている間に界面を視覚化できることです。界面の形態の変化は、界面ダイナミクスおよびレオロジー特性に直接リンクすることができる。界面活性剤含有界面の以前のCFMは、平坦なラングミュアトラフ16、20、^28、29、42、43、44、^45、46、47を用いて行われていたが、ここで記載する方法は^、高度に湾曲した界面²²に対して行うことができる.さらに、インターフェース全体を一度にイメージングすることができ、特定のドメインのリアルタイム追跡可能な変化を示すことができますが、Langmuirトラフ上の表面の流れは、共焦点視覚ウィンドウに出入りするドメインをもたらしました。この装置の表面圧縮も等方性ですが、ラングミュアトラフ上の障壁は特定の圧縮方向を持っています。CPMは、ラングミュアトラフで可能なよりもはるかに高速な領域振動を可能にします。

この研究の新しい曲率と面積ベースの制御は、CPM³⁰の以前のバージョンよりも大きな利点があります。典型的には、気泡サイズは、固定された毛細管圧力を設定することによって制御された。拡張モジュライ測定のために、毛細管圧を振動させた。毛細管圧が一定に保たれると、界面活性剤が界面に吸着するにつれて、気泡の表面張力が低下する。ラプラス方程式ΔP = 2γ/Rを満たすためには、表面張力が減少するにつれて曲率半径が小さくなる必要があります。CPM内の半球バブルの場合、バブル曲率半径を小さくするとバブル面積^9,48が増加します。

ここで、_Rcは毛細管半径であり、Rは気泡の曲率半径である。気泡の半径の変化は、吸着中の界面の面積を変化させ、これは、Ward-Tordai方程式^10,38を用いた吸着の分析を複雑にする さらに、気泡の表面張力が十分に低下すると、気泡半径は毛細管半径よりも小さくなり、気泡が噴出される。この新しいCPM/CFMのフィードバックループは、吸着を通して気泡領域を一定に保ち、元のワード - トルダイ方程式を使用することができ、気泡噴出のリスクがなく、表面が領域内で増加しないため、吸着がより迅速に起こることを意味する。振動学研究の場合、圧力で正弦波を生成しても、表面積⁴⁸に正弦波を生成しない。以前のCPM法は、圧力駆動振動によって引き起こされる面積変化が正弦波⁴⁸に近似するために、振動を小さく保つことに依存していた。説明した方法は、気泡の面積を直接制御し、界面領域に真の正弦波振動を生成するために使用することができる。応力(表面張力の変化)を界面ひずみ(表面積の変化)に直接関連付けて、拡張弾性率を計算することができます。

このプロトコルの実装を支援するために、マイクロテンシオメータを制御するコードの簡単な説明をここで説明します。このコードは、ループ内の3つのセグメントで構成されています:1つはマイクロ流体ポンプにコマンドを発行し、1つは気泡のリセットメカニズムを制御し、もう1つは気泡の半径を測定して計算値を保存します。ポンプコントローラには、圧力制御、曲率制御、面積制御の3つの主要な動作モードがあります。圧力制御では、ユーザーはポンプによって作成された圧力の設定点を直接入力します。このモードはフィードバックループを必要とせず、モードの中で最も安定しているため重要です。曲率制御では、以前に測定された面圧とラプラス方程式を使用して、特定の曲率の界面を作成するために必要な圧力を計算します。表面積制御モードは、球面キャップの形状に基づいて特定の表面積を作成するために必要な曲率を計算することによってこれに基づいて構築され、キャピラリー半径の正確な測定も必要です。これら2つのモードは、吸着および振動の研究に特に役立ちますが、一貫した表面圧力データの安定したストリームが必要です。そのため、これら 2 つのコントローラーへのフィードは、機能を向上させるために生データから平滑化する必要がある場合があります。ソリューションが十分に明確でない場合、多くの場合、非常に濁ったサンプルが原因で、バブルインターフェイスの良好なイメージを得ることは不可能であるため、このモードは正しく機能しません。振動のコントロールもコードのこのセクションに含まれています。コードの中央のセグメントでは、バブルをキャピラリーから取り除くことができます。ここでは、キャピラリーの設定圧力を高い値に設定し、一定時間そこに保持して、気泡がはじけて新しいインターフェースを作成します。コードの最後のセクションでは、ビジョン取得ソフトウェアを使用してバブルのエッジを追跡し、その半径を測定します。次に、この半径をラプラス方程式とともに使用して表面張力を計算し、ループの初期部分に供給します。

このハイブリッドCPM/CFM技術は、空気と水の界面におけるモデルおよび臨床肺界面活性剤の研究に非常に有益であることが証明されています。気泡の寸法はヒト肺の肺胞の寸法に近似しており、肺界面活性剤単層の形態および動態に対する界面湾曲の影響が観察され得る^9,10,22。ハイブリッド機器は、石油化学から家庭用化学品、涙液膜から抗体安定化まで、幅広い用途で遍在する他の界面活性材料の研究にも重要です。CPM/CFMを組み合わせることで、相分離ドメインのスケールで動的界面特性を調べ、外部条件の変化に応じて表面上の形態を視覚化することができます。この方法は、高価な材料が最小限のサイズのサンプルを使用する必要がある用途に特に有用である。界面ダイナミクスと単層形態の同時観測は、他のどの手法ともほとんど不可能であり、界面科学の分野に広く適用できます。

著者らは、開示すべき利益相反はありません。

全ての共焦点顕微鏡像は、ニコンA1RHDマルチフォトン直立共焦点顕微鏡を用いて得られた。我々は、ミネソタ大学のユニバーシティ・イメージング・センターにおけるサポート・スタッフ、特にギレルモ・マルケスの指導及び支援に感謝する。この研究はNIH Grant HL51177によって支援された。SIはルース・L・キルシュシュタインNRSA機関研究訓練助成金F32 HL151128の支援を受けた。