מיקרוטנסיומטר למיקרוסקופיה קונפוקלית הדמיה של ממשקים דינמיים

כתב יד זה מתאר את התכנון וההפעלה של מיקרוטנציומטר/מיקרוסקופ קונפוקלי לביצוע מדידות בו-זמניות של מתח בין-פאזי וריאולוגיה של הרחבת פני השטח תוך הדמיית המורפולוגיה הבין-פאזית. זה מספק את הבנייה בזמן אמת של יחסי מבנה-תכונה של ממשקים חשובים בטכנולוגיה ובפיזיולוגיה.

ספיחה של מולקולות פעילות על פני השטח לממשקי נוזל-נוזל נמצאת בכל מקום בטבע. אפיון ממשקים אלה דורש מדידת שיעורי ספיגה של חומרים פעילי שטח, הערכת מתחי פנים של שיווי משקל כפונקציה של ריכוז פעילי שטח בתפזורת, והתייחסות לאופן שבו מתח הפנים משתנה עם שינויים באזור הבין-חלקיקי לאחר שיווי המשקל. הדמיה סימולטנית של הממשק באמצעות הדמיה פלואורסצנטית עם מיקרוסקופ קונפוקלי במהירות גבוהה מאפשרת הערכה ישירה של יחסי מבנה-תפקוד. במיקרוטנסיומטר הלחץ הנימי (CPM), בועת אוויר המיספרית מוצמדת בקצה הנימים במאגר נוזלי בנפח 1 מ"ל. הלחץ הנימי על פני ממשק הבועה נשלט באמצעות בקר זרימה מיקרופלואידי מסחרי המאפשר לחץ מבוסס מודל, עקמומיות בועות או שליטה בשטח הבועה בהתבסס על משוואת לפלס. בהשוואה לטכניקות קודמות כגון שוקת Langmuir וירידת התליון, דיוק המדידה והבקרה וזמן התגובה משופרים מאוד; ניתן ליישם וריאציות לחץ נימיות ולשלוט בהן באלפיות השנייה. התגובה הדינמית של ממשק הבועה מוצגת באמצעות עדשה אופטית שנייה כאשר הבועה מתרחבת ומתכווצת. קו המתאר של הבועה מתאים לפרופיל מעגלי כדי לקבוע את רדיוס עקמומיות הבועה, R, וכן את כל הסטיות מהמעגליות שיבטלו את התוצאות. משוואת לפלס משמשת לקביעת מתח הפנים הדינמי של הממשק. לאחר שיווי המשקל, תנודות לחץ קטנות יכולות להיות מוטלות על ידי המשאבה המיקרופלואידית הנשלטת על ידי מחשב כדי לתנוד את רדיוס הבועה (תדרים של 0.001-100 מחזורים לדקה) כדי לקבוע את המודולוס המתרחב הממדים הכוללים של המערכת קטנים מספיק כדי שהמיקרוטנציומטר יתאים מתחת לעדשה של מיקרוסקופ קונפוקלי במהירות גבוהה המאפשר מעקב אחר מינים כימיים המתויגים באופן פלואורסצנטי באופן כמותי ברזולוציה צידית תת-מיקרונית.

ממשקי אוויר-מים המכוסים על ידי סרטים פעילי שטח נמצאים בכל מקום בחיי היומיום. הזרקות מים פעילי שטח משמשות לשיפור התאוששות הנפט משדות מדולדלים ומשמשות כפתרונות שבירת הידראוליים לגז פצלי שמן ונפט. קצף גז-נוזלי ותחליב נוזלי-נוזלי נפוצים בתהליכים תעשייתיים ומדעיים רבים כחומרי סיכה וחומרי ניקוי והם נפוצים במזון. חומרים פעילי שטח וחלבונים בממשקים מייצבים את הקונפורמציות של נוגדנים במהלך^האריזה, האחסון והניהול 1,2,3,4,5, יציבות סרט הדמעות בעין ^6,7,8, ומכניקה ריאתית ^{9,10,11,12,13,14}, ¹⁵.

לחקר חומרים פעילים על פני השטח או חומרים פעילי שטח הסופחים לממשקים ולתכונותיהם יש היסטוריה ארוכה עם טכניקות ניסיוניות רבות ושונות 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . התפתחות אחרונה היא מיקרוטנסומטר לחץ נימי (CPM), המאפשר בחינה של תכונות בין-פרצופיות בממשקים מעוקלים מאוד, בסקאלות אורך קטנות בהרבה, תוך שימוש בחומרים נמוכים משמעותית משיטות נפוצות אחרות 9,23,24,25. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית (CFM) יכולה לשמש לחקר המורפולוגיה של שומנים וחלבונים בממשקי האוויר-מים ב-CPM²² או ב-Langmuir troughs 20,26,27,28,29. כאן שולבו CPM ו- CFM כדי לחבר תופעות מורפולוגיות לתכונות בין-תחומיות דינמיות ושיווי משקל כדי לפתח יחסי מבנה-פונקציה עבור ממשקים ביולוגיים וטכנולוגיים.

ישנם פרמטרים רבים בעלי חשיבות במערכות פעילי שטח בין-תחומיים הנגישות ל- CPM-CFM. ב- CPM, בועת אוויר בקוטר 30-200 מיקרומטר מוצמדת לקצה צינור נימי זכוכית. בגרסאות מוקדמות יותר של ה-CPM, הפרש הלחץ הנימי בין החלק הפנימי והחיצוני של הבועה נשלט באמצעות עמוד מים ומשאבת מזרק מתנד ^9,30 ; הגרסה החדשה המתוארת כאן מחליפה אותם במשאבה מיקרופלואידית מדויקת יותר, הנשלטת על ידי מחשב. מתח הפנים (γ) נקבע באמצעות משוואת לפלס, ΔP = 2γ/R, מירידת הלחץ על פני הממשק שנקבע על ידי המשאבה, ΔP, וניתוח אופטי של רדיוס העקמומיות של הבועה, R. ניתן לקבוע את מתח הפנים הדינמי של הממשק ברזולוציית זמן של 10 אלפיות השנייה לאחר יצירת בועה חדשה במגע עם נוזל בתפזורת המכיל חומר פעילי שטח מסיס. ניתן לתאר את דינמיקת הספיחה של פעילי השטח על ידי משוואת וורד-טורדאי הקלאסית^10,31 כדי לקבוע תכונות חיוניות של חומר פעילי השטח, כולל הדפיזור, כיסוי פני השטח והקשר בין ריכוז בתפזורת למתח פני השטח של שיווי המשקל. ברגע שמושג מתח פנים של שיווי משקל, ניתן לתנוד את האזור הבין-צדדי כדי למדוד את המודולוס המתרחב, על ידי רישום השינויים במתח הפנים, המושרים על ידי שינויים קטנים בשטח הפנים של הבועה, A³². עבור ממשקים מורכבים יותר המפתחים מבנים פנימיים משלהם כגון פולימרים או חלבונים סבוכים, מתח הפנים, , מוחלף על ידי מתח פני השטח הכללי יותר ^4,33, .

יציבות הריאות במהלך הנשימה עשויה להיות קשורה ישירות לשמירה הן על מתח פנים נמוך והן על מודולוס מתרחב גבוה בממשק האוויר-נוזל הנאדי ^9,10. כל משטחי הריאה הפנימיים מרופדים בסרט רציף בעובי מיקרון של נוזל רירית אפיתל כדי לשמור על הידרציה של הרקמות³⁴. נוזל רירית אפיתל זה הוא בעיקר מים, עם מלחים וחלבונים שונים אחרים, אנזימים, סוכרים וחומרים פעילי שטח של הריאות. כמו בכל ממשק מעוקל של אדי נוזל, לחץ נימי מושרה עם הלחץ הגבוה יותר בחלק הפנימי של הנאדיות (או הבועה). עם זאת, אם מתח הפנים היה קבוע בכל מקום בתוך הריאות, משוואת לפלס, ΔP = 2γ/R, מראה כי נאדיות קטנות יותר היו בעלות לחץ פנימי גבוה יותר ביחס לנאדיות גדולות יותר, מה שמאלץ את תכולת הגז של הנאדיות הקטנות יותר לזרום לנאדיות גדולות יותר בלחץ נמוך יותר. זה ידוע בשם "חוסר יציבות לפלס"^9,35. התוצאה נטו היא שהנאדיות הקטנות ביותר יתמוטטו ויתמלאו בנוזל ויתקשו לנפח אותן מחדש ולגרום לחלק מהריאה להתמוטט, וחלקים אחרים יתנפחו יתר על המידה, שניהם תסמינים אופייניים לתסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS). עם זאת, בריאה המתפקדת כראוי, מתח הפנים משתנה באופן דינמי כאשר ממשק נוזל האוויר-אפיתל באזור הבין-פאזי של הנאדיות מתרחב ומתכווץ במהלך הנשימה. אם , או , לחץ לפלס יורד עם ירידה ברדיוס ועולה עם הגדלת הרדיוס כדי לחסל את חוסר היציבות של לפלס, ובכך לייצב את הריאה⁹. לפיכך, , וכיצד זה תלוי בתדירות, מורפולוגיה והרכב חד שכבתי יותר, והרכב נוזל נאדי עשוי להיות חיוני ליציבות הריאות. ה- CPM-CFM סיפק גם את ההדגמות הראשונות של ההשפעות של עקמומיות בין-אישית על^{ספיחה פעילי שטח 25}, מורפולוגיה חד-שכבתית²² ומודולוס⁹ מרחיב. הנפח הקטן (כ-1 מ"ל) של המאגר ב-CPM מאפשר הקדמה, הסרה או החלפה מהירה של השלב הנוזלי וממזער את הכמות הנדרשת של חלבונים יקרים או חומרים פעילי שטח¹⁰.

הניגודיות בתמונת CPM-CFM נובעת מהתפלגות של שברים קטנים של שומנים או חלבונים המתויגים באופן פלואורסצנטי בממשק^16,27. מונו-שכבות דו-ממדיות של פעילי שטח מפגינות לעתים קרובות הפרדת פאזה רוחבית כפונקציה של מתח פני השטח או לחץ פני השטח, π הוא ההבדל בין מתח הפנים של ממשק נוזל-נוזל נקי, γ₀, לבין ממשק מכוסה פעילי שטח, γ. ניתן לחשוב על π כ"לחץ " הדו-ממדי הנגרם על ידי אינטראקציות של מולקולות פעילי שטח בממשק הפועל להורדת מתח פני השטח הנוזלי הטהור. בלחצים נמוכים על פני השטח, חד-שכבתיים של שומנים נמצאים במצב לא מאורגן דמוי נוזל; זה ידוע כשלב הנוזל המורחב (LE). ככל שהלחץ על פני השטח עולה והשטח למולקולת השומנים פוחת, השומנים מכוונים זה עם זה ויכולים לעבור מעבר פאזה מסדר ראשון לשלב ^16,20,27 של נוזל מסודר לטווח ארוך (LC) שלב 16,20,27. שלבי LE ו- LC יכולים להתקיים יחד בלחצים שונים על פני השטח וניתן לדמיין אותם כאשר שומנים המתויגים באופן פלואורסצנטי אינם נכללים בשלב ה- LC ומופרדים לשלב LE. לפיכך, שלב LE בהיר ופאזת ה- LC כהה כאשר היא מצולמת עם CFM¹⁶.

מטרתו של כתב יד זה היא לתאר את הצעדים הדרושים לבנייה ולתפעול של המיקרוטנסומטר המשולב של המיקרוסקופ הקונפוקלי. זה יאפשר לקורא לבצע מחקרי ספיחה, למדוד מתח פנים, התנהגות ריאולוגית, ולבחון מורפולוגיה בין-פאזית בו-זמנית בממשק אוויר/מים או שמן/מים בקנה מידה זעיר. זה כולל דיון כיצד למשוך, לחתוך ולהידריפוביזציה של הנימים הנדרשים, הוראות לשימוש במצבי לחץ, עקמומיות ובקרת שטח פנים, והעברה בין-אישית של חומר פעילי שטח בלתי מסיסים לממשק המעוקל של מיקרוטנציומטר.

1. הכנת צינורות נימיים

1. מקם את הנימים במשיכה נימית והפעל את תוכנית המשיכה הרצויה כדי ליצור שני נימים מחודדים בקוטר חיצוני (OD) של ~ 1 מיקרומטר בקצה.
   הערה: ה- OD של הנימים לפני המשיכה חייב להיות ה- OD שצוין כך שיתאים למחזיק הנימים בתא המיקרוטנציומטר. הקוטר הפנימי (ID) של הנימים יכול להשתנות, אך ישפיע על הרדיוס הקריטי של הנימים לאחר המשיכה. תוכנית משיכה נבחרת כך שהמחדד המתקבל מפחית בתחילה את ה- OD וה- ID הנימיים במהירות, לאחר מכן מגיע לרדיוס ליד ה- OD וה- ID הנימי הרצויים, ולאחר מכן מקטין את קוטרו לאט יותר. פעולה זו תיצור אורך נימי גדול יותר שניתן להבקיע כדי להניב נימים שמישים של 30-100 מיקרומטר במזהה.
2. הבקיע את קצה הנימים בנקודה הרצויה כדי לקבל מזהה של 30-100 מיקרומטר ולנתק את הקצה. לנימי יהיה כעת OD ו-ID של הרדיוס הרצוי בקצה (איור 1A). ניתן לאחסן את הנימים עד שלב 2.
   הערה: הקצה החתוך של הנימים חייב להיות הפסקה נקייה של 90°. כל פגם בקצה החתוך יוביל להצמדה גרועה של הבועה לנימיים ולמדידות שטח גרועות. קצוות נימי מחודדים עדינים מאוד. הם ייהרסו אם הם יבואו במגע עם כל דבר אחר מלבד הפתרונות (למשל, קירות בקבוקון, זרבובית אוויר).

2. הידרופוביזציה של נימים

1. לאסוף נימי זכוכית משוכים, תמיסת ניקוי חומצה, פינצטה מפלסטיק, מים שעברו דה-יוניזציה (DI), תמיסת הידרופוביזציה (2% סילאן באתנול), משאבת ואקום ותמיסת אתנול. ראה טבלת חומרים לקבלת פרטים.
   אזהרה: תמיסת ניקוי חומצה רעילה מאוד, גורמת לקורוזיה/גירוי בעור ובעיניים, מחמצנת. תמיסת הידרופוביזציה היא מגרה את העור/העין/הנשימה. לבשו מגן עיניים, מעילי מעבדה וכפפות ועבדו עם פתרונות במכסה אדים.
2. ניקוי חומצה את הנימים
   הערה: ניקוי חומצה של הנימים מסיר את כל השאריות האורגניות בתוך הנימים ומכין את משטח הזכוכית לתגובת הסילאניזציה שהופכת את הנימי להידרופובי.
   1. תפוס נימי בחוזקה ליד הקצה הרחב שלו עם הפינצטה.
   2. טובלים את הקצה המחודד בתמיסת הניקוי החומצית תוך חיבור הצינור ממשאבת הוואקום לקצה הרחב של הנימים. זה ישאב את הפתרון לתוך הנימים.
      הערה: ניתן לחבר קצה פיפטה לקצה הצינור הנימי כדי לאפשר התאמה טובה יותר עם הקצה הנימי.
   3. יש להפסיק כאשר תמיסת ניקוי החומצה מילאה כמחצית מהנימים.
      הערה: לאחר הסרת קצה הנימים מתמיסת ניקוי החומצה, התמיסה בחלק החיצוני של הנימים יוצרת לעתים קרובות חרוז ליד קצה הנימים. יש לגעת בעדינות בנימי הצוואר בצוואר בקבוקון התמיסה כדי להסיר עודפי תמיסה.
   4. אפשרו לתמיסת ניקוי החומצה להישאר בנימים לפחות 30 דקות, מה שמבטיח כי תקע הנוזל יישאר בקצה המחודד של הנימים.
   5. הסר את תמיסת ניקוי החומצה מהנימי על ידי החזקה חזקה של הנימים עם הפינצטה ושימוש בצינור הוואקום כדי למשוך את הנוזל מהקצה הגדול של הנימים.
3. לשטוף את הנימים
   1. הטביעו את הקצה המחודד של הנימים לתוך מי DI כדי להבטיח שהוא שקוע עמוק מספיק כדי לכסות את כל החלק החיצוני שהיה שקוע בתמיסת הניקוי החומצית. בזמן שהקצה שקוע, השתמשו בצינור הוואקום כדי למשוך מי DI דרך הנימים. הסר את הנימים מהמים והסר את המים הנותרים עם צינור הוואקום.
   2. חזור על השלב הנ"ל לפחות 4x.
4. בצע את שלב 2.3 נגד החלפת אתנול במי DI.
5. יש למרוח את היניקה ברציפות עד שהאתנול מתאדה לחלוטין מהפנים של הנימים. הנימים יהפכו לעכורים וקרירים למגע כאשר האתנול יתחיל להתאדות אך יתבהר לאחר 30 עד 45 שניות.
6. מצפים את הנימים בתמיסת ההידרופוביזציה
   1. לטבול בקצרה את הקצה הרחב של הנימים לתוך ~2% סילאן בתמיסת האתנול. פעולה נימית תגרום לתמיסת הציפוי לעלות בתוך הנימים. הסר את הנימים מהתמיסה לאחר שתקע בגודל של כ-1 ס"מ עלה בתוך הנימים.
   2. כיוון את הנימים כך שהקצה המחודד פונה כלפי מטה, ומאפשר לתמיסת הציפוי ליפול בכוח הכבידה לכיוון הקצה המחודד.
   3. אפשרו לתמיסת הציפוי להישאר בנימים לפחות 3 דקות.
      הערה: אסור שיהיו בועות אוויר בתקע של תמיסת הציפוי שנמצאת במגע עם פנים הקצה המחודד. אם יש בועת אוויר, סביר להניח שהפנים הנימיים לא התייבשו מספיק בשלב 2.5. כדי לתקן זאת, חזור על שלבים 2.4-2.6 לפי הצורך.
7. יש לשטוף את הנימים באתנול 1x באותו אופן כמו שלב 2.3.
8. הגדר את הציפוי ההידרופובי על הנימים
   1. מכניסים בקבוקוני נצנוץ נקיים ויבשים לתנור ואקום בטמפרטורה של 120 מעלות צלזיוס. מניחים נימים מצופים לתוך הבקבוקונים (באופן אידיאלי נימי אחד לכל בקבוקון) עם קצוות רחבים המונחים על בסיס הבקבוקון. אפשר לנימים להישאר בתנור לפחות 6 שעות (עדיף לילה) כדי להשיג הדבקה קבועה של שכבת הסילאן ההידרופובית לנימים. ניתן לאחסן את הנימים עד שלב 4.

3. הכנה ואחסון לדוגמה

1. ערבבו ואחסנו תמיסות של חומרים פעילי שטח ופלואורופור בבקבוקונים נקיים שטופי חומצה כדי למנוע זיהום.
   הערה: שומנים זמינים מסחרית חייבים להיות בעלי הטוהר הגבוה ביותר ולאחסן אותם בין שימוש ב - 20 °C (74 °F). שומנים ישנים או מזוהמים גורמים לעיתים קרובות לתוצאות להיות קשות לשחזור.

4. הגדרת המיקרוטנסומטר

1. הרכיבו את תא ה-CPM כמתואר באיור 2.
   1. מניחים את הצד הגדול של הנימים בחלק העליון של תא ה-CPM עד שהוא נדחף אל החלק התחתון של התא.
   2. הידקו בעדינות את תקע ה-PEEK כדי לאבטח את הנימים, ולאחר מכן חברו את הצינור מהמשאבה המיקרופלואידית לצד הגדול של הנימים. היזהרו שלא לגעת בקצה הנימי המחודד.
2. לפי הצורך, חברו את צינורות חילופי המאגרים ו/או את צינורות בקרת הטמפרטורה לכניסות ולשקעים המתאימים בתא CPM (איור 2); אחרת, חבר את הכניסות והשקעים שאינם בשימוש.
3. חברו את תא ה-CPM לשלב המיקרוסקופ הקונפוקלי, ויישרו אותו בערך עם מטרת ה-CFM, מצלמת CPM ומקור האור CPM (איור 3).
4. פתח את זרימת הגז למשאבה המיקרופלואידית בלחץ ההפעלה המומלץ של המשאבה (150 mbar למשאבה המיקרופלואידית המשמשת כאן) וודא שהזרימה לנימי פתוחה.
5. התחל להפעיל את הממשק הווירטואלי של CPM (קובץ קידוד משלים 1: מיקרו-טנסיומטר Interface.vi וירטואלי) במצב בקרת לחץ כאשר תדירות תנודת הלחץ הנימית והמשרעת מוגדרות לאפס (איור 4-7). איור 4 מציג צילום מסך של הממשק הווירטואלי. עבור מי DI ורדיוס נימי של ~ 35 מיקרומטר, לחץ של ~ 20 mbar מבטיח כי שום מים לא נכנסים לנימים.
6. מלאו את תא ה-CPM במים באמצעות פיפטה.
7. התמקדו בקצה הנימי באמצעות מצלמת המיקרוטנציומטר.
8. התמקדו בקצה הנימי עם ה-CFM. אם יש קושי למצוא את הנימים, השתמש במצלמת CPM כדי למצוא את מטרת ה- CFM. זה יעזור להעריך את המרחק בין מטרת ה- CFM לבועה, תוך השגת מרחק העבודה הנכון.
9. לאחר שהאנולוס (היטל המגזר הירוק) מרוכז בבועה, כוונו את המיקוד באופן ידני כך שניתן יהיה לראות בבירור את קצה הבועה (איור 4-3).
   הערה: ניתן לכוונן את המיקום, זווית ההתחלה והסיום, והרדידי הפנימי והחיצוני של האנולוס באמצעות התפריט שמתחת לחלון התצוגה.
10. לחץ על Reset Bubble, וודא שנוצרה בועה חדשה (ניתן יהיה לשמוע את הבועה הישנה מתפוצצת, והבועה החדשה תהיה ניתנת לצפייה מחלון הצפייה בלוח הבקרה; איור 4-3). אם הבועה אינה מתפוצצת, הגדל את לחץ האיפוס או הגדל את זמן השהיית האיפוס בכרטיסיה איפוס בועות מתחת לחלון התצוגה. בדקו אם מתח הפנים הוא סביב 73 mN/m (עבור מלח או בועות מים/אוויר) (איור 4-9).
11. מוציאים את המים דרך המזרק הישיר לתא (איור 3-13), מרוקנים אותם ומחברים אותם מחדש. הדגימה מוכנה לטעינה כדי להריץ את הניסוי.

5. מחקר ספיחה

1. מלא את התא בדגימה הרצויה באמצעות פיפטה אוטוקלאבית ששומרת על תוכנת CPM במצב בקרת לחץ . ודא שמתח הפנים הראשוני הוא סביב 73 mN/m כאשר נוצר ממשק בועות חדש.
2. קבעו את הרדיוס של הבועה החדשה שנוצרה והזינו את הערך הזה לתוך פקד האזור של קו האמצע (איור 4-7) ושנו את סוג הבקרה לבקרת שטח על-ידי לחיצה על הכרטיסיה בקרת שטח (איור 4-8).
   הערה: ניתן גם להשתמש בבקרת לחץ קבועה, אך הדבר גורם לרדיוס הבועה להשתנות ברציפות כאשר מתח הפנים של הממשק משתנה. אזור משתנה זה יכול לסבך את הניתוח של שיעורי הספיחה פעילי שטח ולגרום לבועה להתפוצץ במהלך המחקר.
3. התחל להקליט את הסרטון הקונפוקלי.
4. לחצו על איפוס בועת (איור 4-5), ולחצו מיד על איסוף נתונים (איור 4-6). נורית האיתות בכפתור תהפוך לירוקה.
5. התאם את קצב הקלטת הנתונים בהתאם לריכוז הדגימה על-ידי החלקת הפס המוצג באיור 4-6. לספיחות איטיות יותר, השתמש בקצב הקלטה איטי יותר. ניתן להתאים זאת באמצע ריצה אם רצוי קצב הקלטה גבוה יותר בשלב מוקדם, אך קצב איטי יותר עדיף על מחקרים ארוכים על מנת להקטין את גודל הקובץ.
6. לאחר סיום הניסוי (כאשר הושגה רמת מתח פני השטח הסופית), שמור את הקובץ על-ידי בחירת נתיב הקובץ הנכון (איור 4-1) ולחיצה על כפתור השמירה (איור 4-2).
7. עצור ושמור את ההקלטה גם ב- CFM.

6. מחקר תנודות/הרפיה

1. מלא את התא בדגימה באמצעות פיפטה שעברה בדיקה אוטומטית, תוך שמירה על תוכנת CPM במצב בקרת לחץ . ודא שמתח הפנים הוא סביב 73 mN/m בעת יצירת ממשק בועות חדש.
2. המתן עד שהמדגם יספוג במלואו לממשק. ניתן לבצע זאת ישירות לאחר מחקר ספיחה במקום להתחיל מחדש עם ממשק בועה חדש.
3. החליטו אם תנודתיות תהיה תנודת לחץ, תנודת שטח או תנודת עקמומיות על ידי בחירת הכרטיסייה המתאימה (איור 4-8) והזנת הערך הבסיסי הרצוי, אחוזי התנודה ותדירות התנודה (איור 4-7).
   הערה: תנודות שטח גלים מרובעות, מרובעות ומשולש נגישות גם מהתפריט הנפתח בכרטיסייה תנודת שטח אחר .
4. התחל את ההקלטה של הסרטון הקונפוקלי ולחץ על איסוף נתונים (איור 4-6) בתוכנת CPM.
5. התחל את התנודה. הקפד לרשום לפחות שבעה מחזורים לקבלת התוצאות הטובות ביותר. בחר קצב רכישת נתונים (איור 4-6) כדי לתת מספר מספיק של נקודות נתונים עבור כל מחזור תנודה.
6. אם רצוי אמפליטודות או תדרים אחרים של תנודות, שנה את הערכים במהלך הניסוי.
7. שמור את התוצאות כמו בשלבים 5.6 ו- 5.7.

7. מחקר חילופי ממסים

1. מלאו את התא בדגימה באמצעות פיפטה שעברה בדיקה אוטומטית, תוך שמירה על תוכנת CPM במצב בקרת לחץ. ודא שמתח הפנים הוא סביב 73 mN/m, כאשר נוצר ממשק בועות חדש.
   הערה: ניתן לבצע מחקרי ספיחה ו/או תנודה לפני מחקר חילופי הממסים.
2. חברו את צינור הכניסה עם בקבוק תמיסת ההחלפה הרצויה (איור 3-11) למשאבה הפריסטלטית (איור 3-10).
3. התחל את הקלטת הסרטון בתוכנת קונפוקל ולחץ על איסוף נתונים (איור 4-6) בתוכנת CPM.
4. הגדר את מהירות המשאבה הפריסטלטית. זה ישלוט על קצב חילופי הנוזלים ויש לבחור אותו על סמך הדרישות לניסוי, כלומר כמה מהר צריך להחליף את הממס.
5. אם יש צורך להחליף מספר נוזלים, יש לעצור את המשאבה הפריסטלטית ולחבר את הכניסה לתמיסת החלפה אחרת.
6. לאחר שהחילוף הסתיים (כ-20 דקות), שמרו את התוצאות כמו בשלבים 5.6 ו-5.7.

8. ספיחת פעילי שטח בלתי מסיסה

הערה: אם חומר השטח לספיחה אינו מסיס בנוזל המאגר, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להעביר מונו-שכבתי ממשק האוויר/מים של התא אל פני השטח של הבועה. ליפידים רבים היוצרים דו-שכבתיים הם כמעט בלתי מסיסים בתמיסת מלח ואינם נספגים באופן ספונטני בבועה כאשר הם תלויים בתמיסת המאגר.

1. מלא את התא בדגימה באמצעות פיפטה שעברה בדיקה אוטומטית, תוך שמירה על תוכנת CPM במצב בקרת לחץ . ודא שמתח הפנים הוא סביב 73 mN/m, כאשר נוצר ממשק בועות חדש.
2. להפקיד מונולאייר של חומר פעילי שטח בלתי מסיסים בממשק אוויר-מים של התא מתמיסה בתמיסה אורגנית נדיפה. באמצעות מזרק, הפקידו טיפות קטנות בממשק ואפשרו לממס להתאדות ולהשאיר את השומנים מאחור כסרט דק.
   אזהרה: כלורופורם משמש כממס לפוספוליפידים כגון פוספטידילכולינים וחומצות שומן. פתרונות התפשטות הם בדרך כלל 0.01-0.02 מ"ג של שומנים לכל מ"ל של הממס. כלורופורם הוא רעיל מאוד, יכול לגרום לגירוי בעור ובעיניים, והוא מסרטן. לבשו מגן עיניים מתאים, מעיל מעבדה וכפפות והכינו את התמיסה במכסה אדים.
3. הקטינו את שטח הפנים באמצעות בקרת הלחץ בקו האמצע (איור 4-7) של הבועה עד שהיא תהיה כמעט שטוחה. זה מונע מהבועה לצוץ לאחר שהחומר פעילי השטח נספג.
4. הסר את נוזל המאגר מהתא דרך המזרק הישיר לתא עד שממשק האוויר/מים יעבור מעבר לקצה הנימים. אמנם ניתן להשתמש במשאבת מזרק, אך ניתן להשיג שלב זה על ידי שימוש ידני במזרק.
5. הגדל את גובה נוזל המאגר לרמה הראשונית שלו.
   הערה: לאחר שהקצה יוצב מחדש, הבועה תהיה גדולה יותר בשל חומר פעילי השטח שנספג כעת בממשק. החד-שכבתי יהיה מוכן כעת לניסויים של החלפת ממסים או ממסים.

9. נקה

1. כבה את ה- CFM.
2. עבור למצב בקרת לחץ .
3. הסר את הדגימה מהתא באמצעות פיפטה. טען את התא במי DI והעלה את הלחץ ל~50 mbar כדי לגרום לבועות לברוח כל הזמן מהנימי ולנקות את קצה הנימים. חזור על תהליך זה 2x.
4. סגור את שסתום הבטיחות וכבה את ה- CPM על ידי לחיצה על הכפתור האדום בפינה השמאלית העליונה, כבה את לוח הבקרה של הלחץ באור ובכחול וסגור את מקור הלחץ.
5. הסר את התא משלב המיקרוסקופ הקונפוקלי. יש לשטוף את התא במי אתנול ו-DI. הסר את צינור הנימים מתא CPM.

10. ניקוי התא

1. לפרק את התא. מברישים את הקיר הפנימי עם מברשת שיניים תוך כדי שטיפה מתחת למי DI. הטביעו את החלקים באתנול וכתבו אותו במשך כ-30 דקות.
2. יש לשטוף את כל החלקים במי DI מספר פעמים. מייבשים את החלקים על ידי ניפוחם בגז חנקן או ייבושם בתוך תנור ואקום.

11. ניתוח תנודה

1. הפעל את קוד Dilatational_Rheology_Analysis.m (קובץ קידוד משלים 2), ובחר את הקובץ הרצוי שנשמר מהממשק הווירטואלי CPM. נתונים לדוגמה כלולים בקבצים המשלימים.
2. תרשים הלחץ לעומת הזמן יופיע כפי שמוצג באיור משלים 1. לחץ לחיצה שמאלית על הנקודה שבה התנודה מתחילה ולחץ שוב לחיצה שמאלית במקום שבו התנודה מסתיימת. אם הנתונים מכילים תנודות מרובות, חזור על תהליך זה עבור כל התנודות.
   1. כאשר כל נקודות ההתחלה והסיום נלחצו בלחיצה שמאלית, לחצו באמצעות לחצן העכבר באמצעות לחצן העכבר לחיצה ימנית בכל מקום. לדוגמה, כפי שמוצג באיור המשלים 1, ניתן ללחוץ לחיצה שמאלית בנקודות 1, 2, 3 ו-4, ולאחר מכן לחיצה ימנית.
      הערה: הקוד יחשב את המודולוס המתרחב ואת זווית הפאזה והתוצאות ייכתבו לקובץ .csv חדש במיקום הקובץ המקורי. את התוצאות עבור הנתונים לדוגמה ניתן לראות בתוצאות הקוד שניתנו בקובץ הקידוד המשלים 2. MATLAB גם תיצור מספר ייצוגים גרפיים של הנתונים כפי שמוצג באיור משלים 2.

מקור עיקרי של טעות מדידה נובע מהנימים שיש להם פגמים בתהליך החיתוך (איור 5A,B) או מתהליך הציפוי (איור 5D). שני סוגי הפגמים מובילים לטעויות בקביעת הצורה והגודל של הבועה על ידי מערכת ניתוח התמונה האופטית, מה שמוביל לערכי מתח פנים לא מדויקים. חשוב לבחון בקפידה כל נימי חדש לאחר משיכתו וציפייתו תחת המיקרוסקופ האופטי לפני החדרת הנימים לתוך ה-CPM. יש להשליך נימי טעות, אך נימי מצופה בצורה גרועה יכולים להיות מנוקים בחומצה ומצופים מחדש כדי לשפר את הצמדת הבועה בסוף הנימים (שלב 2 של הפרוטוקול). נימים פועלים בצורה הטובה ביותר אם חתך הקצה ניצב באופן מושלם לנימים (איור 5C) וסיכות הבועה ישירות בקצה הנימים (איור 5E). הציפוי ההידרופובי על הנימים יהפוך לפחות יעיל בהצמדה עם השימוש, ויחייב לנקות מחדש את הנימים ולצפות אותו מחדש.

נתונים מייצגים עבור ספיחה פעילי שטח לעומת זמן מוצגים באיור 6. בטכניקות ניסיוניות קודמות כגון תליון או טיפות ססיל ששימשו למדידת ספיחה פעילי שטח לא היה מנגנון להתאמה דינמית של הלחץ הנימי מכיוון שהשינוי במתח הפנים גורם לאזור הבועה להשתנות במהלך ספיחה 30,36,37. למעשה, עבור בועות וטיפות גדולות יותר, נדרשים שינויים בצורת הבועה או הצניחה (ומכאן שטח הפנים) כדי לקבוע את מתח הפנים מניתוח צורת הממשק מכיוון שהלחץ הנימי אינו נמדד באופן עצמאי והלחץ הנימי משתנה על פני משטח הטיפה או הבועה³⁷. זה גם מסבך את הניתוח של הספיחה מכיוון שככל שספיחות פעילי שטח מגיעות לממשק, מתח הפנים פוחת, וכדי לספק את משוואת לפלס שטח הפנים של הבועה חייב לגדול, מה שדורש חומר פעילי שטח נוסף לספיחה כדי להגיע לשיווי משקל. ב-CPM, לחץ נימי קבוע דורש שרדיוס הבועה הראשוני חייב להיות בטווח קטן לפני ספיגת פעילי השטח כדי למנוע מהבועה להיפלט מהנימי אם מתח הפנים יורד יותר מדי. דינמיקת ספיחה פעילי שטח מעוצבת לעתים קרובות על ידי משוואת וורד-טורדאי הקלאסית³¹, המתארת את הספיחה של מולקולות פעילי שטח לממשק נקי של אזור בין-פאזי קבוע. בעוד שניתן לשנות את משוואת וורד-טורדאי כך שתתחשב בשטח הפנים המשתנה, הדבר מציג פרמטרים נוספים ומסבך מאוד את הניתוח^38,39.

כדי להתגבר על בעיות אלה, פותחה לולאת משוב מבוססת מודל באמצעות משוואת לפלס המחזיקה את העקמומיות (ואת שטח הפנים) של קבוע הבועה לאורך כל תהליך הספיחה על ידי התאמה דינמית של הלחץ הנימי. ישנם הבדלים משמעותיים בקצב השינוי של מתח הפנים מכיוון ששטח הבועה אינו גדל כל הזמן. השינויים באזור הבועה במהלך הספיחה אינם קבועים עם הזמן מכיוון שמתח הפנים משתנה לאט בהתחלה, ולאחר מכן מאיץ במהירות לפני שיווי המשקל. סיבוך נוסף הוא שהשינוי השברירי באזור תלוי ברדיוס הבועה הראשוני. יתרון נוסף של רדיוס בועות קבוע הוא שהדמיית הממשק פשוטה יותר כאשר משטח הבועה נשאר קבוע, מה שמפשט את מיקוד ה-CFM. במהלך תהליך הספיחה, כאשר ספיחה פעילי שטח מגיעה לממשק (וידאו 1), האות הפלואורסצנטי מהממשק גדל. אם החומרים פעילי השטח יוצרים תחומי פני שטח, ניתן לראות תחומים אלה נוצרים וגדלים²².

השינויים במתח הפנים במהלך תנודות באזור מוצגים באיור 7. בגרסאות קודמות של CPM, תנודות נעשו בלחץ נימי הבועה; עם זאת, יצירת גל סינוס בלחץ נימי אינה מתורגמת ישירות לגל סינוס בשטח הפנים מכיוון שהשניים קשורים זה לזה באמצעות משוואת לפלס. על ידי ניצול לולאת משוב מבוססת מודל באמצעות משוואת לפלס, נוצרות תנודות באזור ולא בלחץ נימי, מה שמוביל לנתונים שקל יותר לנתח ולאסוף על פני טווח גדול יותר של משרעת. כתוצאה מכך, ניתן להשתמש בנתוני מתח הפנים לעומת השטח שנאספו משיטה זו כדי לחשב באופן ישיר את המודולוס המתרחב הבין-פאזי של שכבת פעילי השטח: (איור 8), כאשר הוא הלחץ הכולל של המערכת _ולחץτהוא לחץ סוטה לא איזוטרופי שנעדר לעתים קרובות בתמיסות פעילי שטח פשוטים ^4,33. לפיכך, עבור מערכת פעילי שטח פשוטה, . עבור ממשקים שבהם ניתן ליצור רשתות אלסטיות, כגון חלבונים פעילים על פני השטח, לעתים קרובות קיימים לחצים נוספים ולכן יש לקחת בחשבון בעת הגדרת המודולוס המתרחב. סרטון 2 מציג סרטון CFM של תנועתם של תחומי LC שחורים במטריצת פאזה LE צבעונית רציפה במוליעים חד-שכבתיים של פוספוליפידים. תחומי ה-LC המובהקים בממשק מתארגנים מחדש לרשת מסתעפת המכסה את הממשק כאשר מתרחשות תנודות בבועה המעוקלת^22,40. ניתן להשתמש בכרטיסיה תנודות שטח אחרות כדי ליצור גלים נסורים, ריבועיים ומשולשים כפי שניתן לראות באיור משלים 3, והלשונית דחיסה מאפשרת דחיסה והרחבה של שטח קצב קבוע.

עבור מחקרי חילופי ממסים, חומר פעילי שטח מותר תחילה לספוח לממשק, ולאחר מכן נוזל המאגר מוחלף כדי לאפשר למין שני הפעיל על פני השטח ליצור קשר עם ממשק זה. ניתן לבחון את השינוי במתח הפנים כאשר פעיל השטח השני מתחרה בחומר פעילי השטח המקורי בממשק. המודולוס המתרחב של פני השטח הוא לעתים קרובות בדיקה רגישה יותר של חילופי פעילי השטח יחד עם המורפולוגיה של פני השטח באמצעות CFM. איור 9 מראה את השינוי במתח פני השטח, במודולוס המתרחב של פני השטח ובמורפולוגיה של פני השטח כאשר מתרחש חילופי ממסים כאלה. בעוד הפרטים של חילופי כזה יכולים להשתנות, שינוי בכל אחד משלושת המאפיינים יכול להצביע על שילוב של הרכיב השני לתוך monolayer או פתרון של הרכיב הראשי לתוך נפח. תג פלואורסצנטי שני יכול להיות מחובר למין המשני כדי לבחון את האינטראקציה שלו עם הממשק מתמונות ה-CFM.

איור 1: טיפול נימי. (A) תמונה המציגה את הניקוד של הנימים. קרמיקת ניקוד הזכוכית מוחזקת במהדק כדי להחזיק אותה יציבה. (B) ניקוי חומצה של הנימים. תמיסת ניקוי החומצה נמשכת לתוך הנימים עם משאבת הוואקום. (C) הידרופוביזציה של הנימים. תקע תמיסת סילאן המוחזק בתוך הנימים אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: בניית תאים. (1) מחזיק תא אלומיניום גדול, (2) אטם פלואורואלסטומר (ארבעה בסך הכל), (3) שקופית זכוכית (שניים בסך הכל), (4) תא PEEK ו-(5) מחזיק תא אלומיניום קטן. כאשר הוא מורכב, אטם פלואורואלסטומר ממוקם משני צדי כל מגלשת זכוכית. התא מוחזק יחד עם ברגים וברגים. התמונה המוגדלת של תא ה-PEEK מציגה את המיקומים של היציאות השונות: (6) יציאה נימית, (7) כניסת חילופי ממסים, (8) שקע חילופי ממסים, ו-(9,10) כניסת ושקע של מעיל בקרת טמפרטורה. ניתן להשתמש בתקע PEEK כדי לחבר את הצינורות או הנימים לתא. ניתן לסגור לחלוטין יציאות שאינן בשימוש על-ידי תקעים ללא ערוצים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: שרטוט של CPM/CFM, לא בקנה מידה. (1) תא CPM, (2) הצינור הנימי עם בועה בקצה, (3) מטרת המיקרוסקופ הקונפוקלי, (4) מטרת מצלמת המיקרוסקופ עם מסנן, (5) מקור אור CPM, (6) משאבה מיקרופלואידית, (7) שסתום בטיחות, (8) כניסת חילופי נוזלים, (9) מוצא חילופי נוזלים, (9) מוצא חילופי נוזלים, (10) משאבה פריסטלטית, (11) מאגר נוזל חילופי, (12) פסולת חילופי נוזלים, (13) ישירות למזרק התא, (14) כניסת מעיל בקרת טמפרטורה ושקע, ו-(15) מאגר ומשאבה מבוקרי טמפרטורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: ממשק וירטואלי CPM. (1) נתיב הקובץ שבו הנתונים יישמרו; (2) פרמטרים של מערכת, הערות ולחצן 'שמור'. כל השדות באזור זה נשמרים בקובץ הנתונים הסופי; (3) תמונת מצלמת CPM; (4) הגדרות השולטות בניתוח התמונה, מדידת אנולוס, איפוס בועות ומעקב אחר מסגרות לשנייה; (5) לחצן איפוס הבועה; (6) לחצן איסוף נתונים, בקרת קצב הקלטת נתונים ומחווני איסוף נתונים; (7) בקרות עבור כל ערכי קו האמצע של מצב ההפעלה, משרעת התנודה ותדירות התנודה; (8) מתג מצב הפעלה: לחיצה על כל כרטיסיה משנה למצב בקרה זה. כל מצב מציג את אות הלחץ הנשלח למשאבה בגרף "אות הלחץ" וכן כמה פקדים נוספים; (9) נתוני מתח פנים חיים; (10) נתוני לחץ חי; (11) רדיוס חי של נתוני עקמומיות; (12) נתוני שטח פנים חיים; ו-(13) נתוני מתח פנים ושטח פנים חיים, שניתן להשתמש בהם כדי לקבוע באופן גס את זווית הפאזה במהלך מחקר תנודות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 5: פגמים נימיים. (C) לחתוך נכון נימי, (D) נימי עם הצמדה גרועה עקב ציפוי לקוי או פגום, ו-(E) נימי מוצמד כראוי. החצים האדומים ב-D וב-E מציינים היכן מוצמדות הבועות. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הבועה תצמיד בקצה הנימי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 6: תוצאות מיקרו-טנסיומטר של מחקר ספיחה הן עבור ספיחה בלחץ קבוע (כתום) והן עבור ספיחה קבועה (כחולה). שטח הפנים של הבועה עבור ספיחת השטח הקבוע גדל באופן משמעותי לאורך המחקר וגורם לספיחה להימשך זמן רב יותר כדי להגיע לאותו מתח פנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 7: תנודת שליטה טיפוסית בשטח הפנים. נתוני שטח הפנים הם סינוסואידים בעוד שנתוני הלחץ והעקמומיות אינם כאלה, כפי שמעידים ערכי קו האמצע שאינם נמצאים בנקודת האמצע של התנודה. הקשר המתמטי בין שלושת הערכים אומר שרק אחד יכול להיות סינוסואיד אמיתי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 8: תוצאות ריאולוגיות לדוגמה לאחר ניתוח. מודולוס מרחיב של Lyso PC (1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine) כפונקציה של תדירות להגדלת הריכוזים של Lyso PC עבור בועות ברדיוס של כ-45 מיקרומטר. ריכוזים >0.1 mM של Lyso PC המלווים דלקת מפחיתים את המודולוס המתרחב בטווח של קצבי אוורור/ נשימה רגילים (צהוב) כדי ליצור 2ε−γ < 0, שהוא ערך ההצלבה לגרימת חוסר היציבות של לפלס (קו אדום מנוקד). ריכוזים נמוכים של Lyso PC ≤0.01 mM, שעלולים להתרחש בריאות נורמליות אינם גורמים לחוסר יציבות. בתדרים >10 rad/sec, כל ריכוזי המחשב של Lyso הם מעל ההצלבה, ולא יהיו רגישים לחוסר היציבות של Laplace. קווים אדומים מוצקים הם התאמות של תיאוריה לנתונים. איור ששוחזר מתוך הפניה⁹. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 9: תוצאות CFM ו-CPM עבור מחקר החלפת ממסים עבור חומרים פעילי שטח של ריאות שהוחלפו במי DI ולאחר מכן Lyso PC. (A) מראות כיצד מתח פני השטח ומודולוס מרחיב פני השטח משתנים במהלך המחקר. הגרף מופרד לארבעה אזורים: כאשר חומר פעילי השטח של הריאות נספג לממשק (כחול), כאשר ה-LS מוחלף במי DI (ירוק), כאשר תמיסת החליפין עוברת לתמיסת Lyso PC (אדום), וכאשר התא מתמלא בתמיסת Lyso PC (כתום). ניתן לראות את המאפיינים משתנים במהלך הבורסות השונות המצביעות על כך שהממשק משתנה. (B) מציגה תמונה קונפוקלית של חומר פעילי השטח של הריאה שנספגה לממשק לפני ההחלפה ו-(C) מציגה את אותו משטח לאחר השלמת ההחלפה עם פתרון Lyso PC. בשני המקרים, העיגול המקווקו הלבן מציין את הקצה הפנימי של הנימים. מבנה התחומים על החד-שכבתי משתנה באופן דרסטי לאחר חילופי הממסים, ומאשש את תוצאות ה- CPM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

וידאו 1: סרטון קונפוקלי של מחקר ספיגת לחץ קבועה עבור חומרים פעילי שטח של הריאות. הצבע הכוזב מראה את המרחק בכיוון z כאשר סרגל הצבע בצד שמאל של הסרטון, כאשר סגול מציין את הבועה ליד הנימים וירוק הוא החלק העליון של הבועה. הממשק מואר בתחילה באופן עמום מכיוון שרק מעט מחומר פעילי השטח הפלואורסצנטיים נספג. ככל שיותר ויותר ספיחה פעילי שטח, הבועה מתחילה לגדול ככל שהצבע עובר יותר לירוק והממשק הופך להיות מאוכלס על ידי תחומי LC שחורים שיכולים לנוע על פני הממשק. ניתן לראות אגרגטים של חומרים פעילי שטח בתמיסה צפים בתמיסה כצורות אמורפיות בהירות וכמה מהן מתיישבות על ממשק הבועה, מתפוררות ומפקידות את חומר פעילי השטח שלהן על הממשק. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

וידאו 2: וידאו קונפוקלי של מחקר תנודות עבור פעילי שטח של הריאות. הצבע הכוזב מציג את המרחק בכיוון z עם סרגל הצבעים בצד שמאל של הסרטון. המשטח נתון למספר תדרי תנודה שונים וניתן לראות את תחומי ה-LC הכהים בממשק משתנים לאורך התנודות. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

איור משלים 1: דוגמה לשלב ביניים בקוד כדי לקבוע את הריאולוגיה המתרחבת. כאשר מסך זה מופיע, על המשתמש ללחוץ לחיצה שמאלית בקצה השמאלי ביותר של התנודה כדי לנתח, ולאחר מכן ללחוץ שמאלה על הקצה הימני ביותר. ניתן לנתח תנודות מרובות כך שהמשתמש יוכל ללחוץ לחיצה שמאלית על 1, 2, 3 ו- 4, ולאחר מכן ללחוץ לחיצה ימנית כדי לנתח את שתי התנודות הללו. התנודות המוצגות הן של משרעת ותדרים שונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: דוגמה לתוצאות הגרפיות המופקות על-ידי קוד הריאולוגיה המתרחב. זה מראה את ההתאמות של סינוסואידים לתנודות בלחץ, רדיוס, שטח פנים ומתח פני השטח, כמו גם את התמרת פורייה של כל תנודה. באופן אידיאלי, ההרמוניה השנייה בהתמרת פורייה צריכה להיות פחות מ -10% מההרמונית הראשונה עבור שטח הפנים ומתח הפנים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור 3 משלים: מצבי פעולה חלופיים. (A) גל סינוס, (B) גל נסורת, (C) גל ריבועי, (D) גל משולש, (E) התפשטות קצב קבוע, ו-(F) דחיסת קצב קבוע. מצבי הדחיסה וההרחבה מאפשרים ליצור איזותרמים מסוג Langmuir עבור חומרים פעילי שטח בלתי מסיסים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ קידוד משלים 1: מיקרוטנסומטר Interface.vi וירטואלית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ קידוד משלים 2: Dilatational_Rheology_Analysis.m. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

ה-CPM/CFM המשולב הוא כלי רב עוצמה לבחינת דינמיקה בין-פאזית, שיווי משקל ומורפולוגיה. פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים לקבלת נתונים באמצעות CPM/CFM.

איור 2 מראה את עיצוב התא עם תעלות עבור הנימים, הממסים וחילופי החום שצוינו. הכניסה להחלפת ממסים צריכה להיות בתחתית התא בעוד שהשקע צריך להיות בחלק העליון, מה שמאפשר לתא לא לעלות על גדותיו במהלך ההחלפה. בפועל, קצבי הזרימה של הכניסה והיציאה עשויים להיות שונים במקצת עבור אותה משאבה פריסטלטית. אחת הבעיות הנפוצות בתכנון התא הזה היא דליפה מהתא. זה נגרם לרוב על ידי חיבור לקוי בין התא לאחד החיבורים, אך אם כל החיבורים יבשים ואינם דולפים, ייתכן שהדבר נובע מסדק בהחלקת הזכוכית של התא עקב הידוק יתר של הברגים המקיפים את התא.

איור 3 מראה את הקשרים בין המשאבות השונות לבין התא, כמו גם את יישור התא עם מטרות ה-CFM וה-CPM. מצלמת CPM (4) משמשת כדי לדמות את צורת הבועה במהלך הפעולה. יש לצייד את מצלמת ה-CPM במסנן אופטי המונע מאור הלייזר המרגש של CFM להיכנס למצלמת CPM. אחרת, לייזר CFM הופך את התמונות במצלמת CPM לקולעות ביותר וקשות להתאמה באמצעות ניתוח תמונה. שסתום בטיחות מחבר בין הנימים לבין המשאבה המיקרופלואידית (7) ומאפשר לבצע שינויים במשאבה ובמקור לחץ האוויר, ללא סיכון של זרימה חוזרת מהתא המגיע למשאבה. שסתום שני (13) מספק גישה למזרק כדי לאפשר הזרקה ישירה של נוזל לתוך המאגר וממנו. ייתכן שיהיה צורך להוסיף נוזל למאגר במקרה של דליפה, וייתכן שיהיה צורך להסירו לצורך שלב 8 של הפרוטוקול (ספיגת חומרים פעילי שטח בלתי מסיסים) או כדי להסיר בועות שטוהרו מהנימילריה אם הן נקשרו למטרה הקונפוקלית.

במהלך כל ניסוי, מספר שלבים מרכזיים חייבים להתבצע בזהירות. רוב הבעיות המתרחשות ברגע שהמכשיר פועל, מערבות את הנימים עצמם. ככזה, חיתוך וציפוי זהירים יכולים למזער קשיים. חיתוך הנימים לקוטר הרצוי הוא תהליך קשה ובעל תפוקה נמוכה. כל שבב או חוסר אחידות בקצה הנימים יובילו לקריאות גרועות של רדיוס הבועה. בנוסף, אם הציפוי ההידרופובי אינו מיושם כראוי, או אם הוא מתפרק עם הזמן והשימוש, הבועה לא תיצמד כראוי לקצה הנימים. ניתן להצביע על כך על ידי הבועה הנראית כאילו היא נעוצה בתוך הנימים או מחליקה לאורך החלק הפנימי של הנימים במהלך מחקר תנודה. נימי שנחתך היטב אך לא מצמידים כראוי ניתן לנקות מחדש ולטפל בו באופן הידרופובי.

שלב מרכזי נוסף ומקור אפשרי לטעויות הוא ניקוי מאגר התאים, הצינורות והנימים בין חומרים שונים או ריכוזים שונים של אותו חומר. יש הרבה סדקים קטנים במאגר והחומר פעילי השטח יכול לספוח ולשנות מדידות שנלקחו בזמנים מאוחרים יותר אם לא ניקו כראוי. פירוק מלא והשריה של התא נדרשים לעתים קרובות כדי להבטיח הסרה של כל עודף חומר פעיל על פני השטח. עדיף להתחיל על ידי שימוש בריכוז הנמוך ביותר אם יש לחקור סדרה של ריכוזים של אותו חומר פעילי שטח.

לעיתים, סידור הצינור הנימי עם המטרה הקונפוקלית יכול להיות קשה. ניתן להשתמש במצלמת המיקרוטנסומטר כדי לעזור ליישר את המטרה הקונפוקלית, אך עבור מרחק עבודה גדול של מטרת ה- CFM, ייתכן שזה לא יועיל. אם המיקרוסקופ הקונפוקלי ממוקד מעבר לקצה הנימים, ניתן להשתמש גם בחתך הנימי, אזור נטול כל חומר פלואורסצנטי, כדי לסייע בהכוונת המטרה. אם הבועה הנימית אינה נפלטת, עלולה להיות בעיה עם הלחץ המסופק לנימים (שאמור להיות 150 mbar בפעולה רגילה). ניתן לבדוק זאת על ידי כניסה למצב בקרת לחץ והגדרת הלחץ לערך גבוה. אם הלחץ אינו מגיע ללחץ שנקבע, סביר להניח שיש דליפה בצינורות מהמשאבה המיקרופלואידית או שהמשאבה אינה מקבלת לחץ גז מספיק. כמו במחקרים רבים העוסקים במדע פני השטח, חשוב לוודא כי לא יוכנסו חומרים מזהמים לתמיסות בשום שלב. אם הקריאות אינן כצפוי (מתח פני השטח מתחיל נמוך מדי או יורד מהר מדי), יצירת דגימה חדשה, או שימוש במדגם שנחקר היטב או בנוזל טהור הוא גם שלב מוקדם טוב בפתרון בעיות.

מספר שינויים ניתן לבצע במנגנון כדי להשיג מטרות ניסיוניות אחרות. שמן או מים ניתן להוסיף לתוך נימים המאפשר מחקר של שמן מים במקום ממשקי אוויר-מים³⁹. זה מגביר את הסיכון לזרימה חוזרת לתוך המשאבה ולכן יש לנקוט בזהירות נוספת, ואולי אפילו הוספת מלכודת שמן לצינורות בין המשאבה לנימים עשויה להיות נחוצה.

ישנן מספר מגבלות ל- CPM / CFM. ל- CPM יש טווח עבודה מוגבל של גודל נימי, 20-300 מיקרומטר עבור OD נימי עבור המשאבה והאופטיקה במערכת. אמנם ניתן להוסיף חומרים פעילי שטח בלתי מסיסים לממשק באמצעות חילופי^{ממסים 41} או השיטה המתוארת כאן, אך ניתן להסיק את ריכוז פני השטח רק מביצוע מתח פנים לעומת איזותרמי שטח והשוואה לאלה המתקבלים משוקת לאנגמיור. CFM יכול לזהות רק חומרים פלואורסצנטיים, כך שלא ניתן לדמיין כל חומר שאינו פלואורסצנטי או שאינו מתויג באופן פלואורסצנטי. חומרים פעילי שטח רבים הם מולקולות קטנות, ותיוג שלהם עלול לשנות את תכונותיהם, אם כי זו אמורה להיות פחות בעיה עבור מולקולות גדולות יותר הפועלות על פני השטח, כגון חלבונים או פולימרים^26,27.

לשיטה זו יש מספר יתרונות מרכזיים על פני ניתוחי CPM ו-CFM קודמים של ממשקים עמוסי פעילי שטח. החשוב ביותר הוא שהמכשיר ההיברידי מאפשר הדמיה של הממשק תוך מדידת תכונות שונות של משטח דינמי ושיווי משקל. שינויים במורפולוגיה של הממשק יכולים להיות קשורים ישירות לדינמיקה הבין-פאזית ולתכונות הריאולוגיות. CFM קודם של ממשקים עמוסי פעילי שטח נעשה באמצעות שוקת Langmuir שטוחה 16,20,28,29,42,43,44,45,46,47, בעוד שהשיטה המתוארת כאן יכולה להתבצע בממשקים מעוקלים מאוד²² . בנוסף, ניתן לצלם את הממשק כולו בבת אחת, ולהראות שינוי שניתן לעקוב אחריו בזמן אמת של תחומים ספציפיים, בעוד שזרימות פני השטח על שוקת Langmuir הובילו לתחומים שזרמו פנימה והחוצה מהחלון החזותי הקונפוקלי. דחיסות פני השטח במנגנון זה הן גם איזוטרופיות, בעוד שלמחסומים על שקתות Langmuir יש כיווני דחיסה מסוימים. ה- CPM מאפשר תנודות שטח מהירות בהרבה ממה שהיה אפשרי בשוקת לאנגמיור.

לעקמומיות החדשה ולבקרה מבוססת השטח במחקר זה יש יתרונות גדולים על פני גרסאות קודמות של CPM³⁰. בדרך כלל, גודל הבועה נשלט על ידי הגדרת לחץ נימי קבוע; עבור מדידות מודוליות מורחבות, הלחץ הנימי התנדנד. כאשר הלחץ הנימי מוחזק קבוע, כאשר חומרים פעילי שטח נסחפים לממשק, מתח הפנים של הבועה פוחת. כדי לקיים את משוואת לפלס, ΔP = 2γ/R, רדיוס העקמומיות חייב לרדת ככל שמתח הפנים יורד. עבור הבועה ההמיספרית ב- CPM, הקטנת רדיוס הבועה של העקמומיות מגדילה את שטח הבועה ^9,48:

שבו R_cהוא רדיוס הנימים ו-R הוא רדיוס הבועה של העקמומיות. הרדיוס המשתנה של הבועה משנה את שטח הממשק במהלך הספיחה, מה שמסבך את ניתוח הספיחה באמצעות משוואות וורד-טורדאי^10,38 בנוסף, אם מתח הפנים של הבועה יופחת מספיק, רדיוס הבועה יקטן מרדיוס הנימים והבועה תיפלט. לולאת המשוב ב-CPM/CFM החדש יותר שומרת על אזור הבועה קבוע לאורך כל הספיחה, כלומר ניתן להשתמש במשוואת וורד-טורדאי המקורית, אין סיכון לפליטת בועה, והספיחה מתרחשת מהר יותר מכיוון שהמשטח אינו גדל באזור. עבור מחקרים מתנדנדים, יצירת גל סינוס בלחץ אינה מייצרת גל סינוס בשטח הפנים⁴⁸. שיטות CPM קודמות הסתמכו על שמירה על תנודות קטנות על מנת שהאזור ישתנה כתוצאה מתנודה מונעת לחץ כדי להעריך גל סינוס⁴⁸. השיטה המתוארת שולטת ישירות באזור הבועה וניתן להשתמש בה כדי ליצור תנודות גל סינוס אמיתיות באזור הבין-פרצופי. ניתן לקשר ישירות את הלחץ (שינוי במתח הפנים) לזן הבין-פאזי (שינוי בשטח הפנים) כדי לחשב את המודולוס המתרחב.

כדי לסייע ביישום פרוטוקול זה, מתואר כאן תיאור קצר של הקוד השולט במיקרו-טנסיומטר. הקוד מורכב משלושה מקטעים בלולאה: אחד מנפיק פקודות למשאבה המיקרופלואידית, אחד שולט במנגנון האיפוס של הבועה, ואחד מודד את רדיוס הבועה ושומר את הערכים המחושבים. לבקר המשאבה שלושה מצבי הפעלה עיקריים: בקרת לחץ, בקרת עקמומיות ובקרת שטח. בבקרת לחץ, המשתמש מזין ישירות נקודה מוגדרת עבור הלחץ שנוצר על ידי המשאבה. מצב זה חשוב משום שהוא אינו דורש לולאת משוב, וככזה הוא היציב ביותר מבין המצבים. בקרת העקמומיות משתמשת בלחץ המשטח שנמדד בעבר ובמשוואת לפלס כדי לחשב איזה לחץ נדרש כדי ליצור ממשק של עקמומיות נתונה. מצב בקרת שטח הפנים מתבסס על כך על ידי חישוב העקמומיות הנדרשת כדי ליצור שטח פנים נתון המבוסס על הגיאומטריה של המכסה הכדורי, הדורשת גם מדידה מדויקת של רדיוס הנימים. שני מצבים אלה שימושיים במיוחד למחקרי ספיחה ותנודות, אך דורשים זרם קבוע של נתוני לחץ פני שטח עקביים. ככזה, ייתכן שיהיה צורך להחליק את ההזנה לשני בקרים אלה מהנתונים הגולמיים לתפקוד טוב יותר. כאשר הפתרון אינו ברור מספיק, לעתים קרובות בשל מדגם עכור מאוד, מצב זה לא יעבוד כראוי כמו קבלת תמונה טובה של ממשק הבועה אינו אפשרי. הפקדים עבור התנודה כלולים גם בחלק זה של הקוד. החלק האמצעי של הקוד מאפשר לנקות את הבועה מהנימים. כאן, הלחץ הקבוע של הנימים מוגדר לערך גבוה ומוחזק שם למשך פרק זמן מוגדר המאפשר לבועה לצוץ וליצור ממשק חדש. החלק האחרון של הקוד משתמש בתוכנת רכישת ראייה כדי לעקוב אחר קצה הבועה ולמדוד את הרדיוס שלה. רדיוס זה משמש לאחר מכן עם משוואת לפלס כדי לחשב את מתח הפנים, אשר מוזן לאחר מכן לחלק הראשוני של הלולאה.

טכניקת CPM/CFM היברידית זו הוכיחה את עצמה כמועילה מאוד למחקרים שלנו על חומרים פעילי שטח של מודלים וריאות קליניים בממשקי אוויר-מים. ממדי הבועה מתקרבים לאלה שבנאדיות בריאה האנושית ואת ההשפעות של עקמומיות בין-פאזית על המורפולוגיה והדינמיקה של מונו-שכבות פעילי שטח של הריאות ניתן לראות ^9,10,22. המכשיר ההיברידי יהיה חשוב גם למחקרים של חומרים פעילים אחרים על פני השטח שנמצאים בכל מקום עם יישומים הנעים בין פטרוכימיים לכימיקלים ביתיים, החל מיריעות דמעה וכלה בייצוב נוגדנים. ה-CPM/CFM המשולב מאפשר לנו לחקור תכונות בין-פאזיות דינמיות בקנה מידה של תחומים מופרדים פאזה ולדמיין את המורפולוגיות על פני השטח כאשר התנאים החיצוניים משתנים. שיטה זו שימושית במיוחד ביישומים שבהם חומרים יקרים דורשים שימוש במדגמים בגודל מינימלי. התצפית הבו-זמנית של הדינמיקה הבין-פאזית והמורפולוגיה החד-שכבתית היא כמעט בלתי אפשרית עם כל טכניקה אחרת, מה שהופך אותה לישימה באופן נרחב לתחום המדע הבין-תחומי.

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

כל תמונות המיקרוסקופיה הקונפוקלית התקבלו באמצעות המיקרוסקופ הקונפוקלי הזקוף Nikon A1RHD Multiphoton. אנו מכירים בהדרכה ובסיוע של צוות התמיכה, במיוחד גיירמו מרקס, במרכז ההדמיה האוניברסיטאי באוניברסיטת מינסוטה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH HL51177. SI נתמך על ידי מענק הכשרה למחקר מוסדי של רות ל. קירששטיין NRSA F32 HL151128.