مقياس التمدد الدقيق للتصور المجهري البؤري للواجهات الديناميكية

تصف هذه المخطوطة تصميم وتشغيل مقياس التمدد الدقيق/المجهر البؤري لإجراء قياسات متزامنة للتوتر البيني والريولوجيا التوسعية السطحية مع تصور المورفولوجيا بين الوجهين. وهذا يوفر البناء في الوقت الحقيقي للعلاقات بين البنية والملكية للواجهات المهمة في التكنولوجيا وعلم وظائف الأعضاء.

إن امتزاز الجزيئات النشطة على السطح إلى واجهات السوائل والسوائل موجود في كل مكان بطبيعته. يتطلب توصيف هذه الواجهات قياس معدلات الامتزاز السطحي ، وتقييم التوترات السطحية المتوازنة كدالة لتركيز السطحي السائب ، وربط كيفية تغير التوتر السطحي بالتغيرات في المنطقة البينية بعد التوازن. يسمح التصور المتزامن للواجهة باستخدام التصوير الفلوري باستخدام المجهر البؤري عالي السرعة بالتقييم المباشر للعلاقات بين البنية والوظيفة. في مقياس الضغط الشعري الدقيق (CPM) ، يتم تثبيت فقاعة هواء نصف كروية في نهاية الشعيرات الدموية في خزان سائل بحجم 1 مل. يتم التحكم في الضغط الشعري عبر واجهة الفقاعة عبر وحدة تحكم تدفق الموائع الدقيقة التجارية التي تسمح بالضغط القائم على النموذج أو انحناء الفقاعة أو التحكم في منطقة الفقاعة بناء على معادلة لابلاس. بالمقارنة مع التقنيات السابقة مثل حوض Langmuir وإسقاط القلادة ، يتم تحسين دقة القياس والتحكم ووقت الاستجابة بشكل كبير. يمكن تطبيق اختلافات الضغط الشعري والتحكم فيها في ميلي ثانية. يتم تصور الاستجابة الديناميكية لواجهة الفقاعة عبر عدسة بصرية ثانية مع توسع الفقاعة وانكماشها. يتناسب محيط الفقاعة مع ملف تعريف دائري لتحديد نصف قطر انحناء الفقاعة ، R ، وكذلك أي انحرافات عن الدائرية من شأنها أن تبطل النتائج. تستخدم معادلة لابلاس لتحديد التوتر السطحي الديناميكي للواجهة. بعد التوازن ، يمكن فرض تذبذبات ضغط صغيرة بواسطة مضخة الموائع الدقيقة التي يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر لتذبذب نصف قطر الفقاعة (ترددات 0.001-100 دورة / دقيقة) لتحديد معامل التمدد الأبعاد الإجمالية للنظام صغيرة بما فيه الكفاية بحيث يتناسب مقياس الشد الدقيق تحت عدسة المجهر البؤري عالي السرعة مما يسمح بتتبع الأنواع الكيميائية الموسومة بالفلورسنت كميا بدقة جانبية دون الميكرون.

واجهات الهواء والماء التي تغطيها أفلام الفاعل بالسطح منتشرة في كل مكان في الحياة اليومية. تستخدم حقن المياه الخافضة للتوتر السطحي لتعزيز استخراج النفط من الحقول المستنفدة وتستخدم كحلول تكسير هيدروليكي للغاز الصخري والنفط. الرغاوي الغازية السائلة والمستحلبات السائلة السائلة شائعة في العديد من العمليات الصناعية والعلمية كمواد تشحيم وعوامل تنظيف وهي شائعة في الغذاء. تعمل المواد الخافضة للتوتر السطحي والبروتينات في الواجهات على استقرار تكوينات الأجسام المضادة أثناء التعبئة والتغليف والتخزين والإدارة 1,2,3,4,5 ، واستقرار الفيلم المسيل للدموع في العين ^6,7,8 ، والميكانيكا الرئوية 9,10,11,12,13,14 ^{، 15}.

دراسة العوامل النشطة على السطح أو المواد الخافضة للتوتر السطحي التي تمتص الواجهات وخصائصها لها تاريخ طويل مع العديد من التقنيات التجريبية المختلفة 16،17،¹⁸،¹⁹،²⁰،^21،22،23،24،25،^26،27 . أحد التطورات الحديثة هو مقياس الضغط الشعري الدقيق (CPM) ، والذي يسمح بفحص الخصائص البينية على واجهات منحنية للغاية ، على مقاييس طول أصغر بكثير ، مع استخدام مواد أقل بكثير من الطرق الشائعة الأخرى 9,23,24,25. يمكن استخدام المجهر الفلوري البؤري (CFM) لدراسة مورفولوجيا الدهون والبروتينات في واجهات الهواء والماء في CPM²² أو في أحواض Langmuir^{20,26,27,28,29}. هنا تم الجمع بين CPM و CFM لربط الظواهر المورفولوجية بالخصائص البينية الديناميكية والمتوازنة لتطوير علاقات بين البنية والوظيفة للواجهات البيولوجية والتكنولوجية.

هناك العديد من المعلمات ذات الأهمية في أنظمة الفاعل بالسطح البينية التي يمكن الوصول إليها من قبل CPM-CFM. في CPM ، يتم تثبيت فقاعة هواء قطرها 30-200 ميكرومتر على طرف أنبوب شعري زجاجي. في الإصدارات السابقة من CPM ، تم التحكم في فرق الضغط الشعري بين داخل وخارج الفقاعة عبر عمود ماء ومضخة حقنة متذبذبة ^9,30 ؛ الإصدار الجديد الموصوف هنا يحل محلها مضخة ميكروفلويديك عالية الدقة يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر. يتم تحديد التوتر السطحي (γ) عبر معادلة لابلاس ، ΔP = 2γ / R ، من انخفاض الضغط عبر الواجهة التي تحددها المضخة ، ΔP ، والتحليل البصري لنصف قطر انحناء الفقاعة ، R. يمكن تحديد التوتر السطحي الديناميكي للواجهة بدقة زمنية تبلغ 10 مللي ثانية بعد توليد فقاعة جديدة تتلامس مع سائل سائب يحتوي على خافض للتوتر السطحي قابل للذوبان. يمكن وصف ديناميكيات الامتزاز السطحي بواسطة معادلة وارد-تورداي الكلاسيكية^10,31 لتحديد الخصائص الأساسية للفاعل بالسطح، بما في ذلك الانتشار والتغطية السطحية والعلاقة بين التركيز السائب والتوتر السطحي التوازني. بمجرد تحقيق التوتر السطحي المتوازن ، يمكن تذبذب المنطقة البينية لقياس معامل التمدد ، عن طريق تسجيل التغيرات في التوتر السطحي ، الناجمة عن التغيرات الصغيرة في مساحة سطح الفقاعة ، A³². بالنسبة للواجهات الأكثر تعقيدا التي تطور هياكلها الداخلية الخاصة مثل البوليمرات أو البروتينات المتشابكة ، يتم استبدال التوتر السطحي ، بإجهاد سطحي أكثر عمومية ^4,33 ، .

قد يرتبط استقرار الرئة أثناء التنفس ارتباطا مباشرا بالحفاظ على كل من التوتر السطحي المنخفض ومعامل التمدد العالي في واجهة الهواء السائل السنخية ^9,10. تصطف جميع أسطح الرئة الداخلية بطبقة مستمرة بسماكة ميكرون من سائل البطانة الظهارية للحفاظ على ترطيب الأنسجة³⁴. سائل البطانة الظهاري هذا هو الماء في المقام الأول ، مع الأملاح والعديد من البروتينات الأخرى والإنزيمات والسكريات والفاعل بالسطح الرئوي. كما هو الحال بالنسبة لأي واجهة منحنية بين بخار السائل ، يتم تحفيز الضغط الشعري مع ارتفاع الضغط داخل الحويصلات الهوائية (أو الفقاعة). ومع ذلك ، إذا كان التوتر السطحي ثابتا في كل مكان داخل الرئتين ، فإن معادلة لابلاس ، ΔP = 2γ / R ، توضح أن الحويصلات الهوائية الأصغر سيكون لها ضغط داخلي أعلى مقارنة بالحويصلات الهوائية الأكبر ، مما يجبر محتويات الغاز في الحويصلات الهوائية الأصغر على التدفق إلى الحويصلات الهوائية الأكبر والأقل ضغطا. يعرف هذا باسم "عدم استقرار لابلاس"^9,35. والنتيجة الصافية هي أن أصغر الحويصلات الهوائية سوف تنهار وتمتلئ بالسائل ويصبح من الصعب إعادة تضخيمها مما يتسبب في انهيار جزء من الرئة ، وأجزاء أخرى سوف تتضخم بشكل مفرط ، وكلاهما من الأعراض النموذجية لمتلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS). ومع ذلك ، في الرئة التي تعمل بشكل صحيح ، يتغير التوتر السطحي ديناميكيا حيث تتوسع واجهة السائل الظهاري الهوائي في منطقة الوجه الأسناخ وتتقلص أثناء التنفس. إذا ، أو ، ينخفض ضغط لابلاس مع انخفاض نصف القطر ويزداد مع زيادة نصف القطر وذلك للقضاء على عدم استقرار لابلاس ، وبالتالي استقرار الرئة⁹. وبالتالي ، وكيف يعتمد على التردد ، قد يكون مورفولوجيا الطبقة الأحادية وتكوينها ، وتكوين السائل السنخي ضروريا لاستقرار الرئة. كما قدم CPM-CFM أول عروض توضيحية لآثار الانحناء بين الوجوه على الامتزاز السطحي²⁵ ، ومورفولوجيا الطبقة الأحادية²² ومعامل التمدد⁹. يسمح الحجم الصغير (~ 1 مل) للخزان في CPM بالإدخال السريع أو الإزالة أو التبادل للطور السائل ويقلل من الكمية المطلوبة من البروتينات باهظة الثمن أو المواد الخافضة للتوتر السطحي¹⁰.

يرجع التباين في صورة CPM-CFM إلى توزيع أجزاء صغيرة من الدهون أو البروتينات الموسومة بالفلورسنت في الواجهة^16,27. غالبا ما تظهر الطبقات الأحادية الفاعل بالسطح ثنائية الأبعاد فصل الطور الجانبي كدالة للتوتر السطحي أو الضغط السطحي ، π هو الفرق بين التوتر السطحي لواجهة سائلة سائلة نظيفة ، γ ₀ ، وواجهة مغطاة بالفاعل بالسطح ، γ. يمكن اعتبار π على أنه "الضغط" 2-D الناجم عن تفاعلات جزيئات الفاعل بالسطح في الواجهة التي تعمل على خفض التوتر السطحي للسائل النقي. في الضغوط السطحية المنخفضة ، تكون الطبقات الأحادية الدهنية في حالة غير منظمة تشبه السائل. يعرف هذا باسم مرحلة السائل الموسع (LE). مع زيادة الضغط السطحي وانخفاض المساحة لكل جزيء دهني ، تتجه الدهون مع بعضها البعض ويمكن أن تخضع لمرحلة انتقالية من الدرجة الأولى إلى المرحلة المكثفة السائلة طويلة المدى (LC)¹⁶،^20،27. يمكن أن تتعايش مرحلتا LE وLC عند ضغوط سطحية مختلفة ويمكن تصورهما على أنهما يستبعدان الدهون الموسومة بالفلورسنت من مرحلة LC وينفصلان عن مرحلة LE. وبالتالي ، فإن مرحلة LE مشرقة ومرحلة LC مظلمة عند تصويرها باستخدام CFM¹⁶.

الهدف من هذه المخطوطة هو وصف الخطوات اللازمة لبناء وتشغيل مقياس التمدد المجهري البؤري المشترك. سيسمح ذلك للقارئ بإجراء دراسات الامتزاز ، وقياس التوتر السطحي ، والسلوك الريولوجي ، وفحص المورفولوجيا بين الوجوه في وقت واحد على واجهة هواء / ماء أو زيت / ماء على نطاق ميكرون. ويشمل ذلك مناقشة كيفية سحب الشعيرات الدموية المطلوبة وقطعها وكرهها للماء ، وتعليمات لاستخدام أوضاع التحكم في الضغط والانحناء ومساحة السطح ، والنقل البيني للفاعل بالسطح غير القابل للذوبان إلى الواجهة المنحنية لمقياس التوتر الدقيق.

1. إعداد الأنابيب الشعرية

1. ضع الشعيرات الدموية في مجتذب شعري وقم بتشغيل برنامج السحب المطلوب لإنشاء شعيرتين شعريتين مدببتين بقطر خارجي (OD) يبلغ ~ 1 ميكرومتر عند الطرف.
   ملاحظة: يجب أن يكون OD للشعيرات الدموية قبل السحب هو OD المحدد ليتناسب مع حامل الشعيرات الدموية في خلية مقياس الشد الدقيق. يمكن أن يختلف القطر الداخلي (ID) للشعيرات الدموية ، ولكنه سيؤثر على نصف القطر الحرج للشعيرات الدموية بعد السحب. يتم اختيار برنامج سحب بحيث يقلل المستدق الناتج في البداية من OD و ID الشعريين بسرعة ، ثم يصل إلى نصف قطر بالقرب من OD و ID الشعريين المطلوبين ، ثم يقلل من قطره ببطء أكبر. سيؤدي ذلك إلى إنشاء طول شعري أكبر يمكن تسجيله لإنتاج شعيرة دموية قابلة للاستخدام من 30-100 ميكرومتر في ID.
2. سجل طرف الشعيرات الدموية في المكان المطلوب للحصول على معرف من 30-100 ميكرومتر وقطع الطرف. سيكون للشعيرات الدموية الآن OD ومعرف نصف القطر المطلوب عند الطرف (الشكل 1A). يمكن تخزين الشعيرات الدموية حتى الخطوة 2.
   ملاحظة: يجب أن تكون الحافة المقطوعة للشعيرات الدموية عبارة عن فاصل نظيف بزاوية 90 درجة. سيؤدي أي عيب في الحافة المقطوعة إلى تثبيت سيئ للفقاعة على الشعيرات الدموية وقياسات خصائص السطح الضعيفة. نصائح الشعيرات الدموية المدببة حساسة للغاية. سيتم تدميرها إذا لامست أي شيء آخر غير المحاليل (على سبيل المثال ، جدران القارورة ، فوهة الهواء).

2. كره الماء من الشعيرات الدموية

1. جمع الشعيرات الدموية الزجاجية المسحوبة ، محلول تنظيف الحمض ، ملاقط البلاستيك ، المياه منزوعة الأيونات (DI) ، محلول كره الماء (2٪ silane في الإيثانول) ، مضخة فراغ ، ومحلول الإيثانول. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل.
   تنبيه: محلول التنظيف الحمضي سام للغاية ، ويسبب تآكل / تهيج الجلد والعين ، ويتأكسد. محلول كره الماء هو مهيج للجلد / العين / الجهاز التنفسي. ارتد واقيا للعين ومعاطف المختبر والقفازات واعمل مع الحلول في غطاء الدخان.
2. حمض تنظيف الشعيرات الدموية
   ملاحظة: التنظيف الحمضي للشعيرات الدموية يزيل أي بقايا عضوية داخل الشعيرات الدموية ويعد السطح الزجاجي لتفاعل السيلانات الذي يجعل الشعيرات الدموية الكارهة للماء.
   1. أمسك بشعيرات شعرية بقوة بالقرب من نهايتها الواسعة باستخدام الملقط.
   2. اغمس الطرف المدبب في محلول التنظيف الحمضي أثناء توصيل الخرطوم من مضخة التفريغ إلى الطرف العريض من الشعيرات الدموية. هذا سوف يمتص الحل في الشعيرات الدموية.
      ملاحظة: يمكن توصيل طرف ماصة بنهاية خرطوم الشعيرات الدموية للسماح بملاءمة أفضل مع الطرف الشعري.
   3. توقف عندما يملأ محلول التنظيف الحمضي حوالي نصف الشعيرات الدموية.
      ملاحظة: بعد إزالة الطرف الشعري من محلول التنظيف الحمضي ، غالبا ما يشكل المحلول الموجود على السطح الخارجي للشعيرات الدموية خرزة بالقرب من الطرف الشعري. المس الشعيرات الدموية بلطف على عنق قارورة المحلول لإزالة المحلول الزائد.
   4. اسمح لمحلول التنظيف الحمضي بالبقاء في الشعيرات الدموية لمدة 30 دقيقة على الأقل ، مما يضمن بقاء قابس السائل في الطرف المدبب من الشعيرات الدموية.
   5. قم بإزالة محلول التنظيف الحمضي من الشعيرات الدموية عن طريق تثبيت الشعيرات الدموية بإحكام باستخدام الملقط واستخدام خرطوم التفريغ لسحب السائل من الطرف الكبير من الشعيرات الدموية.
3. شطف الشعيرات الدموية
   1. اغمر الطرف المدبب من الشعيرات الدموية في ماء DI لضمان غمرها بعمق كاف لتغطية أي مظهر خارجي تم غمره في محلول التنظيف الحمضي. أثناء غمر الطرف ، استخدم خرطوم التفريغ لسحب ماء DI عبر الشعيرات الدموية. قم بإزالة الشعيرات الدموية من الماء وإزالة الماء المتبقي باستخدام خرطوم التفريغ.
   2. كرر الخطوة أعلاه 4x على الأقل.
4. قم بتنفيذ الخطوة 2.3 مرة أخرى لاستبدال الإيثانول بماء DI.
5. ضع الشفط باستمرار حتى يتبخر الإيثانول تماما من داخل الشعيرات الدموية. ستصبح الشعيرات الدموية غائمة وباردة الملمس عندما يبدأ الإيثانول في التبخر ولكنه سيزول بعد 30 إلى 45 ثانية.
6. قم بتغطية الشعيرات الدموية بمحلول كره الماء
   1. اغمس لفترة وجيزة الطرف العريض من الشعيرات الدموية في السيلان ~ 2٪ في محلول الإيثانول. سيؤدي العمل الشعري إلى ارتفاع محلول الطلاء داخل الشعيرات الدموية. قم بإزالة الشعيرات الدموية من المحلول بمجرد ارتفاع قابس بحجم ~ 1 سم داخل الشعيرات الدموية.
   2. قم بتوجيه الشعيرات الدموية بحيث يواجه الطرف المدبب لأسفل ، مما يسمح لمحلول الطلاء بالسقوط مع الجاذبية نحو الطرف المدبب.
   3. اسمح لمحلول الطلاء بالبقاء في الشعيرات الدموية لمدة 3 دقائق على الأقل.
      ملاحظة: يجب ألا تكون هناك فقاعات هواء في قابس محلول الطلاء الذي يتلامس مع الجزء الداخلي من الطرف المدبب. إذا كانت هناك فقاعة هواء ، فمن المحتمل ألا يكون الجزء الداخلي الشعري قد جف بشكل كاف في الخطوة 2.5. لعلاج ذلك، كرر الخطوات 2.4-2.6 حسب الحاجة.
7. شطف الشعيرات الدموية مع الإيثانول 1x بنفس الطريقة مثل الخطوة 2.3.
8. اضبط الطلاء الكارهة للماء على الشعيرات الدموية
   1. ضع قوارير تلألؤ نظيفة وجافة في فرن فراغ على درجة حرارة 120 درجة مئوية. ضع الشعيرات الدموية المطلية في القوارير (من الناحية المثالية شعيرة شعرية واحدة لكل قارورة) مع نهايات عريضة ترتكز على قاعدة القارورة. اسمح للشعيرات الدموية بالبقاء في الفرن لمدة 6 ساعات على الأقل (يفضل بين عشية وضحاها) لتحقيق الترابط الدائم لطبقة سيلان الكارهة للماء مع الشعيرات الدموية. يمكن تخزين الشعيرات الدموية حتى الخطوة 4.

3. إعداد العينات وتخزينها

1. امزج وخزن محاليل الفاعل بالسطح والفلوروفور في قوارير نظيفة مغسولة بالأحماض لتجنب التلوث.
   ملاحظة: يجب أن تكون الدهون المتاحة تجاريا من أعلى درجات النقاء وتخزينها بين الاستخدام عند - 20 درجة مئوية. غالبا ما تتسبب الدهون القديمة أو الملوثة في صعوبة تكاثر النتائج.

4. إعداد مقياس الشد الدقيق

1. قم بتجميع خلية CPM كما هو موضح في الشكل 2.
   1. ضع الجانب الكبير من الشعيرات الدموية في الجزء العلوي من خلية CPM حتى يندفع إلى الجانب السفلي من الخلية.
   2. قم بشد قابس PEEK برفق لتأمين الشعيرات الدموية ، ثم قم بتوصيل الأنبوب من مضخة الموائع الدقيقة إلى الجانب الكبير من الشعيرات الدموية. احرص على عدم لمس الطرف الشعري المدبب.
2. (أ) عند الاقتضاء، إرفاق خراطيم تبادل الخزانات و/أو التحكم في درجة الحرارة بالمداخل والمنافذ المعنية في خلية الاجتماع التحضيري للمؤتمر (الشكل 2)؛ خلاف ذلك ، قم بتوصيل المداخل والمنافذ غير المستخدمة.
3. قم بتوصيل خلية CPM بمرحلة المجهر البؤري ، مع محاذاتها تقريبا مع هدف CFM وكاميرا CPM ومصدر ضوء CPM (الشكل 3).
4. افتح تدفق الغاز إلى مضخة الموائع الدقيقة عند ضغط التشغيل الموصى به للمضخة (150 مللي بار للمضخة الموائع الدقيقة المستخدمة هنا) وتأكد من أن التدفق إلى الشعيرات الدموية مفتوح.
5. ابدأ تشغيل الواجهة الافتراضية CPM (ملف الترميز التكميلي 1: مقياس التوتر الميكروي Interface.vi الظاهري) في وضع التحكم في الضغط مع ضبط تردد تذبذب الضغط الشعري وسعته على الصفر (الشكل 4-7). يوضح الشكل 4 لقطة شاشة للواجهة الافتراضية. بالنسبة لمياه DI ونصف قطر الشعيرات الدموية البالغ ~ 35 ميكرومتر ، يضمن ضغط ~ 20 مللي بار عدم دخول الماء إلى الشعيرات الدموية.
6. املأ خلية CPM بالماء باستخدام ماصة.
7. ركز على الطرف الشعري باستخدام كاميرا مقياس الشد الدقيق.
8. ركز على الطرف الشعري باستخدام CFM. إذا كانت هناك صعوبة في العثور على الشعيرات الدموية، فاستخدم كاميرا CPM للعثور على هدف CFM. سيساعد ذلك في تقريب المسافة بين هدف CFM والفقاعة ، وتحقيق مسافة العمل الصحيحة.
9. بعد أن تتمحور الحلقة (إسقاط القطاع الأخضر) على الفقاعة، اضبط التركيز يدويا بحيث يمكن رؤية حافة الفقاعة بوضوح (الشكل 4-3).
   ملاحظة: يمكن ضبط الموضع وزاوية البدء والنهاية ونصف القطر الداخلي والخارجي للحلقة عبر القائمة الموجودة أسفل نافذة العرض.
10. انقر فوق إعادة تعيين الفقاعة ، وتأكد من تشكيل فقاعة جديدة (سيتمكن المرء من سماع فرقعة الفقاعة القديمة ، وستكون الفقاعة الجديدة قابلة للملاحظة من نافذة عرض لوحة التحكم ؛ الشكل 4-3). إذا لم تنبثق الفقاعة، فقم بزيادة ضغط إعادة التعيين أو قم بزيادة وقت إعادة تعيين التأخير في علامة التبويب إعادة تعيين الفقاعة أسفل نافذة العرض. تحقق مما إذا كان التوتر السطحي حوالي 73 mN/m (للفقاعات المالحة أو فقاعات الماء / الهواء) (الشكل 4-9).
11. أخرج الماء عبر حقنة مباشرة إلى الخلية (الشكل 3-13) ، وأفرغه ، وأعد توصيله. العينة جاهزة للتحميل لتشغيل التجربة.

5. دراسة الامتزاز

1. املأ الخلية بالعينة المطلوبة باستخدام ماصة معقمة تحافظ على برنامج CPM في وضع التحكم في الضغط . تأكد من أن التوتر السطحي الأولي يبلغ حوالي 73 mN/m عند إنشاء واجهة فقاعة جديدة.
2. حدد نصف قطر الفقاعة المشكلة حديثا وأدخل تلك القيمة في عنصر تحكم منطقة خط الوسط (الشكل 4-7) وقم بتغيير نوع التحكم إلى عنصر تحكم المنطقة بالنقر فوق علامة التبويب التحكم في المنطقة (الشكل 4-8).
   ملاحظة: يمكن أيضا استخدام التحكم المستمر في الضغط ، ولكن هذا يؤدي إلى تغيير نصف قطر الفقاعة باستمرار مع تغير التوتر السطحي للواجهة. يمكن أن تعقد هذه المنطقة المتغيرة تحليل معدلات الامتزاز السطحي وتتسبب في ظهور الفقاعة أثناء الدراسة.
3. ابدأ تسجيل الفيديو متحد البؤرة.
4. انقر فوق إعادة تعيين الفقاعة (الشكل 4-5) ، وانقر على الفور على جمع البيانات (الشكل 4-6). سيتحول ضوء الإشارة الموجود على الزر إلى اللون الأخضر.
5. اضبط معدل تسجيل البيانات وفقا لتركيز العينة عن طريق تحريك الشريط الموضح في الشكل 4-6. بالنسبة للامتزاز الأبطأ، استخدم معدل تسجيل أبطأ. يمكن ضبط هذا في منتصف التشغيل إذا كان معدل التسجيل الأعلى مطلوبا في وقت مبكر ، ولكن يفضل وجود معدل أبطأ للدراسات الطويلة من أجل تقليل حجم الملف.
6. بعد نهاية التجربة (عندما يتم الوصول إلى هضبة التوتر السطحي النهائية) ، احفظ الملف عن طريق اختيار مسار الملف الصحيح (الشكل 4-1) والنقر فوق الزر حفظ (الشكل 4-2).
7. أوقف التسجيل واحفظه على CFM أيضا.

6. دراسة التذبذب / الاسترخاء

1. املأ الخلية بالعينة باستخدام ماصة معقمة تحافظ على برنامج CPM في وضع التحكم في الضغط . تأكد من أن التوتر السطحي يبلغ حوالي 73 mN/m عند إنشاء واجهة فقاعة جديدة.
2. انتظر حتى يتم امتصاص العينة بالكامل إلى الواجهة. يمكن إجراء ذلك مباشرة بعد دراسة الامتزاز بدلا من البدء من جديد بواجهة فقاعة جديدة.
3. قرر ما إذا كان التذبذب سيكون تذبذبا للضغط أو تذبذبا للمساحة أو تذبذبا للانحناء عن طريق تحديد علامة التبويب المناسبة (الشكل 4-8) وإدخال قيمة خط الأساس المطلوبة ونسبة التذبذب وتردد التذبذب (الشكل 4-7).
   ملاحظة: يمكن أيضا الوصول إلى تذبذبات منطقة الموجة المنشارية والمربعة والمثلثة من القائمة المنسدلة في علامة التبويب تذبذب المنطقة الأخرى .
4. ابدأ تسجيل الفيديو البؤري وانقر على جمع البيانات (الشكل 4-6) على برنامج CPM.
5. ابدأ التذبذب. تأكد من تسجيل سبع دورات على الأقل للحصول على أفضل النتائج. اختر معدل الحصول على البيانات (الشكل 4-6) لإعطاء عدد كاف من نقاط البيانات لكل دورة تذبذب.
6. إذا كانت هناك حاجة إلى سعات أو ترددات تذبذب أخرى، فقم بتغيير القيم أثناء التجربة.
7. احفظ النتائج كما في الخطوتين 5.6 و5.7.

7. دراسة تبادل المذيبات

1. املأ الخلية بالعينة باستخدام ماصة معقمة تحافظ على برنامج CPM في وضع التحكم في الضغط. تأكد من أن التوتر السطحي يبلغ حوالي 73 mN/m، عند إنشاء واجهة فقاعة جديدة.
   ملاحظة: يمكن إجراء دراسات الامتزاز و / أو التذبذب قبل دراسة تبادل المذيبات.
2. قم بتوصيل أنبوب المدخل بزجاجة محلول التبادل المطلوب (الشكل 3-11) بالمضخة التمعجية (الشكل 3-10).
3. ابدأ تسجيل الفيديو في برنامج confocal وانقر فوق جمع البيانات (الشكل 4-6) على برنامج CPM.
4. اضبط سرعة المضخة التمعجية. سيتحكم هذا في معدل تبادل السوائل ويجب اختياره بناء على متطلبات التجربة ، أي مدى السرعة التي يحتاج إليها المذيب للتبادل.
5. إذا كانت هناك حاجة إلى تبادل سوائل متعددة، فأوقف المضخة التمعجية، وقم بتوصيل المدخل بمحلول تبادل آخر.
6. بعد انتهاء التبادل (~ 20 دقيقة)، احفظ النتائج كما في الخطوتين 5.6 و5.7.

8. الامتزاز السطحي غير القابل للذوبان

ملاحظة: إذا كان الفاعل بالسطح المراد امتصاصه غير قابل للذوبان في سائل الخزان ، فيمكن استخدام هذه الطريقة لنقل طبقة أحادية من واجهة الهواء / الماء للخلية إلى سطح الفقاعة. العديد من الدهون المكونة من طبقتين غير قابلة للذوبان تقريبا في محلول ملحي ولا تمتص تلقائيا للفقاعة عند تعليقها في محلول الخزان.

1. املأ الخلية بالعينة باستخدام ماصة معقمة تحافظ على برنامج CPM في وضع التحكم في الضغط . تأكد من أن التوتر السطحي يبلغ حوالي 73 mN/m، عند إنشاء واجهة فقاعة جديدة.
2. إيداع طبقة واحدة من الفاعل بالسطح غير القابل للذوبان على واجهة الهواء والماء للخلية من محلول في محلول عضوي متطاير. باستخدام حقنة ، قم بإيداع قطرات صغيرة في الواجهة والسماح للمذيب بالتبخر تاركا الدهون وراءه كفيلم رقيق.
   تحذير: يستخدم الكلوروفورم كمذيب للفوسفاتيدات مثل الفوسفاتيديل كولين والأحماض الدهنية. عادة ما تكون محاليل الانتشار 0.01-0.02 ملغ من الدهون لكل مل من المذيب. الكلوروفورم سام بشكل حاد ، ويمكن أن يسبب تهيج الجلد والعين ، وهو مسرطن. ارتد حماية مناسبة للعين ومعطفا مختبريا وقفازات، واصنع المحلول في غطاء الدخان.
3. قلل مساحة السطح عبر التحكم في ضغط خط الوسط (الشكل 4-7) للفقاعة حتى تصبح مسطحة تقريبا. هذا يمنع الفقاعة من الظهور بعد امتصاص الفاعل بالسطح.
4. قم بإزالة سائل الخزان من الخلية عبر حقنة مباشرة إلى الخلية حتى تتحرك واجهة الهواء / الماء عبر طرف الشعيرات الدموية. في حين يمكن استخدام مضخة حقنة ، يمكن تحقيق هذه الخطوة عن طريق استخدام المحقنة يدويا.
5. زيادة ارتفاع سائل الخزان إلى مستواه الأولي.
   ملاحظة: بعد إعادة غمر الطرف ، ستكون الفقاعة أكبر بسبب الفاعل بالسطح الذي يتم امتصاصه الآن على الواجهة. ستكون الطبقة الأحادية جاهزة الآن لتجارب التذبذب أو تبادل المذيبات.

9. تنظيف

1. قم بإيقاف تشغيل CFM.
2. التغيير إلى وضع التحكم في الضغط .
3. قم بإزالة العينة من الخلية باستخدام ماصة. قم بتحميل الخلية بماء DI وارفع الضغط إلى ~ 50 مللي بار للتسبب في هروب الفقاعات باستمرار من الشعيرات الدموية وتنظيف الطرف الشعري. كرر هذه العملية 2x.
4. أغلق صمام الأمان وأوقف تشغيل CPM بالنقر فوق الزر الأحمر في الزاوية العلوية اليسرى ، وأطفئ لوحة التحكم في الضغط الخفيف والأزرق ، وأغلق مصدر الضغط.
5. إزالة الخلية من مرحلة المجهر البؤري. شطف الخلية مع الإيثانول والماء DI. قم بإزالة الأنبوب الشعري من خلية CPM.

10. تنظيف الخلية

1. تفكيك الخلية. قم بتنظيف الجدار الداخلي بفرشاة أسنان أثناء الشطف تحت ماء DI. غمر الأجزاء في الإيثانول وسونيكات لمدة ~ 30 دقيقة.
2. شطف جميع الأجزاء بالماء DI عدة مرات. جفف الأجزاء إما عن طريق نفخها بغاز النيتروجين أو تجفيفها داخل فرن فراغ.

11. تحليل التذبذب

1. قم بتشغيل التعليمات البرمجية Dilatational_Rheology_Analysis.m (ملف الترميز التكميلي 2)، واختيار الملف المطلوب المحفوظ من الواجهة الظاهرية لكل ألف ظهور. يتم تضمين عينة من البيانات في الملفات التكميلية.
2. سيظهر مخطط الضغط مقابل الوقت كما هو موضح في الشكل التكميلي 1. انقر بزر الماوس الأيمن فوق النقطة التي يبدأ فيها التذبذب وانقر بزر الماوس الأيسر مرة أخرى حيث ينتهي التذبذب. إذا كانت البيانات تحتوي على تذبذبات متعددة، كرر هذه العملية لجميع التذبذبات.
   1. عند النقر بزر الماوس الأيسر فوق جميع نقاط البداية والنهاية، انقر بزر الماوس الأيمن فوق الماوس في أي مكان. على سبيل المثال ، كما هو موضح في الشكل التكميلي 1 ، يمكن للمرء النقر بزر الماوس الأيسر عند النقاط 1 و 2 و 3 و 4 ، متبوعا بنقرة بزر الماوس الأيمن.
      ملاحظة: ستقوم التعليمة البرمجية بحساب معامل التمدد وزاوية الطور وسيتم كتابة النتائج إلى ملف .csv جديد في موقع الملف الأصلي. يمكن رؤية نتائج بيانات العينة في نتائج التعليمات البرمجية الواردة في ملف الترميز التكميلي 2. كما سيولد MATLAB العديد من التمثيلات البيانية للبيانات كما هو موضح في الشكل التكميلي 2.

ينشأ أحد المصادر الرئيسية لخطأ القياس من الشعيرات الدموية التي تحتوي على عيوب إما من عملية القطع (الشكل 5A ، B) أو عملية الطلاء (الشكل 5D). كلا النوعين من العيوب يؤدي إلى أخطاء في تحديد شكل الفقاعة وحجمها بواسطة نظام تحليل الصور البصري ، مما يؤدي إلى قيم توتر سطحي غير دقيقة. من المهم فحص كل شعيرة شعرية جديدة بعناية بعد سحبها وتغليفها تحت المجهر الضوئي قبل إدخال الشعيرات الدموية في CPM. يجب التخلص من الشعيرات الدموية المقطوعة بشكل خاطئ ، ولكن يمكن تنظيف الشعيرات الدموية المطلية بشكل سيئ بالأحماض وإعادة طلائها لتحسين تثبيت الفقاعة في نهاية الشعيرات الدموية (الخطوة 2 من البروتوكول). تعمل الشعيرات الدموية بشكل أفضل إذا كان القطع النهائي عموديا تماما على الشعيرات الدموية (الشكل 5C) ودبابيس الفقاعة مباشرة في نهاية الشعيرات الدموية (الشكل 5E). سيصبح الطلاء الكارهة للماء على الشعيرات الدموية أقل فعالية في التثبيت مع الاستخدام ، مما يتطلب إعادة تنظيف الشعيرات الدموية وإعادة طلائها.

يتم عرض البيانات التمثيلية للامتزاز السطحي مقابل الوقت في الشكل 6. لم يكن لدى التقنيات التجريبية السابقة مثل قلادة أو قطرات sessile المستخدمة لقياس الامتزاز السطحي آلية لضبط الضغط الشعري ديناميكيا لأن التغير في التوتر السطحي يؤدي إلى تغير منطقة الفقاعة أثناء الامتزاز^30,36,37. في الواقع ، بالنسبة للفقاعات والقطرات الأكبر ، يلزم إجراء تغييرات في شكل الفقاعة أو السقوط (وبالتالي مساحة السطح) لتحديد التوتر السطحي من تحليل شكل الواجهة حيث لا يتم قياس الضغط الشعري بشكل مستقل ويختلف الضغط الشعري على سطح السقوط أو الفقاعة³⁷. هذا يعقد أيضا تحليل الامتزاز لأنه عندما يمتزع الفاعل بالسطح الواجهة ، ينخفض التوتر السطحي ، ولتلبية معادلة لابلاس ، يجب زيادة مساحة سطح الفقاعة ، مما يتطلب المزيد من الفاعل بالسطح للامتزاز للوصول إلى التوازن. في CPM ، يتطلب الضغط الشعري الثابت أن نصف قطر الفقاعة الأولي يجب أن يكون ضمن نطاق صغير قبل الامتزاز السطحي لمنع الفقاعة من الخروج من الشعيرات الدموية إذا انخفض التوتر السطحي أكثر من اللازم. غالبا ما يتم نمذجة ديناميكيات الامتزاز السطحي بواسطة معادلة وارد-تورداي الكلاسيكية³¹ ، والتي تصف امتزاز جزيئات الفاعل بالسطح إلى واجهة نظيفة من المنطقة البينية الثابتة. في حين يمكن تعديل معادلة وارد-تورداي لمراعاة مساحة السطح المتغيرة، فإن هذا يقدم معلمات إضافية ويعقد التحليل بشكل كبير^38,39.

للتغلب على هذه المشكلات ، تم تطوير حلقة تغذية مرتدة قائمة على النموذج باستخدام معادلة لابلاس التي تحمل انحناء (ومساحة السطح) ثابت الفقاعة طوال عملية الامتزاز عن طريق ضبط الضغط الشعري ديناميكيا. هناك اختلافات كبيرة في معدل تغير التوتر السطحي لأن مساحة الفقاعة لا تتزايد باستمرار. التغيرات في منطقة الفقاعة أثناء الامتزاز ليست ثابتة مع مرور الوقت حيث يتغير التوتر السطحي ببطء في البداية ، ثم يتسارع بسرعة قبل التوازن. ومن المضاعفات الإضافية أن التغير الجزئي في المنطقة يعتمد على نصف قطر الفقاعة الأولي. فائدة إضافية لنصف قطر الفقاعة الثابت هي أن تصوير الواجهة يتم تبسيطه حيث يظل سطح الفقاعة ثابتا ، مما يبسط تركيز CFM. أثناء عملية الامتزاز ، حيث تمتص المواد الخافضة للتوتر السطحي الواجهة (فيديو 1) ، تزداد إشارة الفلورسنت من الواجهة. إذا شكل الفاعل بالسطح مجالات سطحية ، فيمكن ملاحظة هذه المجالات وهي تتشكل وتنمو²².

ويبين الشكل 7 التغيرات في التوتر السطحي أثناء تذبذبات المنطقة. في الإصدارات السابقة من CPM ، تم إجراء تذبذبات في الضغط الشعري للفقاعة. ومع ذلك ، فإن توليد موجة جيبية في الضغط الشعري لا يترجم مباشرة إلى موجة جيبية في مساحة السطح حيث يرتبط الاثنان عبر معادلة لابلاس. من خلال الاستفادة من حلقة التغذية المرتدة القائمة على النموذج باستخدام معادلة لابلاس، يتم إنشاء التذبذبات في المنطقة بدلا من الضغط الشعري، مما يؤدي إلى بيانات يسهل تحليلها وجمعها على نطاق أكبر من السعات. ونتيجة لذلك ، يمكن استخدام بيانات التوتر السطحي مقابل المساحة التي تم جمعها من هذه الطريقة لحساب معامل التمدد البيني لطبقة الفاعل بالسطح مباشرة: (الشكل 8) ، حيث يكون الإجهاد الكلي للنظام والإجهاد τ هو_إجهادانحرافي غير متساوي الخواص غالبا ما يكون غائبا في حلول الفاعل بالسطح البسيطة ^4,33. وبالتالي ، بالنسبة لنظام الفاعل بالسطح البسيط ، . بالنسبة للواجهات التي يمكن فيها تشكيل شبكات مرنة ، مثل البروتينات النشطة على السطح ، غالبا ما تكون هناك ضغوط إضافية ، وبالتالي يجب أخذها في الاعتبار عند تحديد معامل التوسع. يعرض الفيديو 2 فيديو CFM لحركة نطاقات LC السوداء في مصفوفة طور LE ملونة مستمرة في الطبقات الأحادية الفوسفوليبيد. يتم إعادة تنظيم نطاقات LC المميزة على الواجهة في شبكة متفرعة تغطي الواجهة عند حدوث تذبذبات على الفقاعة المنحنية^22,40. يمكن استخدام علامة التبويب تذبذبات المنطقة الأخرى لإنشاء موجات منشار ومربعة ومثلثة كما هو موضح في الشكل التكميلي 3 وتسمح علامة التبويب ضغط بضغط وتوسيع منطقة معدل ثابت.

بالنسبة لدراسات تبادل المذيبات ، يسمح أولا للفاعل بالسطح بالامتزاز إلى الواجهة ، ثم يتم تبادل سائل الخزان للسماح لنوع ثان نشط على السطح بالاتصال بهذه الواجهة. من الممكن فحص التغير في التوتر السطحي حيث يتنافس الفاعل بالسطح الثاني مع الفاعل بالسطح الأصلي في الواجهة. غالبا ما يكون معامل التمدد السطحي مسبارا أكثر حساسية لتبادل السطحي إلى جانب مورفولوجيا السطح عبر CFM. ويبين الشكل 9 التغير في التوتر السطحي، ومعامل التمدد السطحي، ومورفولوجيا السطح مع حدوث أحد هذه التبادلات للمذيبات. في حين أن تفاصيل مثل هذا التبادل يمكن أن تختلف ، فإن التغيير في أي من الخصائص الثلاث يمكن أن يشير إلى دمج المكون الثاني في الطبقة الأحادية أو حل المكون الأساسي في الجزء الأكبر. يمكن إرفاق علامة فلورسنت ثانية بالأنواع الثانوية لمراقبة تفاعلها مع الواجهة من صور CFM.

الشكل 1: العلاج الشعري . (أ) صورة توضح درجة الشعيرات الدموية. يتم تثبيت السيراميك الزجاجي في مشبك لإبقائه ثابتا. (ب) التنظيف الحمضي للشعيرات الدموية. يتم سحب محلول التنظيف الحمضي إلى الشعيرات الدموية باستخدام مضخة التفريغ. (ج) كره الماء للشعيرات الدموية. Silane حل المكونات عقد داخل الشعرية يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: بناء الخلايا. (1) حامل خلية ألومنيوم كبير ، (2) طوقا فلورو إيلاستومر (أربعة في المجموع) ، (3) شريحة زجاجية (اثنان في المجموع) ، (4) خلية PEEK ، و (5) حامل خلايا ألومنيوم صغير. عند التجميع ، يتم وضع طوقا فلوروإيلاستومر على جانبي كل شريحة زجاجية. يتم الاحتفاظ بالخلية مع مسامير ومسامير. تظهر الصورة المكبرة لخلية PEEK مواقع المنافذ المختلفة: (6) منفذ شعري ، (7) مدخل تبادل المذيبات ، (8) منفذ تبادل المذيبات ، و (9,10) مدخل ومخرج سترة التحكم في درجة الحرارة. يمكن استخدام قابس PEEK لتوصيل الأنابيب أو الشعيرات الدموية بالخلية. يمكن إغلاق المنافذ التي لا يتم استخدامها بالكامل بواسطة المقابس بدون قنوات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: مخطط CPM/CFM، وليس على نطاق واسع. (1) خلية CPM ، (2) الأنبوب الشعري مع فقاعة عند الطرف ، (3) هدف المجهر البؤري ، (4) هدف كاميرا المجهر مع مرشح ، (5) مصدر ضوء CPM ، (6) مضخة الموائع الدقيقة ، (7) صمام أمان ، (8) مدخل تبادل السوائل ، (9) مخرج تبادل السوائل ، (10) مضخة تمعجية ، (11) خزان سائل تبادل ، (12) نفايات تبادل السوائل ، (13) مباشرة إلى حقنة الخلية ، (14) مدخل ومخرج سترة التحكم في درجة الحرارة ، و (15) خزان ومضخة يتم التحكم في درجة حرارتها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: الواجهة الظاهرية CPM. (1) مسار الملف حيث سيتم حفظ البيانات ؛ (2) معلمات النظام والتعليقات والزر حفظ. يتم حفظ جميع الحقول في هذه المنطقة في ملف البيانات النهائي ؛ (3) صورة كاميرا CPM ؛ (4) الإعدادات التي تتحكم في تحليل الصورة ، وقياس الحلقة ، وإعادة تعيين الفقاعة ، وتتبع الإطارات في الثانية ؛ (5) زر إعادة تعيين الفقاعة؛ (6) زر جمع البيانات ، والتحكم في معدل تسجيل البيانات ، ومؤشرات جمع البيانات ؛ (7) عناصر التحكم لجميع قيم خط الوسط في وضع التشغيل ، وسعة التذبذب ، وتردد التذبذب ؛ (8) تبديل وضع التشغيل: يؤدي النقر فوق كل علامة تبويب إلى تغيير وضع التحكم هذا. يعرض كل وضع إشارة الضغط التي يتم إرسالها إلى المضخة في الرسم البياني "إشارة الضغط" بالإضافة إلى بعض عناصر التحكم الإضافية ؛ (9) بيانات التوتر السطحي الحية؛ (10) بيانات الضغط الحي؛ (11) نصف قطر حي لبيانات الانحناء؛ (12) بيانات المساحة السطحية الحية؛ و (13) التوتر السطحي الحي وبيانات مساحة السطح ، والتي يمكن استخدامها لتحديد زاوية الطور تقريبا أثناء دراسة التذبذب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: العيوب الشعرية . (أ) و (ب) الشعيرات الدموية المقطوعة. (ج) قطع الشعيرات الدموية بشكل صحيح ، (د) الشعيرات الدموية مع تثبيت سيئ بسبب الطلاء الضعيف أو المتدهور ، و (ه) الشعيرات الدموية المثبتة بشكل صحيح. تشير الأسهم الحمراء في D و E إلى مكان تثبيت الفقاعات. للحصول على أفضل النتائج ، ستقوم الفقاعة بتثبيت الطرف الشعري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: نتائج مقياس الشد الدقيق لدراسة الامتزاز لكل من الضغط الثابت (البرتقالي) والمساحة الثابتة (الأزرق). تزداد مساحة سطح الفقاعة لامتزاز المنطقة الثابتة بشكل كبير طوال الدراسة وتتسبب في أن يستغرق الامتزاز وقتا أطول للوصول إلى نفس التوتر السطحي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: تذبذب التحكم النموذجي في مساحة السطح. (أ) الضغط، (ب) الانحناء، و (ج) بيانات مساحة السطح. بيانات مساحة السطح هي جيبية في حين أن بيانات الضغط والانحناء ليست كذلك ، كما يتضح من قيم خط الوسط التي لا تكون عند نقطة منتصف التذبذب. العلاقة الرياضية بين القيم الثلاث تعني أن واحدة فقط يمكن أن تكون جيبية حقيقية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8: عينة النتائج الريولوجية بعد التحليل. معامل التمدد ل Lyso PC (1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine) كدالة للتردد لزيادة تركيزات Lyso PC لفقاعات نصف قطرها ~ 45 ميكرومتر. التركيزات >0.1 mM من Lyso PC التي تصاحب الالتهاب تقلل من معامل التمدد على مدى نطاق معدلات التهوية / التنفس الطبيعية (الأصفر) لجعل 2ε−γ < 0 ، وهي قيمة التقاطع لتحفيز عدم استقرار لابلاس (الخط الأحمر المنقط). تركيزات منخفضة من Lyso PC ≤0.01 mM ، والتي قد تحدث في الرئتين الطبيعيتين لا تحفز عدم الاستقرار. عند الترددات >10 rad / sec ، تكون جميع تركيزات Lyso PC أعلى من التقاطع ، ولن تكون عرضة لعدم استقرار Laplace. الخطوط الحمراء الصلبة هي تناسب النظرية مع البيانات. () الشكل مستنسخ من المرجع⁹. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 9: نتائج CFM و CPM لدراسة تبادل المذيبات للفاعل بالسطح الرئوي المتبادل مع ماء DI ثم Lyso PC . (A) يوضح كيف يتغير التوتر السطحي ومعامل التمدد السطحي طوال الدراسة. يتم فصل الرسم البياني إلى أربع مناطق: عندما يتم امتصاص الفاعل بالسطح الرئوي إلى الواجهة (الأزرق) ، وعندما يتم تبادل LS مع ماء DI (أخضر) ، وعندما يتم تحويل حل التبادل إلى حل Lyso PC (أحمر) ، وعندما تمتلئ الخلية بمحلول Lyso PC (برتقالي). يمكن رؤية الخصائص تتغير في جميع أنحاء البورصات المختلفة مما يشير إلى أن الواجهة تتغير. (B) يعرض صورة متحدة البؤرة للفاعل بالسطح الرئوي الممتز للواجهة قبل التبادل و (C) يظهر نفس السطح بعد اكتمال التبادل مع حل Lyso PC. في كلتا الحالتين ، تشير الدائرة البيضاء المتقطعة إلى الحافة الداخلية للشعيرات الدموية. يتغير هيكل المجالات على الطبقة الأحادية بشكل كبير بعد تبادل المذيبات ، مما يؤكد نتائج CPM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الفيديو 1: فيديو متحد البؤرة لدراسة الامتزاز بالضغط المستمر للفاعل بالسطح في الرئة. يظهر اللون الخاطئ المسافة في اتجاه z مع شريط الألوان على الجانب الأيسر من الفيديو ، مع إشارة أرجوانية إلى الفقاعة بالقرب من الشعيرات الدموية والأخضر هو الجزء العلوي من الفقاعة. يتم إضاءة الواجهة في البداية بشكل خافت حيث يتم امتصاص القليل فقط من الفاعل بالسطح الفلورسنت. مع تزايد الممتزات السطحية ، تبدأ الفقاعة في النمو مع تحول اللون أكثر إلى اللون الأخضر وتصبح الواجهة مملوءة بنطاقات LC سوداء يمكنها التحرك عبر الواجهة. يمكن رؤية مجاميع الفاعل بالسطح في المحلول عائمة في المحلول كأشكال غير متبلورة مشرقة ويستقر العديد منها على واجهة الفقاعة ، وتتفكك وتودع الفاعل بالسطح على الواجهة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الفيديو 2: فيديو بؤري لدراسة التذبذب للفاعل بالسطح الرئوي . يعرض اللون الزائف المسافة في اتجاه z مع شريط الألوان على الجانب الأيسر من الفيديو. يتعرض السطح لعدة ترددات تذبذب مختلفة ويمكن رؤية نطاقات LC المظلمة على الواجهة تتغير في جميع أنحاء التذبذبات. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الشكل التكميلي 1: مثال على خطوة وسيطة في الشفرة لتحديد الريولوجيا التوسعية. عند ظهور هذه الشاشة، يجب على المستخدم النقر بزر الماوس الأيسر على الحافة اليسرى من التذبذب لتحليلها، ثم النقر بزر الماوس الأيسر فوق الحافة الموجودة في أقصى اليمين. يمكن تحليل التذبذبات المتعددة بحيث يمكن للمستخدم النقر بزر الماوس الأيسر فوق 1 و 2 و 3 و 4 ، ثم النقر بزر الماوس الأيمن لتحليل هذين التذبذبين. التذبذبات المعروضة هي ذات سعات وترددات مختلفة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: مثال على النتائج الرسومية التي تنتجها شفرة الريولوجيا التوسعية. يوضح هذا تناسب الجيوب الأنفية مع التذبذبات في الضغط ونصف القطر ومساحة السطح والتوتر السطحي بالإضافة إلى تحويل فورييه لكل تذبذب. من الناحية المثالية ، يجب أن يكون التوافقي الثاني في تحويل فورييه أقل من 10٪ من التوافقي الأول لمساحة السطح والتوتر السطحي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: أوضاع التشغيل البديلة. (أ) موجة جيبية، (ب) موجة منشار، (ج) موجة مربعة، (د) موجة مثلثة، (ه) تمدد معدل ثابت، و (و) ضغط معدل ثابت. تسمح أوضاع الضغط والتوسع بإنشاء متساوي الحرارة من نوع Langmuir للخافضات للتوتر السطحي غير القابلة للذوبان. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

ملف الترميز التكميلي 1: مقياس التمدد الدقيق الظاهري Interface.vi. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

ملف الترميز التكميلي 2: Dilatational_Rheology_Analysis يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

يعد CPM / CFM مجتمعين أداة قوية لفحص الديناميكيات البينية والتوازنات والمورفولوجيا. يصف هذا البروتوكول الخطوات اللازمة للحصول على البيانات باستخدام CPM/CFM.

يوضح الشكل 2 تصميم الخلية مع قنوات للشفرات الدموية والمذيبات والتبادل الحراري المشار إليها. يجب أن يكون مدخل تبادل المذيبات في أسفل الخلية بينما يجب أن يكون المخرج في الأعلى ، مما يسمح للخلية بعدم تجاوز الخلية أثناء التبادل. في الممارسة العملية ، قد تكون معدلات تدفق المدخل والمخرج مختلفة قليلا لنفس المضخة التمعجية. إحدى المشكلات الشائعة في تصميم الخلية هذه هي التسرب من الخلية. غالبا ما يحدث هذا بسبب ضعف الاتصال بين الخلية وأحد الوصلات ، ولكن إذا كانت جميع الوصلات جافة ولا تتسرب ، فقد يكون هذا بسبب حدوث صدع في الشريحة الزجاجية للخلية بسبب الإفراط في تشديد البراغي المحيطة بالخلية.

ويبين الشكل 3 الصلات بين مختلف المضخات والخلية، فضلا عن محاذاة الخلية مع أهداف CFM وCPM. تستخدم كاميرا CPM (4) لتصوير شكل الفقاعة أثناء التشغيل. يجب أن تكون كاميرا CPM مجهزة بمرشح بصري يمنع ضوء الليزر المثير CFM من دخول كاميرا CPM. خلاف ذلك ، يجعل ليزر CFM الصور الموجودة في كاميرا CPM صاخبة للغاية ويصعب ملاءمتها باستخدام تحليل الصور. يربط صمام الأمان بين الشعيرات الدموية والمضخة الموائع الدقيقة (7) ويسمح بإجراء تغييرات على المضخة ومصدر ضغط الهواء ، دون التعرض لخطر التدفق العكسي من الخلية التي تصل إلى المضخة. يوفر الصمام الثاني (13) إمكانية الوصول إلى حقنة للسماح بالحقن المباشر للسوائل داخل وخارج الخزان. قد يلزم إضافة السائل إلى الخزان في حالة حدوث تسرب وقد يلزم إزالته للخطوة 8 من البروتوكول (الامتزاز السطحي غير القابل للذوبان) أو لإزالة الفقاعات التي تم تطهيرها من الشعيرات الدموية إذا كانت مرتبطة بالهدف البؤري.

خلال كل تجربة، يجب تنفيذ عدة خطوات رئيسية بعناية. معظم المشاكل التي تحدث بمجرد تشغيل الأداة ، تنطوي على الشعيرات الدموية نفسها. على هذا النحو ، يمكن أن يقلل القطع والطلاء الدقيق من الصعوبات. قطع الشعيرات الدموية إلى القطر المطلوب هو عملية صعبة ومنخفضة الغلة. أي رقاقة أو تفاوت في طرف الشعيرات الدموية سيؤدي إلى قراءات ضعيفة لنصف قطر الفقاعة. بالإضافة إلى ذلك ، إذا لم يتم تطبيق الطلاء الكارهة للماء بشكل صحيح ، أو إذا تحلل بمرور الوقت والاستخدام ، فلن يتم تثبيت الفقاعة بشكل صحيح عند طرف الشعيرات الدموية. يمكن الإشارة إلى ذلك من خلال الفقاعة التي تبدو مثبتة داخل الشعيرات الدموية أو تنزلق على طول الجزء الداخلي من الشعيرات الدموية أثناء دراسة تذبذبية. يمكن إعادة الشعيرات الدموية التي يتم قطعها جيدا ولكن لا يتم تثبيتها بشكل صحيح ومعالجتها برهاب الماء.

خطوة رئيسية أخرى ومصدر محتمل للخطأ هو تنظيف خزان الخلية والأنابيب والشعيرات الدموية بين مواد مختلفة أو تركيزات مختلفة من نفس المادة. هناك العديد من الشقوق الصغيرة في الخزان ويمكن للفاعل بالسطح أن يمتص ويغير القياسات المأخوذة في أوقات لاحقة إذا لم يتم تنظيفه بشكل صحيح. غالبا ما يكون التفكيك الكامل للخلية ونقعها مطلوبا لضمان إزالة أي مواد زائدة نشطة على السطح. من الأفضل البدء باستخدام أدنى تركيز إذا كان من المقرر دراسة سلسلة من تركيزات نفس الفاعل بالسطح.

في بعض الأحيان ، قد يكون من الصعب اصطفاف الأنبوب الشعري مع الهدف البؤري. يمكن استخدام كاميرا مقياس الشد الدقيق للمساعدة في محاذاة الهدف البؤري ، ولكن بالنسبة لمسافة عمل كبيرة لهدف CFM ، قد لا يكون ذلك مفيدا. إذا كان المجهر البؤري مركزا خارج طرف الشعيرات الدموية ، فيمكن أيضا استخدام المقطع العرضي الشعري ، وهي منطقة خالية من أي مادة فلورية ، للمساعدة في توجيه الهدف. إذا لم تخرج الفقاعة الشعرية ، فقد تكون هناك مشكلة في الضغط الذي يتم توفيره للشعيرات الدموية (والتي من المفترض أن تكون 150 مللي بار تحت التشغيل العادي). يمكن التحقق من ذلك عن طريق الدخول في وضع التحكم في الضغط وضبط الضغط على قيمة عالية. إذا لم يصل الضغط إلى الضغط المحدد ، فمن المحتمل أن يكون هناك تسرب في الأنابيب من مضخة الموائع الدقيقة أو أن المضخة لا تتلقى ضغط غاز كاف. كما هو الحال مع العديد من الدراسات التي تنطوي على علوم السطح ، من المهم التأكد من عدم إدخال أي مواد ملوثة إلى المحاليل في أي وقت. إذا لم تكن القراءات كما هو متوقع (يبدأ التوتر السطحي منخفضا جدا أو يتناقص بسرعة كبيرة) ، فإن إجراء عينة جديدة ، أو استخدام عينة مدروسة جيدا أو سائل نقي هو أيضا خطوة مبكرة جيدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

يمكن إجراء العديد من التعديلات على الجهاز لتحقيق أهداف تجريبية أخرى. يمكن إضافة الزيت أو الماء إلى الشعيرات الدموية مما يسمح بدراسة واجهات الزيت والماء بدلا من واجهات الهواء والماء³⁹. هذا يزيد من خطر التدفق العكسي إلى المضخة لذلك يجب توخي الحذر ، وربما يكون من الضروري إضافة مصيدة زيت إلى الأنابيب بين المضخة والشعيرات الدموية.

هناك العديد من القيود على CPM / CFM. يحتوي CPM على نطاق عمل محدود من حجم الشعيرات الدموية ، 20-300 ميكرومتر ل OD الشعري للمضخة والبصريات في النظام. في حين أنه من الممكن إضافة خافض للتوتر السطحي غير القابل للذوبان إلى الواجهة باستخدام تبادل المذيبات⁴¹ أو الطريقة الموضحة هنا ، لا يمكن استنتاج تركيز السطح إلا من خلال القيام بالتوتر السطحي مقابل متساوي الحرارة في المنطقة ومقارنته بتلك التي تم الحصول عليها من حوض Langmuir. يمكن ل CFM اكتشاف المواد الفلورية فقط ، لذلك لا يمكن تصور أي مواد غير فلورية أو غير موسومة بالفلورسنت. العديد من المواد الخافضة للتوتر السطحي هي جزيئات صغيرة ، ويمكن أن يؤدي وضع علامات عليها إلى تغيير خصائصها ، على الرغم من أن هذا يجب أن يكون أقل مشكلة بالنسبة للجزيئات الأكبر النشطة على السطح مثل البروتينات أو البوليمرات^26,27.

تتميز هذه الطريقة بالعديد من المزايا الرئيسية مقارنة بتحليلات CPM و CFM السابقة للواجهات المحملة بالفاعل بالسطح. الأهم من ذلك هو أن الأداة الهجينة تسمح بتصور الواجهة بينما يتم قياس خصائص السطح الديناميكية والمتوازنة المختلفة. يمكن ربط التغييرات في مورفولوجيا الواجهة مباشرة بالديناميكيات البينية والخصائص الريولوجية. تم إجراء CFM السابق للواجهات المحملة بالسطحي باستخدام حوض Langmuir مسطح 16,20,28,29,42,43,44,45,46,47 ، في حين يمكن تنفيذ الطريقة الموضحة هنا على واجهات منحنية للغاية ²² . بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تصوير الواجهة بأكملها في وقت واحد ، مما يدل على تغيير قابل للتتبع في الوقت الفعلي لنطاقات محددة بينما أدت التدفقات السطحية على حوض Langmuir إلى تدفق المجالات داخل وخارج النافذة المرئية البؤرية. كما أن الانضغاطات السطحية على هذا الجهاز متساوية الخواص ، في حين أن الحواجز الموجودة على أحواض Langmuir لها اتجاهات ضغط خاصة. يسمح CPM بتذبذبات منطقة أسرع بكثير مما هو ممكن في حوض Langmuir.

الانحناء الجديد والتحكم القائم على المنطقة في هذه الدراسة له مزايا كبيرة على الإصدارات السابقة من CPM³⁰. عادة ، يتم التحكم في حجم الفقاعة عن طريق تعيين ضغط شعري ثابت. بالنسبة لقياسات المعدلات التوسعية ، كان الضغط الشعري متذبذبا. عندما يتم الاحتفاظ بالضغط الشعري ثابتا ، حيث يمتص الفاعل بالسطح الواجهة ، ينخفض التوتر السطحي للفقاعة. لتلبية معادلة لابلاس ، ΔP = 2γ / R ، يجب أن ينخفض نصف قطر الانحناء مع انخفاض التوتر السطحي. بالنسبة للفقاعة نصف الكروية في CPM ، فإن تقليل نصف قطر الفقاعة من الانحناء يزيد من مساحة الفقاعة ^9,48:

حيث R _cهو نصف قطر الشعيرات الدموية و R هو نصف قطر الفقاعة من الانحناء. يغير نصف قطر الفقاعة المتغير مساحة الواجهة أثناء الامتزاز ، مما يعقد تحليل الامتزاز باستخدام معادلات Ward-Tordai^10,38 بالإضافة إلى ذلك ، إذا تم خفض التوتر السطحي للفقاعة بما فيه الكفاية ، فسيصبح نصف قطر الفقاعة أصغر من نصف قطر الشعيرات الدموية وسيتم طرد الفقاعة. تحافظ حلقة التغذية المرتدة في CPM / CFM الأحدث على منطقة الفقاعة ثابتة طوال فترة الامتزاز ، مما يعني أنه يمكن استخدام معادلة Ward-Tordai الأصلية ، وليس هناك خطر من طرد الفقاعة ، ويحدث الامتزاز بسرعة أكبر لأن السطح لا يزداد في المنطقة. بالنسبة للدراسات المتذبذبة ، فإن إنتاج موجة جيبية في الضغط لا ينتج موجة جيبية في مساحة السطح⁴⁸. اعتمدت طرق CPM السابقة على إبقاء التذبذبات صغيرة من أجل تغيير المساحة الناجم عن التذبذب المدفوع بالضغط لتقريب موجة جيبية⁴⁸. تتحكم الطريقة الموصوفة مباشرة في منطقة الفقاعة ويمكن استخدامها لإنشاء تذبذبات موجة جيبية حقيقية في المنطقة البينية. من الممكن ربط الإجهاد مباشرة (التغير في التوتر السطحي) بالإجهاد البيني (التغير في مساحة السطح) لحساب معامل التوسع.

للمساعدة في تنفيذ هذا البروتوكول ، يتم وصف موجز للرمز الذي يتحكم في مقياس التوتر الدقيق هنا. يتكون الرمز من ثلاثة أجزاء في حلقة: واحد يصدر أوامر إلى مضخة الموائع الدقيقة ، واحد يتحكم في آلية إعادة تعيين الفقاعة ، وواحد يقيس نصف قطر الفقاعة ويحفظ القيم المحسوبة. تحتوي وحدة التحكم في المضخة على ثلاثة أوضاع تشغيل رئيسية: التحكم في الضغط ، والتحكم في الانحناء ، والتحكم في المنطقة. في التحكم في الضغط ، يقوم المستخدم مباشرة بإدخال نقطة محددة للضغط الناتج عن المضخة. هذا الوضع مهم لأنه لا يتطلب حلقة تغذية راجعة ، وبالتالي فهو الأكثر استقرارا بين الأوضاع. يستخدم التحكم في الانحناء الضغط السطحي الذي تم قياسه مسبقا ومعادلة لابلاس لحساب الضغط المطلوب لإنشاء واجهة لانحناء معين. يعتمد وضع التحكم في مساحة السطح على ذلك من خلال حساب الانحناء المطلوب لإنشاء مساحة سطح معينة بناء على هندسة الغطاء الكروي ، والذي يتطلب أيضا قياسا دقيقا لنصف قطر الشعيرات الدموية. هذان الوضعان مفيدان بشكل خاص لدراسات الامتزاز والتذبذب ولكنهما يتطلبان تدفقا ثابتا من بيانات الضغط السطحي المتسقة. على هذا النحو ، قد تحتاج التغذية في هاتين الوحدتين إلى تنعيم من البيانات الخام للحصول على وظيفة أفضل. عندما لا يكون الحل واضحا بما فيه الكفاية ، غالبا بسبب عينة عكرة للغاية ، لن يعمل هذا الوضع بشكل صحيح لأن الحصول على صورة جيدة لواجهة الفقاعة غير ممكن. يتم تضمين عناصر التحكم الخاصة بالتذبذب أيضا في هذا القسم من التعليمات البرمجية. يسمح الجزء الأوسط من الشفرة بمسح الفقاعة من الشعيرات الدموية. هنا ، يتم تعيين الضغط المحدد للشعيرات الدموية على قيمة عالية ويتم الاحتفاظ به هناك لفترة زمنية محددة مما يسمح للفقاعة بالفرقعة وإنشاء واجهة جديدة. يستخدم القسم الأخير من الشفرة برنامج اكتساب الرؤية لتتبع حافة الفقاعة وقياس نصف قطرها. ثم يستخدم نصف القطر هذا مع معادلة لابلاس لحساب التوتر السطحي، الذي يتم تغذيته بعد ذلك إلى الجزء الأولي من الحلقة.

أثبتت تقنية CPM / CFM الهجينة هذه أنها مفيدة للغاية لدراساتنا حول النماذج والمواد الخافضة للتوتر السطحي الرئوية السريرية في واجهات الهواء والماء. أبعاد الفقاعة تقارب تلك الموجودة في الحويصلات الهوائية في الرئة البشرية ويمكن ملاحظة آثار الانحناء بين الوجوه على مورفولوجيا وديناميات الطبقات الأحادية السطحية الرئوية⁹،^10،22. وستكون الأداة الهجينة مهمة أيضا لدراسات المواد الأخرى النشطة على السطح الموجودة في كل مكان مع تطبيقات تتراوح من البتروكيماويات إلى المواد الكيميائية المنزلية ، من الأفلام المسيلة للدموع إلى تثبيت الأجسام المضادة. يسمح لنا CPM / CFM المشترك بالتحقيق في الخصائص البينية الديناميكية على نطاق المجالات المنفصلة عن الطور وتصور المورفولوجيات على السطح مع تغير الظروف الخارجية. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص في التطبيقات التي تتطلب فيها المواد باهظة الثمن استخدام عينات صغيرة الحجم. يكاد يكون من المستحيل المراقبة المتزامنة للديناميكيات البينية والمورفولوجيا أحادية الطبقة مع أي تقنية أخرى ، مما يجعلها قابلة للتطبيق على نطاق واسع في مجال العلوم البينية.

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

تم الحصول على جميع صور المجهر البؤري باستخدام المجهر البؤري المستقيم A1RHD من نيكون. نحن نعترف بتوجيه ومساعدة موظفي الدعم ، وخاصة غييرمو ماركيز ، في مركز التصوير الجامعي في جامعة مينيسوتا. تم دعم هذا العمل من قبل NIH Grant HL51177. تم دعم SI من قبل منحة تدريب البحوث المؤسسية من Ruth L. Kirschstein NRSA F32 HL151128.