用于动态界面共聚焦显微镜可视化的微量天体测量仪

本手稿描述了微量血压计/共聚焦显微镜的设计和操作，以便在可视化界面形态的同时测量界面张力和表面膨胀流变学。这提供了在技术和生理学中重要的界面的结构 - 属性关系的实时构建。

表面活性分子对流体 - 流体界面的吸附在自然界中无处不在。表征这些界面需要测量表面活性剂吸附速率，评估平衡表面张力作为块体表面活性剂浓度的函数，并关联表面张力如何随平衡后界面面积的变化而变化。使用荧光成像和高速共聚焦显微镜同时对界面进行可视化，可以直接评估结构 - 功能关系。在毛细管压力微量计（CPM）中，将半球形气泡固定在毛细管末端的1 mL液体储液器中。通过商业微流体流量控制器控制穿过气泡界面的毛细管压力，该控制器允许基于模型的压力、气泡曲率或基于拉普拉斯方程的气泡面积控制。与以往的Langmuir槽和吊坠落技术相比，测量和控制精度和响应时间大大提高;毛细管压力变化可以在几毫秒内应用和控制。气泡界面的动态响应通过第二个光学透镜可视化，因为气泡膨胀和收缩。气泡轮廓拟合到圆形轮廓，以确定气泡曲率半径 R，以及任何会使结果无效的圆度偏差。拉普拉斯方程用于确定界面的动态表面张力。平衡后，计算机控制的微流体泵可以施加小的压力振荡来振荡气泡半径（频率为0.001-100个周期/分钟），以确定膨胀模量系统的整体尺寸足够小，以至于微秒计适合高速共聚焦显微镜的透镜下，允许以亚微米横向分辨率定量跟踪荧光标记的化学物质。

表面活性剂薄膜覆盖的空气-水界面在日常生活中无处不在。表面活性剂-水注入用于提高枯竭油田的采收率，并用作页岩气和石油的水力压裂解决方案。气液泡沫和液液乳液在许多工业和科学过程中作为润滑剂和清洁剂很常见，在食品中很常见。界面处的表面活性剂和蛋白质在包装、储存和给药过程中稳定抗体构象^{1，2，3，4，5}，眼睛中的泪膜稳定性^6，7，8 和肺力学^{9，10，11，12，13，14，15}.

表面活性剂或表面活性剂吸附到界面及其性质的研究有着悠久的历史，具有许多不同的实验技术^{16，17，18，19，}20^{，21，22，23，24，25，26，27}.最近的发展是毛细管压力微量血压计（CPM），它允许在更小的长度尺度上检查高度弯曲界面上的界面性质，同时使用的材料明显少于其他常用方法^{9，23，24，25}。共聚焦荧光显微镜（CFM）可用于研究CPM 22中气水界面或Langmuir槽^{20，26，27，28，29}处脂质和蛋白质的形态。在这里，CPM和CFM相结合，将形态现象与动态和平衡界面性质联系起来，以发展生物和技术界面的结构 - 功能关系。

在界面表面活性剂系统中有许多重要的参数可供CPM-CFM使用。在CPM中，将直径为30-200μm的气泡固定在玻璃毛细管的尖端。在CPM的早期版本中，气泡内部和外部之间的毛细管压差 通过 水柱和振荡注射泵^9，30 控制;这里描述的新版本用更高精度的计算机控制微流体泵取代了这些。表面张力（γ） 通过 拉普拉斯方程ΔP = 2γ / R确定，该方程由泵ΔP设置的界面上的压降和对气泡曲率半径R的光学分析确定。在与含有可溶性表面活性剂的散装液体接触时产生新气泡后，界面的动态表面张力可以用10 ms的时间分辨率确定。表面活性剂的吸附动力学可以用经典的Ward-Tordai方程^10，31 来描述，以确定表面活性剂的基本性质，包括扩散率，表面覆盖率以及体积浓度与平衡表面张力之间的关系。一旦达到平衡的表面张力，界面面积就可以振荡以测量膨胀模量， 通过记录表面张力的变化，由气泡表面积的微小变化引起， A³²。对于发展自己的内部结构（如缠结聚合物或蛋白质）的更复杂的界面，表面张力被更一般的表面应力^4，33， 所取代。

呼吸期间的肺稳定性可直接与在肺泡气液界面^9，10处保持低表面张力和高扩张模量直接相关。所有肺内表面都衬有连续的，微米厚的上皮衬里液膜，以维持组织水合作用³⁴。这种上皮衬里液主要是水，含有盐和各种其他蛋白质，酶，糖和肺表面活性剂。与任何弯曲的液蒸气界面一样，毛细管压力随着肺泡（或气泡）内部压力的升高而诱导。然而，如果肺内各处的表面张力恒定，拉普拉斯方程ΔP = 2γ / R表明，较小的肺泡相对于较大的肺泡具有更高的内部压力，迫使较小肺泡的气体含量流向较大，压力较低的肺泡。这被称为"拉普拉斯不稳定性"^9，35。最终结果是，最小的肺泡会塌陷并充满液体，变得难以再充气，导致部分肺塌陷，其他部分会过度充气，这两者都是急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的典型症状。然而，在功能正常的肺中，随着肺泡界面区域的空气 - 上皮流体界面在呼吸过程中扩张和收缩，表面张力动态变化。如果 ，或 ，拉普拉斯压力随着半径的减小而减小，并随着半径的增加而增加，以消除拉普拉斯的不稳定性，从而稳定肺⁹。因此， 以及它如何依赖于频率、单层形态和组成，以及肺泡液组成可能对肺的稳定性至关重要。CPM-CFM还首次证明了界面曲率对表面活性剂吸附²⁵、单层形貌²² 和膨胀模量⁹的影响。CPM中储液槽体积小（~1 mL）允许快速引入，去除或交换液相，并最大限度地减少所需数量的昂贵蛋白质或表面活性剂¹⁰。

CPM-CFM图像中的对比度是由于在界面^16，27处分布的荧光标记的脂质或蛋白质的一小部分。二维表面活性剂单层通常表现出横向相分离作为表面张力或表面压力的函数， π是清洁的流体 - 流体界面γ₀和表面活性剂覆盖的界面的表面张力之间的差异，π γ。在低表面压力下，脂质单层处于液体状无组织状态;这被称为液体膨胀（LE）相。随着表面压力的增加和每个脂质分子的面积减小，脂质彼此定向并且可以经历一阶相变，以长程有序液体凝结（LC）相^16，20，27。LE和LC相可以在各种表面压力下共存，并且可以可视化，因为荧光标记的脂质从LC相中排除并分离到LE相。因此，当使用CFM¹⁶成像时，LE相位是明亮的，LC相位是暗的。

本手稿的目的是描述构建和操作组合共聚焦显微镜微量血压计所需的步骤。这将允许读者在微米级的空气/水或油/水界面上同时进行吸附研究，测量表面张力，流变行为并检查界面形态。这包括讨论如何拉动、切割和疏水所需的毛细血管，使用压力、曲率和表面积控制模式的说明，以及将不溶性表面活性剂的界面转移到微量血压计曲面界面。

1. 毛细管的制备

1. 将毛细管放入毛细管拉拔器中，并运行所需的拉拔程序，以制造两个锥形毛细管，其尖端的外径（OD）约为1μm。
   注意:拉动前毛细管的外径必须是指定适合微型血压计单元中毛细管支架的外径。毛细管的内径（ID）可以变化，但会影响拉动后毛细管的临界半径。选择拉拔程序，以便所得的锥度最初迅速减小毛细管OD和ID，然后达到所需毛细管OD和ID附近的半径，然后更慢地减小直径。这将产生更大的毛细管长度，可以对其进行评分以产生ID为30-100μm的可用毛细管。
2. 在所需位置对毛细管的尖端进行评分，以获得30-100μm的ID并折断尖端。毛细管现在将在尖端具有所需半径的OD和ID（图1A）。毛细血管可以储存到步骤2。
   注:毛细管的切割边缘必须为 90° 干净。切割边缘的任何缺陷都会导致气泡与毛细管的固定不良，并且表面性能测量较差。锥形毛细管尖端非常细腻。如果它们与溶液以外的任何东西（例如，小瓶壁，空气喷嘴）接触，它们将被破坏。

2. 毛细管的疏水

1. 收集拉出的玻璃毛细管，酸清洗液，塑料镊子，去离子（DI）水，疏水溶液（乙醇中2%硅烷），真空泵和乙醇溶液。有关详细信息 ，请参阅材料表 。
   注意:酸性清洁液具有剧毒，会引起皮肤和眼睛腐蚀/刺激，会氧化。疏水溶液是皮肤/眼睛/呼吸道刺激物。戴上护目镜、实验室外套和手套，并在通风橱中使用溶液。
2. 对毛细管进行酸洗
   注意:对毛细管进行酸洗可去除毛细管内的任何有机残留物，并为硅烷化反应准备玻璃表面，从而使毛细管疏水。
   1. 用镊子将毛细管牢牢地抓住靠近其宽端的毛细管。
   2. 将锥形尖端浸入酸清洗液中，同时将软管从真空泵连接到毛细管的宽端。这会将溶液吸入毛细管。
      注意:移液器吸头可以连接到毛细管软管的末端，以便更好地配合毛细管末端。
   3. 当酸性清洁溶液充满毛细管的一半时停止。
      注意:从酸清洗溶液中取出毛细管尖端后，毛细管外部的溶液通常在毛细管尖端附近形成珠子。轻轻触摸毛细管到溶液小瓶的颈部以除去多余的溶液。
   4. 让酸清洁溶液在毛细管中保留至少30分钟，确保液体的塞子保持在毛细管的锥形端。
   5. 用镊子牢牢握住毛细管，并使用真空软管从毛细管的大端拉出液体，从毛细管中取出酸清洗液。
3. 冲洗毛细管
   1. 将毛细管的锥形端浸入去离子水中，确保其浸入足够深的深度以覆盖浸没在酸清洗溶液中的任何外部。当尖端被浸没时，使用真空软管将去离子水拉过毛细管。从水中取出毛细管，并用真空软管除去剩余的水。
   2. 重复上述步骤至少4x。
4. 再次执行步骤2.3，用乙醇代替去离子水。
5. 连续抽吸，直到乙醇从毛细管内部完全蒸发。当乙醇开始蒸发时，毛细管会变得浑浊和凉爽，但在30至45秒后会清除。
6. 用疏水溶液涂覆毛细管
   1. 将毛细管的宽端短暂浸入乙醇溶液中〜2%硅烷中。毛细管作用将导致涂层溶液在毛细管内上升。一旦毛细管内约1厘米大小的插头上升，就从溶液中取出毛细管。
   2. 调整毛细管的方向，使锥形尖端朝下，使涂层溶液随着重力向锥形尖端下降。
   3. 让涂层溶液在毛细管中保持至少3分钟。
      注意:与锥形尖端内部接触的涂层溶液的插头中不得有气泡。如果存在气泡，则毛细管内部很可能在步骤2.5中没有充分干燥。要解决此问题，请根据需要重复步骤 2.4-2.6。
7. 以与步骤2.3相同的方式用乙醇1x冲洗毛细管。
8. 在毛细管上设置疏水涂层
   1. 将干净且干燥的闪烁小瓶放入设定为120°C的真空烘箱中。 将涂覆的毛细管放入小瓶中（理想情况下每个小瓶一个毛细管），宽端放在小瓶的底部。让毛细管在烘箱中停留至少6小时（优选过夜），以实现疏水性硅烷层与毛细管的永久结合。毛细血管可以储存到步骤4。

3. 样品制备和储存

1. 将表面活性剂和荧光团溶液混合并储存在干净的酸洗小瓶中，以避免污染。
   注意:市售脂质必须具有最高纯度，并在-20°C的使用之间储存。 旧的或受污染的脂质通常会导致结果难以重现。

4. 设置微型血压计

1. 组装 CPM 单元格， 如图 2 所示。
   1. 将毛细管的大一侧放入CPM细胞的顶部，直到它推入细胞的下侧。
   2. 轻轻拧紧PEEK塞子以固定毛细管，然后将管子从微流体泵连接到毛细管的大侧。注意不要触摸锥形毛细管尖端。
2. 如有必要，将储液罐交换和/或温度控制软管连接到CPM单元上的相应入口和出口（图2）;否则，请插入未使用的入口和出口。
3. 将CPM细胞连接到共聚焦显微镜载物台，将其与CFM物镜，CPM相机和CPM光源大致对齐（图3）。
4. 在泵的推荐工作压力（此处使用的微流体泵为150 mbar）下打开流向微流体泵的气流，并确保流向毛细管的气流是开放的。
5. 在压力控制模式下开始运行 CPM 虚拟接口（补充编码文件 1:微型血压计虚拟 Interface.vi），毛细管压力振荡频率和振幅设置为零（图 4-7）。图 4 显示了虚拟接口的屏幕截图。对于去离子水和毛细管半径为~35μm，~20 mbar的压力可确保没有水进入毛细管。
6. 使用移液管用水填充CPM细胞。
7. 使用微型血压计相机聚焦毛细管尖端。
8. 使用 CFM 将重点放在毛细管尖端上。如果难以找到毛细管，请使用CPM相机找到CFM物镜。这将有助于近似CFM物镜和气泡之间的距离，从而实现正确的工作距离。
9. 环空（绿色扇形投影）在气泡上居中后，手动调整焦点，以便可以清楚地看到气泡边缘（图4-3）。
   注:环的位置、起始和结束角度以及环的内半径和外半径可通过视图 窗口下方的 菜单进行调整。
10. 单击"重置气泡"，并确保形成一个新气泡（一个人将能够听到旧气泡的弹出，并且可以从控制面板查看窗口中观察到新气泡;图 4-3）。如果气泡不弹出，请在查看窗口下方的"气泡重置"选项卡中增加"重置压力"或增加"重置延迟时间"。检查表面张力是否在73 mN/ m左右（对于盐水或水/气泡）（图4-9）。
11. 通过直接进入细胞的注射器取出水（图3-13），将其清空，然后重新连接。该示例已准备好加载以运行实验。

5. 吸附研究

1. 使用高压灭菌的移液器将CPM软件保持在 压力控制 模式下，用所需的样品填充细胞。确保在创建新的气泡界面时，初始表面张力约为73 mN/m。
2. 确定新形成的气泡的半径并将该值输入到中心线区域控件中（图4-7），并通过单击"区域控制"选项卡将控件类型更改为区域 控制 （图4-8）。
   注意:也可以使用恒压控制，但这会导致气泡半径随着界面表面张力的变化而不断变化。这种变化的区域会使表面活性剂吸附速率的分析复杂化，并导致气泡在研究过程中破裂。
3. 开始录制共聚焦视频。
4. 单击 重置气泡 （图4-5），然后立即单击 收集数据（图4-6）。按钮上的信号灯将变为绿色。
5. 通过滑动 图4-6所示的条形，根据样品的浓度调整数据记录速率。对于较慢的吸附，请使用较慢的记录速率。如果早期需要更高的记录速率，则可以在运行过程中进行调整，但对于长时间的研究，为了减小文件大小，最好是较慢的速率。
6. 实验结束后（当达到最终的表面张力平台时），通过选择正确的文件路径（图4-1）并单击"保存"按钮（图4-2）来保存文件。
7. 停止并将记录也保存在CFM上。

6. 振荡/松弛研究

1. 使用高压灭菌的移液器将样品填充细胞，使CPM软件保持在 压力控制 模式下。确保在创建新的气泡界面时，表面张力约为73 mN/m。
2. 等到样品完全吸附到界面上。这可以在吸附研究后直接进行，而不是从新的气泡界面重新开始。
3. 通过选择适当的选项卡（图4-8）并输入所需的基线值，振荡%和振荡频率（图4-7），确定振荡是压力振荡，面积振荡还是曲率振荡。
   注:锯齿波、方波和三角波区域振荡也可从" 其他区域振荡 "选项卡的下拉菜单中访问。
4. 开始录制共聚焦视频，然后单击CPM软件上的 "收集数据"（图4-6）。
5. 开始振荡。确保记录至少七个周期以获得最佳结果。选择数据采集速率（图4-6），为每个振荡周期提供足够数量的数据点。
6. 如果需要其他振荡幅度或频率，请在实验期间更改值。
7. 保存结果，如步骤 5.6 和 5.7 所示。

7. 溶剂交换研究

1. 使用高压灭菌的移液器将样品填充细胞，使CPM软件保持在压力控制模式。当创建新的气泡界面时，确保表面张力约为73 mN/m。
   注意:吸附和/或振荡研究可以在溶剂交换研究之前进行。
2. 将带有所需交换溶液瓶的入口管（图3-11）连接到蠕动泵（图3-10）。
3. 在共聚焦软件中开始录制视频，然后单击CPM软件上的 "收集数据 "（图4-6）。
4. 设置蠕动泵速度。这将控制流体交换的速率，并且必须根据实验的要求（即需要交换溶剂的速度）进行选择。
5. 如果需要更换多种流体，请停止蠕动泵，并将入口连接到另一个交换溶液。
6. 交换完成后（约20分钟），保存步骤5.6和5.7中的结果。

8. 不溶性表面活性剂吸附

注意:如果要吸附的表面活性剂不溶于储液器液体，则可以使用此方法将单层从电池的空气/水界面转移到气泡表面。许多双层形成的脂质几乎不溶于盐水溶液，当悬浮在储液槽溶液中时不会自发地吸收到气泡中。

1. 使用高压灭菌的移液器将样品填充细胞，使CPM软件保持在 压力控制 模式下。当创建新的气泡界面时，确保表面张力约为73 mN/m。
2. 将不溶性表面活性剂的单层沉积在细胞的空气 - 水界面上，从挥发性有机溶液中的溶液中分离出来。使用注射器，在界面处沉积小液滴，并允许溶剂蒸发，留下脂质作为薄膜。
   注意:氯仿用作磷脂的溶剂，如磷脂酰胆碱和脂肪酸。铺展溶液通常为每毫升溶剂0.01-0.02mg脂质。氯仿具有急性毒性，可引起皮肤和眼睛刺激，并致癌。戴上适当的护目镜、实验室外套和手套，将溶液放入通风橱中。
3. 通过气泡的中心线压力控制（图4-7）减小表面积，直到它几乎变平。这可以防止表面活性剂吸附后气泡破裂。
4. 通过直接到细胞的注射器从细胞中取出储液器液体，直到空气/水界面经过毛细管的尖端。虽然可以使用注射泵，但此步骤可以通过手动使用注射器来实现。
5. 将储液罐液体高度增加到其初始水平。
   注意:吸头重新浸没后，由于表面活性剂现在吸附在界面上，气泡会变大。单层现在可以用于振荡或溶剂交换实验。

9. 清理

1. 关闭节能灯。
2. 更改为 "压力控制" 模式。
3. 使用移液管从细胞中取出样品。用去离子水加载传感器，并将压力调高至~50 mbar，使气泡不断逸出毛细管并清洁毛细管尖端。重复此过程 2x。
4. 通过单击左上角的红色按钮关闭安全阀并关闭CPM，关闭浅色和蓝色压力控制面板，然后关闭压力源。
5. 从共聚焦显微镜载物台中取出细胞。用乙醇和去离子水冲洗细胞。从CPM细胞中取出毛细管。

10. 清洁电池

1. 拆卸电池。在去离子水下冲洗时，用牙刷刷内壁。将部件浸入乙醇中并超声处理约30分钟。
2. 用去离子水冲洗所有部件几次。通过用氮气吹气或在真空烤箱内干燥来干燥零件。

11. 振荡分析

1. 运行 Dilatational_Rheology_Analysis.m 代码 （补充编码文件 2），选择从 CPM 虚拟界面保存的所需文件。示例数据包含在补充文件中。
2. 压力与时间的关系图将如图 1所示。左键单击振荡开始的点，然后再次左键单击振荡结束的位置。如果数据包含多个振荡，请对所有振荡重复此过程。
   1. 左键单击所有起点和终点后，右键单击任意位置的鼠标。例如，如 补充图 1 所示，可以左键单击点 1、2、3 和 4，然后单击鼠标右键。
      注意:代码将计算膨胀模量和相位角，并将结果写入原始文件位置的新.csv文件中。示例数据的结果可以在 补充编码文件 2 中给出的代码结果中看到。MATLAB 还将生成数据的多个图形表示形式，如 补充图 2 所示。

测量误差的主要来源来自毛细管，这些毛细管在切割过程（图5A，B）或涂层过程（图5D）中具有缺陷。这两种类型的缺陷都会导致光学图像分析系统在确定气泡形状和尺寸时出现错误，从而导致表面张力值不准确。在将毛细管插入CPM之前，在将毛细管拉出并涂覆在光学显微镜下后，仔细检查每个毛细管非常重要。必须丢弃毛细管，但可以对包衣不良的毛细管进行酸洗并重新包衣，以改善毛细管末端的气泡固定（协议的步骤2）。如果末端切口完全垂直于毛细管（图5C），并且气泡销直接位于毛细管的末端（图5E），则毛细管效果最佳。毛细管上的疏水涂层在固定时使用时效果会降低，需要重新清洁和重新涂覆毛细管。

表面活性剂吸附与时间的代表性数据如图 6所示。 先前的实验技术如用于测量表面活性剂吸附的吊坠或无柄滴剂没有动态调节毛细管压力的机制，因为表面张力的变化导致气泡面积在吸附^{过程中发生变化30、36、37}。事实上，对于较大的气泡和液滴，需要通过分析界面形状来确定气泡或液滴形状（以及因此的表面积）的变化，因为毛细管压力不是独立测量的，毛细管压力在液滴或气泡表面上变化³⁷。这也使吸附分析复杂化，因为当表面活性剂吸附到界面时，表面张力降低，并且为了满足拉普拉斯方程，气泡的表面积必须增加，需要额外的表面活性剂来吸附以达到平衡。在CPM中，固定的毛细管压力要求在表面活性剂吸附之前的初始气泡半径必须在很小的范围内，以防止气泡在表面张力降低太多时从毛细管中弹出。表面活性剂吸附动力学通常由经典的Ward-Tordai方程³¹建模，该方程描述了表面活性剂分子对恒定界面面积的干净界面的吸附。虽然可以修改Ward-Tordai方程以考虑变化的表面积，但这引入了额外的参数，并使分析^38，39变得非常复杂。

为了克服这些问题，使用Laplace方程开发了一个基于模型的反馈回路，该方程通过动态调节毛细管压力在整个吸附过程中保持气泡的曲率（和表面积）恒定。由于气泡的面积没有不断增加，因此表面张力的变化速率存在显着差异。吸附过程中气泡面积的变化不随时间而恒定，因为表面张力首先变化缓慢，然后在平衡前迅速加速。另一个复杂因素是，该区域的分数变化取决于初始气泡半径。恒定气泡半径的另一个好处是，当气泡表面保持固定时，界面成像得到简化，从而简化了对CFM的聚焦。在吸附过程中，当表面活性剂吸附到界面（视频1）时，来自界面的荧光信号增加。如果表面活性剂形成表面结构域，则可以观察到这些结构域形成并生长²²。

面积振荡期间表面张力的变化 如图7所示。在先前版本的CPM中，在气泡毛细管压力中振荡;然而，在毛细管压力中产生正弦波并不能直接转化为表面积上的正弦波，因为两者 通过 拉普拉斯方程相关。通过使用拉普拉斯方程的基于模型的反馈回路，在该区域而不是毛细管压力中创建振荡，从而在更大幅度范围内更容易分析和收集数据。结果，从该方法收集的表面张力与面积数据可用于直接计算表面活性剂层的界面膨胀模量: （图8），其中 是系统的总应力和 τ_应力是非各向同性偏转应力，在简单的表面活性剂溶液中经常不存在^4，33。因此，对于简单的表面活性剂体系， .对于可以形成弹性网络的界面，例如表面活性蛋白，通常存在额外的应力，因此在定义膨胀模量时必须考虑在内。 视频2 显示了磷脂单层中连续彩色LE相基质中黑色LC域运动的CFM视频。接口上的不同LC域重新组织成一个分支网络，当弯曲气泡^22，40上发生振荡时，该分支网络覆盖接口。" 其他区域振荡 "选项卡可用于创建锯齿波、方波和三角波，如图 3 所示，" 压缩 "选项卡允许恒定速率区域压缩和扩展。

对于溶剂交换研究，首先允许表面活性剂吸附到界面上，然后交换储液层液体以允许第二种表面活性物质接触该界面。当第二种表面活性剂在界面处与原始表面活性剂竞争时，可以检查表面张力的变化。表面膨胀模量通常是表面活性剂交换的更灵敏的探针，以及 通过 CFM的表面形貌。 图9 显示了当发生这种溶剂交换时，表面张力，表面膨胀模量和表面形貌的变化。虽然这种交换的细节可能会有所不同，但对三种性质中的任何一种的改变都可能表明第二种组分与单层的整合或主要组分在散装中的溶剂化。可以将第二个荧光标签附着在次生物种上，以观察其与CFM图像界面的相互作用。

图1:毛细管治疗 （A）显示毛细管评分的图像。玻璃划痕陶瓷被固定在夹子中以使其保持稳定。（B）毛细管的酸洗。酸清洗液用真空泵拉入毛细管。（C）毛细管的疏水化。硅烷溶液插头固定在毛细管内 请点击此处查看此图的放大图。

图 2:电池结构 （1） 大型铝电池座，（2） 氟橡胶垫片（共 4 个），（3） 载玻片（共 2 个），（4） PEEK 电池和 （5） 小型铝电池盒。组装时，含氟弹性体垫片放置在每个载玻片的任一侧。电池用螺钉和螺栓固定在一起。PEEK电池的放大图像显示了各个端口的位置:（6）毛细管端口，（7）溶剂交换入口，（8）溶剂交换出口和（9，10）温度控制夹套入口和出口。PEEK插头可用于将管子或毛细管连接到电池上。未使用的端口可以通过没有通道的插头完全关闭。 请点击此处查看此图的大图。

图 3:CPM/CFM 的示意图，无法缩放。 （1）CPM电池，（2）尖端有气泡的毛细管，（3）共聚焦显微镜物镜，（4）带滤光片的显微镜相机物镜，（5）CPM光源，（6）微流体泵，（7）安全阀，（8）流体交换入口，（9）流体交换出口，（10）蠕动泵，（11）交换流体储液器，（12）流体交换废物，（13）直接到细胞注射器， （14）温控夹套入口和出口，以及（15）温控油箱和泵。 请点击此处查看此图的大图。

图 4:CPM 虚拟接口 （ 1） 将保存数据的文件路径;（2）系统参数、注释和保存按钮。此区域中的所有字段都保存到最终数据文件中;（3）CPM相机图像;（4）设置控制图像分析、环空测量、气泡复位、帧/秒跟踪;（5）气泡重置按钮;（6）"收集数据"按钮、数据记录速率控制、数据采集指标;（7）控制所有工作模式的中心线值、振荡幅度和振荡频率;（8）操作模式切换:单击每个选项卡将更改为该控制模式。每个模式在"压力信号"图中显示发送到泵的压力信号以及一些额外的控制;（9）活的表面张力数据;（10）实时压力数据;（11）实时半径曲率数据;（12）活表面积数据;和（13）实时表面张力和表面积数据，可用于在振荡研究期间粗略确定相位角。 请点击此处查看此图的大图。

图5:毛细血管缺陷 （A）和（B）毛细血管杂项;（C）毛细管正确切割，（D）毛细管由于涂层不良或降解而固定不良，以及（E）毛细管正确固定。 D 和 E 中的红色箭头表示气泡的固定位置。为了获得最佳效果，气泡将固定在毛细管尖端。 请点击此处查看此图的大图。

图6:恒压（橙色）和恒定面积（蓝色）吸附的吸附研究微量强度计结果。 在整个研究过程中，恒定面积吸附的气泡表面积显着增加，并导致吸附需要更长的时间才能达到相同的表面张力。 请点击此处查看此图的大图。

图 7:典型的表面积控制振荡， （A） 压力、（B） 曲率和 （C） 表面积数据。表面积数据是正弦波，而压力和曲率数据不是正弦图，中心线值不在振荡的中点就证明了这一点。三个值之间的数学关系意味着只有一个值可以是真正的正弦波。 请点击此处查看此图的大图。

图 8:分析后的样品流变学结果。赖索PC（1-棕榈酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱）的膨胀模量作为增加〜45μm半径气泡的Lyso PC浓度的频率的函数。伴随炎症的Lyso PC浓度>0.1 mM，在正常通气/呼吸频率（黄色）范围内降低扩张模量，使2ε-γ<0，这是诱导拉普拉斯不稳定性（红点线）的交叉值。在正常肺部可能发生的低浓度Lyso PC≤0.01 mM不会引起不稳定。在频率>10拉德/秒时，所有Lyso PC浓度都高于分频器，并且不易受到拉普拉斯不稳定的影响。红色实线是理论与数据的契合。图取自参考文献⁹。请点击此处查看此图的大图。

图9:与去离子水交换的肺表面活性剂的溶剂交换研究的CFM和CPM结果 （A）显示了整个研究中表面张力和表面膨胀模量的变化。该图分为四个区域:当肺表面活性剂吸附到界面时（蓝色），当LS与去离子水交换时（绿色），当交换溶液切换到Lyso PC溶液（红色）时，以及当细胞充满Lyso PC溶液（橙色）时。可以看到属性在各种交换中发生变化，表明接口正在发生变化。（B）显示肺表面活性剂在交换前吸附到界面上的共聚焦图像和（C）显示与Lyso PC溶液交换完成后的同一表面。在这两种情况下，白色虚线圆圈表示毛细管的内缘。溶剂交换后，单层上结构域的结构急剧变化，证实了CPM结果。 请点击此处查看此图的大图。

视频1:肺表面活性剂恒压吸附研究的共聚焦视频。 假色显示 z 方向的距离，颜色条位于视频左侧，紫色表示毛细管附近的气泡，绿色表示气泡的顶部。界面最初被模糊地照亮，因为只有一小部分荧光表面活性剂被吸附。随着越来越多的表面活性剂吸附，气泡开始增长，因为颜色更多地变为绿色，并且界面被可以在界面上移动的黑色LC域填充。可以看到溶液中表面活性剂的聚集体以明亮的无定形形状漂浮在溶液中，并且一些沉淀到气泡界面上，分解并将其表面活性剂沉积到界面上。 请按此下载此影片。

视频2:肺表面活性剂振荡研究的共聚焦视频。 假色显示 z 方向上的距离，颜色条位于视频的左侧。表面受到几种不同的振荡频率的影响，并且可以看到界面上的暗LC域在整个振荡过程中发生变化。 请按此下载此影片。

补充图1:代码中确定膨胀流变学的中间步骤的示例。 出现此屏幕时，用户应左键单击振荡的最左边进行分析，然后左键单击最右边。可以分析多个振荡，以便用户可以左键单击 1、2、3 和 4，然后右键单击以分析这两个振荡。所示的振荡具有不同的振幅和频率。 请按此下载此档案。

补充图 2:膨胀流变学代码生成的图形结果示例。 这显示了正弦波与压力、半径、表面积和表面张力振荡的拟合，以及每次振荡的傅里叶变换。理想情况下，傅里叶变换中的二次谐波应小于表面积和表面张力的第一次谐波的10%。 请按此下载此档案。

补充图3:备用操作模式。 （A） 正弦波、（B） 锯齿波、（C） 方波、（D） 三角波、（E） 恒速率膨胀和 （F） 恒速率压缩。压缩和膨胀模式允许为不溶性表面活性剂创建朗缪尔型等温线。 请按此下载此档案。

补充编码文件1:微型血压计虚拟 Interface.vi。请按此下载此档案。

补充编码文件 2:Dilatational_Rheology_Analysis.m。请按此下载此档案。

CPM/CFM组合是检查界面动力学、平衡和形态的强大工具。此协议描述了使用 CPM/CFM 获取数据所需的步骤。

图2 显示了带有毛细管、溶剂和热交换通道的电池设计。溶剂交换的入口应位于电池的底部，而出口应位于顶部，以使电池在交换过程中不会溢出。在实践中，同一蠕动泵的入口和出口流量可能略有不同。这种电池设计的一个常见问题是从电池泄漏。这通常是由电池和其中一个连接之间的连接不良引起的，但如果所有连接都是干燥且未泄漏，则可能是由于电池周围的螺栓过度拧紧导致电池的载玻片出现裂缝。

图3 显示了各种泵和电池之间的连接，以及电池与CFM和CPM目标的对齐情况。CPM相机（4）用于在操作过程中对气泡形状进行成像。CPM相机必须配备光学滤光片，以防止CFM激发激光进入CPM相机。否则，CFM激光会使CPM相机中的图像变得非常嘈杂，并且难以使用图像分析进行拟合。安全阀连接毛细管和微流体泵（7），并允许对泵和气压源进行更改，而不会有从电池回流到达泵的风险。第二个阀门（13）提供对注射器的访问，以允许将流体直接注入和注入储液器。在泄漏的情况下，可能需要将流体添加到储液器中，并且可能需要在方案的步骤8（不溶性表面活性剂吸附）中除去流体，或者如果它们已附着在共聚焦物镜上，则可能需要除去从毛细管中吹扫的气泡。

在每个实验过程中，必须仔细执行几个关键步骤。仪器运行后发生的大多数问题都涉及毛细管本身。因此，仔细的切割和涂层可以最大限度地减少困难。将毛细管切割成所需直径是一个困难且产量低的过程。毛细管尖端的任何碎屑或不均匀都会导致气泡半径读数不佳。此外，如果疏水性涂层未正确应用，或者如果随着时间的推移和使用而降解，则气泡将无法正确固定在毛细管的尖端。这可以通过气泡似乎被固定在毛细管内部或在振荡研究期间沿着毛细管内部滑动来表示。切割良好但未正确固定的毛细管可以重新清洁并进行疏水处理。

另一个关键步骤和可能的错误来源是清洁不同材料或相同材料不同浓度之间的细胞储液槽，管道和毛细管。储层中有许多小缝隙，如果清洁不当，表面活性剂会吸附并改变以后的测量结果。通常需要完全拆卸和浸泡电池，以确保去除任何多余的表面活性物质。如果要研究一系列相同浓度的表面活性剂，最好从使用最低浓度开始。

有时，将毛细管与共聚焦物镜对齐可能很困难。微秒计相机可用于帮助对准共聚焦物镜，但对于CFM物镜的较大工作距离，这可能没有帮助。如果共聚焦显微镜聚焦在毛细管尖端之外，毛细管横截面（一个没有任何荧光材料的区域）也可用于帮助定位物镜。如果毛细管气泡没有弹出，则提供给毛细管的压力可能存在问题（在正常运行下应该是150 mbar）。这可以通过进入压力控制模式并将压力设置为高值来检查。如果压力未达到设定压力，则微流体泵的管道中可能存在泄漏或泵未获得足够的气体压力。与许多涉及表面科学的研究一样，重要的是要确保在任何时候都不会将污染材料引入溶液中。如果读数与预期不符（表面张力开始太低或下降太快），制造新样品或使用经过充分研究的样品或纯液体也是故障排除的良好早期步骤。

可以对装置进行一些修改以实现其他实验目标。油或水可以添加到毛细管中，允许研究油水而不是气水界面³⁹。这增加了回流到泵中的风险，因此必须格外小心，甚至可能需要在泵和毛细管之间的管道中添加油阱。

《产品分类法》/《商品分类法》有几个限制。CPM的毛细管尺寸工作范围有限，泵的毛细管外径为20-300μm，系统中的光学元件。虽然可以使用溶剂交换⁴¹ 或此处描述的方法将不溶性表面活性剂添加到界面中，但表面浓度只能通过表面张力与面积等温线进行比较以及与从Langmuir槽获得的等温线进行比较来推断。CFM只能检测荧光材料，因此任何非荧光或非荧光标记的材料都无法可视化。许多表面活性剂是小分子，标记它们可能会改变它们的性质，尽管这对于较大的表面活性分子（如蛋白质或聚合物）来说应该不是一个问题^26，27。

与以前对表面活性剂界面进行 CPM 和 CFM 分析相比，该方法具有几个关键优势。最重要的是，混合仪器允许在测量各种动态和平衡表面特性时可视化界面。界面形态的变化可以直接与界面动力学和流变特性联系起来。以前表面活性剂界面的CFM是使用平坦的Langmuir槽^{16，20，28，29，42，43，44，45，46}，⁴⁷完成的，而这里描述的方法可以在高度弯曲的界面²²上执行.此外，整个界面可以一次成像，显示特定域的实时可跟踪变化，而Langmuir槽上的表面流动导致域流入和流出共聚焦视觉窗口。该装置的表面压缩也是各向同性的，而朗缪尔槽上的屏障具有特定的压缩方向。CPM允许比朗缪尔槽上更快的区域振荡。

本研究中新的曲率和基于面积的控制与以前版本的CPM³⁰相比具有主要优势。通常，通过设置固定的毛细管压力来控制气泡大小;对于膨胀模量测量，毛细管压力振荡。当毛细管压力保持恒定时，当表面活性剂吸附到界面时，气泡的表面张力降低。为了满足拉普拉斯方程ΔP = 2γ/R，曲率半径必须随着表面张力的降低而减小。对于 CPM 中的半球形气泡，减小气泡曲率半径会增加气泡面积^9，48:

其中 R_c是毛细管半径，R 是曲率的气泡半径。气泡半径的变化改变了吸附过程中界面的面积，这使得使用Ward-Tordai方程^10，38 的吸附分析变得复杂，此外，如果气泡的表面张力足够低，气泡半径将小于毛细管半径并且气泡将被喷射出来。这种较新的CPM / CFM中的反馈回路在整个吸附过程中保持气泡面积恒定，这意味着可以使用原始的Ward-Tordai方程，没有气泡喷射的风险，并且由于该区域的表面没有增加，吸附发生得更快。对于振荡研究，在压力中产生正弦波不会在表面积⁴⁸中产生正弦波。以前的CPM方法依赖于保持较小的振荡，以使压力驱动的振荡引起的面积变化接近正弦波⁴⁸。所描述的方法直接控制气泡的面积，并可用于在界面区域产生真正的正弦波振荡。可以将应力（表面张力的变化）与界面应变（表面积的变化）直接联系起来，以计算膨胀模量。

为了帮助实现该协议，此处描述了控制微量天文计代码的简要说明。该代码由循环中的三个部分组成:一个向微流体泵发出命令，一个控制气泡的复位机制，另一个测量气泡的半径并保存计算值。泵控制器有三种主要操作模式:压力控制、曲率控制和面积控制。在压力控制中，用户直接输入泵产生的压力的设定点。这种模式很重要，因为它不需要反馈回路，因此是最稳定的模式。曲率控制使用先前测量的表面压力和拉普拉斯方程来计算创建给定曲率的界面所需的压力。表面积控制模式在此基础上，根据球形帽的几何形状计算创建给定表面积所需的曲率，这也需要精确测量毛细管半径。这两种模式对于吸附和振荡研究特别有用，但需要稳定的一致表面压力数据流。因此，可能需要从原始数据平滑这两个控制器的馈送，以获得更好的功能。当溶液不够清晰时，通常是由于样品高度浑浊，这种模式将无法正常工作，因为无法获得气泡界面的良好图像。振荡的控件也包含在代码的此部分中。代码的中间段允许从毛细管中清除气泡。在这里，毛细管的设定压力设置为高值，并在那里保持一定的时间，允许气泡弹出并创建一个新的界面。代码的最后一部分使用视觉采集软件来跟踪气泡的边缘并测量其半径。然后将该半径与拉普拉斯方程一起使用来计算表面张力，然后将其馈送到环路的初始部分。

这种混合CPM / CFM技术已被证明对我们在空气 - 水界面处的模型和临床肺表面活性剂的研究非常有益。气泡尺寸近似于人肺肺肺泡中的气泡尺寸，并且可以观察到界面曲率对肺表面活性剂单层的形态和动力学的影响^9，10，22。混合仪器对于研究其他表面活性材料也很重要，这些材料无处不在，从石化到家用化学品，从泪膜到抗体稳定。结合的CPM / CFM使我们能够在相分离域的规模上探测动态界面特性，并随着外部条件的变化可视化表面上的形貌。这种方法在昂贵材料需要使用最小尺寸样品的应用中特别有用。同时观察界面动力学和单层形态几乎是任何其他技术都无法实现的，因此广泛适用于界面科学领域。

作者没有利益冲突要披露。

所有共聚焦显微镜图像均使用尼康A1RHD多光子直立共聚焦显微镜获得。我们感谢明尼苏达大学成像中心的支持人员，特别是吉列尔莫·马克斯的指导和帮助。这项工作得到了NIH格兰特HL51177的支持。SI得到了露丝·柯尔施泰因NRSA机构研究培训补助金F32 HL151128的支持。